编码交替蔗糖酶的核酸分子的制作方法

专利名称：编码交替蔗糖酶的核酸分子的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码交替蔗糖酶(alternansucrase)的核酸分子。此外本发明也涉及载体、宿主细胞和由此处所述核酸分子转化的植物细胞，和含有这些细胞的植物。此外，也描述了制备由于插入编码交替蔗糖酶的DNA分子而合成碳水化合物交替糖(alternan)的转基因植物的方法。此外还描述了制备交替糖的方法。
公开内容包含于本申请书之内的现有技术文件在下文中引用。
交替糖是一种由葡萄糖单元组成的多糖。葡萄糖单元通过α-1，3-和α-1，6-糖苷键彼此连接，这两种键主要交替出现。然而，交替糖不是一种线性多糖，而可含有分支(Seymour等人，碳水化合物研究(CarbohydrateResearch)74，(1979)，41-62)。由于其物理化学性质，曾经讨论了交替糖用于制药工业如作为药物活性成分的载体和作为添加剂用于纺织品、化妆品和食品工业的可能性(Lopez-Munguia等人，酶与微生物技术(Enzyme Microb.Technol.)15，(1993)，77-85；Leathers等人，工业微生物与生物技术杂志(Journal of Industrial Microbiology &Biotechnology)18，(1997)，278-283)。此外，它还能用作阿拉伯胶的替代品(Coté，碳水化合物聚合物(Carbohydrate Polymers)19，(1992)，249-252)。
工业上对制造寡糖和多糖特别是交替糖的生物技术方法特别感兴趣，交替糖几乎不能或根本不能通过经典有机合成获得。与有机合成化学的经典方法相比，生物技术方法具有优点。例如，酶促催化反应通常显示更高的特异性(区域特异性、立体特异性)和更高的反应速度，在较温和反应条件下进行，并导致较高产量。这些因素在制造新的寡糖和多糖中是非常重要的。
交替糖是利用具有交替蔗糖酶生物活性的酶酶促制备的。交替蔗糖酶属于葡糖基转移酶类，其由蔗糖开始，能催化交替糖和果糖的形成。迄今为止，交替蔗糖酶只在细菌变异链球菌(Streptococcus mutans)(Mukasa等人，(普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)135(1989)，2055-2063)；Tsumori等人，(普通微生物学杂志131(1985)，3347-3353))和革兰氏阳性菌肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的特殊菌株中发现，它们通常与其他多糖形成酶(如形成葡聚糖的葡聚糖蔗糖酶)或与多糖降解酶(如交替糖酶)一起存在。因此，天然存在的菌株除交替糖之外也产生葡聚糖。
迄今为止，已用部分纯化的蛋白质有无细胞系统中或用产交替蔗糖酶肠膜明串珠菌菌株通过发酵生产出了交替糖。
已描述了用于纯化交替蔗糖酶的多种纯化方法(Lopez-Munguia等人，酶与微生物技术15(1993)，77-85；Lopez-Munguia等人，纽约科学院年报(Annals New York Academy of Sciences)613(1990)，717-722；Coté和Robyt，碳水化合物研究101(1982)，57-74)。这些方法复杂且成本相对较高，并且通常导致低蛋白质产量(Leathers等人，工业微生物学与生物技术杂志(Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology)18(1997)，278-283)。这些方法都不能生产高纯度的交替蔗糖酶蛋白质，因此该蛋白质的测序和相应DNA序列的分离迄今尚未成功。如果按照这些方法纯化的交替蔗糖酶蛋白质用于体外生产交替糖，则交替蔗糖酶制品中所含的葡聚糖蔗糖酶蛋白质残余物在生产的交替糖中产生葡聚糖杂质。交替糖与葡聚糖的分离相对耗时且昂贵(Leathers等人，工业微生物学与生物技术杂志18(1997)，278-283)。交替蔗糖酶蛋白质酶制剂中所含的葡聚糖蔗糖酶蛋白质杂质的另一个缺点是一部分蔗糖底物被转化为葡聚糖而不是交替糖的事实，这导致交替糖产量的降低。
利用明串珠菌的发酵生产也导致交替糖和葡聚糖产品混合物的形成。为了提高来源于明串珠菌菌株的交替蔗糖酶的量，已分离了突变体如突变体NRRL B-21138，其分泌交替蔗糖酶并产生相对于葡聚糖蔗糖酶较高比例的交替蔗糖酶量。然而，如果这些突变体与蔗糖发酵，则获得的交替糖持续显示有葡聚糖杂质(Leathers等人，工业微生物学与生物技术杂志18(1997)，278-283)。
从上述现有技术能看出，迄今尚且不能生产高度纯化的交替蔗糖酶蛋白质。
因此，本发明研究关于提供可以以省时、便宜的方式制备交替糖的工具和方法的问题。
专利权利要求书中表征的实施方案解决了这一问题。
因此，本发明涉及编码具有交替蔗糖酶生物活性的蛋白质的核酸分子，其选自(a)编码至少成熟形式的蛋白质的核酸分子，其包含Seq.ID No.2所示的氨基酸序列或质粒DSM 12666中所含cDNA编码的氨基酸序列；(b)包含Seq.ID No.1所示核苷酸序列或质粒DSM 12666中所含cDNA的核苷酸序列或相应核糖核苷酸序列的核酸分子；(c)编码一种蛋白质的核酸分子，该蛋白质的氨基酸序列与Seq.IDNo 2所示的氨基酸序列有至少40％的同源性；(d)核酸分子，其一条链可与如(a)或(b)所述的任一核酸分子杂交；(e)包含一种核苷酸序列的核酸分子，该核苷酸序列编码由(a)、(b)、(c)或(d)所述的任一种核酸分子编码的蛋白质的生物活性片段；和(f)核酸分子，其核苷酸序列由于遗传密码的简并而不同于如(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所述的核酸分子的序列。
因此，本发明涉及编码具有交替蔗糖酶生物活性的蛋白质的核酸分子，该分子优选地编码包含Seq.ID No.2所示氨基酸序列的蛋白质。
具有交替蔗糖酶(E.C.2.4.1.140)的酶学或生物学活性的酶被认为是指能催化蔗糖转化为交替糖和果糖的酶。这种转化可在外部接纳体(例如麦芽糖、异麦芽糖、异麦芽三糖等)存在或不存在时发生。无外部接纳体时，交替蔗糖酶由蔗糖始催化果糖和高分子交替糖的释放，交替糖是一种由葡萄糖单元组成的多糖，其主链由彼此主要以α-1，3-和α-1，6-糖苷键交替连接的葡萄糖单元组成。关于α-1，3-和α-1，6-连接的葡萄糖单元，文献显示不同的数值。根据Mukasa等人，(普通微生物学杂志135(1989)，2055-2063)，交替糖由76mol％α-1，3-连接的葡萄糖和24mol％α-1，6-连接的葡萄糖组成。Tsumori等人(普通微生物学杂志131(1985)，3347-3353)描述交替糖是一种含有49.1mol％α-1，6-连接的葡萄糖和33.9mol％α-1，3-连接的葡萄糖及13.6mol％末端葡萄糖和3.3mol％α-1，3，6-支链葡萄糖的葡聚糖。在外部接纳体如麦芽糖、异麦芽糖、异麦芽三糖和甲基-α-D-葡聚糖存在时，交替蔗糖酶能催化α-D-葡聚糖链的合成，其中葡萄糖残基主要通过α-1，6-和α-1，3-糖苷键交替连接，在这些多糖接纳体处合成果糖。根据所使用的接纳体，形成的产物具有不同的结构。例如能如Lopez-Munguia(纽约科学院年报613(1990)，717-722)所述或如本申请书实施例所述检测交替蔗糖酶的酶活性。
本发明尤其涉及含有Seq.ID No.1所示核苷酸序列的核酸分子或其部分，优选地涉及包含Seq.ID No.1所示编码区或相应核糖核苷酸序列的分子。
此外，本发明也涉及编码一种交替蔗糖酶的核酸分子，其一条链可与上述分子之一杂交。
本发明也涉及编码一种蛋白质的核酸分子，它与Seq.ID No.2所示的完整氨基酸序列有同源性，也就是说有至少40％、优选地至少60％、优选地至少70％、特别优选地至少80％、特别是至少90％的同一性，该蛋白质具有交替蔗糖酶的生物活性。
