专利名称：H6亚型禽流感病毒rt-lamp试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及禽流感病毒检测领域，尤其是一种H6亚型禽流感病毒RT-LAMP试剂
品.ο
背景技术：
禽流感AI是被动物卫生组织(OIE)列为A类的一种急性烈性传染病，国内也将其列为一类疫病。AI是由禽流感病毒AIV引起的，主要引发禽类的呼吸系统疾病，并以急性发病、高死亡率和产蛋率下降为特征。H6亚型AIV(H6 subtype avian influenza virus)虽然不是高致病性禽流感病毒，但是它在禽类间可以传播，造成禽类的隐形感染，还有可能抗原漂移或转变形成新的毒力更强的毒株，因此早期、快速、准确的诊断十分重要。常规的禽流感病毒诊断方法有病毒分离、血凝(HA)及血凝抑制(HI)试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组织化学以及免疫荧光技术(IF)等。然而，这些方法都存在检测周期长、灵敏度不高、特异性不强、不适合基层活禽市场或者进出口大量样本的检测等。 如今，随着进出口品种和类目增加，迫切需要适应基层和边境口岸的简便、快速检测方法及试齐LU环介导的等温核酸扩增在等温条件下，即水浴锅中就可完成扩增反应，不需要特殊仪器设备，如PCR仪等，检验周期很短，在一小时内即可完成反应。反应完成后，可直接通过加入荧光染料，通过肉眼观察就能直接判断反应结果。与其他的检测技术相比，推广应用难度较低。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种检测简便快速、灵敏度高、特异性强、仪器要求低、成本低廉的H6亚型禽流感病毒RT-LAMP试剂盒，以适应基层和边境口岸现场H6亚型禽流感的检测。为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案H6亚型禽流感病毒RT-LAMP试剂盒，其特征在于该试剂盒含有以下试剂反应液A 含有 IOX 等温反应缓冲液、AMV 5U/y L, Rnasin 20U/y L, Bst DNA PoLymerase8U/μ LUOmM dNTP、25mM硫酸镁、5Μ的甜菜碱、10 μ M的外引物1和外引物2、 30μΜ的内引物1和内引物2、40μΜ的环引物1和环引物2 ;10Χ等温反应缓冲液含有 200mM pH值为8. 8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和曲拉通X-100 ；外引物1 序列为 GGGAATCCCCAATGCGAC，外引物2 序列为 TCTACTCCTGCCCATGTACT，内引物 1 序列为 GTAGCAGATCCCATTTTGAGCCTTGGTGATCAAAGCTGGTCAT，内引物 2 序列为 CCAGGAATTTTGAATGAAGTAGAAGTTGGGAAACATTTCAAATCT，环引物1 序列为 TAGGTCTTTCCACTATAT，
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环引物2 序列为 CACTTATTGGATCAGGAGA ；反应液B 50 X SYBR Green I 荧光染料。反应液A每管23yL，其组成为2. 5yL IOX等温反应缓冲液、1. 0 μ L AMV 5U/ μ LU. 0μ L Rnasin 20U/y LU. 0μ L Bst DNA PoLymerase 8U/y L>5y L 25mM硫酸镁、 3. 5μ L 10mMdNTP,5y L 5M的甜菜喊、0.5yL 10 μ M 的夕卜弓 |物 1 禾口 0· 5 μ L 10 μ M 夕卜弓 |物 2、 LOyL 30 μ M的内引物1禾口 LOyL 30 μ M内引物2、0. 5 μ L 40 μ M的环弓丨物1禾口 0. 