专利名称：重组痘苗病毒天坛株及使用其检测痘苗病毒中和抗体的方法
技术领域：
本发明涉及免疫学领域，更具体地涉及痘苗病毒中和抗体检测。
背景技术：
痘苗病毒是痘病毒科正痘病毒属中最为人们所熟悉的成员，也是目前已知结构上最为复杂的一种病毒。痘苗病毒天坛株(Vaccinia Tian Tan, VTT)曾作为天花病毒病的疫苗株在我国大量人群中长期使用，具有相对毒力较弱、使用安全和生物学性状清楚等特点，是研制基因工程重组痘苗病毒活疫苗及真核表达载体的理想毒株(McCurdy LH, Rutigliano JA, Johnson TR, Chen M，Graham BS. Modified vaccinia virus Ankara immunization protects against lethal challenge with recombinant vaccinia virus expressing murine interleukin-4. Journal of virology 2004Nov ；78(22) :12471-9 ； Dai K，Liu Y，Liu Μ,Xu J，Huang W,Huang X，et al. Pathogenicity and immunogenicity of recombinant Tiantan Vaccinia Virus with deleted C12L and A53R genes. Vaccine 2008S印 15 ；26 (39) :5062-71 ；以及 Gomella LG，Mastrangelo MJ，McCue PA，Maguire HJ，Mulholland SG，Lattime EC. Phase i study of intravesical vaccinia virus as a vector for gene therapy of bladder cancer. The Journal of urology 20010ct ； 166(4) :1291-5)。20世纪中叶，世界卫生组织(WHO)在全球幵展了灭绝天花的运动。在这场运动中， 世界范围内应用最广泛的痘苗病毒疫苗有4株EM63株，李斯特(Lister)株，NYCBH株和天坛株，其中天坛株在中国人群中大量接种，其在中国天花消灭过程中发挥了重要作用。虽然自1980年WHO宣布全球消灭天花后，痘苗病毒天坛株疫苗停止接种使用(Miattacharya S.Uncertain advances :a review of the final phases of the smallpox eradication program in India,1960-1980. American journal of public health 2004Nov ；94 (11) 1875-8 ，但我国人群中仍存在针对痘苗病毒的中和抗体。这些中和抗体水平将直接影响各类痘苗病毒载体疫苗的应用效果。因此，在目前痘苗病毒被广泛作为载体研究疫苗的现状下，确切了解我国各年龄段人群针对天花病毒的免疫状态显得非常重要。因此，迫切需要建立一种高通量、灵敏度高可定量的针对痘苗病毒的中和抗体检测方法。目前，检测痘苗病毒中和抗体的方法基本有以下三类1.噬斑抑制法这是一种最为传统的中和抗体检测方法，被认为是“金标准”(董小曼，陈秀珍，董翊.天花疫苗天坛株病毒中和试验方法的建立和验证.中国医药生物技术2007;2(6) :464-6)。其理论依据为，痘苗病毒形成的单个噬斑被认为代表一个感染性病毒单位，因此，噬斑数量的减少直接和中和抗体水平相关联(Katz JB. The effect of the virus-serum incubation period upon vaccinia virus serum neutralization titers. Journal of biological standardization 19870ct ； 15 (4) :389-92)。该方法的主要缺点是检测周期长天)；检测通量低；结果分析主观性强；需要在6孔细胞培养板中分析，因此样品量较大。2008年，Maria教授采用96孔板分析中和抗体滴度降低了样品需求量，但仍需放大12. 5倍后人工判读数据(Borges MB, Kato SE, Damaso CR, Moussatche N, da Silva Freire Μ, Lambert Passos SR, et al. Accuracy and repeatability of a micro plaque reduction neutralization test for vaccinia antibodies. Biologicals 2008Mar ；36 (2) :105-10)。