专利名称：制备痘病毒的方法以及痘病毒组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及组合物和药物组合物，其包含痘病毒(poxvirus)，更特别的， 包含胞外包膜病毒。本发明还涉及制备痘病毒的方法和由此得到的痘病毒。 此外，本发明还涉及所述痘病毒和所述组合物在制备药物中的用途。
背景技术：
新威胁(禽流感、西尼罗病毒、炭疽等)的出现和基因疗法的发展，使 得制备和纯化痘病毒用于预防或治疗目的的需求增加。对于哺乳动物病毒 安卡拉(Ankara)(MVA)而言尤为如此。此痘病毒最初用于给免疫缺陷的病 患接种预防天花，现在还作为载体用于基因疗法。例如，MVA作为MUC l基因的载体，用于给病人接种，预防表达Mucl的肿瘤(Scholl等，2003， J Biomed Biotechnol.， 2003， 3， 194-201)。携带HPV抗原编码基因的MVA ， 还作为载体用于卵巢癌的治疗。
痘病毒是一群复杂的包膜病毒，主要以其罕见的形态、庞大的DNA 基因组和它们在细胞质复制的位置为特点。痘病毒科几个成员的基因组已 得到基因组图并测序，包括哥本哈根(Copenhagen)痘苗病毒( vaccinia virus )(VV)林(Goebel等人，19卯，Virol. 179, 247-266和517-563; Johnson 等人，1993, Virol. 196， 381-401)和改良的痘苗病毒安卡拉(MVA)林(Antoine 等人，1998， Virol. 244, 365-396)。 VV具有约192 kb的双链DNA基因組， 编码约200个蛋白，其中约100个参与病毒组装。MVA为高度弱化的痘苗 病毒林，由痘苗病毒的安卡拉林在鸡胚成纤维细胞中超过500次连续传代 产生(Mayr等人，1975， Infection 3， 6-16)。 MVA病毒保藏在法国微生物 保藏中心(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM))，保藏号N6。2 1-721。 MVA基因组完整序列的测定和与哥本哈根VV基因组 的对比，使得能够精确鉴定病毒基因组中发生的变化、定义造成片段化 ORF (开放阅读框)的7个缺失(I到VII)和大量突变(Antoine等人，1998， Virology 244， 365-396)。
包膜病毒进入胞内的天然途径涉及一系列步骤，包括暴露在病毒表面 的病毒多肽与细胞受体的结合，以及病毒和细胞膜之间的融合机制，使得 病毒基因组释放进入感染细胞的细胞质。
然而，在痘病毒的特殊情况中，由于两种形态特殊的传染性病毒形式 即称为胞内成熟病毒(IMV)和胞外包膜病毒(EEV)的两种病毒形式的存 在，准确的递送途径分析被复杂化了。 IMV形式的特质之一以包围病毒核 心的单层脂包膜为特征，且尽管可在感染细胞裂解后胞外释放，仍主要处 于感染细胞的胞质内。许多暴露在IMV脂包膜表面的天然多肽已被鉴定， 例如p14 kDa和p21 kDa蛋白，分别由A27L基因(Rodriguez等人，1985, J. Virol. 56， 482-488; Rodriguez和Estaban， 1987, J. Virol. 61 ， 3550-3554) 和A17L基因编码，以及由LtR、 A14L、 D8L、 A9L(Yeh等人，2000， J. Virol. 74， 9701-9711)、 El OR (Senkevich等人，2000， Virol. 5, 244-252) 和H3L基因编码的蛋白。与IMV相比，EEV形式具有额外的外层脂膜 包膜(双脂层)，由反面高尔基体网络潴泡得到。它相应于在感染细胞外释 放的病毒形式。EEV表面膜包膜具有IMV表面所没有的约10种蛋白，例 如编码的B5R、 A34R和血凝素(HA)基因产物。对于大多数痘苗林(例如哥 本p合根和MVA林)以及其它痘病毒，例如禽痘病毒(Boulanger等人，2000， J.Gen. Viro1.81, 675-687)，均描述过所述IMV和EEV形式的共存。
由于在环境中最为稳定，IMV在寄主对寄主的传染中起主导作用 (Hooper等人，Virology, 2003， 306， 181-185)。就此而言，IMV颗粒是 用于基因疗法所优选的栽体。有鉴于此，已有的痘病毒纯化方法只针对在 包装细胞中的病毒(也就是IMV),而脱落到培养液中的EEV颗粒则被丢 弃。由于与IMV表面相比，重组EEV表面具有更大量的各种多肽，已有 提案提出使用具有靶向感染特异性的重组EEV (US20050208074;Galmiche等人，J. Gen. Virol.， 1997, 78， 3019-3027)。然而，即使对于 此特殊用途，IMV颗粒仍为特别优选(US20050208074，第4页，29章)。
发明内容
令人惊讶地，申请人发现，无靶向感染特异性的EEV,治疗和/或预 防功效比IMV更好。
就此而言，本发明涉及痘病毒，优选重组痘病毒，其中所述痘病毒为 无靶向感染特异性的EEV。本发明还涉及组合物，优选包含无靼向感染特 异性的重组EEV的药物组合物。
如全篇申请中通用的那样，除非文中另有明确说明，术语"一个/一种" 使用时意指"至少一个/至少一种"、"至少第一个/至少第一种"、"一个或 多个/一种或多种"或"多个/多种，，所述及的成分或步骤。例如，术语"一 个/一种细胞"包括多个/多种细胞及其混合物。
