专利名称：一种jc病毒的检测方法、其试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种病毒的检测方法和试剂盒，具体讲，涉及ー种JC病毒的检测方法及其试剂盒。
背景技术：
JC病毒(JCV)属人类多瘤病毒，是ー种小双链DNA病毒。JCV由PADGETT于1971年等首先在进行性多灶性脑白质病(Progressive Multifocal Lukoenphalapathy,PML)患者中发现并分离出。该病毒只有ー种血清型，但可分为30多个基因型。JCV是ー种机会感染性病原，正常人群中血清学阳性率高达80%以上。初次感染 一般发生在儿童时期，并且多无症状。JCV可通过分娩(胎盘)、哺乳或长期共同生活接触从母亲传播给子女，也可通过呼吸道、消化道传播。初次感染后，JCV以潜伏状态存在于人体组织，但是当宿主免疫力降低时，病毒可以重新激活复制，并且导致宿主病理改变。JCV具有明显的嗜神经性特点，严重免疫抑制患者感染JCV后可引起进行性多灶性脑白质病(PML)。PML主要发生于淋巴网状内皮细胞恶性肿瘤如慢性淋巴细胞性白血病、淋巴增生障碍(如淋巴瘤)、实质性器官瘤、重度免疫抑制的患者(包括爱滋病、系统性红斑狼疮、韦格肉芽肿病、硬皮病、皮肌炎、多发性肌炎及类风湿性关节炎等)和器官移植后药物治疗所致严重免疫抑制患者。JCV还能在肾脏组织中复制，并通过尿液排出病毒。器官移植后，免疫抑制剂的使用是诱导多瘤病毒激活复制的重要原因，其中，40%以上的肾移植患者可检测到JCV的复制。与BK病毒(BKV) —祥，JCV的感染也可致肾移植患者的多瘤病毒相关性肾病(PVAN)。PVAN被认为是影响肾移植手术成功与否最关键的因素之一。形态学上，比如Decoy细胞检测与肾组织活检均不能区分BKV与JCV感染。JCV具有致瘤性。近年国外研究结果发现，JCV在体外可使人及动物多种组织类型正常细胞发生恶性转化，在仓鼠及转基因小鼠体内可诱发多种肿瘤形成，但其致瘤机制尚不清楚。目前没有针对JCV有效的抗病毒药物，早期诊断是JCV感染相关疾病防治的最好手段。确认JCV感染的检测包括检测血清中特异性VPl抗体；对感染者的尿液、脑脊液、血液及病变组织进行JCV DNA检测；对活组织进行原位杂交及免疫组化检测等。由于JCV在人群中感染率很高，抗体检测并非确证活动性JCV感染的可靠方法。国外研究认为，利用聚合酶链式反应(PCR)对尿液、血液或脑脊液特异性地检测JCV DNA是PVAN或PML早期诊断 及预测的最佳方法。PCR技术检测方法的灵敏度为75%，特异度则高达96%，同时可以区分BKV与JCV的感染。荧光定量PCR比常规PCR具有更高的灵敏度、特异性，操作更加快速、方便，是用于JCV DNA检测的理想手段。目前国内对JCV的研究尚属空白，更没有成熟的检测方法或试剂。综上亟需能够实现快速、有效且准确检测JC病毒的产品，以用于JC病毒载量的检測，JC病毒相关性疾病的预测及治疗监測。
发明内容
本发明的首要目的是提供ー种用于检测JC病毒的方法；本发明的第二发明目的在于提出检测JC病毒的试剂盒；本发明的第三发明目的在于提出该检测JC病毒试剂盒的应用。为了完成本发明的目的，采用的技术方案为本发明涉及ー种JC病毒的检测方法，包括以下步骤(I)针对JC病毒基因组设计特异性引物JCV-F和JCV-R，Taqman荧光探针JCV-P，
Taqman荧光探针JCV-P的5’端标记有荧光基团，在除5’端外的任意ー个位置上标记有淬灭基团，优选为3’端；(2)处理待测样本，进行PCR反应；(3)通过荧光定量PCR仪检测反应结果；其中，JCV-F的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，或由SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；JCV-R的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，或由SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；JCV-P的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示，或由SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列。其中，SEQID NO 1 的核苷酸序列为 GGTATACACAGCAAAAGAAGCAACA，SEQ ID NO 2 的核苷酸序列为 CAGTGATGATGAAAACACAGGATCC，SEQ ID NO 3 的核苷酸序列为 GCATGCAGATCTACAGGAAAGTCTTTAGGGT。本发明的第一优选技术方案为，所述的Taqman突光探针的突光报告基团选自由6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4’，5’ - ニ氯-2’，7’ - ニ甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁5或花菁5. 5中的至少ー种；所述荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、4-(4- ニ甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂I、黑洞淬灭剂2或黑洞淬灭剂3中的至少ー种。