本发明也涉及编码一种交替蔗糖酶的核酸分子，其序列由于遗传密码的简并而不同于上述核酸分子的核苷酸序列。
本发明也涉及具有与整个或部分上述序列互补的序列的核酸分子。
Seq.ID No.1所示的核酸序列例如编码一种胞外交替蔗糖酶。包含Seq.ID No.2的大约前39个N端氨基酸基团的信号序列确保其分泌。在某些情况下，这只是对于将在无天然存在的信号序列时和/或与其他信号序列一起时表达的成熟蛋白质才是希望的。因此，上述核酸分子至少编码具有交替蔗糖酶生物活性的成熟形式的蛋白质。
在本发明中，术语“杂交”意思是在常规杂交条件下、优选地在严格条件下的杂交，如Sambrook等人，《分子克隆实验室指南》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第2版(1989)Cold SpringHarbour Laboratory Press，Cold Spring Harbour，NY所述。在特别优选的含义中，术语“杂交”是指在下列条件下发生杂交杂交缓冲液 2xSSC；10xDenhardt溶液(Fikoll 400＋PEG＋BSA；比例1∶1∶1)；0.1％SDS；5mMEDTA；50mM Na2HPO4；250μg/ml鲱精DNA；50μg/ml tRNA；或0.25M磷酸钠缓冲液，pH7.2；1mM EDTA7％SDS杂交温度T ＝60℃洗涤缓冲液 2xSSC；0.1％SDS洗涤温度T ＝60℃。
可与本发明的核酸分子杂交的核酸分子原则上能编码来源于表达这些蛋白质的生物的交替蔗糖酶。
例如，可与本发明的分子杂交的核酸分子能从微生物的基因组文库中分离。此外，它们也能通过遗传工程或化学合成制备。
这些核酸分子可用本发明的分子或这些分子的部分或这些分子的反向互补体鉴定和分离，例如通过根据标准方法的杂交(参见，例如Sambrook等人，1989，《分子克隆实验室指南》，第2版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。
具有与Seq.ID No.1所示核苷酸序列相同或基本相同的核酸分子或其部分例如能用作杂交探针。用作杂交探针的片段也可以是用普通合成技术制备的合成片段，其序列与本发明的核酸分子基本一致。
可与本发明的核酸分子杂交的分子也包括上述编码本发明的交替蔗糖酶的核酸分子的片段、衍生物和等位变体。在此，片段可理解为长度足以编码所述蛋白质之一，优选地显示交替蔗糖酶生物活性的核酸分子的部分。与此相关，术语衍生物是指这些分子的序列在一个或多个位点上也不同于上述核酸分子的序列，并显示与这些序列有高度同源性。在本说明书中，同源性是指至少40％的序列同一性，特别是至少60％、优选地80％以上、特别优选地90％以上的同一性。与上述核酸分子的不同可通过缺失、置换、插入和/或重组实现。
优选地，通过将各自序列与SEQ ID No.1编码区的核苷酸序列比较确定同源性程度。当比较的序列没有相同长度时，同源性程度优选地是指与较长序列中核苷酸残基相同的较短序列中核苷酸残基的百分数。同源性程度可用已知的计算机程度如ClustalW程序常规确定(Thompson等人，核酸研究(Nucleic Acids Research)22(1994)，4673-4680)，该程序的由Julie Thompson(Thompson@EMBL-Heidelberg.DE)和TobyGibson(Gibson@EMBL-Heidelberg.DE)发布，欧洲分子生物学实验室，Meyerhofstrasse 1，D 69117 Heidelberg，德国。ClustalW也能从几个网站下载，包括IGBMC(Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire etCellulaire，B.P.163，67404 Illkirch Cedex，法国；ftp//ftp-igbmc.u-strasbg，fr/pub/)和EBI(ftp//ftp.ebi.ac.uk/pub/software/)和EBI(欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute)，Wellcome TrustGenome Campus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK)的所有镜象站点。
当使用ClustalW程序1.8版本确定特定序列是否与根据本发明的参照序列例如90％相同时，对于DNA序列对比，设定值如下设置KTUPLE＝2，TOPDIAGS＝4，PAIRGAP＝5，DNAMATRIXIUB，GAPOPEN＝10，GAPEXT＝5，MAXDIV＝40，TRANSITIONS未加权。
对于使用ClustalW程序1.8版本的蛋白质序列对比，设置如下KTUPLE＝1，TOPDIAG＝5，WINDOW＝5，PAIRGAP＝3，GAPOPEN＝10，GAPEXTEND＝0.05，GAPDIST＝8，MAXDIV＝40，MATRIX＝GONNET，ENDGAPS(OFF)，NOPGAP，NOHGAP。
此外，同源性优选地是指编码蛋白质显示与SEQ ID NO2所示氨基酸序列有至少40％、更优选地至少60％、再更优选地至少80％、特别是至少90％、特别优选地至少95％的序列同一性。
同源性还指在相应的核酸分子或其编码的蛋白质之间有功能和/或结构相当。与上述分子同源并且代表这些分子的衍生物的核酸分子通常是这些分子的变异，它们代表具有相同生物学功能的修饰。它们可以是天然发生的变异，例如来源于其他微生物的序列，也可以是突变，该突变可以天然形成或可以通过人工诱变产生。此外，变异也可以是合成产生的序列。等位变体可以是天然发生的变体或是合成产生的变体或是通过重组DNA技术生产的变体。
在一个更优选的实施方案中，术语“衍生物”包括编码一种蛋白质的核酸分子，该蛋白质包含至少1个、更优选地至少3个、再更优选地至少5个、特别是至少10个、特别优选地至少20个选自下列的肽基序a)MKQQE(SEQ ID NO22)，b)KKVPV(SEQ ID NO23)，c)KDDEN(SEQ ID NO24)，d)IDGNL(SEQ ID NO25)，e)YVADS(SEQ ID NO26)，f)HLRKN(SEQ ID NO27)，g)NENTP(SEQ ID NO28)，h)NVDGY(SEQ ID NO29)，i)NPDLK(SEQ ID NO30)，j)SNDSG(SEQ ID NO31)，k)NTFVK(SEQ ID NO32)，l)ISGYL(SEQ ID NO33)，m)SNAAL(SEQ ID NO34)，n)RQYTD(SEQ ID NO35)，o)QLYRA(SEQ ID NO36)，p)DDKAP(SEQ ID NO37)，q)TRQYT(SEQ ID NO38)，r)ITFAG(SEQ ID NO39)，s)NQYKG(SEQ ID NO40)，t)LFLNA(SEQ ID NO41)，
u)QVSDT(SEQ ID NO42)，v)LITLN(SEQ ID NO43)，w)GRYVH(SEQ ID NO44)，x)TAPYG(SEQ ID NO45)，y)VVDYQ(SEQ ID NO46)，z)LSGQE(SEQ ID NO47)。
本发明核酸分子的不同变体所编码的蛋白质具有其通常具有的某些特征。例如包括酶活性、分子量、免疫反应性、构象等，和物理性质，如在凝胶电泳中的迁移行为、色谱行为、沉降系数、溶解度、光谱性质、稳定性、最适pH、最适温度等。