术语"和/或"在此使用的任何时候，意义包括"和"、"或"以及"由 所述术语连接的要素的所有或任何其它组合"。
术语"约，，或"大约"，在此处使用时，指在给定数值或范围上下20% 以内，优选10%以内，更优选5%以内。
在此使用的术语"包含"意指所述产品、组合物和方法包括所提到的 成分或步骤，但不排除其它成分或步骤。当"基本上由……组成"用于定 义产品、组合物和方法时，应意指基本上排除其它成分或步骤。因此，基 本上由所提到的成分组成的组合物，不排除微量污染物和可药用载体。 "由......组成"应意指，排除超出微量的其他成分或步骤。
痘病毒科包含脊推动物痘病毒((0^to/7ax:v/r附)和昆虫痘病毒 (五wto附印欣Wr附)亚科的病毒。其中，本发明所述的痘病毒优选选自正痘病 毒属(O幼opwcWrws)、副痘病毒属(i^m/wxv/r附)、禽痘病毒属(jv,》OA:v/f"力、 山羊痘病毒属(C"戸》ovW尸附)、兔痘病毒属(丄c/70"]p狄Wr附)、猪痘病毒属 (S"^;axWrM力、软祝痘病毒属(Mo〃附"]paxv/r附)、亚》荅痘病毒属 (Ja似/7狄vi'r附)。根据更优选的实施方案，本发明的痘病毒为正痘病毒。正痘病毒优选为痘苗病毒，更优选为改良的痘苗病毒安卡拉(MVA)
如前所述，IMV颗粒包含病毒核心，其包括由单层脂包膜包围的病毒 基因组。术语"EEV"指由额外的双层脂包膜包围的IMV颗粒，其表面 暴露着细胞的和病毒的多肽。
此处使用的术语"靶向感染特异性，，指受控的感染特异性，其中与相 关的非改良痘病毒颗粒相比，痘病毒颗粒设计为对靼细胞显示新的或加强 的趋向性。结果为，不同于其相关的非改良痘病毒颗粒，具有靶向感染特 异性的痘病毒颗粒具有感染耙细胞的倾向，这意味着具有耙向感染特异性 的痘病毒颗粒感染其耙细胞(其表面展示抗配体抗体，为本发明痘病毒颗粒 表面展示的配体部分所识别)，与感染非靼细胞(其表面不展示这样的抗配 体抗体)相比更有效或更快速，而无耙向感染特异性的痘病毒颗粒感染耙细 胞，与感染非靶细胞相比，效率较低或相似。
术语"重组病毒"指包含插入在其基因组中的外源序列的病毒。在此 使用的外源序列指在亲本病毒中不天然存在的核酸。
在一个实施方案中，外源序列编码具有直接或间接细胞毒性功能的分 子。"直接或间接"细胞毒性，指由外源序列编码的分子，可自身为有毒的 (例如蓖麻毒素、肿瘤坏死因子、白介素-2、干扰素-Y、核糖核酸酶、脱氧 核糖核酸酶、假单胞菌外毒素A)或可代谢成为有毒的产物，或可作用于其 它物质形成有毒的产物。蓖麻毒素cDNA的序列在Lamb等人(Eur. J. Biochem.， 1985， 148， 265-270)中公开，在此通过引用并入本文中。
在本发明的优选实施方案中，外源序列为自杀基因。自杀基因编码的 蛋白能够将相对无毒的前药转化为有毒的药物。例如，胞嘧啶脱氨酶将5-氟胞嘧啶(5FC)转化为5-氟尿嘧啶(5FU) (Mullen等人(1922) PNAS 89， 33);单纯疱渗的胸苷激酶使细胞对于抗病毒剂更昔洛韦(GCV)或阿昔洛韦 (Moolten (1986) Cancer Res. 46， 5276; Ezzedine等人(1991) New Biol 3, 608)的处理敏感。可使用任何生物体，例如大肠杆菌CE "/Z)或酿酒酵母菌 (^ccAflf簡戸s <wev/sZ"e)的胞嘧咬脱氨酶。因此，在本发明更优选的实施方案中，基因编码的蛋白具有胞嘧咬脱
氨酶活性，更加优选编码的蛋白如专利申请WO2005007857和W09954481
中所说明。
前药/酶组合的其它例子包括Bagshawe等人(WO88/07378)公开的那 些，即多种不同的烷化剂和假单胞菌属物种的CPG2酶，和Epenetos和 Rowlinson-Busza (WO 91/11201)公开的那些，即生氰的前药(例如苦杏仁苷) 和植物衍生的p-葡糖苷酶。
在本发明的此实施方案中有用的酶包括但不限于碱性磷酸酶，用于 将含磷酸盐的前药转化为游离药物；芳基硫酸酯酶，用于将含硫酸盐的前 药转化为游离药物；蛋白酶，例如沙雷菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆 菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B和L)，用于将含肽 的前药转化为游离药物；D-丙氨酰羧肽酶，用于转化含D-氨基酸取代基的 前药；糖类切割酶，例如p-半乳糖苷酶和神经氨酸酶，用于将糖基化的前 药转化为游离药物；p-内酰胺酶，用于将p-内酰胺类^f汙生的药物转化为游 离药物；以及青霉素酰胺酶，例如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶，分
别用于将药物胺氮的苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生物转化为游离药物。或者， 具有酶活性的抗体，本领域也称为抗体酶，可用于将本发明的前药转化为 游离活性药(MasseyR.等人,Nature, 1987， 328， 457-458)。
