专利名称：染色样品中生物聚合物的快速检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及原位杂交领域。更具体地，涉及使用原位杂交分析手段检测在一个染色细胞中少至1个拷贝的细胞的生物聚合物(biopolymer)。
原位杂交提供了在单细胞水平鉴定和定量组织中诸如核酸(DNA和RNA)和蛋白质之类的生物聚合物的技术。这种杂交技术能在单细胞水平上检测组织中特定基因的存在或缺失。原位杂交程序还能用来在单细胞水平检测基因产物的表达。
通过使用特异的核酸(RNA或DNA)探针，能检测感染的和其他疾病状态的遗传标志。某些遗传疾病的特征是存在一些在正常细胞中并不存在的基因。其他一些致病因素的特征是表达一些在正常细胞中并不表达的DNA或RNA的翻译产物(即，多肽或蛋白质)。某些疾病状态的特征是缺失某基因或基因片段，或者是基因产物或蛋白质之表达的缺失或改变。
现有技术能检测这些标志，但是相对费时且灵敏度有限。杂交技术的基础是，单链DNA或RNA与互补的核酸链的配对(即杂交)能力。这种杂交反应使得特异性探针的发展能够鉴别特异的基因(DNA)，或多聚核苷酸顺序的存在，或者鉴定这些基因的转录(mRNA)和表达。
溶液杂交法在进行杂交反应之前，需要破坏细胞并从细胞中分离出核酸，从而牺牲了细胞完整性、检测的三维的分辨力和灵敏度。原位杂交能在个体细胞中检测RNA或DNA顺序。原位杂交能排除周围的和其他细胞外源的RNA和DNA对特定靶基因、核酸或蛋白质的稀释作用，从而具有比溶液杂交法更高的灵敏度。原位杂交还能同时检测多种物质，即在个体细胞中的基因、核酸或蛋白质，从而能够鉴定特定的表达细胞基因或病毒顺序的细胞。此外，因为原位杂交分析能对单细胞进行操作和定量分析，所以只需最低限度的样品和试剂。
在本发明之前，原位杂交程序只能检测在每个细胞中大于10拷贝的核酸。这样的程序需至少8小时到超过14天的时间来操作。以前的原位杂交程序既不能定量，也不能同时进行多种检测。最近一段时间，在两个悬而未决的美国专利SN.784，690(1991年10月28日申请)和SN.668，751(1991年3月13日申请)中公开的原位杂交程序，已经将时间减少到少于4小时，并且将灵敏度提高到单拷贝每个细胞。
传统的鉴别细菌的实验室方法很大程序上依赖使用简易的或特异的微生物学测试(如Gram染色)、在多种普通的(或特异的)底物的生长、以及随后使用特定的生化测试。近年来，微生物分类学中出现的一个大趋势是，用直接的分子特征，即DNA碱基组成，DNA/DNA杂交，基因测序等，来定义分类单位。这些方法使细菌进化方面的研究发生了变革，但是，对在给定环境或样品中鉴别出特定生物贡献很少。因此，分离纯培养物并用传统的程序进行培养物鉴定的方法，大体上保持不变。
最近已经开始尝试发展快速鉴定微生物的方法学。其中之一使是使用对生物的16SrRNA特异的DNA探针。但是，已有技术存在方法上的缺陷，没有足够的检测16S DNA的灵敏度，即检测少至7个拷贝16S DNA的水平(S.Jinks-Robertson et al.，In Cellular and Molecular Biology，2∶1367-1385(1987))。使用16S DNA的一个优点在于现在已有大量的碱基顺序数据信息。大约1000种16SDNA顺序已被制成文件用于细菌系统发生的研究。该碱基数据包括了大量细菌(包括病原体)的数据。从技术前景看，16S DNA的片段能作为分子探针，用于任何细菌的物种鉴定，无论是活的、快速生长的，还是死的、休眠的有机体。
在细胞学和组织学的样品中使用了大量不同的染色方法，例如，潘帕尼可拉氏染色(papanicolaou stain)是一种用于从宫颈样本(cervical specimen)获得的细胞的染色法。通常，从一个病人仅制备一个载物片并将其染色。如果，例如，在染色的载物片上有一些被怀疑为人乳头瘤病毒(HPV)感染的细胞，已有技术没有提供一种去除盖玻片(coverslip)并用原位杂交方法分析这些可疑细胞的方法。相应地，必须获得额外的样本，但在随后的采样中存在潜在的错过病灶的可能。
已有技术还存在缺陷，即不能将原位杂交程序用于检测染色样品中细菌或者病毒的DNA或mRNA或细胞基因。应用原位杂交技术检测DNA或者RNA和mRNA的形式，然后在染色的组织学或细胞学样品中鉴定细菌或病毒菌株和细胞基因，是该技术领域中长期已来迫切需要和期待解决的技术问题。
在本发明的一个具体实施中，提供了一种检测在具有基本完整细胞膜的预先染色样品中生物聚合物存在的方法。这种“两步骤”方法包括了测定细胞的生物聚合物的存在。首先，样品可通过加热固定或者用含某种沉淀剂和/或交联剂的介质固定。随后，固定的细胞与杂交液接触。杂交液含有变性剂，杂交稳定剂，缓冲剂，选择性膜成孔剂和至少一种探针，探针具有与被检测的特定的靶核苷酸至少基本互补的核苷酸顺序。然后，细胞样品在至少一种可检测的标记物存在下与杂交溶液一起保温。该方法能检测少至单个生化聚合物每个细胞。
在本发明的另一实施例中，提供了一种“一步骤”方法，检测具有基本完整细胞膜的预先染色的样品中的生物聚合物的存在。该方法包括了测定细胞的生物聚合物的存在。首先，样品与含有变性剂，杂交稳定剂，缓冲剂，膜成孔剂和至少一种探针的介质接触。最佳地，介质含有固定剂。样品是在杂交条件下进行接触的。随后，细胞样品在至少一种可检测的标记物的存在下，与介质一起保温。通过检测标记物而检测出双链体或三链体，而不需为了阻断探针的非特异结合而进行预杂交步骤，从而便于探针进入。该方法能检测单拷贝每细胞的靶生物聚合物。
在本发明的另一实施例中，提供了一个用于确定在预先染色的具有基本完整细胞膜的样品中某生物聚合物存在与否的试剂盒(kit)。该试剂盒能用于测定细胞的生物聚合物。试剂盒含有杂交液，该杂交液含有变性剂，杂交稳定剂，缓冲剂和膜成孔剂，最好还含有固定剂。试剂盒还可以任意地含有一种选择的探针，从而该探针能与可疑的生物聚合物杂交形成杂交复合物。此外，该试剂盒可以含有将所述的可疑样品与探针接触从而形成杂交复合物的设备，和测量标记的探针的设备。
图1显示了在预先用潘帕尼可拉氏染色法染色的宫颈细胞中，检测HPC的结果。
图2显示了在预先用潘帕尼可拉氏染色法染色的细胞中，同时检测和区分16型和18型HPV的结果。
图3显示了在预先用苏木精和曙红染色的宫颈组织中，检测HPV的结果。
图4显示了在预先用Diff-Quick方法染色的细胞中，检测染色体DNA的结果。
本发明的新方法能用于检测大量不同的微生物，这些微生物正是导致许多疾病生理状态的原因。例如，本发明的方法能用来检测导致诸如败血症，性传染疾病，腹泻和呼吸道疾病之类的疾病生理状态的微生物。
本发明的新方法能用来检测大量不同的细菌、病毒和真菌。能被本发明方法检测的细菌的代表性的例子包括链球菌属(Strepococ-cus)，葡萄球菌属(Staphylococcus)，梭状芽胞杆菌属(Clostridium)，芽胞杆菌属(Bacillus)，假单胞菌属(Pseudomonas)，沙门氏菌属(Salmonella)，克雷伯氏杆菌属(Kleb-siella)，类(拟)杆菌属(Bacteroides)，大肠杆菌(Escherichia coli)，淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonrrhea)和衣原体属(Chlamydia)。真菌的代表性的例子包括念球菌属(Candida)，新型隐球菌(Cryptococ-cus neformans)，皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitides)，荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)，粗球孢子菌(Coccidioides immi-tis)和巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)。可检测的病毒的代表性的例子包括人乳头瘤病毒，Ⅱ型单纯疱疹病毒，肝炎病毒，人体免疫缺陷病毒，流感病毒，副流感病毒和轮状病毒。
螺旋体的代表性的例子包括苍白密螺旋体(Treponema pal-lidum)，伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)和钩端螺旋体属(Lep-tospira)。原生动物的代表性的例子包括痢疾内变形虫(Entamoe-ba histolytic)，结肠袋虫(Balantidium coli)，贾第虫(Giardia lambli-a)，Leishmania tropica，疟原虫属(Plasmodium)，阴道毛滴虫(Tri-chomonas vaginalis)和锥体虫属(Trypanosoma)的物种。
除了能检测微生物，本发明方法还用来检测和定量预先染色的哺乳动物样品中的细胞基因。这样的细胞基因的代表性的例子包括致癌基因，肿瘤抑制基因和生长刺激因子基因。较佳地，这样的致癌基因是neu(c-erb-B-2)，c-ras，c-myc，和c-myb。同样，本发明方法能用于检测和定量肿瘤抑制基因及刺激生长因子基因。肿瘤抑制基因的例子包括P53和成视网膜细胞瘤基因。生长因子的代表性的例子包括集落刺激因子-粒性细胞/巨噬细胞(CSF-GM)，转化生长因子(TGF-α)和表皮生长因子(EGF)。本技术领域的普通技术人员会理解到，其他的细胞生物聚合物，采用本发明方法能从预先染色的样品中检测出并加以定量。