本发明的第二优选技术方案为当突光淬灭基团选自4-(4-ニ甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸时,突光报告基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4’，5’ - ニ氯-2’，7’ - ニ甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酷、六氯-6-甲基荧光素、花菁3中的至少ー种；当荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明时，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4’，5’ - ニ氯-2’，7’ - ニ甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯或六氯-6-甲基荧光素中的至少ー种；当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂I吋，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基_4’，5’ - ニ氯_2’，7’ - ニ甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酷、六氯-6-甲基荧光素或花菁3中的至少ー种；当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂2时，荧光报告基团选自6-羧基四甲基罗丹明、花菁3、羧基-X-罗丹明或磺酰罗丹明中的至少ー种；
当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂3时，荧光报告基团选自花菁5或花菁5. 5中的ー种。最优选地，所述荧光报告基团为6-FAM ;所述荧光淬灭基团为BHQl。本发明的第三优选技术方案为，步骤(2)中PCR反应的反应体系包括PCR反应液19.84 1、0嫩聚合酶0.2“1、待检模板5.(^1 ；其中，PCR反应液的组成为10X反应缓冲液2.5 μ 1，JCV-F(10 μ Μ)O. 6 μ I,JCV-R(IOyM)O. 3 μ I, JCV-P (10 μ Μ) O. 7 μ I, dNTP 3. O μ 1，最后用无菌超纯水将反应体系补至 19. 8 μ I。
本发明的第四优选技术方案为步骤⑵中PCR反应的反应条件为92 95°C条件下反应3 5分钟；然后92 95°C，10 15秒，55 65°C，10 35秒，共35 45个循环；优选94°C条件下反应4分钟；然后94°C，15秒，60°C，35秒，共40个循环。本发明的第五优选技术方案为所述的PCR反应均设置阴性质控组和JC病毒定量标准品I IV组，其中阴性质控组的待测模板为纯水，JC病毒定量标准品I-IV的待测模板分别为JCV定量标准品I、JCV定量标准品II、JCV定量标准品III、JCV定量标准品IV。本发明的第六优选技术方案为JCV定量标准品I IV的构建方法包括以下步骤(I)配制PCR反应体系，加入提纯的病毒基因组，进行PCR反应；(2)将扩增产物插入T载体构建重组质粒，经基因测序确认正确后将重组质粒转化细菌扩增；(3)提纯重组质粒后利用紫外分析法測定吸光度，计算质粒浓度，最后将重组质粒稀释成4个梯度5X IO5 5X 108COpieS/ml，分别作为试剂盒的JCV定量标准品I、JCV定量标准品II、JCV定量标准品III、JCV定量标准品IV。本发明的第七优选技术方案为所述的待测样本的处理方法包括磁珠提取法、柱提法、煮沸裂解法和十六烷基三甲基溴化铵法。本发明的第八优选技术方案为荧光定量PCR仪检测反应结果；如果检测通道没有出现S型扩增曲线，判为JC病毒阴性；如果检测通道出现S型扩增曲线，则判定为阳性，并利用JCV定量标准品检测所生成的标准曲线计算待测样本的浓度(copies/ml)。 本发明的第九优选技术方案为荧光定量PCR仪检测反应结果，采用荧光定量PCR仪，荧光信号收集时设定为FAM荧光素，荧光信号收集设在60°C。本发明还涉及ー种JC病毒的检测试剂盒，所述的试剂盒包括PCR反应液、耐热DNA聚合酶、待检模板、阴性质控组和JC病毒定量标准品I IV组。其中，其中，JCV-F的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，或由SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；JCV-R的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，或由SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；JCV-P的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示，或由SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列。本发明还涉及所述的JC病毒的检测试剂盒在检测和/或诊断JC病毒相关性疾病中的应用。JC病毒的感染与多瘤病毒相关性肾病、骨髄移植患者的出血性膀胱炎、进行性多灶性脑白质病、肺部疾病、肿瘤、自身免疫性疾病等有夫。下面对本发明的技术方案做进ー步的解释和说明本发明的首要目的是解决目前缺乏JC病毒检测产品的问题，提供一种检测JC病毒的方法，使用该方法可以实现对JC病毒的快速、有效且准确的定量或定性检测，来保证及时的JC病毒载量的检测，JC病毒相关性疾病的预测及治疗监測。本发明涉及ー种用于检测JC病毒的试剂盒，该试剂盒具有敏感性高、特异性好、反应快速且成本低的优势，适合于大规模临床开展；可以实现对JC病毒的快速、有效且准确的定量检测，因而能保证及时的病例诊治及治疗效果监测。