专利名称：使用不同的核苷酸混合物的dna测序方法和用于该方法的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及采用双脱氧核苷酸介导的链终止反应的DNA核苷酸序列分析方法，更具体地讲，涉及通过一步分离步骤进行DNA序列分析的测序方法，所述DNA序列比可由常规桑格测序法所能分析的序列长度更长，该方法的特征在于采用其双脱氧核苷酸与脱氧核苷酸的摩尔比彼此不同的两种核苷酸混合物来产生DNA片段。
背景技术：
已经知道，桑格双脱氧核苷酸介导的链终止法是用于分析DNA核苷酸序列的常规方法。在桑格法中，DNA核苷酸链通过和在戊糖的C-3位含有取代的羟基的脱氧核苷酸(dNTP)反应而延长，并通过和在戊糖的C-3位不含有取代的羟基的双脱氧核苷酸(ddNTP)反应而终止。
在桑格法中，四种dNTP如脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胸苷三磷酸(dTTP)和脱氧胞苷三磷酸(dCTP)用作产生与模板DNA互补的DNA片段的底物。四种ddNTP如双脱氧鸟苷三磷酸(ddGTP)、双脱氧腺苷三磷酸(ddATP)、双脱氧胸苷三磷酸(ddTTP)和双脱氧胞苷三磷酸(ddCTP)用作用于终止互补DNA片段的链延长反应的底物。与dNTP不同，ddNTP在戊糖的C-3位不含有羟基。因此，当ddNTP和延长反应中的互补DNA片段的末端反应时，互补DNA片段的链延长反应被终止。
因此，在桑格法中产生了不同长度的其末端被ddNTP终止的DNA片段。在桑格法中，产生了与模板DNA的核苷酸数目相对应的不同的互补DNA片段，进而通过电泳，按分子量的顺序将其进行分离。之后，通过测定每个互补DNA片段的末端碱基来识别模板DNA的核苷酸序列。
然而，尽管桑格法很方便，但是它的一个缺陷在于，由于互补DNA延长反应的持续合成能力是有限的，只有长度在500-700bp的DNA可以被准确测定。例如，为了准确和完整地识别平均长度为2Kb的人类cDNA，DNA测序步骤需要通过对人类cDNA的分割来重复三次以上。如上所解释的，作为长DNA的测序方法，桑格法是一种费时、费力和昂贵的方法。
同时，在所谓的鸟枪法(已知是用于基因组DNA的大规模核苷酸测序方法)中，全长DNA被分割为几个DNA片段，分别识别每个片段的碱基的序列。之后，使用计算机相互比较每个片段的序列，通过删除重叠部分来分析全长DNA序列。在上述鸟枪法中，利用可通过一次DNA序列分析识别的DNA长度的扩展来缩减全长DNA序列分析所需的时间和劳力。
通常，在常规的桑格双脱氧核苷酸介导的链终止方法中，采用单一的DNA聚合酶。因此，对应于模板DNA20-30bp的短DNA片段和对应于模板DNA600-700bp的长DNA片段少量生成。然而，对应于模板DNA40-500bp的DNA片段大量生成。所以，短DNA片段和长DNA片段的含量相对较低，从而DNA两端末端部分的核苷酸序列比其中间部分难以测定。
由于上述原因，可通过对核苷酸序列的一次分析进行分析的DNA的长度实际上受到限制。因此，人们长期以来为得到一种新方法进行了多种研究，该方法应能扩展通过核苷酸序列的一次分析来识别的DNA长度，所述核苷酸序列的一次分析是借助对模板DNA两端末端部分更准确的测定进行的。
发明的公开因此，本发明的目的在于提供一种通过核苷酸序列的一次分析测定较长DNA序列的方法以及该方法所用的试剂盒。本发明的方法是对常规桑格DNA测序方法的改进，它可以用于测定比可由桑格测序方法所测定的更长的DNA。
在凭借双脱氧核苷酸介导的链终止反应的常规DNA测序方法中，核苷酸混合物中ddNTP与dNTP的摩尔比(在下文中，ddNTP与dNTP的摩尔比以“ddNTP/dNTP”表示)为约0.02，也就是说，ddGTP/dGTP是0.02-0.05；ddATP/dATP是0.02-0.058；ddTTP/dTTP是0.02-0.1；ddCTP/dCTP是0.02-0.033。
本发明的目的是通过提供如下一种方法实现的采用其中双脱氧核苷酸与脱氧核苷酸的摩尔比彼此不同的两种以上的核苷酸混合物，即采用其中双脱氧核苷酸与脱氧核苷酸的摩尔比高于常规桑格法中的摩尔比或低于常规桑格法中摩尔比的两种以上的核苷酸混合物进行DNA序列分析的方法。