相似地，前药包括，但不限于上列前药，例如，含磷酸盐的前药、含 硫代磷酸盐的前药、含硫酸盐的前药、含肽的前药、D-氨基酸修饰的前药、 糖基化的前药、含P-内酰胺的前药、含任选取代的苯氧乙酰胺的前药或含 任选取代的苯乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶和其它可转化的5-氟尿苷前药。 可衍生为前药形式，用于本发明的细胞毒性药物的例子包括，但不限于， 依托泊甙、替尼泊甙、阿霉素、道诺霉素、洋红霉素、氨基喋呤、更生霉 素、丝裂霉素、顺铂和顺铂类似物、博莱霉素、埃斯波霉素(esperamicin)(见 例如US4，675，187)、 5-氟尿嘧啶、美法仑和其它相关的氮芥。
在另外的实施方案中，外源基因编码能切割靶向RNA或DNA的核酶。 待切割的靶向RNA或DNA可为细胞功能所必需的RNA或DNA，其切割导致细胞死亡；或者待切割的RNA或DNA可为编码不期望的蛋白、例如 癌基因产物的RNA或DNA，该RNA或DNA的切割可防止细胞癌变。
在又一实施方案中，外源基因编码反义RNA。 "反义RNA"指RNA分子，其与编码蛋白的mRNA分子杂交并干 扰其表达，或与细胞中的另一 RNA分子如mRNA前体或tRNA或rRNA 杂交，或与基因杂交并干扰其表达。
在本发明的另一实施方案中，外源序列代替靶细胞中缺陷基因的功能。 哺乳动物、包括人类的几千种遗传疾病是由缺陷基因所导致。这样的遗传 疾病的例子包括嚢性纤维化，已知为CFTR基因中的突变；杜兴氏肌营养 不良，已知为肌营养不良蛋白基因的突变；镰刀细胞病，已知为HbA基 因的突变。许多类型的癌症为由缺陷基因导致，特别是原癌基因，和经历 突变的肿瘤抑制基因。
原癌基因的例子为ras、 src、 bcl等；肿瘤抑制基因的例子为p53和Rb。
在本发明另外的实施方案中，外源序列编码肿瘤相关抗原(TAA)。 TAA 指，与相同组织类型的非肿瘤细胞相比，在肺瘤细胞中检测到的频率和密 度较高的分子。TAA的例子包括但不限于CEA、 MART-1、 MAGE-l、 MAGE-3、 GP画IOO、 MUC画1、 MUC画2、点突变的ras癌基因、正常或点突 变的p53、过表达的p53、 CA画125、 PSA、 C國erb/B2、 BRCAI、 BRCAII、 PSMA、酪氨酸酶、TRP-1、 TRP-2、 NY-ESO誦l、 TAG72、 KSA、 HER-2/neu、 bcr-abl、 pax3-fkhr、 ews-fli-l、存活素和LRP。根据更优选的实施方案， TAA为MUC1。
重组痘病毒可包含不止一个外源序列，且各外源序列可编码不止一个 分子。例如，在同一重组痘病毒中联合编码TAA的外源序列和与编码细 胞因子的外源序列可十分有用。
在本发明的另一实施方案中，外源基因编码抗原。此处使用的"抗原" 指可被抗体结合的配体；抗原本身不需为免疫原性。
优选抗原衍生自病毒，例如HIV-1，(例如gp 120或gp 160)，任何猫免疫缺陷病毒、人或动物的疱療病毒，例如gD或其衍生物或即早期蛋白，例如ICP27，来自HSV1或HSV2，巨细胞病毒(例如gB或其衍生物)、水痘带状疱疹病毒(例如gpl、 II或III),或衍生自肝炎病毒，例如乙型肝炎病毒，例如乙型肝炎表面抗原或其衍生物、曱型肝炎病毒、丙型肝炎病毒(优选来自lb基因型ja林的非结构蛋白)和戊型肝炎病毒，或来自其它病毒病原体，例如呼吸道合胞病毒、人乳头瘤病毒(优选来自HPV16林的E6和E7蛋白)或流感病毒，或衍生自细菌性病原体，例如沙门氏菌属(Sfl/附o"e〃")、奈瑟菌属(7Ve/weWfl)、疏螺旋体属(丑o/Te"fl)(例如OspA或OspB或其衍生物)，或衣原体属(C似"otjW'"),或博德特菌属(^^^&//")，例如P.69、 PT和FHA，或衍生自寄生虫，例如痴原虫属(尸/flw/m^/"附)或弓形虫属(7i ;co/7/tf5"/mi)。
在本发明特别优选的实施方案中，重组痘病毒编码与TG4010(Rochlitz等人，J Gene Med. 2003年8月；5(8): 690画9)和TG4001 (Liu等人，ProcNatlAcadSciUSA.2004年10月5日；101增刊2: 14567-71)相同的蛋白。在本发明另一特别优选的实施方案中，本发明的痘病毒具有与TG4010或与TG4001的序列同源性高于90%的序列。
最好重组痘病毒还包含表达外源序列所必需的元件。表达所必需的元件包含使得核苷酸序列能转录成RNA、 mRNA能翻译为多肽的一套元件，特别是在待用本发明的重组痘病毒感染的细胞中有效的启动子序列和/或调控序列，和任选的使得所述多肽能在细胞表面分泌或表达所必需的序列。这些元件可为诱导型或组成型的。当然，启动子经改造以适合所选的重组痘病毒和宿主细胞。作为举例说明，可提及痘苗病毒启动子p^5K、 pH5R、pKlL、 p28、 pll或所述启动子的组合。文献提供了大量关于这样的启动子序列的信息。
此外，必需的元件还可包括改善外源序列在宿主细胞的表达或其维持的额外元件。可特别提到内含子序列(WO 94/29471)、分泌信号序列、核定位系列、IRES类型的翻译再起始内部位点、结束转录的polyA序列。
已有的痘病毒制备方法包括在细胞系(例如HelaS3)、胚蛋或鸡胚成纤维细胞中复制病毒。病毒复制后，弃去培养液，裂解细胞，由细胞中释放
的痘病毒通过蔗糖垫层离心纯化(Kotwal和Abraham; Poxvirus growth,Purification and tittering in Vaccinia Virus and Poxvirology, 2004，101-108， Humana Press Inc., Totowa; NJ; USA)。用这些方法，纯化的组合物中不含EEV。