5 μ L 40 μ M环弓丨物2 ；反应液B每管2 μ L。本发明采用逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)技术，并根据Η6亚型AIV血凝素 (HA)基因序列(见序列表SEQ. ID. No. 1)的保守区八个位点设计了 LAMP的6条特异性引物，由此发明了用于快速检测H6亚型禽流感病毒(AIV)的H6亚型禽流感病毒RT-LAMP试剂盒。应用本发明的RT-LAMP试剂盒建立H6亚型禽流感病毒检测方法，通过对家禽咽喉及泄殖腔棉拭子样品的RNA提取，环介导等温扩增、扩增产物的显色检测，从而检测出H6亚型禽流感病毒。该法无需特殊仪器，只需在水浴锅中进行，反应时间短，仅为一个小时，反应完成后，可直接通过肉眼观察判定结果，实现了简便、灵敏、快速地检测H6亚型AIV。因而，特别适合基层和边境口岸现场检测H6亚型禽流感的需要，对该病的防控具有重要意义。
图1是应用本发明H6亚型禽流感病毒RT-LAMP试剂盒的检测方法特异性日光下观察结果图。图2是应用本发明H6亚型禽流感病毒RT-LAMP试剂盒的检测方法特异性紫外光下观察结果图。图1和图2中1鸡传染性支气管炎病毒(IBV)，2鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)， 3鸡毒支原体(MG)，4新城疫病毒(NDV)，5 Hl亚型禽流感病毒(AIV)，6 H3亚型禽流感病毒 (AIV)，7H5亚型禽流感病毒(AIV)，8H7亚型禽流感病毒(AIV)，9H9亚型禽流感病毒(AIV)， 10H6亚型禽流感病毒AIV。图3是应用本发明H6亚型禽流感病毒RT-LAMP试剂盒的检测方法特异性琼脂糖凝胶电泳结果图，图中M DL2000DNA分子量标准，1空白对照，2鸡传染性支气管炎病毒 (IBV)，3鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)，4鸡毒支原体(MG)，5新城疫病毒(NDV)，6H1亚型禽流感病毒(AIV)，7H3亚型禽流感病毒(AIV)，8H5亚型禽流感病毒(AIV)，9H7亚型禽流感病毒(AIV)，10H9亚型禽流感病毒(AIV)，11H6亚型禽流感病毒AIV。图4是应用本发明H6亚型禽流感病毒RT-LAMP试剂盒的检测方法敏感性日光下观察结果图。图5是应用本发明H6亚型禽流感病毒RT-LAMP试剂盒的检测方法敏感性紫外光下观察结果图。图4和图5中1-7分别为以下不同浓度的H6亚型禽流感病毒RNA Ing/管， IOOpg/ 管，IOpg/ 管，Ipg/ 管，0. Ipg/ 管，0. Olpg/ 管，Ifg/ 管。图6是应用本发明H6亚型禽流感病毒RT-LAMP试剂盒的检测方法敏感性琼脂糖凝胶电泳结果图，图中M DL2000 DNA分子量标准，1空白对照，2-8分别为以下不同浓度的H6 亚型禽流感病毒 RNA Ing/ 管，IOOpg/ 管，IOpg/ 管，Ipg/ 管，0. Ipg/ 管，0. Olpg/ 管，Ifg/管。图7是应用本发明H6亚型禽流感病毒RT-LAMP试剂盒的检测方法灵敏度琼脂糖凝胶电泳结果图，图中M DL2000DNA分子量标准，1空白对照，2-8分别为以下不同浓度的 H6 亚型禽流感病毒 RNA Ing/ 管，IOOpg/ 管，IOpg/ 管，Ipg/ 管，0. Ipg/ 管，0. Olpg/ 管，Ifg/管。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
