专利名称：重组昆虫痘病毒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生产重组昆虫痘病毒(EPV)，特别是生产能表达异源DNA序列的重组棉铃虫(Heliothis armigera)昆虫痘病毒(HaEPV)。本发明具体的用途包括用该重组昆虫痘病毒作为生物杀昆虫剂，以及用于在细胞培养物中生产所需的生物活性蛋白质;多肽和肽。
昆虫痘病毒是大的，昆虫的双链DNA病毒，迄今已描述了来自毛虫，甲虫和蝗虫的这类病毒(Goodwin el al.，1991)。这些昆虫的经济重要性导致对以EPV作为潜在生物控制剂的深入考虑，并且其他一些研究者对支持利用它们这一能力方面所具有的各种特性的研究已有文献记载。例如，不仅集合的EPV宿主范围宽(覆盖了重要的昆虫群体)，同时个别JEPV分离物一般都有较窄的宿主范围，从而使之可能有高水平的控制特异性。另外，已显示与大量感染性EPV接触的脊椎动物(和脊椎动物细胞培养物)并没有感染或其他可辩明的有害影响的征象(Buckner & Cunnigham，1972;Langridge，1973)。
这些因素为将EPV用作昆虫控制剂提供了重要的可能性。但不幸的是，大多数EPV都表现有低水平的致病性。这种已阻碍了开发以病毒作为主要商品杀昆虫剂之深入尝试的特性可以通过生产重组的昆虫痘病毒将以克服，该重组病毒能表达编码对昆虫有毒性或其他有害作用之外源DNA序列。
重组昆虫痘病毒在生产同质和生物学活性蛋白质、多肽和肽方面也有很大潜力。这些产品目前都是由重组细菌或使用表达载体在真核细胞中产生的。第一种方法在技术上更为简单，但缺点是许多真核细胞来源的蛋白质不能在细菌中得到正确加工。没有正确加工的许多蛋白质是无生物学活性的，因此实用价质很少。另一方面，在脊椎动物细胞中由表达载体生产一般费用都很大，而且蛋白质产率较小。某些真核细胞表达载体(如杆状病毒)还可引起宿主细胞溶解。
与杆状病毒相反，EPV并不一定引起被感染的胞溶解，因而有可能长期持续感染大批细胞培养物。这将使蛋白质的生产效率提高特别是对于那些可由宿主细胞分泌的蛋白质，因为这样将不必破碎细胞即可收集产物(通过定期除去细胞培养基)。
因此，本发明的一个目的是提供适于用作生物杀昆虫剂的重组昆虫痘病毒和/或在细胞培养系统中生产所需蛋白质、多肽和肽的表达载体。为实现这一目的，有必要鉴定EPV基因组中的非必需区域。鉴定这些区域将提供可用于发展EPV病毒载体的位点，通过用已知方法(最常用的是同源重组方法)将外源DNA插入EPV基因组的非必需区域中，其中也可以在插入外来DNA之前缺失非必需区域或其部分。
EPV的河豚精蛋白是闭合体(球形体)的主要成分。因为闭合只是病毒水平传播所必需的，并且没有感染，所以由强启动系驱动的单一河豚精蛋白基因为将外源基因序列插入EPV基因组中提供了很有吸引力的位点。已报导了编码Amsacta moorei EPV(Am EPV)河豚精蛋白的基因序列(Hall and Moyer，1991)。其产物是带有半胱氨酸高含量，并有许多潜在糖基化位点的115kDa蛋白质。该蛋白质与以前描述的其他蛋白质，包括纯化的Choristoneura biennis EPV(CbEPV)制剂的主要蛋白质成分无关，后者已被鉴定为该病毒的河豚精蛋白部分(Yuen ey al.，1990)。
现已发现，昆痘疾病毒在其基因组内还具有适于用作引入外源DNA之位点的非必要区域。
因此，本发明的一个方面可提供了一种重组体昆虫痘病毒，其特征在于外源DNA定位于昆虫痘病毒的下述一个或多个区域中(ⅰ)p11.5开放读码(ORF)区域;
(ⅱ)胸苷激酶(TK)编码区域;
(ⅲ)纺锤体蛋白编码区域(ⅳ)基因间区域基因间区域是指病毒基因组中上游基因或真正或潜在的编码病毒蛋白之开放读码(ORF)的第一个转译终止密码子后面的，或继后下游基因或ORF之转译起始密码子前面的任何区域。这样的基因间区域可包含增强子或启动子元件，其他功能元件，或没有鉴定之活性的其他核苷酸序列。
异源DNA最好插入到p11.5ORF区域或纺锤体蛋白质编码区域。
重组昆虫痘病毒较好是桑灯蛾(Amsacta moorei)EPV，双卷叶蛾(Choristoneura biennis)EPV，棉龄虫(Heliothis armigera)EPV，云杉卷叶蛾(Choristoneura fumiferana)EPV，Aphodius tasmaniae EPV，Dermolepida albohirtum EPV，Melolontha melolon-tha EPV或Servicesthis nigrolineata EPV。
除球形体外，许多EPV分离物还产生大量的称为纺锤体的第二种类型蛋白质结构。这些小体并不闭合病毒颗粒，并且在某些EPV中它们本身闭合成球形体的基质。已从棉龄虫EPV(HaEPV)中分离了纺锤体蛋白(fusolin)编码区(及相邻区域)，并在图I中给出其序列。因此，本发明的第二个方面提供了包含EPV纺锤体蛋白式其部分之编码序列，并可能包含5′启动子序列的分离的DNA分子。
已从HaEPV中分离出p11.5ORF和相邻的5'区域。