有一点是特别期望的，即大量不同的细胞样品和组织样品能用于本发明所描述的技术中。这些细胞样品包括下列代表性的例子宫颈细胞，骨髓细胞，肝细胞，脑脊髓液细胞，血细胞，口腔粘膜细胞，肺细胞和皮肤细胞。组织样品的代表性的例子包括淋巴结组织，乳房组织，宫颈组织，结肠组织，前列(腺)组织，心组织和脑组织。此外，还能检测体液和分泌物，如尿，粪便，痰。
用于本发明方法的细胞及组织样品，可以是用细胞学或组织学中任何一种常用染色法染色的。代表性的染色法的例子包括潘帕尼可拉氏染色法，Wright染色法和苏木精/曙红染色法，以及Diff-Quick染色法。
制作细胞/组织样品原位杂交程序的第一步骤可以是将样品的沉积于固体承载物上。样品的构成为含有细胞或部分细胞，或者由细胞或部分细胞组成的任一材料。细胞可以是活的或者死的，只要靶生物聚合物，即DNA或mRNA，基本上未改变或未破坏，能被检测。样品须含有基本完整的细胞膜。虽然并不必须所有的膜结构保持完整，但是膜必须充分保存从而能够保留靶生物聚合物并能够将检测探针引入生物聚合物位点。
将样品沉积于固体姑载物的技术取决于细胞或组织的类型。它们包括，例如，组织的标准切片或涂片或单细胞悬浮液的细胞离心。
许多类型的固体承载物都能用于本发明。能够使用的承载物包括(但不局限于)玻璃，苏格兰带(Scotch tape)(3M)，尼龙，Gene Screen Plus(New England Nuclear)和硝酸纤维。最佳的是显微镜载玻片。使用这些承载物以及在上面沉积样品的程序，对于本技术领域的技术人员来说是很明显的。选择承载物的材料取决于观察细胞的程序以及所使用的定量程序。某些过滤材料并非均匀厚薄的，因此，在原位杂交程序中收缩和膨胀不均匀。此外，某些自发荧光的承载物会干扰低水平荧光的确定。作为固体承载物，显微镜载玻片是最优选的，因为它具有高的信号/噪声比率并能经处理更好地保留组织。
一步骤法中细胞制备在本发明的一步骤原位杂交程序中，组织样品用物理、化学或酶法破碎成单细胞悬浮液。
将单一溶液加于细胞/组织(下文简称作“样品”)。溶液含有下列一种可加可不加的温和固定剂，一种离液序列高的试剂(chaotrope)或其他的变性剂，一种合成的寡核苷酸探针(预先标记的RNA或DNA探针)和/或抗体探针，盐，去垢剂，缓冲剂和封闭剂(blocking agent)。在该溶液中的保温在40℃-60℃进行5-30分钟。
在一步骤法程序中，不论样品是悬浮的还是在固体承载物上，杂交程序用单一杂交溶液进行。任意地，同样能固定细胞的溶液中可含有一种温和的固定剂。固定化是在与杂交反应同样的溶液中并且与杂交反应一起完成的。固定剂是一种已经被发现的对被分析的特定的细胞类型最理想的固定剂(例如，外骨髓和周围血液有一种最理想的固定剂，尽管该“组织”含有无数截然不同的细胞类型)。固定剂可以是沉淀固定剂(如乙醇)和交联固定剂(如醛)的组合，其中交联固定剂的浓度很低(少于10%)。沉淀固定剂和交联固定剂的浓度和类型是可变的，取决于探针以及所需要的探针的严紧度(strin-gency)，和所期望的杂交温度。
固定剂以及固定化程序的选择会影响细胞成分和细胞形态;这样的影响可以是组织特异性的。较佳地，沉淀固定剂具有以下特征通过沉淀作用固定细胞成分;结果是可逆的，细胞形态被保留，所期望的细胞成分的抗原性被保留，核酸被保留在细胞中的适当位置;核酸没有被修饰以至于不能形成双股或三股杂交链;细胞成分没有受到影响以至于抑制核酸与所有存在的靶顺序杂交。较佳地，用于本发明的固定剂选自如下乙酸，乙醇-乙酸，甲醇和甲醇-丙酮。实施一步骤程序的最佳的固定剂包括10-40%乙醇，10-40%甲醇，10-40%丙酮或其组合。这些固定剂能很好地保持细胞形态，保护抗原并维持其可接受性(accessibility)并具有高的杂交效率。典型地，溶液含有1-40%乙醇，和5%福尔马林。
在两步骤法中固定细胞/组织在将样品沉积于固体承载物或将它们留在溶液中之后，固定样品。固定剂选自任意沉淀固定剂或交联固定剂或它们的组合;固定剂可以是水溶液或非水溶液。固定剂选自下列物质组成的组甲醛溶液，乙醇，盐溶液，氯化汞，氯化钠，硫酸钠，重铬酸钾、磷酸钾，溴化铵，氯化钙，乙酸钠，氯化锂，乙酸铯，乙酸钙或乙酸镁，硝酸钾，重铬酸钾，铬酸钠，碘化钠，碘酸钠，硫代硫酸钠，苦味酸，乙酸，仲甲醛，氢氧化钠，丙酮，氯仿，甘油和百里酚。
较佳地，固定剂含有通过沉淀作用将细胞成分固定的试剂并且具有以下特征结果是可逆的，细胞形态被保留，所期望的细胞成分的抗原性被保留，核酸被保留在细胞中的适当位置;核酸没有被修饰以至于不能形成双股或三股的杂交链;细胞成分没有被影响以至于抑制核酸与所有存在的靶顺序杂交。较佳地，用于本发明的固定剂选自下列物质组成的组乙酸，乙醇-乙酸，甲醇和甲醇-丙酮，这些固定剂能满足于高效的杂交并很好地保护了细胞形态。
固定剂同时可以含有一种化合物，该化合物通过将这些材料(如戊二醛或甲醛)交联在一起而固定细胞组份。交联剂一般更加“粘”，并导致细胞和膜组份被固定住或粘住，从而维持了上面提及的固定剂的特征。使用时，交联剂最好少于10%(体积/体积，V/V)。
交联剂在保护超微结构时，常常因为形成网状物将核酸和抗原包被其中，导致它们不能为探针和抗体接近，从而降近了杂交的效率。某些交联剂还共价修饰核酸，从而阻止了以后杂交链的形成。交联剂的例子包括仲甲醛，甲醛，dimethylsilserimidate和乙基二甲基氨基-丙基碳化二亚胺(ethyldimethylamino-propylcarbodimide)细胞/组织的贮藏在固定之后，显微镜载物片和其他含有样品的固体承载物可以经空气干燥，在室温下贮藏6个月，在冷的(4℃)70%乙醇水溶液中可贮藏6-12个月。如果样品在无RNA酶的条件下处理，那么样品可在梯度乙醇中脱水并且在室温下贮藏至少12个月。
预杂交处理根据本发明，不需要任何正式的预杂交步骤。阻断探针的非特异结合以及方便探针的进入都能在杂交溶液中完成。如果想做短暂杂交(少于30分钟)，那么载物片在加入杂交溶液之前，可以预先加热至杂交温度。
杂交核酸杂交是这样一个过程，其中二个或更多的自然存在的或人工合成的DNA，RNA，寡核苷酸多聚核苷酸或它们的任何组合的双重或三重镜像或相反链互相识别，并且通过形成某种形式的自发的或诱导的化学键，通常为氢键，从而结合在一起。结合的程度能加以控制，取决于汇合的核酸的类型，由正常的汇合的核酸决定的“正确”结合的程序以及由正常的形成化学键和配对的化学规则决定的“正确”结合的程序。例如，如果两条链在链长为10时，在10个中形成了9个正确的配对，那么该结合被说成具90%同源性。
细胞核酸顺序能用分子杂交的方法检测。探针必须以某种方式“标记”从而允许检测在个体细胞中存在的任何互补的细胞核酸顺序。
在本发明中，术语“杂交”同样意指抗体对靶抗原的结合。
在一步骤杂交程序中，杂交混合溶液含有变性剂，通常为甲酰胺，但是其他离液序列高的试剂，例如NaI，尿素，硫氰酸(盐)，胍，三氯乙酸(盐)，四甲基胺和高氯酸盐也都能作用。此外，几种沉淀和/或交联固定剂也具有温和的变性特性;这些性质能通过与主要的变性剂以加和或协同形式加以利用。杂交混合液构成的不同可以有选择地允许仅形成RNA-RNA或RNA-DNA杂交链。这一点可以通过调节变性剂的浓度以及盐浓度(主要是单价的I主族的金属阳离子和铵离子)以及杂交温度来达到。这样允许探针选择性地或者与细胞RNA或者与DNA，或者同时与RNA和DNA(用不同的探针)杂交。这还允许使探针可以存在于预先混合溶液中，从而在同时最适宜地“固定”细胞/组织形态时可以提供产生信号并最大限度减小噪声的最适条件。
杂交溶液成份杂交溶液可以典型地含有离液序列高的变性剂，缓冲剂，成孔剂，杂交稳定剂。离液序列高的变性剂包括甲酰胺，尿素，硫氰酸(盐)，胍，三氯乙酸(盐)，四甲基胺，高氯酸盐和碘化钠。任何将pH值维持在至少7.0-8.0之间的缓冲剂都可以使用。
成孔剂是，例如，诸如Brij35，Brij58，十二烷基磺酸钠，吐温(Tween)，CHAPS或TritonX-100之类的去污剂。根据靶生物聚合物的位置选择成孔剂，以便于探针通过细胞质膜，核膜或细胞区域化结构。例如，0.05%Brij35或0.1%TritonX-100允许探针通过细胞质膜，而不能通过核膜。相反，脱氧胆酸钠允许探针通过核膜。因此，为了将杂交局限于针对细胞质中的靶生物聚合物，那么就应避免使用核膜成孔剂。当靶生物聚合物位于细胞质时，这种选择性的亚细胞分布，通过消除探针与互补的细胞核顺序的杂交，从而提高了分析的特异性和灵敏度。除了去污剂之外的试剂，如固定剂，也具有(成孔)功能。
在杂交溶液中含有杂交稳定剂，例如一价和二价的阳离子盐，以促进探针与其靶生物聚合物之间互补顺序氢键的形成。较佳地，使用浓度为0.15M至1M的氯化钠。为了防止核酸探针的非特异结合，在杂交液中加入与靶生物聚合物无关的核酸。杂交稳定剂的代表性例子有氯化钠，氯化锂，氯化锰和硫酸铁。