在本发明中，相对短的DNA片段是采用其中ddNTP/dNTP高于常规桑格法的ddNTP/dNTP的核苷酸混合物产生的，即，采用ddGTP/dGTP高于0.05，较好是不低于0.1，最好是不低于0.15；ddATP/dATP高于0.058，较好是不低于0.116，最好是不低于0.174；ddTTP/dTTP高于0.1，较好是不低于0.2，最好是不低于0.3；和ddCTP/dCTP高于0.033，较好是不低于0.066，最好是不低于0.099。并且在本发明中，相对长的DNA片段是采用其中ddNTP/dNTP低于常规桑格法的ddNTP/dNTP的核苷酸混合物产生的，即，采用ddGTP/dGTP低于0.02，较好是不高于0.01，最好是不高于0.005；ddATP/dATP低于0.02，较好是不高于0.116，最好是不高于0.0058；ddTTP/dTTP低于0.02，较好是不高于0.015，最好是不高于0.01；和ddCTP/dCTP低于0.02，较好是不高于0.0066，最好是不高于0.0033。此后，将如上制备的各种长度的DNA片段按分子量顺序进行分离，以便测定各DNA片段的末端碱基。
按照本发明的方法，可以无差别地得到从10bp到大于1,000bp的不同长度的DNA片段。结果，模板DNA的两端的末端部分可以得到更加精确和完整的测定。因此，通过本发明的方法，可以分析比常规桑格法所能分析的40-500bp的长度更长的DNA的序列。
在本发明中，其中ddNTP/dNTP高于桑格法中的ddNTP/dNTP的核苷酸混合物大量产生相对短的DNA片段，而其中ddNTP/dNTP低于桑格法中的ddNTP/dNTP的核苷酸混合物则大量生成相对长的DNA片段。所以，可以获得对应于模板DNA10-1000bp的各种长度的DNA片段。将如此获得的各种长度的DNA片段混合，然后通过一步法按照分子量顺序进行分离，以便测定各DNA片段的末端碱基。
因此，根据本发明，10-1000bp的模板DNA的序列通过一步分离步骤可得到更为准确和完整的测定。
附图的简要说明通过参照附图详细地描述优选实施方案，本发明的上述目的和其它的优点将更加清晰，其中
图1是通过采用其中ddGTP/dGTP是0.05；ddATP/dATP是0.058；ddTTP/dTTP是0.1和ddCTP/dCTP是0.033的核苷酸混合物产生的DNA片段的电泳照片。
图2是通过采用其中ddGTP/dGTP是0.15；ddATP/dATP是0.174；ddTTP/dTTP是0.3和ddCTP/dCTP是0.099的核苷酸混合物产生的DNA片段的电泳照片。
图3是通过采用其中ddGTP/dGTP是0.005；ddATP/dATP是0.0058；ddTTP/dTTP是0.01和ddCTP/dCTP是0.0033的核苷酸混合物产生的DNA片段的电泳照片。
图4是按照以上在对
图1至图3的解释中所描述的方法产生的DNA片段混合物的电泳照片。
图5是按照以上在对图2至图3的解释中所描述的方法产生的DNA片段混合物的电泳照片。
本发明的方法的特征在于包括(1)制备下列反应混合物的步骤其中包括ddGTP与dGTP的摩尔比高于0.05，优选不低于0.1，更优选不低于0.15的核苷酸混合物的用于产生互补DNA片段的反应混合物；其中包括ddATP与dATP的摩尔比高于0.058，优选不低于0.116，更优选不低于0.174的核苷酸混合物的用于产生互补DNA片段的反应混合物；其中包括ddTTP与dTTP的摩尔比高于0.1，优选不低于0.2，更优选不低于0.3的核苷酸混合物的用于产生互补DNA片段的反应混合物；和其中包括ddCTP与dCTP的摩尔比高于0.0033，优选不低于0.066，更优选不低于0.099的核苷酸混合物的用于产生互补DNA片段的反应混合物；(2)制备下列反应混合物的步骤其中包括ddGTP与dGTP的摩尔比低于0.02，优选不高于0.01，更优选不高于0.005的核苷酸混合物的用于产生互补DNA片段的反应混合物；其中包括ddATP与dATP的摩尔比低于0.02，优选不高于0.116，更优选不高于0.0058的核苷酸混合物的用于产生互补DNA片段的反应混合物；其中包括ddTTP与dTTP的摩尔比低于0.02，优选不高于0.015，更优选不高于0.01的核苷酸混合物的用于产生互补DNA片段的反应混合物；和其中包括ddCTP与dCTP的摩尔比低于0.02，优选不高于0.0066，更优选不高于0.0033的核苷酸混合物的用于产生互补DNA片段的反应混合物；(3)分别向以上步骤(1)和(2)中制备的上述8种反应混合物中添加模板DNA和引物来产生互补DNA片段的步骤；(4)将步骤(3)中获得的互补DNA片段各自按照ddNTP的种类进行混合并按分子量顺序对如此制备的各互补DNA片段的混合物进行分离的步骤；(5)通过识别如上分离的所述互补DNA片段的末端碱基来确定模板DNA核苷酸序列的步骤。