图1中给出了这些区域的序列。因此，本发明的第三个方面提供了包含p11.5ORF或其部分之编码序列，并还可能包括5'启动子/基因间序列的分离的DNA分子。
本发明的再一个方面提供了重组HaEPV，特征在于异源DNA定位在基因组的一个或多个非必需区域中。异源基因最好插入到该昆虫痘病毒基因组的一个或多个下列区域中(ⅰ)p11.5开放读码(ORF)区域;
(ⅱ)胸苷激酶(TK)编码区域;
(ⅲ)纺锤体蛋白编码区域;
(ⅳ)河豚精蛋白编码区域;
(ⅴ)基因间区域;
异源基因最好插到p11.5ORF区域或纺锤体蛋白编码区域中。
本发明的重组昆虫痘病毒可用作生物杀昆虫剂，可与一种可接受的农用载体物质制成混合物。插入重组EPV之基因组中的异源DNA可包括编码一种或多种对昆虫有害物质的基因。例如，这些物质包括苏云金杆菌δ毒素、昆虫神经激素或与这些激素相互作用的蛋白质(如保幼激素酸酶)、来源于黄蜂、蝎毒或其他异种来源的杀昆虫化合物，或设计此一种引起被感染组织发生病变的方式攻击或杀伤被感染细胞的因子[如对抗基本细胞功能的核糖酶(ribozyme)]。可由天然或其他适当启动子，但最好由昆虫痘病毒启动子，特别是纺锤体蛋白基因启动子，河豚精蛋白基因启动子或p11.5ORF启动子驱动异源基因的表达。因此，本发明的再一个方面包括含有衍生于昆虫痘病毒之河豚糖蛋白基因或纺锤体蛋白基因，或昆虫病毒更好是昆虫痘病毒之p11.5ORF的启动子区域或其部分的分离的DNA分子。
另外，本发明的重组昆虫痘病毒可用于生产预期的生物子活性蛋白质、多肽或肽，如干扰素(如IFN-α，IFN-β，IFN-γ)、组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)、淋巴毒素(LT)、巨噬细胞激活因子(MAF)等细胞激活素、胰岛素。表皮细胞生长因子(EGF)、L生长激素(hGH)、抗体及其片段等。可由天然启动子或其他适当的启动子驱动编码预期蛋白质之基因的表达，但更好是由昆虫痘病毒启动子，特别是纺锤体蛋白基因启动子、河豚精蛋白基因启动子或p11.5ORF启动子驱动表达。可通过感染培养的Helicoverpa或夜蛾(Spodoptera)细胞如包含或或衍生于Helicoverpa BCIRL-HZ-AMI细胞素(U.S.Dept.of Agriculture)、夜蛾Sf9细胞素(American Type Culture Collection)的细胞或类似细胞，使用重组HaEPV来生产所需的蛋白质、多肽或肽。
p11.5CRF似乎也存在于核多菌体病毒(NPV)中并在其中表达。即GeneBank登记号M59422，座位NPAIEN，其含有以前尚未描述过的可能编码HaEOV p11.5同系物之ORF的AcNPV中的2011 bp ds-DNA。如已公开的，该ORF处在于核苷酸位置1662开始(即基因的3′端)的相反方向上。使用跨越1662至1969位的AcNPVPCR衍生的扩增子作为随机预引标记的探针的模板，得自AcNPV感染的和健康夜蛾sf9细胞的Northern印迹表明在被感染但不健康的细胞中存在有其大小预期可编码P11.5蛋白质同系物的RNA产物(约300个核苷酸)。这一结果有力地提示该ORF事实上是一功能性AcNPV基因。感染约48小时后出现表达AcNPV基因的峰。
此外，GeneBank登记号M63414，座位NPOIEIA述及一个来自Orgia pseudotsugata NPV(OpNPV)并且也含有先前未描述过的可能编码p11.5同系物的ORF的3792bp ds-DNA序列。该同源区域从已公开的碱基350(推测的基因的5′末端)延伸到作为推测的转译终止密码子之最后一个碱基的碱基637。
因此，本发明的再一个方面提供了重组NPV，其特征在于异源DNA定位于NPV基因组中基本上同源于p11.5ORF昆虫痘病毒区域的区域内。
NPV较好是杆状病毒，特别是AcNPV或OpNPV。异源DNA可以是上述类型的。
因此，本发明还应被理解为扩展到生产所需蛋白质、多肽或肽的方法，该方法包括用根据本发明的重组昆虫痘病毒或重组核多菌体病毒感染敏感的宿主细胞。
重组HaEPV可用于控制例如Heliothis/Helicoverpa或Spodoptera。重组NPV可用于控制例如各种鳞翅目昆虫。因此，本发明还扩展到控制有害昆虫繁殖的方法，该方法包括将根据本发明的重组昆虫痘病毒或重组核多菌体病毒，或它们与适当载体的混合物施用于遭受感染的地域。
如上所述，可使用同源重组方法很方便地将异源DNA插入EPV或NPV基因组的非必需区域。很容易推想到的是，可使用其中异源基因侧翼接有相当于非必需靶区域之5-10个核苷酸碱基序列的构建体来实现同源重组。但0.5-2.0kb的侧翼序列应能以更大效率提供所需的重组体。
现借下附图和下述非限制性实施例进一步描述本发明。
图1显示棉龄虫昆虫痘病毒p11.5ORF、p50纺锤体蛋白(fusolin)、基因间和侧翼区域的基因组DNA序列。该序列来自BglⅡ4.9kb克隆36。
图2比较了棉龄虫昆虫痘病毒p50纺锤体蛋白(上面一行序列)和Choristoneura biennis昆虫痘病毒之同源蛋白质(下面一行序列)的氨基酸序列。其中全部使用单字母氨基酸代码。