制备用于流式细胞术分析的细胞当细胞用流式细胞术(flow cytomety)分析时，整个程序在样品处于溶液中进行操作。简而言之，细胞悬浮在“磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，然后离心沉淀。将固定剂或含固定剂的杂交液加于细胞沉淀。在再悬浮后，细胞按下面描述的方式进行保温。在离心，再悬浮和洗涤之后，细胞再悬浮于封固剂(mounting mediun)中并在流式细胞仪上分析。
探针类型探针定义为遗传物质DNA，RNA或寡核苷酸或含DNA或RNA的多聚核苷酸以及抗体。DNA或RNA可以由碱基腺嘌呤，尿嘧啶，胸腺嘧啶，鸟嘌呤，胞嘧啶或它们的任何自然的或人工的衍生物组成。探针可以通过与互补的或镜像靶细胞遗传顺序的结合，而形成双链或三链杂交物。结合通过一种或多种类型的化学键而发生，通常通过形成氢键。结合程度指在结合或杂交过程中允许错配的数目。探针与天然存在的或人工合成的靶细胞顺序的结合程序同样和探针与靶顺序的互补程度有关。探针的大小被调节到这样的程度在所期望的错配水平上形成稳定的杂交链;典型的，为了检测单一碱基错配需要约为12-50碱基的探针。更大的探针(从50碱基到数万碱基)更经常在错配水平用探针与靶遗传顺序的相似性的全百分比表示时使用。探针的大小也可以变化，从而允许或防止探针进入或结合于遗传物质或细胞的不同区域。类似的，探针的类型(例如，用RNA对DNA)可以达到这些目的。探针的大小同样影响探针扩散的速度，以及找到细胞的靶配对物的可能性等等。典型的，当核苷酸顺序是靶目标时，在杂交反应中使用双链DNA(dsDNA)，单链DNA(ssDNA)或RNA。
探针的制备可以用于本发明的RNA或DNA探针可以根据本技术领域的熟练技术人员知晓的方法进行制备，或者可以购得。RNA探针可以根据Green et al.(1981)Cell 32∶681中描述的方法进行制备。DNA探针可以根据本技术领域熟练技术人员知晓的方法进行制备，例如Rigby et al.(1977)J.Mol.Biol.113∶237描述的方法。人工合成的寡核苷酸探针可以如Wallace，et al(1979)Nucleic Acids Research6∶3543所描述的那样或者如核酸合成仪的厂商(如ABI)所建议的那样进行制备。用于本发明的探针也可根据两个悬而未决的专利申请U.S.SN784，690(1991年10月28日申请)和US.SN668，751(1991年3月13日申请)中所公开的方法进行制备。
核酸探针能用各种本领域技术人员公知的方法进行制备。纯化的双链DNA顺序(ds DNA)能用缺口翻译法或随机引物延伸法进行无损伤标记。双链探针与固定在细胞内的核酸的杂交能力，因为溶液中互补的链在与细胞核酸杂交之前先互相杂交，而有所下降。单链DNA(ss DNA)探针不受此限制，并且可以通过合成寡核苷酸，通过使用单链噬菌体M13或其质粒衍生物，或者通过反向转录纯化的RNA模板而制得。在杂交反应中使用单链RNA探针可能提供比使用单链或双链DNA探针更大的信号/噪声比。不论在杂交反应中使用dsDNA，ssDNA或ssRNA三股成环状探针，必须有检测杂交体形成的手段。检测杂交体形成的手段利用了用某种可检测的标记物“标记”的探针。
抗体探针对于本领域的技术人员是公知的。术语“抗体探针”指对任一靶抗原特异并与之结合的抗体。这样的靶抗原可以是多肽，蛋白质，碳氢化合物或任何其他生物聚合物，对于这些物质抗体会特异地结合。
抗体探针的制备对于抗原(例如病毒或其特异的决定族，不同来源的多肽和蛋白质，碳氢化合物部分以及大量不同的生物聚合物)特异的抗体探针对于本领域的技术人员来说是公知的。制备这样的抗体的方法对于本领域的技术人员来说同样是已知的。
简而言之，多克隆抗体可以通过用抗原免疫动物宿主而制备。较佳地，抗原按每周间隔皮下注射给宿主，随后在施用最后一次每周剂量一月之后，施用一次加强剂量。然后，收获血清，从中沉淀抗体和用本领域技术人员已知的技术被可检测地标记。
单克隆抗体的制备可以根据本领域技术人员已知的任何方法。将骨髓瘤细胞和免疫供体的脾组胞融合的方法，已经证明是一个成功的方法，它能产生遗传稳定的杂交瘤连续的细胞系，从而能产生大量针对靶抗原(如肿瘤和病毒)的单克隆抗体。例如，单克隆抗体的制备可以根据在Koprowski等的美国专利No.4，172，124所公开的方法，或根据Koprowski等的美国专利No.4，196，265。标记抗体的程序对本本领域技术人员是已知的。
检测系统在加入杂交之前，探针可以被可检测地标记。或者，可以挑选可检测的标记物，在杂交完成后加入，从而与杂交产物结合。为了用于本发明的实施，探针可用任何可检测的基团进行标记。这样的标记基团可以是任何具有可被检测的物理或化学特性的材料。这样的可检测标记物在免疫分析领域已经充分发展了，并且通常情况下，大多数任何可以用于这些方法中的标记物都能应用于本发明。特别有用的是酶活性基团，例如酶(参见Clin.Chem.，22∶1243(1976));酶底物(参见British Pat.Spec.1，548，741)，辅酶(参见U.S.Patents Nos.4，230，797和4，238，565);酶抑制剂(参见U.S.Patent No.4，134，792);荧光剂;(参见Chin.Chem.，25∶353(1979));发色团;发光剂，如化学发光剂(chemiluminescers)和生物发光剂(bioluminescers(参见Clin.Chem.，25∶512(1979);特异结合的配体;和最接近的相互作用的配对物;和放射性同位素，如3H，35S，32P，125I和14C。
生物素标记的核苷酸能通过缺口翻译，酶促法或化学法参入DNA或RNA。结合生物素探针在杂交之后能用抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白，荧光的、酶促的或胶态金偶联物检测出。核酸也可用其他荧光化合物、可免疫检测的荧光衍生物或者生物素类似物进行标记。与具有放射性或荧光的组蛋白HI，酶(碱性磷酸酯酶和过氧化物酶)，或单链结合(ssB)蛋白交联的核酸也可使用。为了增加检测胶态金或过氧化物酶产物的灵敏度，可以使用一些利用银溶液的增加或放大程序。
还可以使用一种间接免疫细胞化学程序(Rudkin and Stollar(1977)Nature 265∶472;Van Prooijen，et al.(1982)Exp.Cell，Res，141∶397).在该程序中，通过给动物注射多聚(Ra)-多聚(dT)(poly(Ra)-poly(dT)而产生针对RNA-DNA杂交链的多克隆抗体。将DNA探针与细胞进行原位杂交，然后，通过与针对RNA-DNA杂交链的抗体一起保温检测出杂交链。
探针的大小和浓度探针的长度影响它的扩散速率，杂交链形成速率，和杂交链的稳定性。根据本发明，小探针(15-100碱基)产生最灵敏、快速和稳定的系统。制备了短探针(15-100碱基)的混合物，它们覆盖了被检测的靶生物聚合物的全长。例如如果靶生物聚合物长1000碱基，那么在杂交液中使用约40个“不同的”长25个碱基的探针，从而完全覆盖靶生物聚合物的全部区域。
探针的浓度影响原位杂交反应的一些参数。可以使用高浓度以增加扩散程序，减少杂交反应的时间，并且使所有的细胞顺序饱和。为了在维持高信号/噪声比的同时使反应快速进行，杂交液中探针从浓度最好为0.01-100μg/ml。最佳的探针使用浓度为2.5μg/ml。
杂交溶液和温度在一个较佳的实施例中，一步骤原位杂交方法的杂交液由以下组成25%甲酰胺，5×SSC，15×Ficoll/PVP，0.4M异硫氰酸胍，约50mM磷酸钠(pH7.4)，50mM DTT，约1mg/ml鲑鱼精子DNA，5%TritonX-100，50mMEDTA和21%PEG。将人工合成的寡核苷酸加到该溶液中。探针大小不少于15-20碱基，较佳地约25碱基，用光生物素(PhotobitinTM)标记。最佳的最适杂交温度为40-45℃。然而可以使用的温度可从15-80℃。
在一步骤法和二步骤法中，杂交混合液中的探针可以在杂交反应之前标记。探针可以是前面提及的许多类型中的一种。如果探针用PhotobiotinTM标记，杂交物可以通过使用与荧光分子(例如FITC，若丹明，Texas RedTM)偶联的链霉抗生物素蛋白/抗生物素蛋白(S/A);或者与酶偶联的S/A;或者用诸如胶态金之类的重金属标记的S/A而检测出。具体地，在杂交反应之后，含有链霉抗生物素蛋白偶联物的溶液，可直接加入到细胞上的杂交混合物中。细胞在该溶液中于45℃保温5-30分钟。然而也可以使用更长的杂交时间和更高或更低的温度。杂交反应的时间可以变化，取决于杂交混合液的组成，该混合液含有固定剂(沉淀剂和/或交联剂的类型和浓度)，缓冲剂，成孔剂，变性剂，和杂交稳定剂。与之类似，温度也可以如描述的那样变化。或者，探针可以直接用荧光染料或分子[例如滂胺天蓝(Pontamine Sky BlueTM)]标记，即通过将核酸探针和染料一起保温(1∶10，重量∶重量)从而使染料结合/嵌入探针。接着探针从染料该液中沉淀，多余的未结合染料通过反复用70%乙醇洗涤而除去。探针也可以直接共价标记，即通过将双链分子(RNA-RNA，RNA-DNA，或DNA-DNA)与能共价结合于核酸的标记物一起保温而标记。在反应进行的条件之下，进行保温之后，链被分离，每一条被分离的链都可用作探针。在该液中探针的典型浓度为2.5μg/ml，尽管也可以使用0.01-100μg/ml的浓度。探针浓度会影响反应动力学而且也会影响分析灵敏度和信号/噪声比。