用于DNA核苷酸测序的本发明的试剂盒，包括如下8种气密性容器(1)装有其中ddGTP与dGTP的摩尔比高于0.05，优选不低于0.1，更优选不低于0.15的核苷酸混合物的气密性容器；(2)装有其中ddATP与dATP的摩尔比高于0.058，优选不低于0.116，更优选不低于0.174的核苷酸混合物的气密性容器；(3)装有其中ddTTP与dTTP的摩尔比高于0.1，优选不低于0.2，更优选不低于0.3的核苷酸混合物的气密性容器；(4)装有其中ddCTP与dCTP的摩尔比高于0.033，优选不低于0.066，更优选不低于0.099的核苷酸混合物的气密性容器；(5)装有其中ddGTP与dGTP的摩尔比低于0.02，优选不高于0.01，更优选不高于0.005的核苷酸混合物的气密性容器；(6)装有其中ddATP与dATP的摩尔比低于0.02，优选不高于0.0116，更优选不高于0.0058的核苷酸混合物的气密性容器；(7)装有其中ddTTP与dTTP的摩尔比低于0.02，优选不高于0.015，更优选不高于0.01的核苷酸混合物的气密性容器；和(8)装有其中ddCTP与dCTP的摩尔比低于0.02，优选不高于0.0066，更优选不高于0.0033核苷酸混合物的气密性容器。
具体地讲，用于DNA核苷酸测序的本发明的试剂盒，包括如下8种气密性容器(1)装有反应缓冲液、稳定剂、DNA聚合酶、dGTP、dATP、dTTP、dCTP和ddGTP混合物的气密性容器，其中ddGTP与dGTP的摩尔比高于0.05，优选不低于0.1，更优选不低于0.15；(2)装有反应缓冲液、稳定剂、DNA聚合酶、dGTP、dATP、dTTP、dCTP和ddATP混合物的气密性容器，其中ddATP与dATP的摩尔比高于0.058，优选不低于0.116，更优选不低于0.174；(3)装有反应缓冲液、稳定剂、DNA聚合酶、dGTP、dATP、dTTP、dCTP和ddTTP混合物的气密性容器，其中ddTTP与dTTP的摩尔比高于0.1，优选不低于0.2，更优选不低于0.3；(4)装有反应缓冲液、稳定剂、DNA聚合酶、dGTP、dATP、dTTP、dCTP和ddCTP混合物的气密性容器，其中ddCTP与dCTP的摩尔比高于0.033，优选不低于0.066，更优选不低于0.099；(5)装有反应缓冲液、稳定剂、DNA聚合酶、dGTP、dATP、dTTP、dCTP和ddGTP混合物的气密性容器，其中ddGTP与dGTP的摩尔比低于0.02，优选不高于0.01，更优选不高于0.005；(6)装有反应缓冲液、稳定剂、DNA聚合酶、dGTP、dATP、dTTP、dCTP和ddATP混合物的气密性容器，其中ddATP与dATP的摩尔比低于0.02，优选不高于0.0116，更优选不高于0.0058；(7)装有反应缓冲液、稳定剂、DNA聚合酶、dGTP、dATP、dTTP、dCTP和ddTTP混合物的气密性容器，其中ddTTP与dTTP的摩尔比低于0.02，优选不高于0.015，更优选不高于0.01；和(8)装有反应缓冲液、稳定剂、DNA聚合酶、dGTP、dATP、dTTP、dCTP和ddCTP混合物的气密性容器，其中ddCTP与dCTP的摩尔比低于0.02，优选不高于0.0066，更优选不高于0.0033。
下面结合以下实施例对本发明做进一步详细的描述。给出这些实施例是用于说明本发明，而不意味着对本发明的限制。
另外，将3微摩尔的dGTP、30微摩尔的dATP、30微摩尔的dTTP、30微摩尔的dCTP和15纳摩尔的ddGTP混合而制成其中ddGTP与dGTP的摩尔比为0.005的核苷酸混合物；将3微摩尔的dGTP、30微摩尔的dATP、30微摩尔的dTTP、30微摩尔的dCTP和175.4纳摩尔的ddATP混合而制成其中ddATP与dATP的摩尔比为0.0058的核苷酸混合物；将3微摩尔的dGTP、30微摩尔的dATP、30微摩尔的dTTP、30微摩尔的dCTP和0.302微摩尔的ddTTP混合而制成其中ddTTP与dTTP的摩尔比为0.01的核苷酸混合物；和将3微摩尔的dGTP、30微摩尔的dATP、30微摩尔的dTTP、30微摩尔的dCTP和0.1微摩尔的ddCTP混合而制成其中ddCTP与dCTP的摩尔比为0.0033的核苷酸混合物。