图3比较了棉龄虫昆虫痘病毒p11.5ORF和p50纺锤体蛋白间的基因间区域的核苷酸序列(上面一行)和Choristoneura biennis昆虫痘病毒中同源基因直接下游的核苷酸序列(下面一行)。
图4(A)证明了被野生型棉龄虫昆虫痘病毒(HaEPV;左)感染的或被分离的G+F-重组HaEPV克隆H12(右)感染的H.Zea细胞中的GUS活性。
(B)证明了被野生型HaEPV;(左)或由pEPAS3∶GUS衍生的G+F-重组HaEPV(右)感染的美洲棉龄虫(H.Zea)细胞中的GUS活性。
可以看出，在两种情况下被野生型HaEPV感染的细胞中都没有GUS活性，但被重组HaEPV感染的细胞中则有活性。
图5提供了被表达GUS的重组棉龄虫昆虫痘病毒(HaEPV)克隆H12(实线)、野生型HaEPV(点线)感染的和伪感染的(破拆线)细胞培养物之溶胞产物的分光光度分析结果。表达GUS的重组体的吸收峰表明存在GUS催化的反应产物。
图6证明由重组棉龄虫昆虫痘病毒(HaEPV)表达NC10蛋白质。该图显示被野生型和表达NC10的重组HaEPV的混合物(泳道1)或只被野生型HaEPV(泳道2)感染的美洲棉龄虫(H.zea)细胞之溶胞产物的Western印迹。箭头指出美洲棉龄虫细胞产物中NC10单体的预期的迁移位置;可看到泳道1中存在免疫反应性带的位置上在泳道2中却没有检出这个带。图左侧示出的数字为蛋白质标志物的迁移位置和分子量。
实施例1棉铃虫昆虫痘病毒基因和病毒蛋白质的特性病毒。野生型棉铃虫昆虫痘病毒(HaEPV)由Dr.R.E.Teakle(Entomology Branch Queensland Department of Primary Industries)提供并在从田野收集的昆虫得到的Helicoverpa armigera的实验室细胞株中增殖(Fernon et al.，待出版)。
用差速离心法从浸软的受感染幼虫中纯化球形体和相关纺锤体。基本上按照Arif(1976)的方法纯化病毒颗粒;用加在碳酸盐缓冲液中的巯基醋酸钠解离，在40-68%蔗糖梯度上(在1mM Tris，pH8.0中)离心并对2mM Mops(pH7.1)透析从球形体中释放病毒颗粒。
在1mg/ml蛋白酶K中保温(室温过夜，然后37℃下2小时)，在TE饱合的(10mM Tris，pH8.0，1mM EDTA)苯酚/氯仿/异戊醇(分别为25∶24∶1)中提取并沉淀，以从病毒颗粒中纯化病毒基因组DNA。
蛋白质分析。按Erlandson(1991)所述方法溶解HaEPV球形体和纺锤体，其中所用缓冲液基本上如Bilimoria和Arif(1979)所述，但不同的是尿素、SDS和巯基乙醇的终浓度分别为6.4m，4%和4%。用SDS-PAGE法分离蛋白质并用胶质考马斯兰(Gradipore Australia)染色。有些情况下，使Laemmli凝胶与加在室上部，电泳缓冲液中的20mM谷胱甘肽一起预电泳30分钟;弃去该缓冲液并换成标准电泳缓冲液，然后上样。基本上按Towbin等人(1979)的方法在硝酸纤维素膜上进行Westem印迹分析。使用聚糖检测药盒(Boehringer Mannheim)，按制造亦推荐的方法检验转印到酯酸纤维素膜上的变性病毒蛋白质的糖基化情况。在加有10%甲醇，pH10.5的5mMCAPS(环己基氨基丙磺酸)中，于Biorad Mini Trans-Blot小室内，以250mA电流作用1小时，使蛋白质转印到PVDF膜(Immobilon-p，Millipore)上。转移后，分别用加在50%甲醇中的0.1%考马斯兰染色并用加在50%甲醇中的10%乙酸脱色以显现蛋白带，然后切下凝胶片并在灭菌蒸馏水中彻底清洗。使用Applied Biosystems 477A型脉冲液相序列分析仪，在PVDE基质上分析蛋白质的N末端氨基酸序列。然后根据所得氨基酸序列数据证实4.9Kb Bg1 HaEPV基因组DNA克隆(＃36)中已测序列的同一性。
融合蛋白质和抗血清。用限制酶消化以切掉含有大部分p50纺锤体蛋白(fusolin)基因之编码区的972 bp SspI片段，并克隆到pGex 3X表达载体(Glutagene;Smith & Johnson，1988)中;使重组质粒生长于大肠杆菌(TG-1菌株)中。向生长活跃的细胞中加IPTG(终浓度1mM)并在37℃继续保温3小时，以诱导HaEPVp50-谷胱甘肽-S-转移酶融合产物的表达。离心收集细胞团块，重新悬注在TEN(50mM Tris，pH7.5;2mM EDTA;100mM NaCl)中并加溶菌酶(终浓度0.2mg/ml)于37℃保温30分钟以溶解细胞，离心(10000g，5分钟)溶胞产物并将沉淀饼重新溶解在PBS中。在30mM尿素和0.2%SDS存在下，于60℃将溶胞产物保温30分钟，以部分地纯化高度可溶性融合蛋白质。然后按上述条件离心溶胞产物混合物，将沉淀饼重新悬浮PBS中，在SDS-PAGE样品缓冲液(Sambrook et al.，1989)中煮沸使之变性，并在SDS-PAGE凝胶(4%堆积胶;12.5%分离胶)上分离蛋白质。从该聚丙烯酰胺胶中切下融合蛋白带，再次上琼脂糖凝胶(Pro Sieve，FMC)上电冰。然后从切下的琼脂糖凝胶中洗脱蛋白质并超滤浓缩之。