如果探针直接用酶标记物标记或者用酶促的或次级检测系统进行检测，那么这个反应可以在任何洗涤步骤之前或之后进行。在将样品与该酶的合适的缓冲剂一起保温之后，载物片接着在该酶的制造商或供应商的规定的条件下，与该酶的底物一起保温。
在固定/杂交/检测反应之后细胞可以沉积在载物片上，或者离心沉淀。接着，未结合的探针用0.1×SSC和0.1%Triton X-100TM溶液洗涤一次从而从细胞中洗去。每一个显微镜载物片(即每100，000分离的细胞或每约1cm2的组织块)可以使用总量为1-200ml的洗涤液。杂交稳定剂/变性剂和或孔剂的浓度和类型都可以变化，取决于细胞一类型，探针的类型和可接受的杂交错配程度。
用一步骤或二步骤法得到的结果当细胞沉积在载物片上时，如果使用直接或间接标记的荧光探针，那么结果可以通过操作荧光显微镜而观察。或者，结果也可以在以荧光为基础的成像分析系统上自动分析。
当细胞保留在溶液中时，结果可以通过使用流式细胞仪记录每个细胞的荧光量而得出，荧光量代表了每个细胞的杂交量。或者，在一个细胞样品内的总信号可以使用诸如液闪计数器(用于放射片的)或化学发光的/荧光的微量滴定板读取器之类针对标记物的设备而得出。
原位杂交的速度，灵敏度和定量在一步骤法的具体实施中，本发明仅需5分钟便可完成，而且灵敏度达到每个细胞少至一个细胞生物聚合物分子。速度和灵敏度来自至少下列四个因素(1)细胞成分没有不可逆地沉淀于或固定于核酸上;(2)如果固定，则该固定是最适于使用的特定的组织的;(3)在高探针浓度和升高的温度下反应动力学过程进行得更快;(4)探针被构建成便于快速进出细胞膜和细胞组份。
在使用放射性探针时，可以通过细胞上的颗粒数目而估计出每个细胞的mRNA或DNA拷贝数。采用荧光或酶法检测时，对荧光的或沉淀着色的产物的相对估计可以估数出mRNA或DNA的拷贝数。通常，在手工拍照，冲胶片和比较相片之后，是比较容易得出大约的拷贝数目的。对原位杂交后提到的放射性的或荧光的信号的定量分析，可以使用成像分析系统(如Meridian ACAS570工作站)自动进行。
本发明的原位杂交技术的灵敏度允许通过目视和照相检测单一细胞中存在的单一拷贝的遗传顺序。
例如(但并不局限于此)，每个长约30碱基的探针带一个单一荧光团时，那么长约6，000碱基的遗传顺序可以通过使用标准荧光量微镜观察结果而被可靠地检测出。当4个荧光团附着于一个探针时，长约1500碱基的特定的遗传顺序的缺失或存在便能通过使用此处提及的保温时间，而被可靠地检测出。此外，当使用针对双链核酸的“有意义”和“反义”链的相应顺序的探针时，使用此处提及的保温时间可以检测出短至约750碱基对的顺序的存在或缺失，或者，人们可以使用成像分析系统检测少至75-150碱基对。
同时检测三种mRNA手工的和一步骤原位杂交程序都能同时检测同样细胞中的不同物质(mRNA，DNA和蛋白质)。它可以用两种方法中的任一种来实现。多种探针都一起加在杂交液中，每种探针含有一种与众不同的标记物(例如，分别在不同检测波长发光的荧光标记物“A”“B”和“C”)。或者，也可以用一种探针和标记物先进行一次杂交和检测，将残留的未反应的探针和标记物洗去，然后进行另一次杂交反应。该过程可以随心所欲地重复多次。或者，探针A，B和C都含有同样的标记物。
同时检测DNA和RNA时，挑选探针的类型至关重要。当细胞靶生物聚合物是RNA时，可以在分析中使用反义的单链DNA探针。如果细胞靶DNA是待检测的生物聚合物，在分析中可以使用有意义链的单链RNA探针。这种探针选择，加上固定/杂交液的成份的选择和浓度，可以使得只形成RNA-DNA杂交。因此，探针可以只结合于所期望的靶细胞生物聚合物;基本上防止其他核酸干扰反应分析。
用于检测DNA或mRNA的一步骤原位杂交技术可以以试剂盒(kit)的形式提供。这样的试剂盒含有下列物质1.含有固定/杂交混合液和一种或多种标记探针的溶液。较佳地，该溶液含有50mM异硫氰酸胍，25-40%甲酰胺，21%PEG，0.4M DTT，15×Ficoll/PVP，50mM EDTA，1mg/ml鲑鱼精子DNA，50mM Tris-乙酸(pH7-8)，约5%Triton X-100和约0.06μg/μl的直接用报导分子(reporter molecule)标记的合成的寡核苷酸。溶液和探针应具有可被测量的预先确定的和识别的特征以及与细胞和靶顺序的反应性。
2.进行本发明所述的原位杂交反应的工具和说明。或者，试剂盒也可以含有
一个次级可检测报导系统，它能与探针或探针-靶杂交物反应。
3.能直接使用或充分稀释后形成洗涤液的浓缩的贮藏液。
4.对实施本发明是必需的或有用的任何机械部份，例如固体承载物(如显微镜载物片)，将细胞固定于所述姑载的设备，或者协助保温样品或洗涤样品的设备。
5.用于记录使用本发明的分析而得到的结果的照像底片或感光乳剂。
试剂盒的另一种类型可以含有被脂质体或微球包成胶囊状的探针溶液。
出于阐述目的给出下列实施例，而不着意于以任何方式局限本发明。在所有的实施例中，对于固体的所有百分比是以重量计的，对于液体的所有百分比是以体积计的，所有的温度都是摄氏温度，除非特别注明。所有引用的文献都以参考文献形式一起表达。
实施例1用DNA探针通过原位杂交检测预先用潘帕尼可拉氏染色的涂片上的HPV细胞的制备将用宫颈刷得到的宫颈细胞置于运输介质上。待运到实验室后，将细胞涡旋震荡1-3秒，然后在1500rpm离心10分钟。倾去上清液，将细胞再悬浮于1ml运输介质。将细胞按所期望的密度直接点于经有机硅处理过的载物片上。接着，用标准的潘帕尼可拉氏染色程序将细胞染色。
将载物片在水浸中5次，在Gills配方＃2中染色10秒;接着在去离子水中浸10次。在95%乙醇中浸10次。在OG-50中染色一分钟。在95%乙醇中浸10次。在EA-50中染2分钟。在95%乙醇中脱色，浸10次。在标准的冰冻的载物片一端滴加50μlGEL/载片(mount)(Biomeda Corp.，Foster City，CA-Catalog M01)。用24×50mm的盖玻片覆盖并放置10分钟。
在原位杂交之前，载物片在重蒸H2O中浸泡直至盖玻片滑落，通常约10分钟。载物片在新鲜H2O中再浸泡5分钟。然后在梯度乙醇溶液(50%，70% & 95%)中脱水。
制备探针阳性对照探针含人体α-着丝粒重复DNA，已知它可以与所有人体染色体杂交。阴性探针，被称作NR，是从细菌中发现的氮还原酶基因衍变而来的，而且已知不与真核细胞内的核酸杂交。HPV16型和HPV18型的顺序从出版的顺序中获得，并且可通过遗传顺序数据库，Genbank，69.0版本(Genetic Sequence Data Bank，Genbank，Version69.0)获取。
探针名称 座位名称 荧光标记物 分子探针股份公司目录#HPV16 PPH16 若丹明衍生物 L-20HPV18 PPH18 若丹明衍生物 L-20设计500种不同的探针(16型和18型各250种)，长度为25碱基并人工合成。
几种长25碱基的合成寡核苷酸从下面列出的DNA顺序制备。
表1探针名称 检测的染色体 座位名称 荧光标记物α-着丝粒重复序列 X HUMSATA 荧光素α-着丝粒重复序列 Y HUMSATB 荧光素探针的合成和标记合成寡聚脱氧核苷酸(Applied Biosystems DNA SynthesizerModel 380B，并使用推荐的A.B.I试剂)，并且在最后阶段将氨基己基磷酸酯连接物附着在5′末端。接着将5′-氨基己基寡聚脱氧核苷酸与Molecular Probes，InC.的荧光若丹明衍生物(目录号＃L-20)偶联，并通过Waters HPLC在基线810色谱工作站进行纯化。
杂交为了进行杂交程序，将50μl杂交混合液(含有22%PEG，30%甲酰胺，5×SSC，0.3mg/ml鲑鱼精子DNA，15×Ficoll/PVP，0.4M异硫氰酸胍，50mM DTT，5%Triton X-100，50mM EDTA，7.5%吐温20，50mM Na3PO4)和0.02μg/μl的探针加于载物片。加上盖玻片将载物片加热至95℃，5分钟，任其冷却至42℃并在此温度保温25分钟。
洗涤在杂交之后，将载物片置于科普林缸(coplin jar)，在缸中加入100ml洗涤液。洗涤液含0.1×SCC和0.4M异硫氰酸胍和0.1%Triton X-100。晃动洗涤液直到盖玻片滑落，然后在溶液中保留4分钟。将该洗涤液移去并加入0.1×SCC和0.1%Triton的第二洗涤液。晃动液体1分钟，倾去，然后重复洗涤5次。在洗涤之后，加入8μl抗褪色剂/Hoechst复染剂。载物片加盖盖玻片并在荧光显微镜下观察。
荧光检测在带荧光功能的Olympus BH10显微镜上进行显微拍照，采用柯达Ektachrome EES-135(PS800/1600)胶片。曝光，按钮置于1600ASA档。一直使用50秒曝光时间，从而可以在所有得到的显微照片之间直接进行比较。
结果图1显示了当HPV探针(用若丹明标记)和阳性对照探针(用FITC标记)一起加入到同一杂交混合液时的典型结果。较小的细胞的核被阳性对照探针成阳性(彩色照片中为绿色)而较大的细胞的核是HPV，阳性的(彩色照片中为亮黄色)。