本发明针对JC病毒基因组设计特异性引物JCV-F和JCV-R，Taqman荧光探针JCV-P7Taqman荧光探针JCV-P的5’端标记有荧光基团，在除5’端外的任意ー个位置上标记有淬灭基团，优选为3’端；本发明在PCR扩增时在加入ー对引物的同时加入一个特异性 的突光探针，该探针为ー寡核苷酸，两端分别标记一个报告突光基团和ー个淬灭突光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时Taq酶的5’_3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同歩。所述荧光报告基团和所述荧光淬灭基团选自由6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein, FAM)、四氣-6-羧基灭光素(tetrachloro-6-carboxyfIuorescein, TET)、六氣 _6_ 甲基突光素(Hexachloro-6-methylfluorescein, HEX)、6_ 竣基四甲基罗丹明(6-carboxytetramethy lrhodamine, TAMRA)、横酸罗丹明(Sulforhodamine 101,Texas Red)、羧基-X-罗丹明(Carboxy-x-rhodamine, R0X)、花菁 3(cyanine3, Cy3)、花菁3. 5 (cyanine3. 5, Cy3. 5)、花菁 5 (cyanine5，Cy5)、花菁 5· 5 (cyanine5. 5, Cy5. 5)、生物搜索技术公司(Biosearch Technologies, Inc)的黑洞萍灭剂 I (Black Hole Quencher 1，BHQ1)、黑洞淬灭剂 2 (Black Hole Quencher 2, BHQ2)、黑洞淬灭剂 3 (Black Hole Quencher3，BHQ3)、4_(4_ ニ 甲基氛基苯偶氣基)苯甲酸(4-(4，-dimethy laminopheny Iazo)benzoic acid, DABCYL)、6_羧基_4’，5’ -ニ氯-2’，7’ - ニ甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酷(6_Carboxy-4’，5’ -dichloro_2’，7’ -dimethoxyf luorescein, JOE)和美国应用生物系统公司的VIC荧光染料所组成的组中。优选地，所述荧光报告基团选自由6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基_4’，5’ - ニ氯_2’，7’ - ニ甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酷、花菁3、花菁5和花菁5. 5所组成的组中；所述荧光淬灭基团选自由6-羧基四甲基罗丹明、4- (4- ニ甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸DABCYL、BHQ1、BHQ2和BHQ3所组成的组中。更优选地，按照下表I所不来选择突光报告基团和突光淬灭基团。表I :
荧光淬灭基团荧光报告基团
DABCYL6-FAM、TET、JOE、HEX、Cy3 中的全少ー种
权利要求
1.ー种JC病毒的检测方法，包括以下步骤 首先针对JC病毒基因组设计特异性引物JCV-F和JCV-R，Taqman荧光探针JCV-P，Taqman荧光探针JCV-P的5’端标记有荧光基团，在除5’端外的任意ー个位置上标记有淬灭基团，优选连接于3’端； 然后，处理待测样本，加入所述的特异性引物及探针进行PCR反应； 最后通过荧光定量PCR仪检测，得到反应结果； 其中，JCV-F的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，或由SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列； JCV-R的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，或由SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列； JCV-P的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示，或由SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列。
2.根据权利要求I所述的JC病毒的检测方法，其特征在于，所述的Taqman荧光探针的荧光报告基团选自由6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4’，5’ - ニ氯-2’，V - ニ甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酷、花菁3、花菁5或花菁5. 5中的至少ー种； 所述荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、4-(4-ニ甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂I、黑洞淬灭剂2或黑洞淬灭剂3中的至少ー种；