使纯化的融合蛋白质(约5μg)与弗氏佐剂混合并经皮下注入体内。用相似量的蛋白质作加强注射，并在第一次注射后的14、28和35天给药;末次加强免疫使用加在琼脂糖凝胶基层中的融合蛋白质，并与佐剂彻底混合。于第28天和40天从兔体内得到抗血清。
为进行免疫萤光研究，将纯化HaEPV球形体和纺锤体的悬液在PBS中清洗，用加有0.05% Tween 20的PBS洗两次，然后在加有2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)的PBS室温下保温1小时。制剂在0.05%Tween 20中洗两次以上，然后在使用PBS作1∶500稀释的第一抗体(兔预免疫血清，或抗p50融合蛋白血清)中保温2小时。洗3次后，向制剂中加入等体积在PBS中1∶64稀释的第二抗体(FITC结合的羊和抗兔IgG;Sigma F-9262)，并保温过夜。再次用PBS彻底洗制剂，然后在含1%邻苯二胺的在PBS中的甘油50%溶液内固定。用Wild Leitz若焦点激光扫描显微镜检测荧光活性。
HaEPV制剂中的蛋白质。在Laemmli凝胶上对含有HaEPV球形体和仿锤体的制剂的中解离的蛋白质进行电泳分离，可产生多条有不同强度的带。当同样的蛋白质制剂在用20mM谷胱甘肽预处理的凝胶上电泳时，出现大致相同的电泳图形，显著的不同点是主带的呈现50KDa的表现迁移率。在标准Laemmli条件下，可在凝胶的这个区域中观察到一条宽的分散带;用谷胱甘肽预处理者则出现明确限定的p50带，而不是分散带，且在这些条件下在我们的制剂中存在最丰富的蛋白质。制剂中的其他主要带已基于它们的表现分子量而定名为p120，p98，p87和p21。
对印迹转移的p50进行N末端安基酸分析测知前11个残基的序列为His-Gly-Tyr-Met-Thr-Phe-Pro-Ile-(Ile/Ala)-Ala-Gln。试图用这些方法限定p120的N末端氨基酸组成，但没有获得成功，可能是因为蛋白质在该位点上被封闭。
克隆和序列分析。根据先前已公开的Chloristoneura biennis EPV序列(Yuen et al.，1990)设计简并寡核苷酸并在Pharinacia LKB Gene Assembler Plus上合成之;寡核苷酸序列为(5′)GAATATGC(A/T)GC(A/T)TTAGCAGG(A/T/C)CC和(5′)ACA(A/G)TT(A/G)TA(A/G)AA(T/A)CCTTC(T/A)CC(T/C)AC。按标准的聚合酶链反应技术(Sambrook et al.，1989)使用这些寡序列，从纯化的HaEPA基因组DNA产生扩增子(amplicon)。该反应共进行31次;初始模板变性为94℃下进行5分钟，然后分别在42°，72°和94℃下进行前5次退火、延伸和变性，所有过程均为1.5分钟。其余反应周期条件基本相同，但退火温度为50°，变性时间为1分钟，并且最后一个周期中延伸步骤为5分钟。用反应得到的复制子作为模板，以合成随机引导的32p标记的DNA探针(Boehringer Mannheim)。用Southern吸印法(Sambrook et al.，1989)筛选限制酶消化的HaEPV基因组DNA中的有用片段，然后将鉴定的4.9kbBglⅡ片段克隆到pTZ19R(Pharmacia)中。
之后克隆该BglⅡ片段并进行序列检测(图1)。发现在该片段内有一个含有p50之N末端氨基酸序列的开放读码。此开放读码由1056个碱基(包括终止密码子)组成，并推测其编码分子量为40132Da的351氨基酸蛋白质，且其等电点为5.87。该氨基酸序鉴定为形成在预测蛋白质之氨基酸21处开始的p50的N末端部分(参见上文)，并完全相同于预测的11个残基中的第10个残基处的序列(得自该基因的三个独立基因组克隆的核苷酸基因数据清楚地表明成熟形式的p50中的第10个氨基酸是Arg)。这一发现证明p50是经过转译后修饰的;剪短的成熟形式的蛋白质的预测分子量为37730Da，等电点为5.63，并含有9个半胱氨酸残基。
在p50成熟期间显然被切掉的20氨基酸肽的推测的分子量为2420，等电点为8.07，且具有一个疏水核心。这些特征与见于其他病毒的作为先导序列并且引导新生蛋白质穿越细胞外膜的肽相一致。
将HaEPV p50氨基酸序列与数据库中可得到的其他序列相比较，揭示它只与Choristoneura biennis EPV(CbEPV)50K蛋白质(Yuen et al.，1990)和Autographa californica NPU的相关34.8K蛋白质(Viallard et al.，1990)有大部分同源性。HaEPV p50与这些蛋白质一一相对排列，使用Gap计算法显示分别有63%和42%完全相同。图2中显示HaEPV p50与CbEPV 50K蛋白质的推测的全长氨基酸序列的比较。
成熟形式的HaEPV p50中的9个半胱氨酸残基，每一个都在CbEPV p50(Yuen et al.，1990)中有其相应的Cys，并且该9个中的6个也保留于AcNPV p34.8中。His-Gly-Try作为成熟形式HaEPV p50之N末端的保守性，支持以前关于该序列(与直接上游的氨基酸结合存在)作为加工主体重要性的猜想，并进一步提示有可能在相似位置上加工AcNPV p34.8(Vialard et al.，1990)。