交替蔗糖酶(E.C.2.4.1.140)是一种属于葡糖基转移酶类的酶。迄今为止，交替蔗糖酶活性未在植物中发现，只在细菌变异链球菌(Mukasa等人，普通微生物学杂志135(1989)，2055-2063)；Tsumori等人，(普通微生物学杂志131(1985)，3347-3353))和革兰氏阳性菌肠膜明串珠菌的特殊菌株如NRRL B-1355、NRRL B-1498和NRRL B-1501中发现。这些菌株通常含有不同的葡糖基转移酶，并且如果使之在含蔗糖培养基上生长则除交替蔗糖酶外分泌葡聚糖蔗糖酶。这两种蔗糖酶通常与它们合成的多糖有高结合亲和力(Lopez-Munguia等人，纽约科学院年报613(1990)，717-722)，因此，在从含蔗糖培养基上生长的肠膜明串珠菌菌株中纯化酶时，这些多糖必须与蛋白质分离(Lopez-Munguia等人，酶与微生物技术15(1993)，77-85；Leathers等人，工业微生物学与生物技术杂志18(1997)，278-283)。
无外部接纳体时，交替蔗糖酶由蔗糖始催化果糖和高分子交替糖的释放，交替糖是一种由葡萄糖单元组成的多糖，其主链由彼此主要以α-1，3-和α-1，6-糖苷键交替连接的葡萄糖单元组成，根据光散射测定数据，其分子量应＞107(Coté，碳水化合物聚合物19(1992)，249-252)。迄今还没有关于具有末端果糖残基的交替糖的报道。然而，不能完全排除交替糖中末端果糖单元的存在。Lopez-Munguia等人(酶与微生物技术15(1993)77-85)描述了交替糖对葡聚糖酶降解有抗性。然而，它能被所谓的交替糖酶降解，从而产生不同聚合程度的交替糖的环形寡聚体(Biely等人，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)226(1994)，633-639)。高分子交替糖的超声处理可使交替糖的分子量降至＜106(Coté，碳水化合物聚合物19(1992)，249-252)。如果制备超声处理的交替糖的水溶液，则这些溶液显示与阿拉伯胶水溶液相当的流变学性质。分子量约为3500的所谓“限制交替糖”能通过用来源于球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)(NRRL B-4425)的异麦芽葡聚糖酶酶降解产生(Coté，碳水化合物聚合物19(1992)，249-252)。
在外部接纳体如麦芽糖、异麦芽糖、异麦芽三糖和甲基-α-D-葡聚糖存在时，交替蔗糖酶能在该糖类接纳体处催化α-D-葡聚糖链的合成，其中葡萄糖部分主要通过α-1，6-和α-1，3-糖苷键交替连接，和果糖的合成。根据所使用的接纳体，得到的产物具有不同的结构和低于高分子交替糖的分子量和＜15的聚合程度。由于这种聚合程度，这些产物通常也被称为寡聚交替糖(Pelenc等人，Sciences Des Aliments 11(1991)，465-476)。然而，在本发明的范围内，可在外部接纳体存在下制备的这些低分子产物也被称为交替糖。
在利用部分纯化的交替蔗糖酶蛋白质制备寡聚交替糖时，麦芽糖是一种可得到高寡聚交替糖产量的接纳体(Lopez-Munguia等人，酶与微生物技术15(1993)，77-85)。潘糖(聚合程度(d.p.)为3)是通过形成α-1，6-糖苷键而由麦芽糖形成的第一种接纳体产物。
与之相反，异麦芽糖是一种效率较低的接纳体，它导致较低的寡聚交替糖产量(Lopez-Munguia等人，酶与微生物技术15(1993)，77-85)。
交替蔗糖酶相对稳定，在50mM乙酸缓冲液，pH5.4中及40℃下半衰期为2天(Lopez-Munguia等人，酶与微生物技术15(1993)，77-85)。该酶在40℃和pH5.6时显示最大活性(Lopez-Munguia等人，酶与微生物技术15(1993)，77-85)。
在没有底物蔗糖时，交替蔗糖酶催化导致交替糖(部分)重排的歧化反应。特别是当用含有葡聚糖蔗糖酶污染的部分纯化的交替蔗糖酶制剂制备寡聚交替糖时，发现有导致寡聚交替糖完全重排的高歧化率(Lopez-Munguia等人，酶与微生物技术15(1993)，77-85)。
对于根据SDS PAGE测定的交替蔗糖酶的分子量，能发现有不同数值分别为135kDa、145kDa、173kDa和196kDa(Leathers等人，工业微生物学与生物技术杂志18(1997)，278-283；Kim和Robyt，酶与微生物技术16(1994)，659-664；Zhanley和Smith，应用与环境微生物学(Applied and Environmental Microbiology)61(3)(1995)，1120-1123)。
交替蔗糖酶的酶活性能如Lopez-Munguia等人(纽约科学院年报613(1990)，717-722)所述，或如本申请书的实施例所述显示。
一个活性单位(1u)可定义为在1分钟内导致1μmol果糖释放的酶量。
本发明的核酸分子可以是DNA分子，特别是基因组分子。而且，本发明的核酸分子也可以是RNA分子。本发明的核酸分子例如能从天然来源获得，或可合成或通过重组技术产生。
本发明的核酸分子使得可制备能产生高纯度和/或足够量的重组交替蔗糖酶蛋白质的宿主细胞，并遗传构建具有这些酶活性导致在植物中形成交替糖的植物。在本发明的范围内，术语“高纯度”意思是根据本发明的蛋白质显示至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％的纯度。此外，还提供了可用宿主细胞制备交替糖和/或用于制备重组交替蔗糖酶蛋白质的材料与方法。因此，提供本发明的核酸分子能通过相对便宜和耗时相对较少的方法制备高纯度的交替糖。
在一个优选的实施方案中，本发明的核酸分子来源于微生物，优选地来源于细菌，更优选地来源于革兰氏阳性菌，特别优选地来源于属于明串珠菌属的细菌。来源于属于肠膜明串珠菌种的细菌的核酸分子是特别优选的。
本发明也涉及可与本发明的核酸分子特异杂交的寡核苷酸。这些寡核苷酸具有优选地至少10个、特别是至少15个、特别优选地至少50个核苷酸的长度。其特征在于它们可与本发明的核酸分子特异杂交，即，它们不能或只能一定程度地与编码其他蛋白质特别是其他葡糖基转移酶的核酸序列杂交。本发明的寡核苷酸例如能用作扩增技术如PCR反应的引物，或作为杂交探针用于分离有关基因。
此外，本发明还涉及载体，特别是质粒、粘粒、病毒、噬菌体和基因技术中常用的其他载体，它们含有上述本发明的核酸分子。在本发明的一个优选实施方案中，本发明的载体能转化真菌细胞或微生物细胞。优选地，这些载体适于转化植物细胞。特别优选地，这些载体允许本发明的核酸分子-可能与侧翼调节区一起-整合到植物细胞的基因组中。其实例是能在农杆菌介导的基因转移中使用的二元载体，和已可购得的载体。
在另一个优选的实施方案中，载体中所含的核酸分子与确保可翻译RNA在原核或真核细胞中转录和合成的调节元件连接。
本发明的核酸分子在原核或真核细胞中例如在大肠杆菌中的表达是令人感兴趣的，因为它使得能更精确地表征这些分子编码的酶的酶活性。此外，也能在不含干扰酶如葡聚糖蔗糖酶或其他多糖形成酶或多糖降解酶的原核或真核细胞中表达这些酶。另外，也能通过分子生物学常用方法向核酸分子中插入不同突变(参见例如，Sambrook等人，1989，《分子克隆实验室指南》，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)，引起可能具有改变的生物学性质的蛋白质的合成。一方面，就此而言，能产生缺失突变体，其中通过从编码DNA序列的5’或3’端逐渐缺失而产生核酸分子，该核酸分子引起相应缩短的蛋白质的合成。例如，在核苷酸序列5’端的这些缺失可使负责微生物中分泌酶的氨基酸序列(转运肽)得到鉴定。
这使得能制备通过去掉相应序列而不再分泌，但由于添加了其他信号序列而仍保留于相应宿主生物的细胞内，或位于其他区室如质体、线粒体、液泡内的酶。
另一方面，也可设想在例如氨基酸序列的修饰将影响酶活性或酶控制的位点处引入点突变。这样，例如能产生具有改变的立体和区域选择性或改变的Km值的突变体，或不再经受细胞中通常存在的控制机制、并通过变构控制或共价修饰得到的突变体。
此外，也能制备具有改变的底物或产物特异性的突变体。而且也能制备具有改变的活性-温度分布(profile)的突变体。
此外，对于在植物中的表达，向本发明的核酸分子中插入突变使基因表达率和/或本发明的核酸分子编码的蛋白质的活性提高。