3.根据权利要求2所述的JC病毒的检测方法，其特征在于， 当突光淬灭基团选自4-(4-ニ甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸时,突光报告基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4’，5’ - ニ氯-2’，7’ - ニ甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、六氯-6-甲基荧光素、花菁3中的至少ー种； 当荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明时，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基_4’，5’ - ニ氯_2’，7’ - ニ甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯或六氯-6-甲基荧光素中的至少ー种； 当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂I吋，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基_4’，5’ - ニ氯_2’，7’ - ニ甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酷、六氯-6-甲基荧光素或花菁3中的至少一种； 当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂2时，荧光报告基团选自6-羧基四甲基罗丹明、花菁3、羧基-X-罗丹明或磺酰罗丹明中的至少ー种； 当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂3吋，荧光报告基团选自花菁5或花菁5. 5中的ー种； 优选的，所述荧光报告基团为6-羧基荧光素；所述荧光淬灭基团为黑洞淬灭剂I。
4.根据权利要求I所述的JC病毒的检测方法，其特征在于，步骤⑵中PCR反应的反应体系为PCR反应液19. 8 μ 1.DNA聚合酶O. 2 μ I和待检模板5. O μ I ; 其中，PCR反应液的组成为10Χ反应缓冲液2.5 μ 1，JCV-F(10 μ Μ) O. 60 μ 1，JCV-R(IOyM)O. 30 μ 1，JCV-P(IOyM)O. 70 μ 1，dNTP3. O μ 1，最后用无菌超纯水将反应体系补至 19. 8 μ I。
5.根据权利要求I所述的JC病毒的检测方法，其特征在于，步骤⑵中PCR反应的反应条件为92 95°C保温3 5分钟后；92 95°C，10 15秒，55 65°C，10 35秒，共35 45个循环；优选为94°C保温4分钟后；94°C，15秒，60°C，35秒，共40个循环。
6.根据权利要求I所述的JC病毒的检测方法，其特征在于，步骤(2)中的PCR反应中，还设置阴性质控组和JC病毒定量标准品I IV组；其中，阴性质控组的待测模板为纯水，JC病毒定量标准品I IV的待测模板分别为JCV定量标准品I、JCV定量标准品II、JCV定量标准品III、JCV定量标准品IV。
7.根据权利要求6所述的JC病毒的检测方法，其特征在干，JCV定量标准品I IV的构建方法包括以下步骤 (1)配制PCR反应体系，加入提纯的JC病毒基因组，进行PCR反应； (2)将扩增产物插入T载体构建重组质粒，经基因测序确认正确后，将重组质粒转化细菌扩增； (3)提纯重组质粒后利用紫外分析法測定吸光度，计算质粒浓度，最后将重组质粒稀释成4个梯度5X 105、5X 106、5X 107、5X 108copies/ml，分别作为试剂盒的JCV定量标准品I、II、III、IV。
8.根据权利要求I 7任ー权利要求所述的JC病毒的检测方法，其特征在于，所述的待测样本的处理方法包括磁珠提取法、柱提法、煮沸裂解法和十六烷基三甲基溴化铵法，优选煮沸裂解法。
9.根据权利要求I 8任ー权利要求所述的JC病毒的检测方法,其特征在于,突光定量PCR仪检测反应结果吋，当检测通道出现S型扩增曲线，判定为阳性，并利用JCV定量标准品检测所生成的标准曲线计算待测样本的浓度；当检测通道没有出现S型扩增曲线，判定为JC病毒阴性。
10.ー种JC病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括检测组、阴性质控组和JC病毒定量标准品I IV组，其中，检测组包括PCR反应液、耐热DNA聚合酶、待检模板，所述的PCR反应液中含有特异性引物JCV-F、特异性引物JCV-R和Taqman荧光探针JCV-P。
11.权利要求10所述的JC病毒的检测试剂盒在检测和/或诊断JC病毒相关性疾病中的应用，JC病毒相关性疾病选自多瘤病毒相关性肾病、骨髄移植患者的出血性膀胱炎、进行性多灶性脑白质病、肺部疾病、肿瘤或自身免疫性疾病。
全文摘要
本发明涉及一种病毒的检测方法和试剂盒，具体讲，涉及一种JC病毒的检测方法及其试剂盒。本发明的检测方法包括以下步骤首先针对JC病毒基因组设计特异性引物JCV-F和JCV-R，Taqman荧光探针JCV-P，Taqman荧光探针JCV-P的5’端标记有荧光基团，在除5’端外的任意一个位置上标记有淬灭基团；然后处理待测样本，进行PCR反应；最后通过荧光定量PCR仪检测反应结果。本发明的检测方法可进行定性、定量检测，具有敏感性高、特异性好、反应快速且成本低的优势。本发明还涉及JC病毒的检测试剂盒及其应用。
文档编号C12Q1/68GK102690895SQ20111021189
公开日2012年9月26日 申请日期2011年7月27日 优先权日2011年7月27日
发明者叶锋, 宋玉亮, 王新颖, 石炳毅, 范宇, 蔡明 , 解俊杰, 钱叶勇, 韩永 申请人:中国人民解放军第三〇九医院, 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司