然而，已有的病毒制备方法并不令人满意。首先，这些方法包括对来自动物的化合物的使用，例如血清和酶。制备方法中使用来自动物的化合物有若干缺点。例如，这些化合物的化学组成即使来自一个制造商，在不同批次中仍可有不同。化合物还可能被传染因子(例如，支原体和病毒)污染，当细胞培养液制剂中使用这些污染的补充物时，可严重损害培养细胞的健康。此外，使用培养液的血清补充物会导致从培养液中纯化期望的物质时，由于血清或提取蛋白非特异的共纯化而变得复杂化并增加成本。最重要的是，使用不明确的化合物可能会阻碍医疗机构批准由此方法得到的药物组合物。
本发明还提供了制备本发明所述的痘病毒颗粒的方法，包括步骤
a) 制备包装细胞的培养物，
b) 感染所述细胞培养物，
c) 培养被感染细胞一段适当时间，
d) 回收由培养上清和/或包装细胞中产生的痘病毒颗粒，和
e) 任选地纯化回收的痘病毒颗粒。本发明所述的方法优选不含动物产品。本发明所述的方法还可用于制备野生型和/或弱化的痘病毒.此处使用的术语"弱化的痘病毒"指经改良的任何痘病毒，其对预期
受试者的致病性充分减弱。优选痘病毒弱化到从临床角度来看是不致病的，也就是说，接触痘病毒的受试者相对于对照受试者，病理水平没有统计学上显著的增加。根据本发明的优选实施方案，弱化的病毒为弱化的痘苗病毒，例如MVA。
术语"感染"指病毒核酸向细胞的转移，在所述细胞中发生病毒核酸的复制，病毒蛋白的合成，或新病毒颗粒的装配。
此处使用的术语"包装细胞"指能被待制备的痘病毒感染的细胞。包装细胞可为原代细胞、重组细胞和/或细胞系。例如，可使用重组细胞，其含有重组病毒载体中缺少的、制备重组病毒必需的元件。
在本发明的一个实施方案中，包装细胞为永生的禽细胞。
在本发明的一个实施方案中，包装细胞为DF1细胞(US5，879，924),其为自发永生化的鸡细胞系，来自10天龄东兰辛系卵(East Lansing Line(ELL-O) egg)。
永生的禽细胞可通过对胚胎干细胞进行渐进性断绝生长因子和滋养层，由此保持其生长特征和未分化千细胞拥有的无限寿命的特性)而得到。例如，Ebx鸡细胞系(WO2005007840)由此方法得到。
根据优选的实施方案，还可使用鸭胚永久细胞系。例如，命名为DEC99的细胞系(Ivanov等人，Experimental Pathology And Parasitology,4/2000 Bulgarian Academy of Sciences)已经培养超过140次连续传代，对禽类不致癌。DEC 99细胞系为标准细胞培养系统，已用于科研，可应生物技术的需要而使用。根据更优选的实施方案，包装细胞为通过专利申请EP06360001.9 7>开的方法获得的细胞系。
根据另一优选实施方案，本发明所述方法中使用的包装细胞为鸡胚成纤维细胞(CEF)。用于制备病毒的CEF的制备和使用为本领域技术人员熟知。
CEF优选提取自无特定病原体(SPF)卵。SPF卵为商业途径可得，例如从查尔斯河实验室(Charles River Laboratories)(威明顿，麻省，美国)。所述卵优选大于9天龄，更优选10到14天龄之间，而更优选l2天龄。
优选胚胎提取之前消毒过的卵。现有技术中已有许多用于卵消毒的方法和产品。特别优选在甲醛溶液中孵育(例如2%甲醛溶液，l分钟)，而后
以70。/。乙醇沖洗。
然后分离纯化胚胎细胞。根据本发明的优选实施方案，细胞经酶消化步骤，破化细胞间基质。为此，使用能够消化细胞间基质的酶特别有益。这样的酶可从包括但不限于胰蛋白酶、胶原酶、链霉蛋白酶、分散酶、 透明质酸酶和神经氨酸酶组成的组中选择。此酶可单独或组合使用。在本 发明特别优选的实施方案中，组合使用分散酶和胰蛋白酶(例如TrypLE， 选自GibcoTM)。本领域技术人员能确定令细胞有效分离的酶浓度、孵育的 温度和时间。
根据优选实施方案，本发明所述的方法不含动物产品(除了包装细胞)。 就此而言，用于制备CEF的酶优选来源于重组。此处使用的"动物产品" 指活体动物细胞中产生或由其产生的任何化合物或化合物的集合。
CEF的制备还可包括过滤步骤和/或离心步骤以除去污染物。 原代CEF细胞可直接使用，或经过再一次细胞传代作为次代CEF细 胞使用。
本领域技术人员能够选择用于制备特定病毒的最适合的细胞。根据优 选实施方案，本发明所述的方法包含使用CEF或根据EP06360001.9所述 的细胞来制备MVA。
在适合的细胞培养液中培养本发明所述方法中使用的包装细胞。在本 发明所述的方法中，可使用不止一种培养液。例如，第一种培养液可在制 备包装细胞(也就是在步骤a)期间使用，第二种细胞培养液可用于感染(也 就是在步骤c和/或步骤b)。
根据优选实施方案，本发明所述的细胞培养液不含动物产品。
许多不含动物产品的培养基已有说明，其中一些由商业途径可得。例
如293 SFM II; 293-F细胞，适应SFM; 293-H细胞，适应SFM; 293fectinTM 转染试剂；CD293AGTTM; CD 293培养基；FreeStyleTM 293表达系统； FreeStyleTM 293培养基；FreeStyleTM 293-F细胞，适应SFM;腺病毒表达 培养基(AEM)， PER,C6⑧细胞生长培养基；CD293AGTTM; CD 293培养 基；COS-7L细胞，适应SFM; EPISERF⑧培养基；OptiPro SFM; VP-SFM; VP-SFM AGTTM (均可购自英骏公司(invitrogen))，可在本发明 所述的方法中用作细胞培养基。