，对本发明H6亚型禽流感病毒RT-LAMP试剂盒作进一步详细说明。一、H6亚型禽流感病毒RT-LAMP试剂盒的配制<1> 反应液 A每管23yL，其组成为2.5yL IOX等温反应缓冲液、1. 0 μ L AMV 5U/ μ L, 1. 0 μ LRnasin 20U/y LU. 0μ L Bst DNA PoLymerase 8U/y L>5y L 25mM 硫酸镁、3. 5 μ L 10mMdNTP,5y L 5M 的甜菜碱、0.5yL 10 μ M 的夕卜弓 |物 1 禾口 0. 5 μ L 10 μ M 夕卜弓 |物 2、1. 0 μ L 30μΜ的内引物1禾口 1. 0μ L 30μΜ内引物2、0. 5μ L 40口] 的环弓|物1禾口0.5口1^ 40 μ M环引物2。其中，IOX等温反应缓冲液含有200mM pH值为8. 8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和1 %曲拉通X-100。外引物1 序列为 GGGAATCCCCAATGCGAC(见序列表 SEQ. ID. No. 2)，外引物2 序列为 TCTACTCCTGCCCATGTACT (见序列表 SEQ. ID. No. 3)，内引物 1 序列为 GTAGCAGATCCCATTTTGAGCCTTGGTGATCAAAGCTGGTCAT (见序列表 SEQ. ID. No. 4)，内引物 2 序列为 CCAGGAATTTTGAATGAAGTAGAAGTTGGGAAACATTTCAAATCT (见序列表 SEQ. ID. No. 5)，环引物1 序列为 TAGGTCTTTCCACTATAT (见序列表 SEQ. ID. No. 6)，环引物2 序列为 CACTTATTGGATCAGGAGA(见序列表 SEQ. ID. No. 7)。<2> 反应液 B每管2 μ L，其组成为50 X STOR Green I荧光染料。二、应用本发明Η6亚型禽流感病毒RT-LAMP试剂盒检测Η6亚型禽流感病毒的方法(以下简称RT-LAMP检测法)主要步骤为<1>家禽咽喉、泄殖腔棉拭子样品的RNA提取取咽喉、泄殖腔棉拭子浸泡于500 μ L生理盐水中，然后将棉拭子充分捻动，在试管壁上挤压干净后，以6000r/min离心15min，取上清250μ L，加入500μ L TRIzol LS reagent，混勻后室温静置lOmin，加入200 μ L氯仿，轻微振荡混勻，4°C、12000r · min-1离心IOmin,取上清约500 μ L，加入500 μ L异丙醇，混勻后室温静置lOmin, 12000r .min-l离心lOmin，沉淀干燥后悬于适量的DEPC处理水中，即为待检RNA备用。<2>H6亚型禽流感病毒环介导等温扩增
在装有23111^反应液4管中加入2111^待检1 織，于60-651恒温水浴中放置60111士11。<3>扩增产物的显色反应在上述反应管中加入1 μ L反应液B，直接用肉眼观察颜色变化，如颜色变为翠绿色，则说明样品中含有Η6亚型禽流感病毒；如果颜色仍为橙色，说明待检样品中不含Η6亚
型禽流感病毒。三、RT-LAMP检测法的特异性和敏感性试验利用优化好的RT-LAMP 反应体系，以 Η1、Η3、Η5、Η7、Η9 亚型 AIV 及 NDV、IBV、ILTV、 MG核酸为待检样品进行检测，检验RT-LAMP方法的特异性。将制备好的H6AIV RNA按10倍倍比稀释，并用Beckman UV-800紫外分光光度计测定稀释后各个梯度的RNA浓度，分别为 lng、lOOpg、10pg、lpg、0. lpg、0. Olpg、Ifgo 对各浓度 RNA 用 RT-LAMP 方法进行扩增，并用一步RT-PCR方法同时进行扩增。2%琼脂糖凝胶电泳观察结果确定该方法的敏感度。如图1至图3所示，特异性试验结果表明H6亚型AIV RT-LAMP的特异性良好。如图1所示，加入STOR Green I染料后H6亚型AIV阳性样品呈绿色，显示为阳性。IBV、ILTV、 MG,NDV,Hl亚型AIV、H3亚型AIV、H5亚型AIV、H7亚型、AIV H9亚型AIV为成橙红色，显示为阴性。如图2所示，将其放置紫外线下，阳性产物管发出很强的绿色荧光，而阴性管不发出绿色荧光；如图3所示，扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，阳性产物出现特异性的梯状条带，阴性产物无条带出现。