而且，本方法很难标准化，不便于实验室间的推广。2. mRNA转录抑制法为了克服各种痘苗病毒毒株间基因差异和检测周期较长的问题，2011年，德国Marit Kramshi教授利用实时荧光定量RT-PCR方法，通过检测痘苗病毒李斯特株mRNA转录的抑制水平评价中和抗体滴度。这种方法虽然可以将检测周期缩短至12小时并有效克服各种毒株之间基因差异的问题(Kramski M,Drozd A,Lichtfuss GF, Dabrowski Pff, Ellerbrok H. Rapid detection of anti-Vaccinia virus neutralizing antibodies. Virology journal ；8 :139)，但最大的缺点是大大增加了检测的成本并对检测人员和实验环境的要求明显提高，并且不适合进行高通量分析。3.报告基因表达抑制法2003年，美国国立卫生研究院Jody M教授利用包含β -半乳糖苷酶(β-Gal) 基因的重组痘苗病毒WR株建立了一种中和抗体检测方法，通过半乳糖苷酶催化底物发光值的下降程度，反映样品中痘苗病毒中和抗体水平的高低。本方法虽然具有灵敏度高、检测时间短以及可高通量的优点，但是操作步骤繁琐的缺点非常明显。半乳糖苷酶催化底物发光反应的线性范围较窄，因此需要对培养上清进行系列稀释使发光值处于线性标准曲线范围内(Manischewitz J, King LR, Bleckwenn ΝΑ, Shiloach J, Taffs R, Merchlinsky Μ,et al. Development of a novel vaccinia-neutralization assay based on reporter-gene expression. The Journal of infectious diseases 2003Aug 1 ； 188(3) :440-8)。2004年，德国环境与健康研究中心的Antonio C教授利用表达绿色荧光蛋白 (GFP)的重组痘苗病毒安卡拉株(MVA-gfp)，建立了一种快速、灵敏且高通量的中和抗体检测方法。但是，本方法主要的缺点在于利用流式细胞仪检测MVA-gfp细胞感染抑制
(Cosma A, Buhler S, Nagaraj R, Staib C, Hammarin AL, Wahren B, et al. Neutralization assay using a modified vaccinia virus Ankara vector expressing the green fluorescent protein is a high—throughput method to monitor the humoral immune response against vaccinia virus. Clinical and diagnostic laboratory immunology 2004Mar ； 11 (2) :406_10)。为了适应群体痘苗病毒中和抗体滴度普查的要求，仍需要建立一种灵敏度高、特异性强、检测成本低、检测周期短和/或适合高通量检测的新型方法。
发明内容
本发明提供了一种包含萤火虫荧光素酶(Iuciferase)基因的重组痘苗病毒天坛株。本发明提供了一种检测样品中痘苗病毒中和抗体水平的方法，所述方法包括将本发明的包含萤火虫荧光素酶基因的重组痘苗病毒天坛株与待测样品共同孵
4育；接种痘苗病毒嗜性细胞；以及进行发光测定。本发明还提供了将本发明的重组痘苗病毒天坛株用于体外检测样品中痘苗病毒中和抗体水平的用途。本发明还提供一种痘苗病毒中和抗体检测试剂盒，其包括本发明的包含萤火虫荧光素酶基因的重组痘苗病毒天坛株，任选地还包括指示用所述包含萤火虫荧光素酶基因的重组痘苗病毒天坛株检测待测样品中的痘苗病毒中和抗体的说明书。本发明的抗体检测方法是基于编码荧光素酶的报告基因表达抑制的特点。本发明的抗体检测方法具有如下一种或多种优点检测周期短；灵敏度高；可重复性高；结果判读客观；高通量；样品需求量少；检测成本低；方法可标准化，便于实验室间推广。