当包装细胞为CEF时，特别优选VP-SFM (英骏公司(invitrogen))用于步骤a，伊格尔基础培养基(Basal Medium Eagle (英骏公司(invitrogen))) 用于步骤b和c。
在包装细胞为CEF的具体实施方案中，细胞培养液以0.5到1.5之间， 优选1.1到1.3之间，更优选约1.2胚胎/1细胞培养液接种。在此实施方案 中，CEF在感染前优选培养1到5天之间，更优选1到2天之间，而更优 选2天。
在要制备的痘病毒为MVA的具体实施方案中，在细胞培养瓶中引入 病毒，MOI优选在0.001到0.1之间，更优选在0.03到0.07之间，而更优 选约0.05。
根据本发明的优选实施方案，在步骤c中，包装细胞在低于37'C的温 度培养，优选在30。C到36.5。C之间，或在约32。C到约36。C之间，更优选 在33。C到35'C之间，最优选在34。C。
根据本发明优选的实施方案，步骤c持续一到六天之间，更优选在二 到四天之间，最优选约72小时。
感染步骤之后，收集用于培养包装细胞的细胞培养液。所述细胞培养 液包含感染的包装细胞脱落的EEV颗粒。根据优选实施方案，感染步骤 之后，收集细胞培养液和包装细胞。细胞培养液和包装细胞可合并或分别 收集。
为了回收包装细胞中的痘病毒，本发明所述的方法可包括破坏包装细 胞膜的步骤。该步骤使得痘病毒由包装细胞中释放出来。包装细胞膜的破 坏可由本领域技术人员熟知的多种不同的技术诱导。这些技术包括但不限 于超声处理、冷冻/解冻、低渗裂解和微射流。
根据本发明的优选实施方案，用高速匀浆器破坏包装细胞膜。高速匀
草原(EastLongmeadow)，美国))或Ika-Labotechnik公司(斯陶芬，德国)。 根据特别优选的实施方案，所述高速匀浆器为SILVERSON L4R。
当包装细胞和细胞培养液合并在一起，不用冷冻/解冻诱导破坏包装细 胞膜，因为此技术会导致EEV颗粒的破坏(lchihashi y.等人，1996， virology,217(2)， 478-85)。
根据优选实施方案，步骤d)还包含澄清步骤，以除去细胞碎片。根 据本发明更优选的实施方案，所述澄清步骤为深层过滤步骤。
深层过滤包括但不限于使用 一种或多种由商业途径可得的产品 CUNO^^司AP系列深层过滤器(例子包括APOl)， CUNO^^司CP系列深 层过滤器(例子包括CPIO、 CP30、 CP50、 CP60、 CP70、 CP90)， CUNO 公司HP系列深层过滤器(例子包括HPIO、 HP30、 HP50、 HP60、 HP70、 HP卯)，CUNO^^司Calif.系列深层过滤器(例子包括CAIO、 CA30、 CA50、 CA60、 CA70、 CA90), CUNO公司SP系列深层过滤器(例子包括SPIO、 SP30、 SP50、 SP60、 SP70、 SP卯)，CUNO Delipid和Delipid Plus过滤器， 密理博(MilliporeCorporation)公司CE系列深层过滤器(例子包括CE15、 CE20、 CE25、 CE30、 CE35、 CE40、 CE45、 CE50、 CE70、 CE75)'密 理博公司DE系列深层过滤器(例子包括DE25、DE30、DE35、DE40、DE45、 DE50、 DE55、 DE560、 DE65、 DE70、 DE75)，密理博公司HC过滤器(例 子包括Al HC、 B1HC、 COHC)， CUNO Polynet过滤器(例子包括 Polynet-PB)，密理博Clarigard和Polygard过滤器，CUNO Life Assure 过滤器，ManCel Associates深层过滤器(例子包括但不限于PR 12 UP、 PR12、 PR5UP)，以及颇尔(PALL)或赛茨申克(SeitzSchenk)公司过滤器。 为改善可得的深层过滤单元的澄清能力，可偶联两个或多个孔径渐减的单 元。在此实施方案中，待澄清的混合物通过第一个深层过滤单元，留下最 大的污染物，接着通过第二个深层过滤部件。根据本发明更优选的实施方 案，孑L径8 nm的sartopure (赛多利斯公司，sartorius)和孔径5 的 sartopure②偶联进行深层过滤步骤。
根据优选实施方案，本发明所述的方法还包括浓缩步骤。更优选所述 浓缩步骤能除去由前述步骤得到的混合物中的蛋白。
根据本发明更优选的实施方案，所述浓缩步骤为微孔过滤步骤。微孔 过滤为压力驱动的膜过滤方法，以浓缩和纯化大分子。更具体地，溶液经 过半透性膜，其孔径选择为将大颗粒(病毒)拒留在截留物中，允许小分子(例如蛋白质)通过膜进入渗透物。微孔过滤减少提取溶液的体积。
根据本发明的优选实施方案，微孔过滤步骤之后进行透析过滤步骤。 这两个步骤可方便地由同一滤膜完成。透析过滤是微孔过滤的改良，涉及 用溶液稀释截留物，以降低截留物中杂质的浓度。截留物的稀释可使更多 杂质从截留物中洗除。应理解透析过滤可以成批才莫式、半连续模式或连续 模式进行。使用透析过滤步骤可方便地更换包含病毒的緩冲液。例如，可 用于将纯化过程中使用的緩冲液交换为可药用緩冲液。
孩i孔过滤和/或透析过滤步骤中使用的滤膜孔径优选在0.01到0.15 nm 之间，更优选约0.1 jim。