为在原核细胞中遗传工程改造，能通过DNA序列重组将本发明的核酸分子或这些分子的部分导入允许诱变或序列修饰的质粒中。标准方法(见Sambrook等人，1989，《分子克隆实验室指南》，第2版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，NY，USA)可进行碱基交换或添加天然或合成序列。通过向片段上添加连接体或接头能使DNA片段彼此连接。而且也能使用提供合适的限制位点或除去多余的DNA或限制位点的工程方法。在这些情况中，其中插入、缺失或置换是可能的，能使用体外诱变、“引物修复”、限制酶切或连接。通常进行序列分析、限制酶切分析和其他生物化学及分子生物学方法作为分析方法。
此外，本发明还涉及质粒pAlsu-pSK(见图2和实施例2)，其于1999年2月4日保藏于德意志微生物保藏中心(DSMZ)，Braunschweig，保藏号为DSM 12666，还涉及质粒DSM 12666的插入片段中所含的、编码具有交替蔗糖酶活性的蛋白质的核酸分子。此外，本发明也涉及可与质粒DSM 12666的插入片段杂交的核酸分子。本发明也涉及其核苷酸序列由于遗传密码的简并而不同于质粒DSM 12666插入片段的核酸分子的核酸分子。此外，本发明也涉及与质粒DSM 12666的插入片段序列有至少40％、优选地至少60％、更优选地至少80％、再更优选地至少90％、最优选地至少95％的同源性即序列同一性的核酸分子。
本发明的另一个优选的实施方案涉及宿主细胞，尤其是用上述本发明的核酸分子或用本发明的载体转化的原核或真核细胞，涉及为这些转化细胞的后代、并含有本发明的核酸分子或载体的细胞。
根据另一个优选的实施方案，宿主细胞是微生物细胞。在本发明说明书中，术语“微生物”包括如Schlegel’s“Allgemeine Mikrobiologie”(Georg Thieme Verlag，1985，1-2)所述的细菌和所有原生生物(例如真菌，特别是酵母、藻类)。本发明的一个优选实施方案涉及藻类细胞和属于曲霉属(Aspergillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、酵母属(Saccharomyces)或毕赤酵母属(Pichia)的宿主细胞(Rodriguez，生物技术杂志(Journal ofBiotechnology)33(1994)，135-146，Romanos，疫苗(Vaccine)，9卷(1991)，901以及下列等)。本发明的一个特别优选的实施方案涉及大肠杆菌细胞。交替蔗糖酶特别优选地由宿主细胞分泌。为生产重组交替蔗糖酶，这些宿主细胞的制备能通过本领域技术人员周知的方法进行。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的宿主细胞不显示干扰酶活性，如多糖形成和/或多糖降解酶。
不同表达系统的综述例如见“酶学方法”(Methods inEnzymology)153(1987)，385-516，Bitter等人，(酶学方法153(1987)，516-544)和Sawers等人，(应用微生物学与生物技术(Applied Microbiologyand Biotechnology)46(1996)，1-9)，Billman-Jacobe(现代生物技术观点(Current Opinion in Biotechnology)7(1996)，500-4)，Hockney(生物技术趋势(Trends in Biotechnology)12(1994)，456-463)，Griffiths等人，分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)75(1997)，427-440)。酵母表达系统的综述例如见Hensing等人，(Antonie van Leuwenhoek 67(1995)，261-279)，Bussineau等人，生物学标准化发展(Developments inBiological Standardization)83(1994)，13-19)，Gellissen等人，(Antonievan Leuwenhoek 62(1992)，79-93，Fleer现代生物技术观点3(1992)，486-496)，Vedvick现代生物技术观点2(1991)，742-745)和Buckholz，生物技术(Bio/Technology)9(1991)，1067-1072)。
表达载体在文献中有广泛描述。它们通常不仅含有选择性标记基因和确保在所选的宿主中复制的复制起点，而且含有细菌或病毒启动子，和大多数情况中的转录终止信号。在启动子与终止信号之间至少有一个限制位点或一个能插入编码DNA序列的多接头。能用天然控制相应基因转录的DNA序列作为启动子序列，只要它在选择的宿主生物中有活性。然而，该序列也能换为其他启动子序列。能使用导致基因组成型表达的启动子和可精确控制后连接(postconnected)的基因表达的诱导型启动子。文献中详述了具有这些性质的细菌和病毒启动子序列。用于在微生物(例如大肠杆菌、酿酒酵母)中表达的调节序列在文献中有充分描述。允许后连接基因特别高表达的启动子包括，例如T7启动子(Studier等人，酶学方法185(1990)，60-89)、lacUV5、trp、trp-lacUV5(DeBoer等人，于Rodriguez和Chamberlin(编)，《启动子，结构与功能》(Promoters，Structure and Function)；Praeger，New York，(1982)，462-481；DeBoer等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)(1983)，21-25)、lp1、rac(Boros等人，基因42(1986)，97-100)。通常，从微生物生长周期的对数期中期到大约末期时蛋白质含量最高。因此，诱导型启动子优选地用于蛋白质的合成。这些启动子通常比组成型启动子导致更高的产量。高度组成型启动子的应用引起克隆基因的连续转录和翻译，从而对于其他必需细胞功能通常有能量丢失的结果，导致细胞生长减缓(Bernard R.Glick/Jack J.Pasternak，Molekulare Biotechnologie(1995).Spektrum Akademischer Verlag GmbH，Heidelberg，Berlin，Oxford，p.342)。因此，为了获得最佳蛋白质含量，通常使用两阶段方法。首先，宿主细胞在最适条件下培养至相对高的细胞密度。第二步，根据所用的启动子类型诱导转录。就此而言，tac启动子特别合适，它能用乳糖或IPTG(＝异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导(deBoer等人，美国国家科学院院报80(1983)，21-25)。文献中也描述了转录终止信号。
用编码交替蔗糖酶的DNA对宿主细胞的转化通常能用标准方法进行，如Sambrook等人(《分子克隆实验室指南》，第2版(1989)ColdSpring Harbor Press，New York；《酵母遗传学方法，实验室手册》(Methods in Yeast Genetics，A Laboratory Course Manual)，Cold SpringHarbor Laboratory Press，1990)所述。宿主细胞在满足所使用的特定宿主细胞需要(特别是在pH值、温度、盐浓度、通风、抗生素、维生素、微量元素等方面)的营养培养基中培养。
此外，本发明涉及由本发明的核酸分子编码的蛋白质及其生物活性片段，及其制备方法，其中在允许蛋白质合成的条件下培养根据本发明的宿主细胞，随后从培养的细胞和/或培养基中分离该蛋白质。
根据本发明的一个优选实施方案，交替蔗糖酶是一种重组产生的蛋白质。在本发明说明书中，它是通过向宿主细胞中插入编码该蛋白质的DNA序列并在其中表达而制备的蛋白质。然后可从该宿主细胞和/或培养基中分离该蛋白质。