将10X反应缓冲溶液(500mM Tris-HCl 20mM MgCl2)、5M的Betain稳定剂、TopTMDNA聚合酶、作为引物的M13 Universal Forward17聚体(5’-gtaaaacgacggccagt，30pmoles)、1.5μg作为模板DNA的pUC19质粒DNA和蒸馏水分别加入如上制得的各核苷酸混合物中，制成40μg的用于生成DNA片段的各反应混合物。
之后，将DNA片段生成反应顺序地重复30个循环在94℃ 240秒，94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 60秒，最后再在72℃进行300秒处理，制成互补DNA片段的混合物。向每一如上制备的互补DNA片段混合物中加入40μl终止(Stop)溶液(2.5％溴酚蓝，2.5％氰基二甲苯，10mM NaOH)，从而终止互补DNA片段的生成反应。将这样得到的所述DNA片段按照dNTP的种类分别进行混合，并通过由8M尿素和6％丙烯酰胺制成的聚丙烯酰胺凝胶电泳，以其分子量顺序进行分离。
每个DNA片段的末端碱基通过使用银-染色法(通过使用Bioneer公司制造的Silverstar染色试剂盒)识别。
向所述DNA核苷酸测序试剂盒的每个气密性容器中分别加入1.5μg作为模板DNA的pUC19质粒DNA、作为引物的M13 UniversalForward 17聚体(5’-gtaaaacgacggccagt，30pmoles)和蒸馏水，制成40μg的用于生成DNA片段的各反应混合物。
按照实施例1描述的方法，生成互补DNA片段，进行分离，以测定模板DNA的核苷酸序列。实施例3如下制备包含12种气密性容器的本发明的DNA测序试剂盒将10X反应缓冲溶液(500mM Tris-HCl，20mM MgCl2)、5M的Betain稳定剂、TopTMDNA聚合酶、3微摩尔的dGTP、30微摩尔的dATP、30微摩尔的dTTP、30微摩尔的dCTP和450纳摩尔的ddGTP混合而成的混合物装入一气密性容器；将10X反应缓冲溶液(500mM Tris-HCl，20mM MgCl2)、5M的Betain稳定剂、TopTMDNA聚合酶、3微摩尔的dGTP、30微摩尔的dATP、30微摩尔的dTTP、30微摩尔的dCTP和5.262纳摩尔的ddATP混合而成的混合物装入一气密性容器；将10X反应缓冲溶液(500mM Tris-HCl，20mM MgCl2)、5M的Betain稳定剂、TopTMDNA聚合酶、3微摩尔的dGTP、30微摩尔的dATP、30微摩尔的dTTP、30微摩尔的dCTP和9.06微摩尔的ddTTP混合而成的混合物装入一气密性容器；将10X反应缓冲溶液(500mM Tris-HCl，20mM MgCl2)、5M的Betain稳定剂、TopTMDNA聚合酶、3微摩尔的dGTP、30微摩尔的dATP、30微摩尔的dTTP、30微摩尔的dCTP和3微摩尔的ddCTP混合而成的混合物装入一气密性容器；将10X反应缓冲溶液(500mM Tris-HCl，20mM MgCl2)、5M的Betain稳定剂、TopTMDNA聚合酶、3微摩尔的dGTP、30微摩尔的dATP、30微摩尔的dTTP、30微摩尔的dCTP和15纳摩尔的ddGTP混合而成的混合物装入一气密性容器；将10X反应缓冲溶液(500mM Tris-HCl，20mM MgCl2)、5M的Betain稳定剂、TopTMDNA聚合酶、3微摩尔的dGTP、30微摩尔的dATP、30微摩尔的dTTP、30微摩尔的dCTP和175.4纳摩尔的ddATP混合而成的混合物装入一气密性容器；将10X反应缓冲溶液(500mM Tris-HCl，20mM MgCl2)、5M的Betain稳定剂、TopTMDNA聚合酶、3微摩尔的dGTP、30微摩尔的dATP、30微摩尔的dTTP、30微摩尔的dCTP和0.302微摩尔的ddTTP混合而成的混合物装入一气密性容器；