HaEPV p50基因和在先推测的开放读码间的5′非编码核苷酸序列长度为80个碱基，其中68个(85%)是A或T残基。
使用Gap计算法比较相应的HaEPV和CbEPV非编码区，显示出低的(50%)核苷酸序列同源性(图3)。
对存在于纯化的HaEPV制剂中的蛋白质(含有球形体和纺锤体)的Western印迹分析显示，纺锤体蛋白质，p50是所存在的最为丰富的蛋白质。对被感染细胞中的病毒蛋白质所作实验提示，该环境中的纺锤体蛋白也是很丰富的。据此，假定每个EPV基因组只有一个纺锤体蛋白基因的拷贝(所有这些指征都使我们如此推想)，则p50基因的启动子似乎应是最活跃的HaEPV病毒启动子。
HaEPV p50融合蛋白质和血清学检测法。
含有HaEPV p50和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)序列的融合蛋白质具有预期的约64KDa的分子量。在SDS-PAGE条件下，GST以其特定表观分子量泳动，而融合蛋白则以81KDa蛋白表观分子量迁移。
在Western印迹上，预免疫血清并不识别转印迹的HaEPV蛋白质，但抗p50融合血清则显示为复合的染色图形。除了如所预略的识别p50外，该抗血清还与p98，以及几个有更高分子量白蛋白带发生强反应。这些观察结果有力地提示p98是p50的二聚体，而且表明由该抗血清识别的有更高分子量的带很可能是p50的更高级数的多聚体。该抗血清不识别据信是HaEPV河豚精蛋白的P120。
当与EaEPV制剂用于免疫荧光研究时，预免疫血清只显示出很低的着染水平。相反，抗p50融合血清则可与HaEPV纺锤体特异地结合，但未显示出与球形体的反应性。如根据被标记之第二抗体的荧光所显示的一样，用共焦点激光扫描显微镜可清楚地看到抗p50融合抗体相对于纺锤体的定位。
另外还发现一个与编码HaEPV p50的基因同源的基因存在于澳大利西鳃角金龟虫Sericesthis nigrolineata的EPV中。纺锤体是内这种病毒产生的。
为制备SnEPV的基因组DNA，在硫代乙醇酸和碳酸盐缓冲液中，加入1/10体积Tris缓冲液(10mM，PH8.0)，用蛋白酶K(1mg/ml)消化(37℃，4小时)，并用6体积蒸馏水稀释。从而破坏球形体。使用前已详述的程序和寡核苷酸，以4微升等分的该制剂作为模板进行PCR扩增。纯化一个该反应中产生的约500bp的扩增子并克隆到pTZ19U(Pharmacia)中。测定已克隆之扩增子的序列，分析所得结果可以看出在扩散子序列和HaEPV纺锤体蛋白基因的序列间存在同源性。
PCR方法已被用于检测与桑灯蛾EPV和Choristoneura biennis EPV(CbEPV)河豚精蛋白基因有同源性的HaEPV基因的存在(Sensu Hall and Moyer，1991，1993)。按乙知方法合成寡核苷酸RM58和RM118(Hall and Moyer，1993)，并与前述的HaEPV基因组DNA制剂一起使用。在该反应中产生一个约1.1kb的扩增子;该扩增子的大小很接近于已报导的当使用带有CbEPV DNA的同样寡核苷酸作模板(Hall and Moyer，1993)，并利用PCR方法的已知特异性时所产生的复制子，这一事实有力地证实HaEPV衍生的扩增子代表了存在于HaEPV基因组中的河豚鱼精蛋白基因同系物的一部分。
基于上述各实验的结果证明的HaEPV基因组与其他昆虫痘病毒基因组间的对应关系，可见相似的PCR为基础的方法学很可能用于鉴定HaEPV基因组中是否存在胸苷激酶(TK)基因。最近已证明了AmEPV、CbEPV和云杉卷叶蛾EPV的基因组中存在同源TK基因(Lytvyn et al.，1992)。
在BglⅡ片段内，还鉴定出一个编码推测的11.5KDa蛋白质的开放读码。分析p11.5ORF上游的DNA序列，提示它很可能是适于表达异源序列的强启动子。
实施例2制备重组HaEPV(ⅰ)G+F-(即GUS+纺锤体蛋白(fusolin)-)HAEPV按下述方法制备重组G+F-HaEPV用已克隆到pTZ19R中的4.9kb BglⅡ HaEPV基因组片段作为构建EPV转移载体的基础。删除该基因组片段中由5′BglⅡ位点和内部EcoRI位点限定的长约700bp的部分，留下含有图1所示序到的4.2kb HaEPV基因组DNA。使用位点特异性诱变方法在纺锤体蛋白基因的上游非编码序列和编码区之间引入BamHI位点。如此构建的转移载体质粒称为pEPAS3。
使用合成的寡核苷酸(GATCTTAAATAGATCTATTTAA)对pEPAS3作进一步的操作，使之自身退火得到带有BamHI相容性末端的ds DNA片段。将该片段插入pEPAS3的BamHI位点，从而将合成接头序列，牛痘病毒相符性晚期启动子序列(TAAAT)，和一个新产生的BglⅡ位点掺入转移载体中。在同一过程中破坏了pEPAS3的原存在的BamHI位点。将此被修饰的转移载体称为pEPAS3 linker1。