核酸可能附着于来自细胞的颗粒，例如病毒。就此而言，本发明所述 的方法可任选地还包括除去溶液中的污染性核酸的步骤。为此目的，可使 用核酸酶。例示性的核酸酶包括Benzonase核酸酶或任何其它本领域中普 遍使用的DNase或RNase，其中，特别优选Benzonase核酸酶。
Benzonase核酸酶降解核酸，而没有蛋白水解活性。Benzonase核酸酶 通过水解特定核苷酸之间的内部磷酸二酯键，快速分解核酸。经完全降解， 溶液中所有的游离核酸分解为长度为2到4个碱基的寡核苷酸。
Benzonase核酸酶使用的终浓度可在50到400 U/ml之间，优选在100 到300 U/ml之间，更优选在150到250 U/ml之间。Benzonase核酸酶处理 可持续1到4小时之间，更优选在1.5到2.5小时之间。
然而，使用前述的深层过滤、微孔过滤和透析过滤时，核酸酶的使用， 更特别地，Benzonase核酸酶的使用不是必需的。就此而言，本发明还涉 及制备痘病毒的方法，其中没有使用核酸酶，更特别地，没有使用 Benzoimsc核酸酶。
至此阶段，由前述方法得到的痘病毒为充分纯化的。可以期望改变含 有病毒的緩沖液。例如，将纯化过程中使用緩冲液交换为可药用緩沖液可 为有益的。许多可用于改变緩冲液的方法为本领域技术人员公知。其中， 特别优选切线过滤。
切线过滤为这样的过滤技术，其中，待过滤的悬液沿与过滤表面平行
16的方向高速移动，以制造悬液紊流，防止滤饼的形成和频繁的过滤器阻塞。 悬液平行于过滤表面高速流动时，溶质由于压力差通过过滤表面的孑L， 并不断被除去。过滤表面应能在机械上抵挡截留物层(也就是悬液浓缩层) 和渗透物层(不含悬浮颗粒的澄清滤过液)之间的压力差。
本发明所述的方法包括的多种不同的步骤，可在不同的工作地点和/ 或在不同时间执行。例如，感染包装细胞和纯化痘病毒可在不同工作地点 进行。而且，包装细胞和/或细胞培养液在純化前，可依所需长久储存(例
如于-80。C)。
本发明还涉及由前述方法获得的组合物，以及包含本发明痘病毒的组 合物。
优选在本发明的组合物中，所述组合物所含有的痘病毒中有多于1 %， 优选多于5%，而更优选多于10%，最优选至少20%为EEV。
根据一个优选实施方案，本发明所述的组合物滴度为至少105，优选 至少106，更优选至少107，而更优选至少108pfu/ml。
根据另一优选实施方案，本发明所述的组合物滴度至少103，优选104, 最优选至少3 x 105 pfu/ng蛋白。
本发明还涉及包含由本发明方法获得的痘病毒和/或本发明所述组合 物的药物组合物。此处使用的"药物组合物"指包含可药用载体的组合物。
这样的载体优选为等渗、低渗或轻微高渗，且具有相对低的离子强度， 例如蔗糖溶液。此外，这样的载体可包含任何溶剂，或水性或部分水性的 液体，例如无热原无菌水。此外，药物组合物的pH经调整和緩冲，以满 足在体内使用的需求。药物组合物还可包括可药用的稀释剂、佐剂或赋形 剂，以及增溶剂、稳定剂和防腐剂。对于可注射给药，优选水性、非水性 或等渗溶液剂型。可以为单次剂量或多次剂量，以液体或可在使用时以适 当稀释剂重构的干燥(散剂、冻干粉等)形式提供。
本发明还涉及由本发明所述方法获得的痘病毒和组合物。
本发明还涉及用本发明所述方法制备病毒、组合物和/或药物组合物的 用途。本发明还涉及本发明所述的痘病毒、组合物和/或药物组合物在制备药 物中的用途。
根据优选实施方案，本发明所述的药物用于癌症的治疗或预防。 在可设想的应用中，可提到乳腺癌、子宫癌(特别是由乳头瘤病毒诱导 的)、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、 喉癌、中枢神经系统肿瘤(特别是胶质瘤)和血癌(淋巴瘤、白血病等)。
本发明所述的组合物可依常规制备，通过局部、胃肠外或消化道途径 给药。可设想的给药途径有很多。可提到的有，例如，胃内、皮下、心内、 肌内、静脉内、腹膜内、瘤内、鼻内、肺内或气管内途径。对于最后三种 实施方案，通过气雾剂或滴注给药较有利。给药可为单次剂量，或在一定 时间间隔后重复一次或几次。给药的适宜途径和剂量作为多种不同参数的 函数而有所变化，例如，依据个体、待治疗的疾病或待转移的目的基因而 定。
根据第 一种可能性，药物可直接在体内给药(例如通过静脉注射进入可 及的肿瘤，或在其外围，皮下注射进行治疗或预防接种)。还可以采用离体
方法包括收集患者细胞(骨髓干细胞、外周血淋巴细胞、肌肉细胞等)， 依据现有技术体外转染或感染这些细胞，再重新投放给患者。
适当的时候且不超出本发明范围的情况下，此外还可设想，将本发明 药物组合物或组合物中所含的多种成分，通过不同途径进行同时或序贯给 药。
根据本发明的有利实施方案，所述治疗用途或治疗方法与患者通过外 科手术(部分或完全切除肿瘤)、放射疗法或化学疗法的第二治疗相组合。 在此具体情况下，本发明所述的治疗在所迷第二治疗之前、伴随或之后应 用。优选，此治疗在所述笫二治疗之后应用。
根据另一优选实施方案，本发明所述的药物用于传染病的治疗或预防， 其中传染病特别是病毒起源的，由乙型或丙型肝炎病毒、HIV、疱疹、逆 转录病毒等诱导。
如下实施例旨在举例说明本发明的多个主题，因此在性质上并非是限制性的。
附图
的简短说明
表l : C57BL/6小鼠的存活率，其体内已植入表达HPV 16 E6和E7 和C-Ha-ras癌基因的TC1细胞。用包含编码HPV抗原的IMV和EEV、 编码HPV抗原的IMV或不编码抗原的IMV的组合物处理不同组别的小 鼠。