将10X反应缓冲溶液(500mM Tris-HCl，20mM MgCl2)、5M的Betain稳定剂、TopTMDNA聚合酶、3微摩尔的dGTP、30微摩尔的dATP、30微摩尔的dTTP、30微摩尔的dCTP和0.1微摩尔的ddCTP混合而成的混合物装入一气密性容器；将10X反应缓冲溶液(500mM Tris-HCl，20mM MgCl2)、5M的Betain稳定剂、TopTMDNA聚合酶、3微摩尔的dGTP、30微摩尔的dATP、30微摩尔的dTTP、30微摩尔的dCTP和150纳摩尔的ddGTP混合而成的混合物装入一气密性容器；将10X反应缓冲溶液(500mM Tris-HCl，20mM MgCl2)、5M的Betain稳定剂、TopTMDNA聚合酶、3微摩尔的dGTP、30微摩尔的dATP、30微摩尔的dTTP、30微摩尔的dCTP和1.754微摩尔的ddATP混合而成的混合物装入一气密性容器；将10X反应缓冲溶液(500mM Tris-HCl，20mM MgCl2)、5M的Betain稳定剂、TopTMDNA聚合酶、3微摩尔的dGTP、30微摩尔的dATP、30微摩尔的dTTP、30微摩尔的dCTP和3.02微摩尔的ddTTP混合而成的混合物装入一气密性容器；将10X反应缓冲溶液(500mM Tris-HCl，20mM MgCl2)、5M的Betain稳定剂、TopTMDNA聚合酶、3微摩尔的dGTP、30微摩尔的dATP、30微摩尔的dTTP、30微摩尔的dCTP和1微摩尔的ddCTP混合而成的其中ddCTP与dCTP的摩尔比为0.033的混合物装入一气密性容器；向所述DNA核苷酸测序试剂盒的每个气密性容器中分别加入1.5μg作为模板DNA的pUC19质粒DNA、作为引物的M13 UniversalForward 17聚体(5’-gtaaaacgacggccagt，30pmoles)和蒸馏水，制成40μg的用于生成DNA片段的各反应混合物。根据实施例1描述的方法生成DNA片段，进行分离，以测定模板DNA的核苷酸序列。
图1是通过采用其中ddGTP/dGTP为0.05；ddATP/dATP为0.058；ddTTP/dTTP为0.1和ddCTP/dCTP为0.033的核苷酸混合物产生的DNA片段的电泳照片，该图清楚显示出对应于模板DNA的40-500bp的互补DNA片段。
图2是通过采用其中ddGTP/dGTP是0.15；ddATP/dATP是0.174；ddTTP/dTTP是0.3和ddCTP/dCTP是0.099的核苷酸混合物产生的DNA片段的电泳照片，该图清楚显示出对应于模板DNA的20-900bp的互补DNA片段。
图3是通过采用其中ddGTP/dGTP是0.005；ddATP/dATP是0.0058；ddTTP/dTTP是0.01和ddCTP/dCTP是0.0033的核苷酸混合物产生的DNA片段的电泳照片，该图清楚显示出对应于模板DNA的100-1000bp的互补DNA片段。
图4是按照以上在对
图1至图3的解释中所描述的方法产生的DNA片段混合物的电泳照片，该图清楚显示出对应于模板DNA的20-1000bp的互补DNA片段。
图5是按照以上在对图2至图3的解释中所描述的方法产生的DNA片段混合物的电泳照片，该图清楚显示出对应于模板DNA的20-1000bp的互补DNA片段。
工业实用性如上所述，利用本发明的方法或试剂盒可以比利用常规桑格法更准确和完整地分析10-1000bp的DNA的核苷酸序列。所以，有可能通过对核苷酸序列的一次分析而测定比桑格法可测定的更长的DNA序列。
权利要求
1.一种采用双脱氧核苷酸介导的终止反应的DNA核苷酸序列分析方法，其特征在于包括1)制备下列反应混合物的步骤其中包括ddGTP与dGTP的摩尔比高于0.05的核苷酸混合物的用于产生互补DNA片段的反应混合物；其中包括ddATP与dATP的摩尔比高于0.058的核苷酸混合物的用于产生互补DNA片段的反应混合物；其中包括ddTTP与dTTP的摩尔比高于0.1的核苷酸混合物的用于产生互补DNA片段的反应混合物；和其中包括ddCTP与dCTP的摩尔比高于0.0033的核苷酸混合物的用于产生互补DNA片段的反应混合物；2)制备下列反应混合物的步骤其中包括ddGTP与dGTP的摩尔比低于0.02的核苷酸混合物的用于产生互补DNA片段的反应混合物；其中包括ddATP与