将编码β-糖苷酸酶的细菌报导基因(GUS;Jefferson 1987)插入pEPAS3 linker1的BglⅡ位点以产生pEPAS3 linker1.GUS;该构建体中，EcoRI位点被导入GUS的编码序列和作为克隆制备物的纺锤体蛋白(fusolin)基因之间。在大肠杆菌中扩增此构建体，然后用Magic Maxiprep程序(Promega)纯化之。将纯化的DNA转移到已用野生型HaJEPV感染24小时的美洲棉铃虫细胞BCIRL＝HZ-MA1细胞株(McIntosh and Ignoffo，1981)。应根据同源重组现象的发生而达到HaEPV在这些细胞内的复制，从而使含报导基因(GUS)构建体的一部分整合到病毒的基因组中。可以预期经修饰的纺锤体蛋白启动子应能驱动GUS基因的表达，而中GUS基因终止密码子将防止与其直接下游融合的纺锤体蛋白基因的其表达。
从上述被感染/转染的美洲棉铃虫细胞中收获含有HaEPV的感染性颗粒的培养基，并用于进一步感染其他美洲棉铃虫细胞。对该培养基进行一系列稀释，使之达到在给定体积的接种物中存在1个感染性颗粒，以便分离下文称之为克隆H12的G+F-HaEPV重组体。按照Jefferson所述方法(1987b)，使用5-溴-4-氯-3-吲哚基葡糖苷酸(X-GLU)底物估测重组HaEPV的GUS活性。图4(A)显示了使用野生型HaEPV(左侧)或G+F-克隆H12HaEPV(右侧)感染的全细胞所作这一检测的结果。从中可以看出GUS活性只存在于H12HaJEPV感染的细胞中。图5显示用分光光度分析法检测G+F-克隆H12HaEPV或野生型HaKEPV感染的或伪感染(即未加病毒)的细胞溶胞产物中GUS酶促活性的结果。可以看出，GUS基因在重组HaEPV感染的细胞中得到表达，但这种活性与野生型HaEPV或细胞本身无关。
按上述方法制备第二个重组体G+F-HaEPV，但不同的是将GUS报导基因克隆到转移载体pEPAS3的BamHI位点中以得到pEPAS3∶GUS。将该载体转染到已被野生型HaEPV感染了24小时的美洲棉铃虫细胞中，可再次期望产生由野生型纺锤体蛋白启动子驱动表达的带有GUS基因的G+F-HaEPV重组体。
用标准酶促检测法估测GUS活性，再次显示特征性GUS催化的兰色反应产物存在于经受EaEPV转染/感染处理的细胞中(图4(B)右侧)，但不存在于受野生型HaEPV感染的细胞中(图4(B)，左侧)。
(ⅱ)G+iHaEPV按下述方法制备在p11.5ORF和纺锤体蛋白基因之间的基因间区域(ⅰ)具有GUS编码序列之拷贝的重组HaEPV再次基于克陆的4.9kb BglⅡ HaEPV基因组片段制备质粒转化载体。
使用位点特异性诱变技术，以保留纺锤体蛋白启动子之完整活性的方式将BglⅡ位点导入p11.5ORF和纺锤体蛋白编码序列之间的基因间区域中。在此诱变反应中，将相对于纺锤体蛋白转译终止密码子来说处于-71至-66碱基位置(见图1)的序列ATATCT改变成AGATCT;所得转移载体构建体被定名为pEPAS4。
切掉pEPA3∶GUS构建体中由49碱基野生型纺锤体蛋白启动子序列和GUS编码序列组成的DraI-EcoRI片段，用Klenow片段DNA聚合酶修成平头，并克隆到pEPAS4的未端填充的基因间BglⅡ位点中。如此构建的转移载体被称为pEPAS4∶GUS。
(ⅲ)抗神经氨酸苷酶+F-HaEPV制备可表达小鼠抗流感病毒神经氨酸苷酶蛋白质之免疫球蛋白重和轻链可变区的融合部分的重组HaEPV。该表达产物有可能用于体外诊断流感。所谓的蛋白质受到进一步的基因工程化修饰，以包含可由市售的单克隆抗体(抗FLAG MS2抗体;International Biotechnologies)识别的八肽序列。
将编码上述蛋白质的基因(Malby，R.L.et al.，1993)克隆到pEPAS3的BamHI位点中，得到转移载体pEPAS3∶NC10。按上述方法共转染H.zea细胞。使用抗FLAG MS2单克隆抗体，以Western印迹法检测由重组HaEPV感染的细胞表达的蛋白质产物，以证明经重组后该基因得以表达(图6)。
(ⅳ)est+F-HaEPV制备可表达已在201位发生突变而使丝氨酸残基变为甘氧酸残基的HeLIOTHIS irescens保幼激素酯酶基因的重组HaEPV。当此突变蛋白由重组核多菌体病毒表达时，即显示出其很强的杀昆虫作用，因此该重组HaEPV被看作是制备有用病毒杀昆剂的候选物。
将突变的est基因克隆到pEPAS3转移载体(Prof.B.B.Hammock，University of Californis，Davis，USA)的BamHI位点中，然后按上述方法进行转染/感染，以制得该重组体。
参考文献Arif, B.M.(1976).Isolation of an entomopoxvirus andcharacterisation of its DNA. Virology 69,626-634.
Bilimoria, S.L. & Arif, B.M.(1979).Subunit protein andalkaline protease of entomopoxvirus spheroids.Virology 96,596-603.