表2:植入表达HPV 16 E6和E7和C-Ha-ras癌基因的TC1细胞后， 没有产生肺瘤的C57BL/6小鼠的百分比。用包含编码HPV抗原的IMV 和EEV、编码HPV抗原的IMV或不表达抗原的IMV的组合物处理不同 组别的小鼠。
表3: 植入表达MUC1的TC1细胞的C57BL/6小鼠的存活率。用包 含编码MUC1和IL2的IMV和EEV、编码MUC1和IL2的IMV或不表 达抗原的IMV的组合物处理不同组别的小鼠。
实施例
1.制备包含IMV和EEV的组合物。
A. 制备CEF。
66个SPF卵在2o/。甲醛溶液中孵育60秒。用70%乙醇沖洗后，打开 卵，取出并切开胚胎。得到的组织而后用分散酶(Ul/ml)和triple select (Ul/ml)在36.5。C消化120分钟。
过滤混合物以除去未消化的组织，通过离心收集CEF(2300 rpm， 1S 分钟)。
B. CEF培养和感染。
在55 1 VP-SFM (英骏公司，invitrogen)中，在36.5 。C孵育CEF 2天。 弃去细胞培养液，在551伊格尔基础培养液(英骏公司，invitrogen)中加入 痘病毒(0.05 MOI)。而后孵育感染的包装细胞三天。c.痘病毒纯化。
收集包装细胞和细胞培养液。混合物而后在Silverson⑥L4R高速匀浆 器中匀浆15分钟。得到的混合物而后用偶联使用的sartopure 8 jim (赛多 利斯^>司，sartorius)和sartopure 5 jim通过^果层过滤澄清，；充速11/min。
混合物进一步通过0.1 jim Prostak微孔过滤组件(目录号 PSWAG021 ，密理博)浓缩18倍。
痘病毒组合物在同样的组件中以期望的可药用载体进行透析过滤。
2.包含EEV和IMV的组合物，与只包含IMV的组合物之间疗效的比较。 A.对荷有HPV抗原表达肿瘤的小鼠的治疗。 吝戎琳沟建琳的命^和/f卓说效
TG4001: MVA载体，携带有编码HPV蛋白E6和E7 (在启动子p7.5 的控制下)和IL2(在启动子pH5R的控制下)的序列。测试两批， 一批包含 IMV和EEV (按之前公开的制备)， 一批只包含IMV。
N33:空载体MVA，既不表达HPV蛋白E6和E7，也不表达IL2，
用作阴性对照。 动#淑
此研究中全部使用6到8周龄的C57BI/6雌性小鼠。这些小鼠从查尔 斯河实验室(Charles River，鲁昂，法国)获得。
说银动物到达时六周龄。实验开始时，不到8周龄。
i^裙动物关在一个隔离的房间中，配有空调，每小时至少ll次气体 交换。温度、相对湿度的范围分别是18。C到22。C和40到70%。照明受控， 自动进行12小时光照和12小时黑暗的循环。
通过常规的环境控制来控制无特定病原体的状态。
欢#:研究过程中，动物可随意进食无菌饮食D04类(UAR， Epinay sur Orge，法国)。水通过瓶子无限供应。
环裙it应和邀^摆淨所有动物到达时均给予临床健康检查。为保证其适合研究，实验开始之前，在无特定病原体(SPF)动物设施中适应环境一 到两周之间。
y^膚勿^挣在和炎^疹伴
TC1系来自用HPV-16 E6和E7、和c-Ha-ras癌基因共转化的C57BI/6 小鼠的原代肺上皮细胞。细胞生长在DMEM中，其中有谷氨酰胺(2mM)、 胎牛血清(10%)、非必需氨基酸(O.l mM)、丙酮酸钠(l mM)、卩-巯基乙醇(36 HM)、潮霉素(0.2 mg/ml)和G418 (0.5 mg/ml)。解冻后，细胞传代两次，最 后一次传代在细胞注射两天前进行。
实验的第一天，在小鼠侧腹皮下注射TC1细胞，剂量为2.0 E+05细
胞/小鼠。
细胞注射7天之后，以5.0 E+05 pfu/50nl/小鼠将测试批次(TG4001 IMV/EEV或只有IMV)、 MVATGN33 (空载体)注入小鼠。每个测试批次使 用20只小鼠。
在同侧腹，但距细胞注射点一定距离处进行皮下病毒注射，间隔7天 进行3次。
细胞注射90天后用卡尺监测肿瘤生长。当肿瘤大小大于直径25 mm， 或即使肿瘤较小但小鼠表现出痛苦时，出于伦理原因将小鼠处死。 记录存活的小鼠。 潜果
所有用编码HPV抗原的MVA载体处理的组，存活率均比用空MVA 载体处理的组更高。用包含EEV和IMV的组合物处理的小鼠，存活率比 用只包含IMV的组合物处理的小鼠更高。此外，用包含EEV和IMV的 组合物处理的小鼠，注射77天后有35。/。没有肿瘤，相比之下，用只包含 IMV的组合物处理的小鼠中只有10%。B.对荷有MUC1表达肺瘤的小鼠的治疗。 吝我##建琳^命^:和谬卓说效
TG4010: MVA载体，携带有编码MUC1蛋白(在启动子p7.5的控制 下)和IL2 (在启动子pH5R的控制下)的序列。测试两批， 一批包含IMV 和EEV， 一批只包含IMV。
空载体MVATGN33，既不表达HPV蛋白E6和E7，也不表达IL2，
用作阴性对照。
篇#1^#动參,發系鍵
游神、祷^和供才此研究中全部使用6到8周龄的C57BI/6雌性小 鼠。这些小鼠从查尔斯河实验室(CharlesRiver，鲁昂，法国)获得。
说效动物到达时六周龄。实验开始时，不到8周龄。
i T裙动物关在一个隔离的房间中，配有空调，每小时至少ll次气 体交换。温度、相对湿度的范围分别是18'C到22'C和40到70%。照明受 控，自动进行12小时光照和12小时黑暗的循环。
动物以IO只为一组关在笼子中，笼子尺寸43 X 27 X 15 cm,地板面 积1161 cm2。