本发明的核酸分子使得能制备可产生高纯度和/或足够量的重组交替蔗糖酶蛋白质的宿主细胞。在本发明范围内，术语“高纯度”是指，根据本发明的蛋白质显示至少80％、优选地至少90％、更优选地至少95％的纯度。无需以上已提到的费时且高成本的方法(用该方法能从其他成分如葡聚糖蔗糖酶、多糖中纯化迄今为止只能从特定明串珠菌菌株中获得的交替蔗糖酶蛋白质)，因为交替蔗糖酶能在不具有任何不利的多糖合成活性的宿主细胞中产生。此外也可使用宿主细胞和载体，它们使得能在无蔗糖时产生交替蔗糖酶蛋白质，从而不再需要另外将交替蔗糖酶蛋白质与多糖分离。此外，选择合适的宿主细胞和载体可产生足够量的交替蔗糖酶蛋白质，这用迄今所述的系统还不可能。
宿主细胞产生的交替蔗糖酶能用常规纯化方法纯化，例如沉淀、离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤、HPLC反向层析等。
修饰编码交替蔗糖酶及在宿主细胞中表达本发明的核酸分子可在宿主细胞中产生一种多肽，它由于特殊性质而易于从培养基中分离。因此，欲表达的蛋白质能表达为具有其他多肽序列的融合蛋白，其特异结合性质使得能通过亲和层析法分离该融合蛋白(例如，Hopp等人，生物技术6(1988)，1204-1210；Sassenfeld，生物技术趋势(Trends Biotechnol.)8(1990)，88-93)。
本发明的另一个实施方案涉及具有交替蔗糖酶酶活性的蛋白质，特别是来源于微生物，优选地革兰氏阳性微生物，特别是明串珠菌属的微生物，特别优选地来源于肠膜明串珠菌。经计算确定，Seq.ID No.2所示的蛋白质的分子量为228.96kDa。本发明也涉及分子量为229kDa±120kDa、优选地229kDa±50kDa、特别优选地230kDa±25kDa的交替蔗糖酶。经计算确定，成熟蛋白质的分子量为224.77kDa。
本发明的核酸分子的提供第一次使得能利用遗传工程制备表达交替蔗糖酶的植物细胞，到目前为止这仍是不可能的，因为经典培养方法不能在植物中表达细菌和真菌基因。
因此本发明也涉及用本发明的核酸分子或本发明的载体转化的转基因植物细胞，或这些细胞的后代，编码具有交替蔗糖酶生物活性的蛋白质的核酸分子在允许可翻译mRNA在植物细胞中转录的调节元件控制下。
例如通过表达相应的核酸分子引入本发明的蛋白质的活性能在通过遗传工程相应修饰的植物细胞中产生交替糖。因此，本发明的核酸分子在植物细胞中的表达是可能的，这能导入在野生型中不存在的另一种相应的交替蔗糖酶活性。此外，也能按照本领域技术人员周知的方法修饰本发明的核酸分子，以获得本发明的交替蔗糖酶，例如它具有改变的温度依赖性或底物或产物特异性。这些方法已在上述不同段落中详细描述。
可使用多种技术向植物宿主细胞中插入DNA。这些技术包括利用根瘤农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)或毛根农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)作为转化剂用T-DNA转化植物细胞，原生质体融合，注射，DNA的电穿孔，通过biolistic法插入DNA，及其他可能。
已广泛研究了农杆菌介导的植物细胞转化的应用，这充分描述于EP120 516；Hoekema，《二元植物载体系统》(The Binary Plant VectorSystem)，Offsetdrukkerij Kanters B.V.，Alblasserdam(1985)，第5章；Fraley等人，植物科学评述(Crit.Rev.Plant Sci.)4(1993)，1-46，和An等人，EMBO J.4(1985)，277-287。关于马铃薯的转化参见例如Rocha-Sosa等人，(EMBO J.8(1989)，29-33)。
也已描述了利用基于农杆菌的载体对单子叶植物的转化(Chan等人，植物分子生物学22(1993)，491-506；Hiei等人，植物杂志6(1994)271-282；Deng等人，中国科学(Science in China)33(1990)，28-34；Wilmink等人，植物细胞报道(Plant Cell Reports)11(1992)，76-80；May等人，生物技术13(1995)，486-492；Conner和Dormisse，国际植物科学杂志(Int.J.Plant Sci.)153(1992)，550-555；Ritchie等人，转基因研究(Transgenic Res.)2(1993)，252-265)。可供选择的转化单子叶植物的系统包括利用biolistic方法转化(Wan和Lemaux，植物生理学(PlantPhysiol.)104(1994)，37-48；Vasil等人，生物技术11(1993)，1553-1558；Ritala等人，植物分子生物学24(1994)317-325；Spencer等人，理论与应用遗传学(Theor.Appl.Genet.)79(1990)，625-631)、原生质体转化、部分通透性细胞的电穿孔、经玻璃纤维的插入。特别是在文献中重复描述了玉米的转化(参见例如，WO 95/06128，EP 0 513 849，EP 0 465 875，EP29 24 35；Fromm等人，生物技术8，(1990)，833-844；Gordon-Kamm等人，植物细胞2，(1990)，603-618；Koziel等人，生物技术11(1993)，194-200；Moroc等人，理论与应用遗传学80，(1990)，721-726)。
也已叙述了其他类谷物的成功转化，例如大麦(Wan和Lemaux，同上；Ritala等人，同上；Krens等人，自然296(1982)，72-74)和小麦(Nehra等人，植物杂志5(1994)，285-297)。在植物细胞中有活性的任何启动子通常都适用于在植物细胞中表达核酸分子。能选择启动子以使在本发明的植物中的表达组成型发生或仅在特定组织中、在植物发育的特定时期或在外部影响所决定的时间发生。启动子对于植物可以是同源的或异源的。
合适的启动子例如是花椰菜花叶病毒的35S RNA启动子(参见例如US-A-5,352,605)和遍在蛋白启动子(参见例如US-A-5,614,399)，它们引起组成型表达，和patatin基因启动子B33(Rocha-Sosa等人，EMBO J.8(1989)，23-29)，其在马铃薯中引起块茎特异的表达，或确保只在光合活性组织中表达的启动子，如ST-LS1启动子(Stockhaus等人，美国国家科学院院报84(1987)，7943-7947；Stockhaus等人，EMBO，J.8(1989)2445-2451)、Ca/b-启动子(参见例如US-A-5,656,496、US-A-5,639,952，Bansal等人，美国国家科学院院报89(1992)，3654-3658)和Rubisco SSU启动子(参见例如US-A-5,034,322；US-A-4,962,028)或来源于小麦的谷蛋白启动子，其导致胚乳特异的表达(HMW启动子)(Anderson，理论与应用遗传学96，(1998)，568-576，Thomas，植物细胞2(12)，(1990)，1171-1180)、来源于稻的谷蛋白启动子(Takaiwa，植物分子生物学30(6)(1996)，1207-1221，Yoshihara，FEBS Lett.383(1996)，213-218，Yoshihara，植物与细胞生理学(Plant and Cell Physiology)37(1996)，107-111)、来源于玉米的shrunken启动子(Maas，EMBO J.8(11)(1990)，3447-3452，Werr，分子普通遗传学202(3)(1986)，471-475，Werr，分子普通遗传学212(2)，(1988)，342-350)、USP启动子、菜豆蛋白启动子(Sengupta-Gopalan，美国国家科学院院报82(1985)，3320-3324，Bustos，植物细胞1(9)(1989)，839-853)或来源于玉米的玉米醇溶蛋白基因启动子(Pedersen等人，细胞29(1982)，1015-1026；Quatroccio等人，植物分子生物学15(1990)，81-93)。然而，也能使用只在外部因素所决定的时间激活的启动子(参见例如WO 93/07279)。就此而言，可简单诱导的热休克蛋白启动子可能是特别有意义的。此外，也可使用种子特异的启动子如来源于蚕豆(Vicia faba)的USP启动子，其可确保在蚕豆及其他植物中的种子特异的表达(Fiedler等人，植物分子生物学22(1993)，669-679；Bumlein等人，分子普通遗传学225(1991)，459-467)。此外也可使用果实特异的启动子，如WO 91/01373所述。