dATP的摩尔比低于0.02的核苷酸混合物的用于产生互补DNA片段的反应混合物；其中包括ddTTP与dTTP的摩尔比低于0.02的核苷酸混合物的用于产生互补DNA片段的反应混合物；和其中包括ddCTP与dCTP的摩尔比低于0.02的核苷酸混合物的用于产生互补DNA片段的反应混合物；3)分别向以上步骤1)和2)中制备的上述8种反应混合物中添加模板DNA和引物来产生互补DNA片段的步骤；4)将步骤3)中获得的互补DNA片段按照ddNTP的种类分别进行混合并按分子量顺序对如此制备的各互补DNA片段的混合物进行分离的步骤；5)通过识别如上分离的所述互补DNA片段的末端碱基来确定模板DNA核苷酸序列的步骤。
2.根据权利要求1的DNA核苷酸序列分析方法，其中用于产生互补DNA片段的反应混合物是其中包括ddGTP与dGTP的摩尔比不低于0.05的核苷酸混合物的反应混合物；其中包括ddATP与dATP的摩尔比不低于0.116的核苷酸混合物的反应混合物；其中包括ddTTP与dTTP的摩尔比不低于0.2的核苷酸混合物的反应混合物；其中包括ddCTP与dCTP的摩尔比不低于0.066的核苷酸混合物的反应混合物；其中包括ddGTP与dGTP的摩尔比不高于0.01的核苷酸混合物的反应混合物；其中包括ddATP与dATP的摩尔比不高于0.0116的核苷酸混合物的反应混合物；其中包括ddTTP与dTTP的摩尔比不高于0.015的核苷酸混合物的反应混合物；和其中包括ddCTP与dCTP的摩尔比不高于0.0066的核苷酸混合物的反应混合物。
3.根据权利要求1的DNA核苷酸序列分析方法，其中用于产生互补DNA片段的反应混合物是其中包括ddGTP与dGTP的摩尔比不低于0.15的核苷酸混合物的反应混合物；其中包括ddATP与dATP的摩尔比不低于0.174的核苷酸混合物的反应混合物；其中包括ddTTP与dTTP的摩尔比不低于0.3的核苷酸混合物的反应混合物；其中包括ddCTP与dCTP的摩尔比不低于0.099的核苷酸混合物的反应混合物；其中包括ddGTP与dGTP的摩尔比不高于0.005的核苷酸混合物的反应混合物；其中包括ddATP与dATP的摩尔比不高于0.0058的核苷酸混合物的反应混合物；其中包括ddTTP与dTTP的摩尔比不高于0.01的核苷酸混合物的反应混合物；和其中包括ddCTP与dCTP的摩尔比不高于0.0033的核苷酸混合物的反应混合物。
4.根据权利要求1的DNA核苷酸序列分析方法，其中用于产生互补DNA片段的反应混合物还包括其中包括ddGTP与dGTP的摩尔比为0.02-0.05的核苷酸混合物的反应混合物；其中包括ddATP与dATP的摩尔比为0.02-0.058的核苷酸混合物的反应混合物；其中包括ddTTP与dTTP的摩尔比为0.02-0.1的核苷酸混合物的反应混合物；其中包括ddCTP与dCTP的摩尔比为0.02-0.033的核苷酸混合物的反应混合物。
5.根据权利要求2的DNA核苷酸序列分析方法，其中用于产生互补DNA片段的反应混合物还包括其中包括ddGTP与dGTP的摩尔比为0.02-0.05的核苷酸混合物的反应混合物；其中包括ddATP与dATP的摩尔比为0.02-0.058的核苷酸混合物的反应混合物；其中包括ddTTP与dTTP的摩尔比为0.02-0.1的核苷酸混合物的反应混合物；其中包括ddCTP与dCTP的摩尔比为0.02-0.033的核苷酸混合物的反应混合物。
6.根据权利要求3的DNA核苷酸序列分析方法，其中用于产生互补DNA片段的反应混合物还包括其中包括ddGTP与dGTP的摩尔比为0.02-0.05的核苷酸混合物的反应混合物；其中包括ddATP与dATP的摩尔比为0.02-0.058的核苷酸混合物的反应混合物；其中包括ddTTP与dTTP的摩尔比为0.02-0.1的核苷酸混合物的反应混合物；其中包括ddCTP与dCTP的摩尔比为0.02-0.033的核苷酸混合物的反应混合物。
7.根据权利要求1的DNA核苷酸序列分析方法，其中将所述的各互补DNA片段的混合物通过电泳按照分子量顺序进行分离。
8.根据权利要求1的DNA核苷酸序列分析方法，其中通过银染法对所述互补DNA片段的末端碱基进行识别。
9.根据权利要求2的DNA核苷酸序列分析方法，其中将所述的各互补DNA片段的混合物通过电泳按照分子量顺序进行分离。