实施例的程序可以被修改成如下形式(1)合成400不同的探针(200个用于16型，200个用于18型)，每个探针设计为30碱基长。但是，除了制备与这些400个不同的寡核苷酸相对应的探针(这些寡核苷酸合起来构成用于两个HPV靶中的任一个靶顺序的一条链的探针)之外，人们还可以制备另外的400种用于两个HPV靶的第二条链的寡核苷酸探针。考虑到它们在HPV基因组图谱上的分布，用于第一条链的探针相对于第二条链的探针将处于“异相位”，因此，每个第一条链的探针的一半(15核苷酸)将在核苷酸顺序上互补于一个第二条链探针的一半，而该第一条链的探针的另一半(15核苷酸)将互补于另一个第二条链探针的一半。使探针互相错开意味着，因为重迭的部分很短(15核苷酸)，所以第一条链的探针将主要不会与第二条链的探针杂交。在另一方面，与仅用对应于一条链的探针的情形相比较，这样可以检测到约两倍的杂交。
(2)将探针制成硫代磷酸酯寡核苷酸，每个30聚合体(30-mer)有4个硫原子。制备采用Applied Biosystem(ABI)DNA合成仪，型号380B并用推荐的ABI试剂。硫原子分布如下第一个位于探针的5'末端，第二个位于第7和第8核苷之间(从5'端开始数)，第三个位于第22和23核苷之间，第4个位于第29和第30核苷之间。按下列方式，接着将多聚硫的寡核苷酸的硫原子与荧光染料碘乙酰胺荧光素偶联(可以调节体积而合成较小的量)200μg干寡核苷酸溶于100μl的250mM Tris缓冲液(pH7.4)中，从而形成第一溶液。将1mg碘乙酰胺与100μl干二甲基甲酰胺(即100%DMF)混合于第二溶液。将两种溶液混在一起并摇过夜。在保温过夜之后，标记的寡核苷酸用乙醇和3M乙酸钠沉淀。该粗制品接着上柱于PD-10层极柱以除去游离的染料。然后收集所需的部分。液体在真空中除去。粗制品接着用HPLC(高效液相色谱法)进行纯化。
(3)阴性和阳性对照探针可以按步骤(1)和(2)类似地构建。
(4)杂交混合液可以修改如下用1.5%PEG代替21%PEG，用30%甲酰胺代替21%甲酰胺，加入10%DMSO(10%，v/v)和5%(v/v)维生素E。同样，不是将50μl杂交混合液加于载物片，而是将40μl混合液加5μl角鲨烯和5μl吡咯烷酮，然后将该混合的50μl溶液加于载物片。同样可以在每100μl混合物中加入5μl1MDTT和5μl蛋白酶K(1mg/ml)溶液，然后进行杂交反应，例如，在45℃进行5分钟，接着在95℃进行5分钟。同样可以在杂交混合液中加入约0.5%或0.10%的金精三羧酸。
(5)不同于将8μl抗褪色剂/Hoechst加于载物片，将8μl下列溶液加于载物片9份体积溶液A加一份体积的溶液B。其中溶液A是溶于50%(v/v)甘油和50%(v/v)1×PBS(0.136M NaCl，0.003M KCl，0.008M Na2HPO4，0.001M KH2PO4)的0.01%1，4-二苯基胺(抗褪色剂)加上核染色剂Hoechst(＃33258;1μg/ml)加上0.0025%Evans Blue，而溶液B是十二烷基乙醇。
实施例2用DNA探针通过原位杂交检测预先用潘帕尼可拉氏染色的涂片上的沙眼衣原体(Chlamydia trachomatous)和淋病奈瑟氏菌(Neisse-ria gonorrhea)的DNA和mRNA细胞制备将用宫颈刷得到的宫颈细胞置于运输介质上。待运到实验室后，将细胞涡旋震荡1-3秒，然后在1500rpm离心10分钟。倾去上清液，将细胞再悬浮于1ml运输介质。将细胞按所期望的密度直接点于经有机硅处理过的载物片上。接着，细胞用标准的潘帕尼可拉氏染色程序进行染色，如实施例1所描述的那样。
探针的制备阳性探针制备如实施例1中所描述。
-7.4kb的质粒是CT基因组的一般组成部分并且每个基因组中的约有10个拷贝，其序列能通过Genetic Sequence Data Bank，Genbank(69.0版本)获取。7.4kb的全长顺序被分割成296个不同的寡核苷酸探针，每个含25碱基。这296个寡聚物按下面描述的进行合成和标记。
对GC，三个重复DNA元件可通过Genetic Sequence Data Bank，Genbank(69.0版本)而被获得。
这些顺序被切成分立的寡核苷酸探针，每个含25碱基，并且按下面描述的进行合成和标记。
表2探针名称 座位名称C.T. CHTPG.C. NGORPTANGORPTBNGORPTC表3荧光标记物 分子探针目录#荧光素 F-143若丹明衍生物 L-20得克萨斯红 T-1905香豆素衍生物 D-1412探针的合成和标记合成寡聚脱氧核苷酸(Applied Biosystems DNA Synthesizer Model 380B，并使用推荐的A.B.I试剂)，并且在最后阶段将氨基己基磷酸酯连接物附着在5'末端。接着将5'-氨基己基寡聚脱氧核苷酸与Molecular Probes，InC.的荧光若丹明衍生物(目录号＃L-20)偶联，并通过Waters HPLC在基线810色谱工作站进行纯化。
为了同时检测两种生物体，探针GC和CT可以用不同的荧光物标记。例如，GC可以用荧光素标记而CT用若丹明衍生物标记。可供选择的荧光染料(附带产品目录号)列于上面。
杂交为了进行杂交程序，将50μl杂交混合液(含有30%PEG，30%甲酰胺，5×SSC，0.3mg/ml鲑鱼精子DNA，15×Ficoll/PVP，0.4M异硫氰酸胍，50mM DTT，5%TritonX-100，50mM EDTA，50mM Na3PO4)和0.02μg/μl的探针加于载物片。加上盖玻片并当DNA为靶目标时将载物片加热至95℃达5分钟，任其冷却至42℃并在此温度保温25分钟。如果mRNA是靶目标，则省去95℃加热步骤。
洗涤在杂交之后，将载物片置于科普林缸(coplin jar)，在缸中加入100ml洗涤液。洗涤液含0.1×SCC和0.4M异硫氰酸胍和0.1%TritonX-100。晃动洗涤液直到盖玻片滑落，然后在溶液中保留4分钟。将该洗涤液移去并加入0.1×SCC和0.1%Triton的第二洗涤液。晃动液体1分钟，倾去，然后再重复后一次洗涤5次。在洗涤之后，加入25μl抗褪色剂/Hoechst复染剂。载物片加盖盖玻片并在荧光显微镜下观察。
荧光检测在带荧光功能的Olympus BH10显微镜上进行显微拍照，采用柯达Ektachrome EES-135(PS800/1600)胶片。曝光，按钮置于1600ASA档。一直使用50秒曝光时间，从而可以在所有得到的显微照片之间直接进行比较。或者，操作者可使用市售的低光亮度单色和彩色摄像机，从而既可以在电视荧屏上观察结果又可以以彩色照片的形式制作永久纪录。
当分别使用CT和GC特异探针时，CT和GC生物体被染成明显的阳性。
实施例3用DNA探针通过原位杂交检测预先用潘帕尼可拉氏染色的涂片上Ⅱ型疱疹病毒DNA或mRNA细胞的制备如实施例1，制备预先染色的宫颈细胞。
阳性对照探针阳性对照探针如实施例1中所描述的一样。
Ⅱ型疱疹病毒(HSV-Ⅱ)特异顺序HSV-Ⅱ的顺序通过Genetic Sequence Data Bank，Genbank(69.0版本)获取。HSV-Ⅱ的最早期和早期基因的顺序被分割成不同的寡核苷酸，每个含25碱基。这些寡聚物按实施例1所描述的进行合成和标记。
杂交，洗涤和荧光检测杂交，洗涤和荧光检测都按实施例1所描述的进行。
使用HSV-Ⅱ探针时，含HSV-Ⅱ的细胞被染成明亮的阳性。
实施例4用DNA探针通过原位杂交检测预先用潘帕尼可拉氏染色法染色的细胞中的HPV以及同时检测和区分HPV16和HPV18细胞的制备培养C-33A(ATCC HTB＃31)，Ca Ski(ATCC CRL ＃1550)和Hela细胞，用胰蛋白酶处理，并按1∶1∶1比例混合，按所需的密度直接点于有机硅处理过的载物片上。接着细胞用标准潘帕尼可拉氏染色程序染色并准备进行原位杂交，如实施例1所示的那样。
探针的制备阳性对照探针制备如实施例1所述。
HPV16型和HPV18型的顺序从出版的顺序中获得，并且通过Genetic Sequence Data Bank，Genbank(69.0版本)取得，如实施例1中所述。
探针的合成和标记按实施例1所述，合成的标记寡聚脱氧核苷酸。将荧光素(目录号F-143)附于HPV16探针而将若丹明衍生物(L-20)附于HPV18探针。
杂交，洗涤和荧光检测如实施例1，进行杂交，洗涤和荧光检测步骤。
结果图2显示了在单一照片中三种不同的细胞。用FITC标记的HPV-16探针在Ca Ski细胞中产生阳性信号(核中亮点)，位于“2A”照片的左上角;而用若丹明标记的HPV-18探针产生阳性信号(核中亮点)，位于同一张“2A”照片的右下角。位于照片中央的细胞是C-33A细胞，呈正确的阴性。“2B”是三种细胞核的Hoechst复染的照片。它表明，该分析体系能在预先染色的细胞中同时检测和区分HPV的两种类型，即HPV16型和HPV18型。
实施例5用DNA探针通过原位杂交检测预先用潘帕尼可拉氏染色法染色的细胞中的单拷贝HPV细胞制备培养C-33A(ATCC HTB＃31)，Ca Ski(ATCC CRL ＃1550)和SiHa(ATCC HTB ＃35)细胞系，用胰蛋白酶处理，按所需的密度直接点于有机硅处理过的载物片上。接着细胞用标准潘帕尼可拉氏染色程序染色并准备进行原位杂交，如实施例1所示的那样。
探针制备HPV16型的顺序以及阳性对照探针按实施例1所述制备。
探针合成和标记按实施例1所述的，合成和标记寡聚脱氧核苷酸探针。