此外，也可具有终止序列，其用来正确地终止转录并向转录物添加poly-A尾，这被认为具有稳定转录物的作用。这些元件在文献中有述(参见例如Gielen等人，EMBO J.8(1989)，23-29)，并能任意替换。
这些细胞不同于天然存在的植物细胞，因为事实是它们含有不在这些细胞中天然存在的本发明的核酸分子。此外，本发明的这些转基因植物细胞不同于天然存在的植物细胞，因为它们含有稳定整合于基因组中的至少一个拷贝的本发明的核酸分子。
此外，至少由于下列特征之一，本发明的植物细胞优选地不同于天然存在的植物细胞如果插入的本发明的核酸分子对于植物细胞是异源的，则发现转基因植物细胞含有本发明的插入核酸分子的转录物。后者能通过例如Northern印迹分析检测。本发明的植物细胞优选地含有一种由本发明的插入核酸分子编码的蛋白质。这可用例如免疫学方法特别是Western印迹分析显示。
按照本领域技术人员周知的方法能使转基因植物细胞再生为整个植物。
本发明也涉及可通过再生本发明的转基因植物细胞而获得的植物。此外，还涉及含有上述转基因植物细胞的植物。
在大多数植物中，光合作用期间在植物内形成的糖形式即主要是蔗糖形式的光同化物被运输到相应靶器官中。由于蔗糖是交替蔗糖酶聚合反应的底物，故所有植物，包括单子叶植物和双子叶植物，在交替蔗糖酶表达方面原则上都能被本发明的核酸分子改变。
编码具有交替蔗糖酶活性的蛋白质的本发明核酸分子在植物中的表达例如能用来实现可从植物中获得的提取物的粘度改变，这种改变是通过交替糖的合成而实现的。就此而言，例如番茄是所关注的。交替蔗糖酶在番茄果实中的表达导致交替糖的合成，并导致从这些果实中获得的提取物的粘度改变，例如用于番茄泥或番茄酱的生产。
本发明的核酸分子的表达在显示较高蔗糖含量或贮存蔗糖的植物器官中特别有利。这些器官例如是甜菜根或甘蔗茎。由于这些植物通常不贮存任何可知含量的淀粉，所以能从这些植物中分离由交替蔗糖酶合成的纯交替糖。
植物细胞中发生蔗糖生物合成的位置是细胞溶胶。但贮存位置是液泡。在向甜菜或马铃薯的贮藏组织转运时，或在向种子胚乳转运期间，蔗糖必须通过质外体。因此，所有这三种区室，即细胞溶胶、液泡、质外体可有助于表达用于合成交替糖的核酸分子。另外，例如由细菌果糖基转移酶在造粉体中的表达所示，质体也有助于此。同样需要蔗糖作为底物的该果糖基转移酶能介导“淀粉果聚糖”在造粉体中的形成(Smeekens，植物科学趋势(Trends in Plant Science)，2，8(1997)，286-288)。
对于产淀粉植物，如马铃薯和玉米，其中淀粉生物合成和淀粉贮藏通常在造粉体中发生，交替蔗糖酶在质外体、细胞溶胶或液泡中的表达将导致在这些区室中另外合成寡糖和/或多糖，这能解释产量的总体提高。
对于马铃薯-造粉体中合成的淀粉能与质外体、细胞溶胶或液泡中合成的交替糖分离，能用极相同的植物回收淀粉和交替糖。
此外，也已知转基因马铃薯和玉米植物，其由于反义构建体抑制了ADP-葡萄糖-焦磷酸化酶而完全抑制了分别在块茎和谷粒中的淀粉合成。对于马铃薯，可溶性糖，特别是蔗糖和葡萄糖，例如在块茎中积累(Müller-Rber等人，EMBO J.11(1992)，1229-1238)。用蔗糖作为底物通过交替蔗糖酶的表达能在这些植物的细胞溶胶、液泡或质外体中产生交替糖。
因此在本发明的另一个优选的实施方案中，本发明的植物细胞特征在于较来源于野生型植物的相应细胞降低的ADP葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)活性。
编码AGPase的DNA分子为本领域技术人员所周知，并为例如Müller-Rber等人，(分子普通遗传学224(1)(1990)，136-146)所描述。利用编码AGPase的DNA分子，能通过重组DNA技术(例如反义、核酶或共抑制方法)产生显示降低的AGPase活性的植物。此外，例如来源于玉米的具有降低的AGPase活性的AGPase突变体(brittle-2和shrunken-2)，为本领域技术人员所知。
术语“降低的”是指与相应野生型细胞相比，AGPase活性优选地至少降低10％、更优选地至少50％、再更优选地至少80％。
AGPase活性能按照Müller-Rber等人(分子普通遗传学224(1)(1990)，136-146)或按照本领域技术人员周知的方法测定。
根据葡萄糖部分被直接从蔗糖转移给存在的糖接纳体的事实区别交替蔗糖酶催化的反应。相反，对于植物，由蔗糖生物合成线性葡聚糖如下进行首先将蔗糖分解为葡萄糖和果糖，然后均转化为活化的中间体ADP-葡萄糖。用淀粉合酶将葡萄糖部分从ADP葡萄糖转移给已存在的葡聚糖，从而释放ADP。蔗糖转化为两个ADP葡萄糖分子需要几个耗能反应。因此，交替蔗糖酶催化的反应的能量消耗大大低于在植物细胞中由蔗糖合成多糖的能量消耗，这可导致在含有本发明的核酸分子的植物中合成的寡糖和/或多糖产量提高。
对于核酸分子在植物中的表达，原则上存在如下可能性合成的蛋白质可能位于植物细胞(例如细胞溶胶、质体、液泡、线粒体)或植物(例如质外体)的任何区室中。为实现在特定区室的定位，必要时编码区必须与确保在相应区室中定位的DNA序列连接。使用的信号序列必须均排列于与编码该酶的DNA序列相同的阅读框中。
为确保在质体中的定位，可设想使用下列转运肽之一菠菜质体铁氧还蛋白NADP＋氧化还原酶(FNR)的转运肽，Jansen等人，(现代遗传学(Current Genetics)13(1988)，517-522)公开。特别是，能使用此处公开的cDNA序列中核苷酸-171-165的序列，其包含5′非翻译区及编码转运肽的序列。另一个实例是玉米蜡质蛋白的转运肽，其包含成熟蜡质蛋白的前34个氨基酸残基(Klsgen等人，分子普通遗传学217(1989)，155-161)。也能使用不含成熟蛋白质前34个氨基酸的转运肽。此外，也能使用核酮糖二磷酸羧化酶小亚基(Wolter等人，美国国家科学院院报85(1988)，846-850；Nawrath等人，美国国家科学院院报91(1994)，12760-12764)、NADP malat脱氢酶(Gallardo等人，Planta 197(1995)，324-332)、谷胱甘肽还原酶(Creissen等人，植物杂志8(1995)，167-175)或R1蛋白(Lorberth等人，自然生物技术(Nature Biotechnology)16，(1998)，473-477)的信号肽。
为确保在液泡中的定位，可设想使用下列转运肽之一patatin蛋白的N端序列(146个氨基酸)(Sonnewald等人，植物杂志1(1991)，95-106)或Matsuoka和Neuhaus，实验植物学杂志(Journal of ExperimentalBotany)50(1999)，165-174；Chrispeels和Raikhel，细胞68(1992)，613-616；Matsuoka和Nakamura，美国国家科学院院报88(1991)，834-838；Bednarek和Raikhel，植物细胞3(1991)，1195-1206；Nakamura和Matsuoka，植物生理学101(1993)，1-5所述的信号序列。