Buckner,C.H. & Cunningham, J.C.(1972). The effect of thepoxvirus of the spruce budworm, Choristoneura fumiferana(Lepidoptera:Tortricidae), on mammals and birds. Can.Ent.
104,1333-1342.
Erlandson, M.(1991). Protease activity associated withocclusion body preparations of an entomopoxvirus fromMelanoplus sanguinipes. Journal of InvertebratePathology 57, 255-263.
Fernon, C.A. Vera, A.P., Crnov, R., Lai-Fook, J. & Dall, D.J.
In vitro replication of Heliothis armigera RPV(in preparation).
Goodwin, R.H., Milner, R.J. & Beaton, C.D. (1991)Entomopoxvirinae. In Atlas of Invertebrate Viruses,Adams,J.R. & Bonami, J.R., eds. pp259-285. CRC Press, Boca Raton.
Hall, R.L. and Moyer, R.W. (1991) Identification, Cloning andSequencing of a Fragment of Amsacta moorei Entomopoxvirus DNAContaining the Spheroidin Gene and Three VacciniaVirus-Related Open Reading Frames. J. Virol. 65, 6516-6527.
Hall, R.L. and Moyer, R.W. (1993). Identification of anAmsacta spheroidin-like protein within the occlusion bodies ofChoristoneura entomopoxviruses. Virology 192, 179-187.
Jefferson, R.A. (1987a) Plant Molecular Biology Reporter 5,387-405.
Jefferson, R.A. (1987b). GUS Gene Fusion System User's Manual.
Version 1.1 Cambriage, U.K.
Langridge, W.H.R. (1983). Detection of Amsacta mooreientomopoxvirus and vaccinia virus proteins in cell culturesrestrictive for poxvirus multiplication. J. Invertebr.
Pathol. 42, 77-82.
Lytvyn, V., Fortin, Y., Banville, M., Arif, B. and Richardson,C. (1992). Comparison of the thymidine kinase genes fromthree entomopoxviruses. J. Gen. Virol. 73, 3235-3240.
Malby, R.L., et al. PROTEINS: Structure, Function andGenetics, 16: 57-63,1993.
McIntosh, A.H. and Ignoffo, C.M. (1981). Relication andinfectivity of the single-embedded nuclear polyhedrosis virus,Baculovirus heliothis, in homologous cell lines. J.
Invertebr. Pathol. 37, 258-264.
Sambrook, J. Fritsch, E.F. & Maniatis, T. (1989) MolecularCloning: A Laboratory Manual. Second Edition, Cold SpringHarbour Laboratory Press, New York.
Smith, D.B. & Johnson, K.S. (1988). Single step purificationof polypeptides expressed in Escherichia coli as fusionswith glutathione-S-transferase. Gene 67,31-40.
Towbin, H., Staehelin, T. & Gordon, J. (1979). Electrophoretictransfer of proteins from polyacrylamide gels tonitrocellulose sheets: procedure and some applications.
Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A. 76,4350-4354.
Vailard, J.E., Yuen, L. & Richardson, C.D. (1990).
Identification and characterisation of a baculovirus occulsionbody glycoprotein which resembles spheroidin, andentomopoxvirus protein. J. Virol. 64,5804-5811.
Yuen, L., Dionne, J., Arif, B. and Richardson, C. (1990).
Identification and Sequencing of the Spheroidin Gene ofChoristoneura biennis Entomopoxvirus. Virology 175,427-433.
Other aspects of the present invention, and modifications andvariations thereto, will become apparent to those skilled inthe art on reading this specification, and all such otheraspects and modifications and variations are to be consideredas included within the scope of the present invention.