杂交，洗涤和荧光检测如实施例1，进行杂交、洗涤和荧光检测步骤。
因为在SiHa细胞中仅有HPV16型的整合DNA的唯一拷贝，因此在SiHa细胞中只有一个亮点。Ca Ski有若干亮点而C-33A没有。
实施例6用DNA探针通过原位杂交检测预先用苏木精和曙红(H&E)染色的宫颈组织切片中的HPV组织制备石蜡包埋的甲醛固定的组织可用以下方式处理以去除盖玻片并用H&E染色1.二甲苯，换三次……每次2分钟2.无水乙醇……浸十次3.95%乙醇，换三次……每次浸十次4.自来水……漂洗直至水能平稳地流淌5.苏木精-Delafield的，Ehrlich的，或Harris的，不含乙酸……10-15分钟6.自来水，换两次……每次浸十次。
7.溶于70%乙醇的1%盐酸……浸5-10次8.流水……充分洗涤9.氨水(0.24%)或者碳酸锂(0.5%)……30秒
10.自来水，换两次……每次浸十次11.曙红……浸10-20次或者曙红一焰红……1-3分钟12.95%乙醇，换两次……每次浸10次13.无水乙醇，换三次……每次浸10次14.二甲苯，换三次……每次浸10次15.95%乙醇，换两次……每次浸10次16.70%乙醇，换两次……每次浸10次17.50%乙醇，换两次……每次浸10次18.重蒸水，换两次……每次浸10次19.按下面所描述的进行杂交探针的制备如实施例1中所述，获得HPV16型和HPV18型的顺序。
探针的合成和标记按实施例1所述，合成和标记的寡聚脱氧核苷酸探针。
杂交，洗涤和荧炮检测如实施例1，进行杂交，洗涤和荧光检测步骤。
结果图3显示了在预先用苏木精和曙红(H&E)染色的宫颈组织中HPV16型和18型的检测结果。图3A是在杂交之前的H&E染色的宫颈组织的照片(放大率＝10X)。图3B是Hoechst复染核的照片(放大率＝40X)，而图3C是在用含HPV的混合液进行杂交后得到的HPV呈阳性染色的细胞的照片(放大率＝40X)。虽然用Hoechst复染时所有细胞被明显是阳性，但是只有少量细胞是明显对HPV阳性的。阴性对照探针是恰当的阴性。
实施例7用DNA探针通过原位杂交检测预先用苏木精和曙红染色的组织样品中的多重耐药基因和ErbB基因细胞制备在活组织检查人体宫颈或乳房之后，得到组织，在甲醛中固定，用H&E染色，然后分析。
探针的制备阳性对照探针含有实施例1中描述的探针。
c-erb-B-2和MDR1顺序从出版的顺序获得，并且可通过Gen-bank(69.0版片)而获得。
表4探针名称 座位名称 荧光标记物c-erb-B-2 HUMERB2R 列于实施例2中的MDR1 HUMMDR1 任何荧光染料探针的合成和标记按实施例1所述，合成的标记寡聚脱氧核苷酸探针。
杂交，洗涤和荧光检测如实施例1，进行杂交，洗涤和荧光检测步骤。
含有多个c-erb-B-2或MDR1基因拷贝的细胞具有比正常细胞(即带有单基因拷贝的细胞)大得多的细胞的和/或强得多细胞质的染色。此外，信号的强弱可以用任何型号的成像分析系统进行定量，如Meridian Instructions，Okemos，Michigan出产的ACAS 570。
实施例8用DNA探针通过原位杂交程序检测预先用Diff-Quick法染色的样品中的染色体DNA细胞制备将用宫颈刷得到的宫颈细胞置于运输介质上，待运到实验室后，将细胞涡旋震荡1-3秒，然后在1500rpm离心10分钟。倾去上清液，将细胞再悬浮于1ml运输介质。细胞按所期望的密度直接点于经有机硅处理过的载物上。接着，按照供应厂商的建议将细胞用标准的Diff-Quick法进行染色。盖玻片如实施例1一样去除。
探针的合成和标记按实施例1所述，合成和标记寡聚脱氧核苷酸探针。
杂交，洗涤和荧光检测如实施例1，进行杂交，洗涤和荧光检测步骤。
结果图4显示了在用Diff-Quick法染色的宫颈细胞中得到的结果(4C放大10倍，而4D放大40倍)，以及接着用含阳性对照探针杂交的结果(4A放大10倍，4B放大10倍)。明亮的阳性信号可以清楚地在这些细胞的核中看到，这表明探针与这些预先染色的细胞中的DNA发生杂交。
实施例9用DNA探针通过原位杂交检测预先用潘帕尼可拉氏染色的涂片上的阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)，念珠菌属(Candida)物种和苍白密螺旋体(Treponema pallidum)的DNA或mRNA细胞制备制备用宫颈刷获得的宫颈细胞，并如实施例1进行染色。将阴道病灶刮出物按标准方法置于干净的载玻片。
阳性对照探针阳性对照探针制备如实施例1中所述。
白色念珠菌Candida albicans)，阴道毛滴虫Trichomonas vaginalis)和苍白密螺旋体(Treponema pallidum)Candida albicans，Trichomonas vaginalis和Treponema pal-lidum的顺序通过Sequence Data Bank或出版的顺序得到。顺序被分割成分立的寡核苷酸探针，每个含25碱基。这些寡聚物按实施例1所述进行合成和标记。
杂交，洗涤和荧光检测如实施例1，进行杂交，洗涤和检测步骤。
当分别使用设计的用于检测这些微生物的特异探针时，微生物Candida，Trichomonas和Treponema被染成明亮的阳性。
在本说明书中提及的所有专利和出版物表明了本发明所属的技术领域的技术人员的种种标准。所有的专利和出版物在此处以参考文献形式引入，其程度正如每个单独的出版物都特别地和个别地表明，是以参考文献形式引入的。
本领域的技术人员很容易理解，本发明很适于实现发明目的，获得提到的结果和好处，以及其他内在的东西。此处描述的组份，方法，程序和技术是目前较佳具体实施的代表，是用来作为典范的，而不是用来限制本发明的范围的。本技术领域的技术人员能对其进行改动和用于其他方面，但是这仍然没有脱离本发明的主旨，并且在所附的权利要求所限定的范围内。
权利要求
1.一种通过检测细胞生物聚合物从而检测在预先染色的样品中生物聚合物的存在与否的方法，其中样品具有基本完整的细胞膜，其特征在于，含有以下步骤用固定介质固定所述的样品，该固定介质含有至少一种选自由沉淀剂和交联剂组成的组的试剂；将所述的固定的样品与杂交液接触，杂交液含有变性剂，杂交稳定剂，缓冲剂，选择性膜成孔剂和至少一种探针，所述的接触在杂交条件下进行；通过检测所述的标记物的方法检测杂交形成物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的杂交形成物选自双链体或三链体。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的探针的核苷酸顺序至少基本互补于待检测的特定靶核苷酸顺序。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的靶核苷酸顺序约75碱基。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的样品含微生物。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的微生物选自细菌，病毒和真菌。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的样品含真核细胞。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的真核细胞是人细胞。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的样品含细胞基因。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的细胞基因选自致癌基因，肿瘤抑制基团和刺激生长因子。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的致癌基因选自c-erb-B-2，c-myc，c-myb和c-ras。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤抑制基因选自P-53和成视网膜细胞瘤基因。
13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的刺激生长因子选自α-转化生长因子，表皮生长因子和集落刺激(生长)因子-粒性细胞/巨噬细胞。
14.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述的预先染色的样品中，所述的细菌选自链球菌属(Streptococcus)，葡萄球菌属(Staphylococcus)，梭状芽胞杆菌属(Clostridium)，芽胞杆菌属(Bacillus)，假单胞菌属(Pseudomonas)，沙门氏菌属(Salmonella)，克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)，类(拟)杆菌属(Bacteroides)，大肠杆菌(Escherichia coli)，淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhea)，和衣原体属(Chlamydia)。