10.根据权利要求2的DNA核苷酸序列分析方法，其中通过银染法对所述互补DNA片段的末端碱基进行识别。
11.根据权利要求3的DNA核苷酸序列分析方法，其中将所述的各互补DNA片段的混合物通过电泳按照分子量顺序进行分离。
12.根据权利要求3的DNA核苷酸序列分析方法，其中通过银染法对所述互补DNA片段的末端碱基进行识别。
13.根据权利要求4的DNA核苷酸序列分析方法，其中将所述的各互补DNA片段的混合物通过电泳按照分子量顺序进行分离。
14.根据权利要求4的DNA核苷酸序列分析方法，其中通过银染法对所述互补DNA片段的末端碱基进行识别。
15.根据权利要求5的DNA核苷酸序列分析方法，其中将所述的各互补DNA片段的混合物通过电泳按照分子量顺序进行分离。
16.根据权利要求5的DNA核苷酸序列分析方法，其中通过银染法对所述互补DNA片段的末端碱基进行识别。
17.根据权利要求6的DNA核苷酸序列分析方法，其中将所述的各互补DNA片段的混合物通过电泳按照分子量顺序进行分离。
18.根据权利要求6的DNA核苷酸序列分析方法，其中通过银染法对所述互补DNA片段的末端碱基进行识别。
19.一种由如下8种气密性容器组成的DNA核苷酸测序试剂盒装有反应缓冲液、稳定剂、DNA聚合酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP和ddGTP核苷酸混合物的气密性容器，其中ddGTP与dGTP的摩尔比高于0.05；装有反应缓冲液、稳定剂、DNA聚合酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP和ddATP核苷酸混合物的气密性容器，其中ddATP与dATP的摩尔比高于0.058；装有反应缓冲液、稳定剂、DNA聚合酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP和ddTTP核苷酸混合物的气密性容器，其中ddTTP与dTTP的摩尔比高于0.1；装有反应缓冲液、稳定剂、DNA聚合酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP和ddCTP核苷酸混合物的气密性容器，其中ddCTP与dCTP的摩尔比高于0.033；装有反应缓冲液、稳定剂、DNA聚合酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP和ddAGTP核苷酸混合物的气密性容器，其中ddGTP与dGTP的摩尔比低于0.02；装有反应缓冲液、稳定剂、DNA聚合酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP和ddATP核苷酸混合物的气密性容器，其中ddATP与dATP的摩尔比低于0.02；装有反应缓冲液、稳定剂、DNA聚合酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP和ddTTP核苷酸混合物的气密性容器，其中ddTTP与dTTP的摩尔比低于0.02；和装有反应缓冲液、稳定剂、DNA聚合酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP和ddCTP核苷酸混合物的气密性容器，其中ddCTP与dCTP的摩尔比低于0.02。
20.根据权利要求19的DNA核苷酸测序试剂盒，其中所述8种气密性容器分别装有其中ddGTP与dGTP的摩尔比不低于0.1的核苷酸混合物；其中ddATP与dATP的摩尔比不低于0.116的核苷酸混合物；其中ddTTP与dTTP的摩尔比不低于0.02的核苷酸混合物；其中ddCTP与dCTP的摩尔比不低于0.066的核苷酸混合物；其中ddGTP与dGTP的摩尔比不高于0.01的核苷酸混合物；其中ddATP与dATP的摩尔比不高于0.0116的核苷酸混合物；其中ddTTP与dTTP的摩尔比不高于0.015的核苷酸混合物；和其中ddCTP与dCTP的摩尔比不高于0.0066的核苷酸混合物。