图1示出了本发明的痘苗病毒中和抗体检测方法的原理示意图(图IA至图1C)。图2显示了 pSCluc构建质粒图。图3左图显示了 lOpfu/lOOOO细胞rTV-Fluc病毒感染包括Vero细胞在内的三种不同细胞后发光值随时间的变化，图3右图显示了 lOOOpfu/lOOOO细胞rTV-Fluc病毒感染包括Vero细胞在内的三种不同细胞后发光值随时间的变化。图4显示了在测定发光值前不冲洗或冲洗Vero细胞对发光值的影响。图5显示了 Vero细胞接种量分别为10000细胞/孔和30000细胞/孔时的发光值。图6显示了不同的rTV-Fluc病毒感染剂量下的发光值。图7显示了三种rTV-Fluc病毒感染剂量标定的阳性对照HCS中和滴度。图8显示了用一种本发明的抗体测定方法和噬斑抑制法对人和鼠血清痘苗病毒天坛株中和抗体滴度检测的结果。图9显示了本发明的检测方法和噬斑抑制法的相关性分析结果。图10显示了用一种本发明的方法检测的小样本人群不同年龄段的人痘苗病毒天坛株中和抗体水平。图11显示了使用rTV-Fluc针对VTT接种的兔(■)和无关对照兔(□)的血清在不同稀释度下测得的中和抗体水平，X轴表示血清的系列稀释度，范围为从1 30至 1 21870。图12显示了使用rTV-Fluc针对rTV_HIVgpl45疫苗接种的小鼠血清(■，▲)和首次接受实验的小鼠血清(□，Δ)的中和抗体检测结果。χ轴表示血清的系列稀释度，范围为从1 30至1 21870。图13显示了使用rTV-Fluc针对ECT接种的鼠(▲)和无关对照鼠(Δ )的血清在不同的稀释度下测得中和抗体水平，χ轴表示血清的系列稀释度，范围为从1 30至 1 21870。图14显示使用rTV-Fluc针对两个rMVA-HIVgpe接种的人(■，▲)和两个首次接受实验的人(□，Δ)的血清不同的稀释度下测得的中和抗体水平，χ轴表示血清的系列稀释度，范围为从1 30至1 21870。图15显示了 T载体连接产物的酶切鉴定图谱。
具体实施例方式如上所述，本发明构建了一种包含萤火虫荧光素酶基因的重组痘苗病毒天坛株。 用于构建本发明重组病毒的痘苗病毒天坛株为本领域技术人员所熟知，例如在如金奇等人，痘苗病毒天坛株基因组251Λ核苷酸序列分析及与非疫苗株WR的比较.病毒学报1988， 4 :288-304中，以及金奇等人，痘苗病毒天坛株全基因组结构特点的分析，中国科学(C 辑)1997年12月，第27卷第6期562-567中有详细描述。用于本发明的痘苗病毒天坛株以及由其构建的本发明的重组病毒可以是复制型的，也可以是非复制型的。在本发明的实施方案中，所述萤火虫荧光素酶基因可以是非分泌型也可以是分泌型。优选地，在本发明中使用非分泌型萤火虫荧光素酶基因。所述萤火虫荧光素酶基因为本领域已知。如上所述，本发明提供了一种通过使用本发明的包含萤火虫荧光素酶基因的重组痘苗病毒天坛株，来检测样品中的痘苗病毒中和抗体水平的方法。本发明的方法包括将本发明的重组病毒与待测样品共同孵育，接种痘苗病毒嗜性细胞，以及进行发光测定。根据本领域已有的知识，本领域技术人员知晓如何进行针对萤火虫荧光素酶催化的发光反应的发光测定。例如，所述发光测定步骤通常包括向所述待测样品中加入一种萤火虫荧光素酶底物试剂，如荧光素(Iuciferin)。本发明的方法可用于检测针对多种痘苗病毒毒株的中和抗体，例如针对痘苗病毒天坛株(VTT)、鼠痘病毒(ECT)或痘苗病毒安卡拉株(MVA)等的中和抗体。本发明的方法可用于检测多个物种来源的样品中的中和抗体水平，例如用于检测来自小鼠、兔或人的血清样品中的中和抗体水平。 在本发明的一个实施方案中，对兔血清检测针对痘苗病毒天坛株的中和抗体。在本发明的另一个实施方案中，对鼠血清检测针对痘苗病毒天坛株的中和抗体。在本发明的再一个实施方案中，对鼠血清检测针对鼠痘病毒的中和抗体。在本发明的又一个实施方案中，对人血清检测针对痘苗病毒天坛株的中和抗体。在本发明的另一个实施方案中，对人血清检测针对痘苗病毒安卡拉株的中和抗体。在本发明方法的实施方案中，所述样品可为可能含有痘苗病毒中和抗体的任何样品。例如，待测样品可为取自受试者的血液、尿液、唾液等。待测样品通常为受试者的血清。本发明的方法中所述的痘苗病毒嗜性细胞是指能够被痘苗病毒感染的细胞。本发明的重组痘苗病毒具有广谱细胞嗜性，因此，多种细胞——例如，原代鸡胚细胞(CEF)、人胸腺激酶缺陷性细胞系(143TK)、Vero细胞(非洲绿猴肾细胞系)等——均可作为痘苗病毒嗜性细胞用于本发明方法中。优选地，本发明方法使用Vero细胞作为痘苗病毒嗜性细胞。本发明的方法的实施方案中，所述发光测定可以包括细胞裂解步骤或者不包括细胞裂解步骤。本领域技术人员可以理解，当本发明方法的实施方案中使用分泌型萤火虫荧光素酶基因时，所述发光测定步骤中不需要进行细胞裂解；当本发明方法的实施方案中使用非分泌型萤火虫荧光素酶基因时，所述发光测定步骤还包括将所述痘苗病毒嗜性细胞裂解。在本发明的方法中，所述发光测定优选在接种细胞后20-40小时期间进行，更优选地，在细胞接种后20- 小时期间进行，再更优选地，在细胞接种后M小时时进行。在本发明的方法中，所述嗜性细胞的接种量可以是使测定的发光值结果的变异系数尽量小的接种量，例如使得变异系数小于15 %，优选小于10 %，更优选小于5 %。