15.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的细菌选自淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoea)和沙眼衣原体(Chlamydia trachomatous)。
16.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的真菌选自念球菌属(Candida)，新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)，皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitides)，荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)，粗球孢菌(Coccidioides immitis)和巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的预先染色的样品为细胞样品或组织样品。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述的细胞样品选自宫颈细胞，骨髓细胞，肝细胞，脑脊髓液细胞，血细胞，口腔粘膜细胞，肺细胞和皮肤细胞。
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述的组织样品选自淋巴结组织，乳房组织，宫颈组织，结肠组织，前列(腺)组织，心组织和脑组织。
20.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的预先染色的样品是用下列染色法染色的潘帕尼可拉氏染色法，Wright染色法，苏木精和曙红染色法以及Diff-Quick染色法。
21.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述的预先染色的样品中的所述的病毒选自人乳头瘤病毒，Ⅱ型单纯疱疹病毒，肝炎病毒，人体免疫缺陷病毒，流感病毒，副流感病毒和轮状病毒。
22.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述的生物聚合物是mRNA。
23.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述的生物聚合物是DNA。
24.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述的生物聚合物是16SrRNA。
25.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述的生物聚合物选自mRNA，DNA，合成的生物聚合物和16SrRNA。
26.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述的生物聚合物是人工合成的生物聚合物。
27.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述的生物聚合物是mRNA。
28.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述的生物聚合物是合成的生物聚合物。
29.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述的生物聚合物是DNA。
30.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述的生物聚合物是16SrRNA。
31.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述的生物聚合物选自mRNA，DNA，合成的生物聚合物和16SrRNA。
32.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述的样品是宫颈细胞。
33.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述的样品是宫颈细胞。
34.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述的染色法是潘帕尼可拉氏染色法。
35.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述的染色法是潘帕尼拉氏染色法。
36.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的标记物附着于所述的探针。
37.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的标记物在杂交形成之后再加入。
38.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的标记物选自放射性标记物，荧光剂，化学发光剂和酶标记物。
39.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的标记物是抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白的结合物。
40.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的固定剂选自乙醇，甲醇，丙酮和甲醛。
41.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的交联剂选自仲甲醛，甲醛，dimethylsilserimidate和乙基二甲基氨基-丙基碳化二亚胺(ethyldimethylamino-propylcarbodimide)。
42.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的变性剂选自甲酰胺，尿素，碘化钠，硫氰酸(盐)，胍，高氯酸盐，三氯乙酸(盐)，四甲基胺。
43.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的杂交稳定剂选自氯化钠，氯化锂，氯化锰和硫酸铁。
44.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的成孔剂选自Brij35吐温，Brij58，TritonX-100，CHAPSTM，脱氧胆酸(盐)和十二烷基磺酸(盐)。
45.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在同一样品中至少同时分析两种生物聚合物。
46.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的温度为15-85℃。
47.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的温度为40-45℃。
48.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的被固定的样品与所述的杂交介质(液)接触约5分钟-约240分钟。
49.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法在约5分钟之内完成。
50.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的探针包括针对靶聚合物的多个区域的短探针的混合物。
51.一种通过分析细胞生物聚合物从而检测在预先染色的样品中生物聚合物的存在与否的方法，该样品具有基本完整的细胞膜，其特征在于，含有以下步骤将所述的样品与介质接触，该介质含有变性剂，杂交稳定剂，缓冲剂，膜成孔剂和至少一种探针，所述的接触在杂交条件下并在至少存在一种探针时进行;通过检测所述的标记物的方法检测杂交形成物，并且省去了杂交步骤，预杂交是为了阻止所述的探针的非特异结合，并且便于在所述的样品与所述的介质接触之前探针的进入。
52.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述的介质还含固定剂。
53.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述的样品包含微生物。
54.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述的杂交形成物是双链体和三链体。
55.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述的探针的核苷酸顺序至少基本互补于待检测的特定靶核苷酸顺序。
56.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述的靶核苷酸顺序约75碱基。
57.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述的微生物选自细菌，病毒和真菌。
58.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述的样品含真核细胞。