如图4至图7所示，敏感性试验结果表明RT-LAMP方法对H6亚型AIV病毒的RNA 的最小检测限为0. Olpg,而常规RT-PCR对H6亚型AIV病毒的RNA的最小检测限为lpg， LAMP法的灵敏度是RT-PCR方法的100倍。四、临床样品检测在活禽市场采集62份棉拭子样品，用双抗(青-链霉素组合)磷酸盐缓冲液(PBS) 处理后接种鸡胚尿囊腔，收取24-96小时死亡或未死亡鸡胚尿囊液，进行病毒分离。同时对 62份棉拭子样品进行RNA抽提，利用上述建立的H6AIV RT-LAMP方法、传统RT-PCR方法及病毒分离法进行检测，验证RT-LAMP方法的可靠性。结果如表1 在选取的62份临床样品中，用RT-LAMP方法检测到6份阳性，用 RT-PCR检测到5份阳性。病毒分离到6株H6亚型AIV病毒阳性样品。RT-LAMP方法的检测结果与病毒分离结果符合率为100%。表1H6亚型AIV临床样品检测结果
权利要求
1.一种H6亚型禽流感病毒RT-LAMP试剂盒，其特征在于该试剂盒含有以下试剂反应液 A 含有 IOX 等温反应缓冲液、AMV 5U/y L、Rnasin 20υ/μ L、Bst DNA PoLymerase8U/ μ LUOmM dNTP、25mM硫酸镁、5Μ的甜菜碱、10 μ M的外引物1和外引物2、30μΜ的内引物 1和内引物2、4(^11的环引物1和环引物2;所述IOX等温反应缓冲液含有200mMpH值为 8.8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和曲拉通 X-100 ；所述外引物1序列为GGGAATCCCCAATGCGAC， 所述外引物2序列为TCTACTCCTGCCCATGTACT，所述内引物 1 序列为 GTAGCAGATCCCATTTTGAGCCTTGGTGATCAAAGCTGGTCAT， 所述内引物 2 序列为 CCAGGAATTTTGAATGAAGTAGAAGTTGGGAAACATTTCAAATCT， 所述环引物1序列为TAGGTCTTTCCACTATAT， 所述环引物2序列为CACTTATTGGATCAGGAGA ； 反应液B 50 X STOR Green I荧光染料。
2.根据权利要求1所述的H6亚型禽流感病毒RT-LAMP试剂盒，其特征在于所述反应液A每管23yL，其组成为2. 5yL IOX等温反应缓冲液、1. 0 μ L AMV 5U/y LU. 0μ L Rnasin 20U/y LU. 0μ L Bst DNA PoLymerase 8U/y L,5y L 25mM 硫酸镁、3. 5 μ L IOmM dNTP,5y L 5Μ的甜菜碱、0. 5yL 10 μ M的夕卜弓|物1禾口 0. 5 μ L 10 μ M夕卜弓|物2、1. 0 μ L 30 μ M的内引物1禾口 1. 0μ L 30 μ M内引物2、0. 5μ L 40 μ M的环引物1禾口 0. 5 μ L40 μ M环引物2 ；所述反应液B每管2 μ L。
全文摘要
本发明公开了一种H6亚型禽流感病毒RT-LAMP试剂盒，它采用逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)技术，并根据H6亚型AIV血凝素(HA)基因序列的保守区八个位点设计了LAMP的6条特异性引物。应用本发明及其建立的检测方法，解决了现有技术的检测周期长、灵敏度不高、特异性不强、操作复杂、仪器要求高等缺陷，特别适合基层和边境口岸现场检测H6亚型禽流感的需要，对该病的防控具有重要意义。
文档编号C12R1/93GK102344972SQ20111034771
公开日2012年2月8日 申请日期2011年11月7日 优先权日2011年11月7日
发明者刘加波, 周辰瑜, 庞耀珊, 谢丽基, 谢志勤, 谢芝勋, 邓显文 申请人:广西壮族自治区兽医研究所