21.根据权利要求19的DNA核苷酸测序试剂盒，其中所述8种气密性容器分别装有其中ddGTP与dGTP的摩尔比不低于0.15的核苷酸混合物；其中ddATP与dATP的摩尔比不低于0.174的核苷酸混合物；其中ddTTP与dTTP的摩尔比不低于0.3的核苷酸混合物；其中ddCTP与dCTP的摩尔比不低于0.099的核苷酸混合物；其中ddGTP与dGTP的摩尔比不高于0.005的核苷酸混合物；其中ddATP与dATP的摩尔比不高于0.0058的核苷酸混合物；其中ddTTP与dTTP的摩尔比不高于0.01的核苷酸混合物；和其中ddCTP与dCTP的摩尔比不高于0.0033的核苷酸混合物。
22.根据权利要求19的DNA核苷酸测序试剂盒，其特征在于还包括装有反应缓冲液、稳定剂、DNA聚合酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP和ddGTP混合物的气密性容器，其中ddGTP与dGTP的摩尔比为0.02-0.05；装有反应缓冲液、稳定剂、DNA聚合酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP和ddATP混合物的气密性容器，其中ddATP与dATP的摩尔比为0.02-0.058；装有反应缓冲液、稳定剂、DNA聚合酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP和ddTTP混合物的气密性容器，其中ddTTP与dTTP的摩尔比为0.02-0.1；装有反应缓冲液、稳定剂、DNA聚合酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP和ddCTP混合物的气密性容器，其中ddCTP与dCTP的摩尔比为0.02-0.033。
23.根据权利要求20的DNA核苷酸测序试剂盒，其特征在于还包括装有反应缓冲液、稳定剂、DNA聚合酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP和ddGTP混合物的气密性容器，其中ddGTP与dGTP的摩尔比为0.02-0.05；装有反应缓冲液、稳定剂、DNA聚合酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP和ddATP混合物的气密性容器，其中ddATP与dATP的摩尔比为0.02-0.058；装有反应缓冲液、稳定剂、DNA聚合酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP和ddTTP混合物的气密性容器，其中ddTTP与dTTP的摩尔比为0.02-0.1；装有反应缓冲液、稳定剂、DNA聚合酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP和ddCTP混合物的气密性容器，其中ddCTP与dCTP的摩尔比为0.02-0.033。
24.根据权利要求21的DNA核苷酸测序试剂盒，其特征在于还包括装有反应缓冲液、稳定剂、DNA聚合酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP和ddGTP混合物的气密性容器，其中ddGTP与dGTP的摩尔比为0.02-0.05；装有反应缓冲液、稳定剂、DNA聚合酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP和ddATP混合物的气密性容器，其中ddATP与dATP的摩尔比为0.02-0.058；装有反应缓冲液、稳定剂、DNA聚合酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP和ddTTP混合物的气密性容器，其中ddTTP与dTTP的摩尔比为0.02-0.1；装有反应缓冲液、稳定剂、DNA聚合酶、dATP、dGTP、dCTP、dTTP和ddCTP混合物的气密性容器，其中ddCTP与dCTP的摩尔比为0.02-0.033。
全文摘要
本发明涉及采用双脱氧核苷酸介导的链终止反应的DNA核苷酸序列分析方法,更具体地讲,涉及通过一步分离步骤进行DNA序列分析的测序方法,所述DNA序列比可由常规桑格测序法所能分析的序列长度更长,该方法的特征在于:采用其双脱氧核苷酸与脱氧核苷酸的摩尔比彼此不同的两种核苷酸的混合物来产生DNA片段。
文档编号C12N15/00GK1338004SQ00803086
公开日2002年2月27日 申请日期2000年11月25日 优先权日1999年11月26日
发明者朴韩浯, 俞在亨 申请人:株式会社百尼尔