59.如权利要求58所述的方法，其特征在于，所述的真核细胞是人细胞。
60.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述的样品含细胞基因。
61.如权利要求60所述的方法，其特征在于，所述的细胞基因选自致癌基因，肿瘤抑制基因和刺激生长因子。
62.如权利要求61所述的方法，其特征在于，所述的致癌基因选自c-erb-B-2，c-myc，c-myb和c-ras。
63.如权利要求61所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤抑制基因选自P-53和成视网膜细胞瘤基因。
64.如权利要求61所述的方法，其特征在于，所述的刺激生长因子选自α-转化生长因子，表皮生长因子和集落刺激(生长)因子-粒性细胞/巨噬细胞。
65.如权利要求57所述的方法，其特征在于，在所述的预先染色的样品中所述的所述的细菌选自链球菌属(Streptococcus)，葡萄球菌属(Staphylococcus)，梭状芽胞杆菌属(Clostridium)，芽胞杆菌属(Bacillus)，假单胞菌属(Pseudomonas)，沙门氏菌属(Salmonella)，克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)，类(拟)杆菌属(Bac-teroides)，大肠杆菌(Escherichia coli)，淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhea)，和衣原体属(Chlamydia)。
66.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述的真菌选自念球菌属(Candida)，新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)，皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitides)，荚膜组织胞浆菌(Histo-plasma capsulatum)，粗球孢菌(Coccidioides immitis)和巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)。
67.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述的预先染色的样品为细胞样品或组织样品。
68.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述的细胞样品选自宫颈细胞，骨髓细胞，肝细胞，脑脊髓液细胞，血细胞，口腔粘膜细胞，肺细胞和皮肤细胞。
69.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述的组织样品选自淋巴结组织，乳房组织，宫颈组织，结肠(colon)组织，前列(腺)组织，心组织和脑组织。
70.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述的预先染色的样品是用下列染色法染色的潘帕尼可拉氏染色法，Wright染色法，苏木精和曙红染色法以及Diff-Quick染色法。
71.如权利要求57所述的方法，其特征在于，在所述的预克染色的样品中的所述的病毒选自人乳头瘤病毒，Ⅱ型单纯疱疹病毒，肝炎病毒，人体免疫缺陷病毒，流感病毒，副流感病毒和轮状病毒。
72.如权利要求65所述的方法，其特征在于，所述的生物聚合物是mRNA。
73.如权利要求65所述的方法，其特征在于，所述的生物聚合物是DNA。
74.如权利要求65所述的方法，其特征在于，所述的生物聚合物是16SrRNA。
75.如权利要求65所述的方法，其特征在于，所述的生物聚合物选自mRNA，合成的生物聚合物，DNA和16SrRNA。
76.如权利要求65所述的方法，其特征在于，所述的生物聚合物是人工合成的生物聚合物。
77.如权利要求71所述的方法，其特征在于，所述的生物聚合物是mRNA。
78.如权利要求71所述的方法，其特征在于，所述的生物聚合物是DNA。
79.如权利要求71所述的方法，其特征在于，所述的生物聚合物是16SrRNA。
80.如权利要求71所述的方法，其特征在于，所述的生物聚合物是合成的生物聚合物。
81.如权利要求71所述的方法，其特征在于，所述的生物聚合物选自mRNA，DNA，16SrRNA和合成的生物聚合物。
82.如权利要求65所述的方法，其特征在于，所述的样品是宫颈细胞。
83.如权利要求71所述的方法，其特征在于，所述的样品是宫颈细胞。
84.如权利要求65所述的方法，其特征在于，所述的染色法是潘帕尼可拉氏染色法。
85.如权利要求71所述的方法，其特征在于，所述的染色法是潘帕尼拉氏染色法。
86.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述的标记物附着于所述的探针。
87.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述的标记物在杂交形成之后再加入。
88.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述的标记物选自放射性标记物，荧光剂，化学发光剂和酶标记物。
89.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述的标记物是抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白的结合物。
90.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述的固定剂选自乙醇，甲醇，丙酮和甲醛。
91.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述的变性剂选自甲酰胺，尿素，碘化钠，硫氰酸(盐)，胍，高氯酸盐，三氯乙酸(盐)和四甲基胺。
92.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述的杂交稳定剂选自氯化钠，氯化锂，氯化锰和硫酸铁。
93.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述的成孔剂选自Brij35，吐温，Brij58，TritonX-100，CHAPSTM，脱氧胆酸(盐)和十二烷基磺酸(盐)。
94.如权利要求51所述的方法，其特征在于，在同一样品中至少同时分析两种生物聚合物。
95.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述的方法能检测每个细胞中少至单拷贝的靶生物聚合物。
96.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述的杂交条件包括温度为15-85℃。
97.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述的杂交条件包括温度为40-45℃。
98.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述的方法在约5分钟之内完成。
99.如权利要求51所述的方法，其特征在于，所述的探针包括针对靶聚合物的多个区域的短探针的混合物。
100.一种通过分析细胞靶生物聚合物从而在预先染色的样品中检测生物聚合物的存在与否的试剂盒，该样品具有基本完整的细胞膜，其特征在于，试剂盒含有杂交液，该杂交液含有变性剂，杂交稳定剂，缓冲剂和膜成孔剂。
101.如权利要求100所述的试剂盒，其特征在于，还含有探针，所述的探针能与所述的靶生物聚合物杂交从而形成杂交复合物。
102.如权利要求100所述的试剂盒，其特征在于，还含有，用于将所述的可疑样品与所述的探针接触从而形成所述的杂交复合物的设备;和用于测量所述的探针存在与否的设备。
103.如权利要求100所述的试剂盒，其特征在于，还含有，能检测杂交形成物的可检测的标记物。
104.如权利要求103所述的试剂盒，其特征在于，所述的杂交形成物的检测是定量的。
105.如权利要求103所述的试剂盒，其特征在于所述的可检测标记物是释放能量的标记物。
106.如权利要求51所述的方法，其特征在于，接触在溶液中进行。
107.如权利要求51所述的方法，其特征在于，通过流式细胞术进行检测的。
全文摘要
本发明提供了采用新颖的原位杂交技术检测在预先染色的样品中的生物聚合物的存在的方法。该方法可分析细胞的生物聚合物，尤其是RNA和DNA。新颖的原位杂交程序可以通过一步骤或两步骤(先固定后杂交)而完成。本发明方法可用来在预先染色的细胞或组织中检测微生物(如细菌，病毒，真菌)或细胞基因(如致癌基因，肿瘤抑制因子或生长刺激因子)的存在。
文档编号C12Q1/68GK1083113SQ93108779
公开日1994年3月2日 申请日期1993年7月17日 优先权日1992年7月17日
发明者W·D·韦伯, J·布雷塞, M·布利克, S·C·朱, M·L·库伯格, M·阿斯加利 申请人:研究发展基金会