欢贪研究过程中，动物可随意进食无菌饮食RM类(SDS， Le Bord，Haut de Vigny ，法国)。
水通过瓶子无限供应。
饮食或水中不存在可能会干扰本研究目标实现水平的污染物。 环裙il应和趁^程,所有动物到达时均给予临床健康检查。为保证
其适合研究，实验开始之前，在无特定病原体(SPF)动物设施中适应环境一
到两周之间。
^^细應辨农和炎^杀伴
RMA肿瘤系来自C57BI/6淋巴瘤。RMA-MUC1细胞由用含有MUC1 基因a的表达质粒转染后得到。细胞生长在DMEM中，其中有谷氨酰胺 (2 mM)、胎牛血清(10%)、非必需氨基酸(O.l mM)、丙酮酸钠(l mM)、卩-巯基乙醇(36pM)和潮霉素(550 ng/ml)。解冻后，细胞传代两次，最后一次传代在注射前一天进行。
小鼠用1.0 x 104或3.0 x 104 pfu/小鼠TG4010病毒免疫，MVATGN33 使用3.0x 1()4pfu/小鼠。
每个测试批次使用20只小鼠。 病毒免疫在侧腹皮下注射，间隔14天进行3次。
最后一次免疫两周后，在同侧腹，但距病毒注射点一定距离处对小鼠 进行肿瘤攻击，使用1.0 E+06 RMA-MUC1活细胞/50 pl/小鼠。
肿瘤攻击六周后用卡尺监测肿瘤生长。当肿瘤大小大于直径25 mm, 或即使肿瘤较小但小鼠表现出痛苦时，出于伦理原因将小鼠处死。 记录存活的小鼠。 每个剂量使用20只小鼠评价。 潜果
所有用编码MUC 1抗原的MVA载体处理的组，与用空MVA载体处 理的组相比，肿瘤生长更少，存活率更高。用包含EEV和IMV的组合物 处理的小鼠，肿瘤生长比用只包含IMV的组合物处理的小鼠更少。
权利要求
1. 一种重组痘病毒，其中所述重组痘病毒为无靶向感染特异性的EEV。
2. 权利要求l所述的重组痘病毒，其中所述痘病毒选自正痘病毒属、 副痘病毒属、禽痘病毒属、山羊痘病毒属、兔痘病毒属、猪痘病毒属、软 祝痘病毒属、亚塔痘病毒属。
3. 权利要求2所述的重组痘病毒，其中所述痘病毒为正痘病毒。
4. 权利要求3所述的重组痘病毒，其中所述正痘病毒为痘苗病毒。
5. 权利要求3所述的重组痘病毒，其中所述正痘病毒为改良的痘苗病 毒安卡拉。
6. 权利要求1到5中任一项所述的重组痘病毒，其中所述痘病毒包含 外源序列，其编码具有直接或间接细胞毒性功能的分子。
7. 权利要求6所述的重组痘病毒，其中所述外源序列为自杀基因。
8. 权利要求1到5中任一项所述的重组痘病毒，其中所述痘病毒包含 外源序列，其编码肿瘤相关抗原(TAA)。
9. 权利要求1到5中任一项所述的重组痘病毒，其中所述痘病毒包含 编码抗原的外源序列。
10. 权利要求9所述的重组痘病毒，其中所述抗原来自病毒。
11. 权利要求1到10中任一项所述的重组痘病毒，其中所述痘病毒包 含外源序列表达所必需的元件。
12. —种制备野生型、弱化的和/或无靶向感染特异性的重组痘病毒的 方法，包括步骤a) 制备包装细胞的培养物，b) 感染所述细胞培养物，c) 培养被感染细胞一段适当时间，d) 回收由培养上清和/或包装细胞中产生的痘病毒颗粒，和
13. 权利要求12所述的方法，其中所述方法不用动物产品。
14. 权利要求12或13所述的方法，其中所迷包装细胞为CEF。
15. 权利要求12到14中任一项所述的方法，其中步骤c)持续二到四天。
16. 权利要求12到15中任一项所述的方法，其中步骤d包括用高速 匀浆器破坏包装细胞。
17. 权利要求12到16中任一项所述的方法，其中所述方法还包括对 由步骤d得到的混合物进行澄清的步骤，以除去细胞碎片。
18. 权利要求17所述的方法，其中所述澄清步骤为深层过滤步骤。
19. 权利要求17或18所述的方法，其中所述方法还包括浓缩步骤。
20. 权利要求19所述的方法，其中所述浓缩步骤为微孔过滤步骤。
21. 权利要求19所述的方法，其中所述方法还包括透析过滤步骤。
22. 权利要求12到21中任一项所述的方法，其中不使用核酸酶，更 特别地，不使用Benzonase核酸酶。
23. —种组合物，其包含权利要求1到11中任一项所述的重组痘病毒， 或由权利要求12到22中任一项所述的方法获得的重组痘病毒。
24. 权利要求23所述的组合物，其中所述组合物中包含的痘病毒中， EEV多于1。/。，优选多于5。/。，而更优选多于10%，最优选至少20%。
25. 权利要求23或24所述的组合物，滴度为至少105，优选至少106， 更优选至少107，而更优选至少108pfu/ml。
26. 权利要求23到25中任一项所述的组合物，滴度为至少103，优选 104,最优选至少3x 1()Spfu/ng蛋白。
27. 权利要求1到11中任一项所述的重组痘病毒、权利要求23到26 中任一项所述的组合物在制备药物中的用途。
28. 权利要求27所述的用途，用于癌症的治疗或预防。
29. 权利要求27所述的用途，用于传染病的治疗或预防。
全文摘要
本发明涉及包含痘病毒，更特别地，包含胞外包膜病毒的组合物和药物组合物。本发明还涉及制备痘病毒的方法和由此得到的痘病毒。此外，本发明还涉及所述痘病毒和所述组合物在制备药物中的用途。
文档编号C12N15/863GK101460627SQ200780020521
公开日2009年6月17日 申请日期2007年6月15日 优先权日2006年6月20日
发明者C·希恩, D·马拉梅, Y·克尔迪尔 申请人:特朗斯吉有限公司