为确保在线粒体中的定位，例如可设想使用Braun等人(EMBO J.11，(1992)，3219-3227)所述的转运肽。
为确保在质外体中的定位，可设想使用下列转运肽之一蛋白酶抑制剂II基因(Keil等人，核酸研究14(1986)，5641-5650；von Schaewen等人，EMBO J.9(1990)，30-33)、来源于解淀粉欧文氏菌(Erwiniaamylovora)的果聚糖蔗糖酶基因(Geier和Geider，物理分子植物病理学(Phys.Mol.Plant Pathol.)42(1993)，387-404)、来源于茄子(Solanumtuberosum)的patatin基因B33片段一其编码前33个氨基酸的信号序列(Rosahl等人，分子普通遗传学(Mol Gen.Genet.)203(1986)，214-220)或Oshima等人(核酸研究18(1990)，181)所述的信号序列。
Seq.ID No.1所示的核酸序列编码一种胞外交替蔗糖酶。包含Seq.ID No.2的大约前39个N端氨基酸残基的信号序列确保了分泌。
转基因植物原则上可以是任何植物种的植物，也就是说，它们可以是单子叶和双子叶植物。优选地，这些植物是为营养或为技术目的特别是为工业目的人工培育的有益植物。它们优选地是贮淀粉植物，如谷类种(黑麦、大麦、燕麦、小麦、粟、西米等)、稻、豌豆、皱粒豌豆、木薯和马铃薯；番茄、芸苔、大豆、大麻、亚麻、向日葵、豇豆或竹芋，成纤维植物(例如亚麻、大麻、棉花)，贮油植物(例如芸苔、向日葵、大豆)和贮蛋白质植物(例如豆荚科植物、谷类、大豆)。本发明也涉及果树和棕榈。此外，本发明也涉及饲料植物(例如草料和牧草，如苜蓿、三叶草、黑麦草)和蔬菜类植物(如番茄、莴苣、菊苣)和观赏植物(如郁金香、风信子)。优选贮糖和/或贮淀粉植物。特别优选甘蔗和甜菜和马铃薯植物、玉米、稻、小麦和番茄植物。
本发明的另一主题是产生转基因植物细胞和转基因植物的方法，与未转化的野生型细胞/未转化的野生型植物相比，它们可合成交替糖。在该方法中，本发明的核酸分子所编码的蛋白质的表达和/或活性与不显示任何交替蔗糖酶表达和/或活性的相应野生型细胞/野生型植物相比提高。特别是，这种方法包括根据本发明的核酸分子在植物细胞中的表达。根据本发明的核酸分子优选地与一种确保在植物细胞中表达的启动子连接。在一个特别优选的实施方案中，该方法包括向植物细胞中导入根据本发明的核酸分子并由该细胞再生植物。
这种表达的提高例如可通过Northern印迹分析来检测。活性的提高可通过检测来源于植物细胞的蛋白质提取物的交替蔗糖酶活性来检测。交替蔗糖酶的酶活性例如能如Lopez-Munguia等人(纽约科学院年报613，(1990)，717-722)所述或如本申请书的实施例所述测定。
本发明也涉及本发明的植物的繁殖材料。术语“繁殖材料”包括适于无性或有性产生后代的植物部分。合适的无性繁殖材料是例如插条、愈伤组织培养物、根茎或块茎。其他繁殖材料包括例如果实、种子、秧苗、原生质体、细胞培养物等。优选的繁殖材料是块茎和种子。本发明也涉及本发明的植物的可收获部分如果实、种子、块茎或根状茎。
本发明的另一个实施方案涉及制备交替糖的方法，其包括从本发明的植物中提取并分离交替糖的步骤。
从本发明的植物中提取并分离交替糖可用标准方法进行，如沉淀、提取和层析法。
此外本发明也涉及可从本发明的植物或从本发明的繁殖材料获得的交替糖。
此外本发明也涉及一种制备交替糖和/或果糖的方法，其中本发明的宿主细胞向含蔗糖培养基中分泌交替蔗糖酶，并从该培养基中分离交替糖和/或果糖。
本发明的方法的一个优选实施方案使用一种重组产生的、由宿主细胞向培养基中分泌的交替蔗糖酶，从而避免了必须破碎细胞才能纯化蛋白质，因为分泌的蛋白质能从上清液中获得。培养基的残余成分能用加工技术中常用的方法除去，如透析、反向渗透、层析法等。这些方法也适用于浓缩分泌至培养基中的蛋白质。微生物分泌蛋白质通常由N端信号肽(信号序列、前导肽、转运肽)介导。具有该信号序列的蛋白质能穿透微生物的细胞膜。蛋白质的分泌能通过向编码交替蔗糖酶的相应区域中添加编码该信号肽的DNA序列而实现。
所表达的交替蔗糖酶的天然信号肽是优选的，来源于肠膜明串珠菌NRRL B 1355的交替蔗糖酶的信号肽(见Seq.ID No.2的大约前25-45个N端氨基酸残基)是特别优选的。
来源于产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)M5A1的α-CGTase的信号肽(Fiedler等人，分子生物学杂志256(1996)，279-291)或GenBank保藏号X86014的序列的核苷酸11529-11618所编码的信号肽是最优选的。
交替糖和/或果糖的制备既不需要活化的葡萄糖衍生物也不需要辅因子，而在细胞内发生的大多数多糖合成反应中这是必要的。因此，分泌交替蔗糖酶的微生物能在含蔗糖培养基中培养，所分泌的交替蔗糖酶引起交替糖和果糖在培养基中的合成。
与来源于可天然分泌交替蔗糖酶的肠膜明串珠菌的宿主细胞相比，根据本发明使用的宿主细胞具有如下优点，它们不分泌具有不利的多糖合成副反应的蛋白质，如葡聚糖蔗糖酶，结果是在宿主细胞外，除交替糖之外，不能形成其他的多糖，这些多糖通常只能通过高成本且耗时的方法才能与交替糖分离。此外，根据本发明的一个优选实施方案的宿主细胞没有任何不利的多糖降解副活性，否则可导致产生的交替糖产量降低。
本发明的方法除交替糖之外产生果糖。果糖能用于便宜地分离所谓的“富含果糖糖浆”(HFCS)。制备果糖的常规方法一方面用于利用转化酶酶促分解蔗糖，或用于将淀粉分解为葡萄糖单元—主要是通过酸水解完成，及随后用葡萄糖异构酶将葡萄糖酶促转化为果糖。然而，这两种方法都产生葡萄糖和果糖的混合物。这两种成分随后必须通过层析法彼此分离。
本发明的方法的两种反应产物的分离，或底物蔗糖的反应产物的分离，例如能利用允许果糖透过而不允许蔗糖和/或交替糖透过的膜来实现。如果准备用这种膜连续除去果糖，则发生更多或更少的蔗糖完全转化。
交替糖与果糖的分离能用标准方法进行或能如工作实施例所述进行。
根据该方法的一个实施方案，宿主细胞来源于微生物，优选地来源于大肠杆菌。
在另一个优选的实施方案，本发明的方法使用真菌宿主细胞，特别是酵母细胞，如酿酒酵母(Aaccharomyces cerevisiae)。在含蔗糖培养基中产生交替糖的酵母细胞由于交替蔗糖酶的酶活性而不易使用，因为酵母分泌一种可分解胞外蔗糖的转化酶。酵母通过己糖转运蛋白吸收产生的己糖。然而，已描述了一种酵母株(Riesmeier等人，EMBO J.11(1992)，4705-4713)，其含有一种缺陷的sec2基因，因此不能分泌转化酶。此外，这些酵母细胞不含能将蔗糖输入细胞中的输送系统。如果利用本发明的核酸分子修饰这种菌株使其可向培养基中分泌交替蔗糖酶，则将在含蔗糖培养基中合成果糖和交替糖。产生的果糖随后能被酵母细胞吸收。
在该方法的另一个优选实施方案中，本发明的宿主细胞为固定形式。
通常，宿主细胞通过细胞内含固定于合适的材料中，如藻酸盐、聚丙烯酰胺、明胶、纤维素或脱乙酰壳多糖。然而，细胞与载体材料的吸附或共价结合也是可能的(Brodelius和Mosbach，酶学方法，135(1987)，222-230)。细胞固定的一个优点是，它允许达到比液体培养大大提高的细胞密度。这导致更高的产率。而且，培养的搅拌和通风成本降低，保持无菌的方法的成本也降低。另一重要方面是连续生产交替糖的可能性，从而避免或者至少大大减少了发酵过程中定期发生的非生产阶段。
本发明的另一个实施方案涉及一种生产交替糖和/或果糖的方法，其中a)使含蔗糖溶液与本发明的蛋白质在可使蔗糖转化为交替糖和/或果糖的条件下接触；和b)从该溶液中分离交替糖和/或果糖。
在该实施方案中，本发明涉及一种利用无细胞酶制剂体外制备交替糖和/或果糖的方法。在此情况中，在允许形成交替蔗糖酶蛋白质的无蔗糖培养基中培养例如可分泌交替蔗糖酶的微生物至稳定期。离心培养基除去细胞后，能从上清液中回收分泌的酶。随后将该酶加入含蔗糖溶液中以合成交替糖和/或果糖。与上述在含细胞系统中合成交替糖相比，该方法具有反应条件易于控制、反应产物基本较纯且易于纯化的优点。蛋白质的纯化能如上所述进行。
