一种水痘病毒滴度快速检测方法
【专利摘要】本发明提供了一种水痘病毒滴度快速检测方法，所述检测方法利用水痘病毒感染单层细胞初期，在感染细胞内复制并大量表达与病毒致病性相关的水痘病毒包膜糖蛋白，通过免疫反应的方法，确定感染病灶，在显微镜下观察计数并计算所述水痘病毒滴度。该方法大大缩短了传统滴度测定法，即蚀斑法，的测定时间，是一种快速、灵敏的检测水痘病毒滴度的方法。
【专利说明】一种水痘病毒滴度快速检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，特别涉及一种水痘病毒滴度快速检测方法。
【背景技术】
[0002] 水痘是一种常见、多发、有高度接触传播性的儿童急性传染病，15岁以下少儿家庭 内接触感染率为61 %?87 %，少数研究报道家庭内接触感染率甚至可达92 %?100 %。由 于儿童期水痘发病绝大多数症状轻微，过去常不被人们所重视，但患水痘后处理不当，会并 发肺炎、脑炎等严重疾病，甚至死亡，且感染后潜伏在体内，激活后又可发生带状疱疹。我国 儿童水痘的发病和危害日益凸显，接种水痘疫苗是目前控制水痘感染与流行的有效手段。
[0003] 水痘病毒属疱疫病毒科a疱疫病毒亚科成员。病毒颗粒呈球形，直径180nm? 200nm，为椭圆形颗粒，由带有糖蛋白突起的脂质包膜和和一个含双链DNA基因组的核衣壳 组成。病毒核衣壳是由162个壳微粒组成的对称20面体，壳外有一层或多层的含脂蛋白的 包膜。包膜上的糖蛋白至少有8种^￡^8^1141^(：41^1(及§11。糖蛋白主要存在于病 毒囊膜和感染细胞的包膜中，与病毒的致病性和免疫原性有着密切关系。糖蛋白的结构和 分子量都已清楚，病毒糖蛋白gE、gB、gC均能诱导机体产生中和抗体。gE的分子量最大，在 病毒包膜上含量最高，是病毒主要抗原，也是制备病毒亚单位疫苗和DNA疫苗的主要候选 抗原。糖蛋白gE (也称gp I)，分子质量为60?98kDa，是水痘病毒囊膜和感染细胞膜上含 量最丰富、抗原性最强的糖蛋白，具有典型的I型跨膜蛋白结构。
[0004] 目前病毒滴度是表观水痘疫苗质量的主要指标，也是生产过程中水痘疫苗原液和 成品的主要检测项目。滴度传统检测方法为蚀斑法（单层法），其操作步骤为：
[0005] (1) 6孔板接种细胞将浓度IO5个/ml的细胞悬液，接种6孔板，每孔3ml，置25? 45°C CO2孵箱培养。一般3天，细胞长成单层，接种病毒。
[0006] (2)6孔板接种病毒将疫苗按适当比例用病毒释液稀释。将细胞长成单层的6孔 板，吸去细胞生长液，加入稀释后的病毒液，0. Iml/孔，置25?45°C，CO2孵箱吸附90min， 中间轻摇6孔板2?3次，吸附完毕后，加入细胞维持液，3ml/孔，置25?45°C，CO2孵箱培 养。7天后染色，判定结果。
[0007] 水痘带状疱疹病毒极不稳定，不能在结痂或污染物中长期存活。病毒感染也仅限 于很窄的pH范围，pH < 6. 2或pH > 7. 8时即丧失感染性。水痘病毒对温度同样敏感，无稳 定剂的条件下很快丧失感染性。目前一般水痘疫苗生产企业需要获得原液后，-80°C冻存， 待滴度检测结果出来以后再进行配制冻干。期间需要等待至少7天时间。
[0008] 因此，目前急需一种能够快速、灵敏检测水痘病毒滴度的方法。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种能够快速、灵敏检测水痘病毒滴度的方法。所述检测方 法利用水痘病毒感染单层细胞初期，在感染细胞内复制并大量表达与病毒致病性相关的水 痘病毒包膜糖蛋白，通过免疫反应的方法，确定感染病灶，在显微镜下观察计数并计算所述 水痘病毒滴度。