由此，所述嗜性细胞的接种量优选为10000-30000细胞/孔之间，更优选地，接种量为30000细胞/ 孔(以接种孔为96孔板孔计)。在本发明的方法中，本发明的病毒感染剂量可以是使测定的发光值结果的变异系数尽量小的剂量，例如使得变异系数小于15 %，优选小于10 %，更优选小于5 %。由此，在本发明方法的一个优选的实施方案中，本发明病毒的感染剂量为66-1800pfu/30000细胞， 更优选的剂量为100-1000pfu/30000细胞，再更优选的剂量为400pfu/30000细胞。本发明还提供了一种痘苗病毒中和抗体检测试剂盒，其包括本发明的包含萤火虫荧光素酶基因的重组痘苗病毒天坛株。本发明的试剂盒中可进一步包含用于萤光素酶发光反应测定的一种或多种其他试剂，优选地，所述试剂盒中可进一步包含萤火虫荧光素酶底物试剂，如萤光素。以下结合实施例对本发明进行具体说明。实施例中使用的化合物或试剂可通过商业途径购得，或者通过本领域技术人员已知的常规方法制备得到；所使用的实验仪器可通过商业途径购得。实施例1 包含萤火虫荧光素酶基因的重组痘苗病毒天坛株的构建包含萤火虫荧光素酶基因痘苗病毒天坛株的构建过程如下首先，以PSC59质粒为框架构建包含萤火虫荧光素酶基因的重组质粒pSCluc ；利用lipofeCt2000脂质体技术转染痘苗病毒天坛株(疫苗株)感染后的鸡胚成纤维细胞(CEF)，经过X-Gal基因蓝白斑挑选过程获得重组的复制型痘苗病毒天坛株rTV-Fluc。1.包含荧光素酶基因的重组痘苗病毒穿梭质粒(pSCluc)的构建1. 1荧光素酶基因PCR扩增用I^rimeSTAR高保真酶(TAKARA，Cat =DROlOA)以包含萤光素酶基因的质粒 pLUCF (John Τ. Schiller，美国国家癌症研究所(National Cancer hstitute)，包含萤光素酶基因的质粒也可通过商购如从本元正阳基因技术有限公司获得)为模板对Luc基因 (非分泌型萤火虫荧光素酶基因，GenBank登记号为EU921841)进行PCR扩增。正向引物LVF(MlI酶切位点)GTCGACGCCACCATGGAAGATGCCAAAAAC反向引物LVR(SmaI酶切位点)CCCGGGTTACACGGCGATCTTGCCGCCC
权利要求
1.一种重组痘苗病毒天坛株，其包含萤火虫荧光素酶基因。
2.权利要求1的重组痘苗病毒天坛株，其中所述萤火虫荧光素酶基因是非分泌型萤火虫荧光素基因。
3.权利要求1或2的重组痘苗病毒天坛株，其是CCTCCV201135。
4.一种痘苗病毒中和抗体的检测方法，包括将权利要求1至3任一项的重组痘苗病毒天坛株与待测样品共同孵育； 接种痘苗病毒嗜性细胞；以及进行发光测定。
5.权利要求4的方法，其中所述待测样品为可能包含针对痘苗病毒的中和抗体的样PΡΠ O
6.权利要求5的方法，其中所述痘苗病毒为痘苗病毒天坛株、痘苗病毒安卡拉株或鼠痘病毒。
7.权利要求4至6任一项的方法，其中所述待测样品来自人、小鼠或兔的血清。
8.权利要求4至7任一项的方法，其中所述痘苗病毒嗜性细胞是Vero细胞。
9.权利要求4至8任一项的方法，其中在病毒感染痘苗病毒嗜性细胞后20小时至40 小时进行发光测定。
10.权利要求4至8任一项的方法，其中在病毒感染痘苗病毒嗜性细胞细胞后20小时至M小时进行发光测定。
11.权利要求4至10任一项的方法，其中病毒感染剂量为使测定的发光值结果的变异系数小于10%的剂量。
12.权利要求11的方法，其中病毒感染剂量为66-1800pfu/30000细胞。
13.权利要求12的方法，其中病毒感染剂量为400pfu/30000细胞。
14.权利要求4至13任一项的方法，其中Vero细胞接种量为使测定的发光值结果的变异系数小于10%的接种量。
15.权利要求14的方法，其中Vero细胞接种量以96孔板板孔计为10000-30000细胞/孔。
16.权利要求1至3任一项的重组痘苗病毒天坛株用于体外检测样品中痘苗病毒中和抗体的用途。
17.权利要求16的用途，其中所述痘苗病毒中和抗体为针对痘苗病毒天坛株、痘苗病毒安卡拉株或鼠痘病毒产生的抗体。
18.一种痘苗病毒中和抗体检测试剂盒，其包括权利要求1-3任一项的重组痘苗病毒天坛株。
19.权利要求18的试剂盒，其进一步包括萤光素酶发光反应检测试剂。
全文摘要
本发明涉及包含荧光素酶基因的重组痘苗病毒天坛株，还涉及痘苗病毒中和抗体检测方法以及包含荧光素酶基因的重组痘苗病毒天坛株用于痘苗病毒中和抗体检测的用途。
文档编号C12N7/01GK102391996SQ20111034897
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月7日 优先权日2011年11月7日
发明者刘强, 王佑春 申请人:中国食品药品检定研究院