在阅读了该说明书基础上，本发明的其他方面及其改进和变化对于本领域的专业人来说均是显而易见的，并且所有的这些其他方面、改进和变化均被认为包括在本发明的范围之中。
权利要求
1.一种重组昆虫痘病毒，特征在于其异源基因定位于选自下列一组之基因组的一个或多个区域中p11.5开放读码(ORF)区域；胸苷激酶(TK)编码区域；和纺锤体蛋白编码基因基因间区域。
2.一种重组昆虫痘病毒，特征在于其异源DNA位于该基因组的p11.5ORF区域中。
3.一种重组昆虫痘病毒，特征在于其异源DNA位于该基因组的胸苷激酶(TK)编码区域中。
4.一种重组昆虫痘病毒，特征在于其异源DNA位于该基因组的纺锤体蛋白编码区域中。
5.一种重组昆虫痘病毒，特征在于其异源DNA位于该基因组的基因间区域中。
6.一种根据权利要求5的重组昆虫痘病毒，其中异源DNA位于p11.5ORF和纺锤体蛋白编码区域间的基因间区域中。
7.一种根据前述权利要求之任何一项的重组昆虫痘病毒，其中昆虫痘病毒是Amsacta moorei EPV，Choristoneura biennis EPV，Heliothis armigera EPV，Choristoneura fumiferana EPV，Aphodius tasmaniae EPV，Dermolepida albohirtum EPV，Melolontha melolontha EPV或Servicesthis nigrolineata EPV。
8.一种重组棉铃虫(Heliothis armigera)昆虫痘病毒(HaEPV)，特征在于其异源DNA位于该基因组的一个或多个非必需区域中。
9.一种重组HaEPV，特征在于其异源DNA位于选自下列一组的基因组的一个或多个区域中p11.5开放读码(ORF)区域;胸苷激酶(TK)编码区域;纺锤体蛋白编码区;河豚精蛋白编码区域;以及基因间区域。
10.一种重组HaEPV，特征在于其异源DNA位于该基因组的p11.5ORF区域中。
11.一种重组HaEPV，特征在于其异源DNA位于该基因组的胸苷激酶(TK)编码区域中。
12.一种重组HaEPV，特征在于其异源DNA位于该基因组的纺锤体蛋白编码区域中。
13.一种重组HaEPV，特征在于其异源DNA位于基因组的河豚精蛋白编码区域中。
14.一种重组HaEPV，特征在于其异源DNA位于基因组的基因间区域中。
15.一种根权利要求14的重组HaEPV，其中异源DNA位于p11.5ORF和纺锤体蛋白编码区域间的基因间区域。
16.一种重核多菌体病毒(NPV)，特征在于其异源DNA位于基因组中实质上与p11.5ORF昆虫粢病毒区域的至少一部分同源的区域中。
17.一种根据权利要求16的重组NPV，其中NPV是杆状病毒。
18.一种根据权利要求17的重组NPV，其中NPV是AcNPV或OpNPV。
19.一种根据前述权利要求之任何一项的重组病毒，其中异源DNA包括至少一个编码能破坏昆虫之物质的基因。
20.一种根据权利要求19的重组病毒，其中异源DNA编码选自下列一组的物质苏云金芽胞杆菌δ毒素，昆虫神经激毒、与昆虫激毒反应的蛋白质、黄峰、蝎毒或其他异源来源的杀昆虫化合物，或针对昆虫基本细胞功能的核糖酶。
21.一种根据权利要求19的重组病毒，其中异源DNA编码保幼激素酯酶。
22.一种根据权利要求1-18中任何一项的重组病毒，其中异源DNA包括至少一个编码所需生物学活性蛋白质、多肽或肽的基因。
23.一种根据权利要求22的重组病毒，其中异源DNA编码选自下列一组的物质IFN-α、IFN-β、IFN-δ、TPA、淋巴毒素、巨噬细胞激活因子、胰岛素、表皮细胞生长因子、人生长激素、抗体和抗体片段。
24.一种根据权利要求22的重组病毒，其中异源DNA编码了抗流感病毒之神经氨酸酶的小鼠重和轻链免疫球蛋白链之可变区的融合成分。
25.一种根据权利要求19-24中任何一项的重组病毒，其中异源DNA的表达是由昆虫痘病毒启动子驱动的。
26.一种根据权利要求25的重组病毒，其中昆虫痘病毒启动子是棉铃虫EPV的纺锤体蛋白启动子，河豚精蛋白启动子或p11.5ORF启动子。
27.一种控制有害昆虫增殖的方法，包括将根据权利要求19-21、25或26中之任何一项的重组病毒，或其与农业上可接受的载体的混合物施用于受感染的地区。
28.一种生产所需蛋白质，多肽或肽的方法，包括用根据权利要求22-26中任何一项的重组病毒感染敏感的宿主细胞。
29.一种根据权利要求1-26中任何一项的重组病毒，其中通过同源重组使异源DNA定位于病毒基因组中。
30.一种分离的DNA分子，其包括编码棉铃虫昆虫痘病毒纺锤体蛋白或其部分的核苷酸序列。
31.一种分离的DNA分子，其包括基本上相当于图1中核苷酸443至核苷酸1498的核苷酸序列。
32.一种分离的DNA分子，其包括编码p11.5ORF或其部分的核苷酸序列。
33.一种分离的DNA分子，其包括编码棉铃虫p11.5ORF或其部分的核苷酸序列。
34.一种分离的DNA分子，其包括基本上相当于图1中核苷酸57至核苷酸362的核苷酸序列。
35.一种分离的DNA分子，其包括编码昆虫痘病毒基因组内处于p11.5ORF和纺锤体蛋白编码区之间的基因间区域或其部分的核苷酸序列。
36.一种分离的DNA分子，其包括棉铃虫编码昆虫痘病毒基因组内处于p11.5ORF和纺锤体蛋白编码区之间的基因间区域或其部分的核苷酸序列。
37.一种分离的DNA分子，其包括基本上相当于图1中核苷酸363至核苷酸442的核苷酸序列。
38.一种分离的DNA分子，其包括编码昆虫痘病毒启动子或其功能性部分的核苷酸序列。
39.一种根据权利要求38的分离的DNA分子，其中启动子是纺锤体蛋白启动子。
40.一种根据权利要求39的分离的DNA分子，其中纺锤体蛋白启动子衍生于棉铃虫昆虫痘病毒。
41.一种根据权利要求38的分离的DNA分子，其中启动子是p11.5ORF启动子。
42.一种根据权利要求41的分离的DNA分子，其中p11.5ORF启动子衍生于棉铃虫昆虫痘病毒。
43.一种分离的DNA分子，其包括基本上相当于图1中核苷酸1至核苷酸56的核苷酸序列。
44.一种分离的DNA分子，其编码包括昆虫痘病毒纺锤体蛋白启动子序列和牛痘病毒相符晚期启动子序列的融合的启动子成分。
45.一种基本上如本文实施例2所述的重组病毒。
全文摘要
描述了重组昆虫病毒，特别是重组棉铃虫昆虫痘病毒(HaPEV)，其中异源DNA位于病毒基因组的非必要区域中。这些重组病毒可用作生物杀昆虫剂，并用于在细胞培养物中生产所需生物学活性蛋白质、多肽和肽。
文档编号C12N15/863GK1083527SQ93109028
公开日1994年3月9日 申请日期1993年6月16日 优先权日1992年6月16日
发明者D·J·达尔, A·施里斯康塔, C·A·费尔农 申请人:联邦科学及工业研究组织