[0010] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0011] 一种水痘病毒滴度快速检测方法，所述检测方法利用水痘病毒感染单层细胞初 期，在感染细胞内复制并大量表达与病毒致病性相关的水痘病毒包膜糖蛋白，通过免疫反 应的方法，确定感染病灶，在显微镜下观察计数并计算所述水痘病毒滴度；
[0012] 所述检测方法包括以下步骤：
[0013] 1)病毒接种
[0014] 取人正常胚肺成纤维细胞（MRC-5细胞），铺满96孔板单层，将待测水痘病毒样品 做梯度稀释，取2?4孔为一组，每组加同一浓度所述水痘病毒稀释液25ul，同时做平行孔 和阴性对照孔，轻轻摇动平板使所述水痘病毒均匀地分布，25?45°C，吸附30?90分钟， 弃去孔内液体，加入甲基纤维素溶液，25?45°C孵育43?47小时；
[0015] 2)滴度测定
[0016] 向经过上述经病毒接种的每孔以及平行孔和阴性对照孔内，加入新配制预冷甲醛 丙酮缓冲液，室温放置5?20分钟，弃去孔内液体，在吸水纸上拍干，每孔加入洗液，洗涤 1?5次，再加入普通山羊血清封闭，室温放置2?8分钟，弃去液体，轻轻拍干，加入小鼠抗 水痘病毒包膜糖蛋白单克隆抗体，25?45°C孵育20?40分钟，弃去孔内液体，在吸水纸纸 上轻拍，洗涤1?5次，加入HRP标记的山羊抗小鼠抗体，在25?45°C孵育20?40分钟， 弃去孔内液体，在吸水纸纸上轻拍，洗涤1?5次，加入TMB显色底物，并在室温下避光孵育 1?4小时；
[0017] 3)滴度计算
[0018] 使用光学显微镜观察，判定经上述处理后每孔的病灶数，接种同一稀释度的孔病 灶数取平均值，所述病毒滴度计算公式为：
[0019] 病毒滴度（PFU/ml)=平均病灶数X稀释倍数X40(lml + 25ul)。
[0020] 进一步的，所述的与病毒致病性相关的水痘病毒包膜糖蛋白为糖蛋白gE、gB、gH 中的一种。
[0021] 进一步的，所述糖蛋白gE的氨基酸序列如序列表中的序列1所示。
[0022] 进一步的，所述糖蛋白gB的氨基酸序列如序列表中的序列2所示。
[0023] 进一步的，所述糖蛋白gH的氨基酸序列如序列表中的序列3所示。
[0024] 进一步的，步骤2)中所述的甲醛丙酮缓冲液为PBS、甲醛和丙酮的混合物，所述 PBS、甲醛和丙酮的体积比为：
[0025] PBS 1. 2
[0026] 甲醛 1.0
[0027] 丙酮 1.8。
[0028] 进一步的，所述的甲醛丙酮缓冲液配置后在_20°C放置3小时以上再使用。
[0029] 进一步的，步骤2)中所述的洗液为PBS和Tween 20的混合物，所述Tween 20的 浓度为〇.〇1?〇. 1%，其优选浓度为〇.〇5%。
[0030] 本发明相比现有技术的有益效果为：
[0031] 1、传统的蚀斑法经过7天时间形成蚀斑，然后染色观察，计数再计算病毒滴度，此 方法耗时较长，加上前期准备细胞时间一共需要10天，而本发明所述的检测方法得出结果 仅需2天就能测出水痘病毒滴度，相比传统蚀斑法（10天）大大缩短检测周期，提高检测效 率，同时也辅助缩短生产周期；
[0032] 2、本发明在节约检测时间的同时，也保持了较高的检测准确度。
【具体实施方式】
[0033] 实施例1
[0034] 一种水痘病毒滴度快速检测方法，所述检测方法利用水痘病毒感染单层细胞初 期，在感染细胞内复制并大量表达与病毒致病性相关的水痘病毒包膜糖蛋白，通过免疫反 应的方法，确定感染病灶，在显微镜下观察计数并计算所述水痘病毒滴度；
[0035] 所述检测方法包括以下步骤：
[0036] 1)病毒接种
[0037] 取人正常胚肺成纤维细胞（MRC-5细胞），铺满96孔板单层，将待测水痘病毒样品 做梯度稀释，取2?4孔为一组，每组加同一浓度所述水痘病毒稀释液25ul，同时做平行孔 和阴性对照孔，轻轻摇动平板使所述水痘病毒均匀地分布，25?45°C，吸附30?90分钟， 弃去孔内液体，加入甲基纤维素溶液，25?45°C孵育43?47小时；
[0038] 2)滴度测定
[0039] 向经过上述经病毒接种的每孔以及平行孔和阴性对照孔内，加入新配制预冷甲醛 丙酮缓冲液，室温放置5?20分钟，弃去孔内液体，在吸水纸上拍干，每孔加入洗液，洗涤 1?5次，再加入普通山羊血清封闭，室温放置2?8分钟，弃去液体，轻轻拍干，加入小鼠抗 水痘病毒包膜糖蛋白单克隆抗体，25?45°C孵育20?40分钟，弃去孔内液体，在吸水纸纸 上轻拍，洗涤1?5次，加入HRP标记的山羊抗小鼠抗体，在25?45°C孵育20?40分钟， 弃去孔内液体，在吸水纸纸上轻拍，洗涤1?5次，加入TMB显色底物，并在室温下避光孵育 1?4小时；
[0040] 3)滴度计算
[0041] 使用光学显微镜观察，判定经上述处理后每孔的病灶数，接种同一稀释度的孔病 灶数取平均值，所述病毒滴度计算公式为：
[0042] 病毒滴度（PFU/ml)=平均病灶数X稀释倍数X40(lml + 25ul)。
[0043] 进一步的，所述的与病毒致病性相关的水痘病毒包膜糖蛋白为糖蛋白gE、gB、gH 中的一种。
[0044] 进一步的，所述糖蛋白gE的氨基酸序列如序列表中的序列1所示。
[0045] 进一步的，所述糖蛋白gB的氨基酸序列如序列表中的序列2所示。
[0046] 进一步的，所述糖蛋白gH的氨基酸序列如序列表中的序列3所示。
[0047] 进一步的，步骤2)中所述的甲醛丙酮缓冲液为PBS、甲醛和丙酮的混合物，所述 PBS、甲醛和丙酮的体积比为：
[0048] PBS 1. 2
[0049] 甲醛 1.0
[0050] 丙酮 1.8。
[0051] 进一步的，所述的甲醛丙酮缓冲液配置后在_20°C放置3小时以上再使用。
[0052] 进一步的，步骤2)中所述的洗液为PBS和Tween 20的混合物，所述Tween 20的 浓度为0.01?o. 1%，其优选浓度为0.05%。
[0053] 实施例2
[0054] 本实施例是实施例1基础上的优选方案，所用的原料的品质与实施例1相同，其中 与实施例1相同的部分不再次重复，请参照实施例1。
[0055] 所述水痘病毒滴度快速检测方法包括以下步骤：
[0056] 1)病毒接种
[0057] 取人正常胚肺成纤维细胞（MRC-5细胞），铺满96孔板单层，每孔3 X IO4个细胞， 25?45°C孵育1小时，用移液器吸出培养基，注意不要挂上细胞；
[0058] 将待测水痘病毒样品做梯度稀释，取2孔为一组，每组加同一浓度所述水痘病 毒稀释液25ul，同时做平行孔和阴性对照孔，轻轻摇动平板使所述水痘病毒均匀地分布， 25?45°C，吸附60分钟，期间每20分钟轻轻摇动一次；
[0059] 用移液器吸出培养基，注意不要挂上细胞，加入50 iU甲基纤维素溶液，37°C孵育 43小时；
[0060] 2)滴度测定
[0061] 向经过上述经病毒接种的每孔以及平行孔和阴性对照孔内，加入150iU新配制 预冷甲醛丙酮缓冲液，室温放置10分钟，弃去孔内液体，在吸水纸上拍干，每孔加入200 iil 洗液，洗涤3次，每次5分钟；
[0062] 再加入50 ii 1普通山羊血清封闭，轻轻摇动混匀，室温放置5分钟，弃去液体，轻轻 拍干；
[0063] 再加入25 ill小鼠抗水痘病毒包膜糖蛋白gE单克隆抗体，37°C孵育25分钟，弃去 孔内液体，在吸水纸纸上轻拍，每孔加入200 iU洗液，洗涤2次，每次5分钟；
[0064] 加入50iU HRP标记的山羊抗小鼠抗体，在37°C孵育25分钟，弃去孔内液体，在吸 水纸纸上轻拍,每孔加入200 ii 1洗液，洗涤2次，每次5分钟；
[0065] 再加入50 ill TMB显色底物，并在室温下避光孵育3小时；
[0066] 3)滴度计算
[0067] 使用光学显微镜观察，判定经上述处理后每孔的病灶数，接种同一稀释度的孔病 灶数取平均值，最高稀释度孔病灶数为5?25个时能得到较准确的结果，若病灶数不在此 范围内，需改变样品稀释倍数稀释重复该实验。
[0068] 所述病毒滴度计算公式为：
[0069] 病毒滴度（PFU/ml)=平均病灶数X稀释倍数X40(lml + 25ul)。
[0070] 带入数据即可，如最高100倍稀释，平均病灶数为10
[0071] 病毒滴度（PFU/ml) = 10X100X40(lml + 25ul) = 40000PFU/ml
[0072] 本实施例发明检测滴度结果与普通蚀斑法检测结果，对比数据请参见表1。
[0073] 表1两种方法检测水痘培养滴度比较（单位：PFU/ml)
[0074]
【权利要求】
1. 一种水痘病毒滴度快速检测方法，其特征在于，所述检测方法利用水痘病毒感染单 层细胞初期，在感染细胞内复制并大量表达与病毒致病性相关的水痘病毒包膜糖蛋白，通 过免疫反应的方法，确定感染病灶，在显微镜下观察计数并计算所述水痘病毒滴度； 所述检测方法包括以下步骤： 1) 病毒接种 取人正常胚肺成纤维细胞（MRC-5细胞），铺满96孔板单层，将待测水痘病毒样品做梯 度稀释，取2?4孔为一组，每组加同一浓度所述水痘病毒稀释液25ul，同时做平行孔和阴 性对照孔，轻轻摇动平板使所述水痘病毒均匀地分布，25?45°C，吸附30?90分钟，弃去 孔内液体，加入甲基纤维素溶液，25?45°C孵育43?47小时； 2) 滴度测定 向经过上述经病毒接种的每孔以及平行孔和阴性对照孔内，加入新配制预冷甲醛丙酮 缓冲液，室温放置5?20分钟，弃去孔内液体，在吸水纸上拍干，每孔加入洗液，洗涤1?5 次，再加入普通山羊血清封闭，室温放置2?8分钟，弃去液体，轻轻拍干，加入小鼠抗水痘 病毒包膜糖蛋白单克隆抗体，25?45°C孵育20?40分钟，弃去孔内液体，在吸水纸纸上轻 拍，洗涤1?5次，加入HRP标记的山羊抗小鼠抗体，在25?45°C孵育20?40分钟，弃去 孔内液体，在吸水纸纸上轻拍，洗涤1?5次，加入TMB显色底物，并在室温下避光孵育1? 4小时； 3) 滴度计算 使用光学显微镜观察，判定经上述处理后每孔的病灶数，接种同一稀释度的孔病灶数 取平均值，所述病毒滴度计算公式为： 病毒滴度（PFU/ml)=平均病灶数X稀释倍数X40(lml + 25ul)。
2. 根据权利要求1所述的水痘病毒滴度快速检测方法，其特征在于，所述的与病毒致 病性相关的水痘病毒包膜糖蛋白为糖蛋白gE、gB、gH中的一种。
3. 根据权利要求2所述的水痘病毒滴度快速检测方法，其特征在于，所述糖蛋白gE的 氨基酸序列如序列表中的序列1所示。
4. 根据权利要求2所述的水痘病毒滴度快速检测方法，其特征在于，所述糖蛋白gB的 氨基酸序列如序列表中的序列2所示。
5. 根据权利要求2所述的水痘病毒滴度快速检测方法，其特征在于，所述糖蛋白gH的 氨基酸序列如序列表中的序列3所示。
6. 根据权利要求1所述的水痘病毒滴度快速检测方法，其特征在于，步骤2)中所述的 甲醛丙酮缓冲液为PBS、甲醛和丙酮的混合物，所述PBS、甲醛和丙酮的体积比为： PBS 1. 2 甲醛 1.0 丙酮 1.8。
7. 根据权利要求6所述的水痘病毒滴度快速检测方法，其特征在于，所述的甲醛丙酮 缓冲液配置后在_2〇°C放置3小时以上再使用。
8. 根据权利要求1所述的水痘病毒滴度快速检测方法，其特征在于，步骤2)中所述的 洗液为PBS和Tween 20的混合物，所述Tween 20的浓度为0? 01?0? 1 %，其优选浓度为 0? 05%。
【文档编号】G01N33/569GK104407147SQ201410419594
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年8月25日 优先权日:2014年8月25日
【发明者】高辉 申请人:北京合康源生物科技有限公司