本发明的方法的一个优选实施方案使用一种纯化的交替蔗糖酶。纯化的交替蔗糖酶是指基本上不含合成蛋白质的细胞的细胞成分的酶，并且无具有多糖合成活性(如葡聚糖蔗糖酶)或降解活性的蛋白质污染，和/或无(多糖)接纳体污染。术语“纯化的交替蔗糖酶”优选地指具有至少70％、优选地至少85％、特别优选地至少95％纯度的交替蔗糖酶。
纯化蛋白质在制备交替糖和/或果糖中的应用具有许多优点。与使用部分纯化的蛋白质提取物的方法相比，本发明的方法的反应培养基不含生产菌株(微生物)的任何残余，其可用于蛋白质的纯化或通过遗传工程制备。
此外，纯化蛋白质的应用在食品及药品工业用途上有利。由于反应培养基组成确定且不含任何不需要的成分，所以产品同样在成分上更加精确确定。因此，通过遗传工程生产的这些产品获得食品和药品工业批准的方法需要相当少的证明，特别是因为这些产品不应显示任何痕量的转基因微生物。
此外，与迄今描述的使用部分纯化的交替蔗糖酶制剂在无细胞系统中的体外方法相反，使用纯化交替蔗糖酶的本发明的方法具有可制备高纯度交替糖而不发生葡聚糖蔗糖酶和葡聚糖污染的优点，这是因为本发明的蛋白质有高纯度。此外，本发明的方法可高产量地生产交替糖，而没有例如由葡聚糖蔗糖酶的不利副反应引起的损失，这种副反应将使部分底物蔗糖转化为不希望的葡聚糖，葡聚糖与交替糖的分离只能用耗时且昂贵的方法实现。
本发明的方法除交替糖之外还产生果糖。果糖能用于便宜地回收所谓的“富含果糖糖浆”(HFCS)。由于使用纯化的交替蔗糖酶，本发明的方法能产生高纯度的产物。因此，与由玉米淀粉制备HFCS的常规方法相比-其包括经离子交换除去缓冲盐的高成本步骤(Crabb和Mitchinson，TIBTECH 15(1997)，349-352)，本发明的方法不需要昂贵的果糖纯化。
本发明的方法的另一个优选实施方案使用一种重组产生的交替蔗糖酶。
根据另一个优选的实施方案，具有交替蔗糖酶酶活性的酶固定于一种载体材料上。
交替蔗糖酶的固定具有如下优点是合成反应催化剂的酶易于从反应混合物中回收，并能重新利用数次。由于酶的纯化通常是昂贵且耗时的，故酶的固定和再利用可大大节约成本。另一个优点是反应产物不含任何残余蛋白质的纯度。
有多种载体材料可用于蛋白质的固定，与载体材料的偶联可通过共价或非共价键进行(综述见《酶学方法》135，136，137)。广泛应用的载体材料包括例如琼脂糖、藻酸盐、纤维素、聚丙烯酰胺、硅石或尼龙。
根据本发明的另一个实施方案，(固定于载体材料上的)交替蔗糖酶存在于两层膜之间，其一允许果糖透过而不允许蔗糖和交替糖透过，另一个允许蔗糖而不允许交替糖透过。底物的供应通过允许蔗糖透过的膜进行。合成的交替糖保留于两层膜之间的空隙中，释放的果糖能通过只允许果糖透过的膜从反应平衡中连续去除。这种排列可有效分离反应产物，从而产生纯果糖。
此外，也描述了通过离子交换层析对果糖的分离(《淀粉水解产物，世界性的技术、生产及用途》(Starch Hydrolysis Products，WorldwideTechnology，Production，and Application)，F. W.Schenck，R.E.Hebeda编，(1992)，VCH Publishers，Inc.，纽约)。
因此，交替蔗糖酶在制备纯果糖中的用途一方面具有能使用相对便宜的底物蔗糖作为原材料的优点，另一方面又能从反应混合物中容易地分离果糖而不需其他的酶促转化或层析方法。
此外，本发明还涉及制备交替糖和/或果糖的方法，其中a)使含蔗糖溶液与本发明的蛋白质和接纳体分子在可使蔗糖转化为交替糖和/或果糖的条件下接触；和b)从该溶液中分离交替糖和/或果糖。
在本发明的范围内，接纳体分子是指交替蔗糖酶能催化其链延伸反应的分子。在反应开始时能加入反应混合物中的接纳体优选地是碳水化合物或碳水化合物衍生物。外部接纳体的应用导致产生在本发明说明书中称为交替糖的低分子产物。碳水化合物接纳体优选地是寡糖或多糖，特别是支链多糖，如糊精、糖原或支链淀粉，优选地是线性多糖，特别优选地是选自的麦芽糖、异麦芽糖、异麦芽三糖和甲基-α-D-葡聚糖的糖类。如果在这些接纳体处发生交替糖链的延伸，则形成具有比离析物更高的分子量的产物。当使用麦芽糖、异麦芽糖、异麦芽三糖和甲基-α-D-葡聚糖时，人们获得比能在无外来糖接纳体时制备的交替糖有更低分子量的产物。
制备的寡聚交替糖的分子量大小取决于所使用的蔗糖/接纳体比。例如，产物的聚合程度随蔗糖/异麦芽糖比值的提高而提高。
此外，蔗糖/接纳体比值可影响寡聚交替糖产量。例如，寡聚交替糖产量随蔗糖/异麦芽糖比值的提高而提高。
迄今描述的利用作者声称已纯化的交替蔗糖酶生产寡聚交替糖的方法(Pelenc等人，Sciences Des Aliments 11(1991)，465-476)在糖接纳体麦芽糖的存在下只能产生寡聚交替糖和寡葡聚糖的产物混合物。在此情况中，寡葡聚糖的合成可能是由于交替蔗糖酶制剂的葡聚糖蔗糖酶污染。与该方法相比，本发明的方法具有利用重组产生的不含任何葡聚糖蔗糖酶污染物的交替蔗糖酶蛋白质能生产寡聚交替糖而不同时形成寡葡聚糖的优点。因此，本发明的方法能生产寡聚交替糖，而不需要其他高成本的分离寡葡聚糖的纯化步骤。
根据另一个优选的实施方案，具有交替蔗糖酶酶活性的酶固定于一种载体材料上。
根据本发明的方法的另一个优选实施方案，使用重组产生的交替蔗糖酶。
此外，本发明还涉及含有交替糖的终产品。在该方面，终产品被认为是指化妆品，优选地食品、饲料，特别优选地是药品。
最后，本发明涉及一种制备上述产物的方法，其包括本发明的上述交替糖生产方法之一，和这样获得的交替糖的配制，其形式适于相应产品的上述用途之一。
公开了这些和其他实施方案，其对于技术人员是显然的，且包括于本发明的说明书和实施例中。能按本发明含义使用的关于上述方法、工具和用途之一的其他文献能从本领域中获得，例如利用电子装置从公开图书馆获得。该目的尤其能用公开数据库如“medline”达到，其可通过互联网例如从http//www.ncbi.nlm.gov/PrbMed/medline.html网址获得。其他数据库和地址为技术人员所知，并能从互联网例如从网址http//www.lycos.com获得。关于生物技术专利和专利申请的来源和信息的综述见Berks，TIBTECH 12(1994)，352-364。
附图描述


图1用克隆AS-19B1、AS-19B2、AS-28B和AS-29Ba的相应重叠片段筛查肠膜明串珠菌NRRL B 1355基因组文库后克隆的完整序列区的线性图谱。
图2质粒图谱pAlsu-pSK。
图3HPLC层析谱在麦芽糖存在下寡聚交替糖的制备(实施例2)。
图4质粒图谱pAlsu-pET24a图5SDS PAGE，及随后蔗糖酶活性的测定(参见实施例6)使用下列蛋白质提取物1＋2)含有pAlsu-pET24a-3的大肠杆菌BL21(DE3)3＋4)含有pAlsu-pET24a-7的大肠杆菌BL21(DE3)5＋6)含有pAlsu-pET24a-21的大肠杆菌BL21(DE3)7＋8)含有pET24a的大肠杆菌BL21(DE3)1，3，5，7) IPTG诱导之前的培养物2，4，6，8) 培养末期的培养物图6葡聚糖T10的HPLC层析谱。
图7葡聚糖酶消化后葡聚糖T10的HPLC层析谱。
图8
寡聚交替糖的HPLC层析谱。
图9葡聚糖酶消化后寡聚交替糖的HPLC层析谱。
图10包含质粒pBinAR-N的多接头的表达盒的图谱。
图11质粒图谱pat-Alsu-Hyg。
图12质粒图谱fnr-Alsu-Hyg。
实施例实施例中使用的载体1.pBinAR-N利用标准方法(Sambrook等人，《分子克隆实验室指南》，第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，USA(1989))，我们将35S启动子与OCS-终止子之间的不同多接头(参见
图10)导入质粒pBinAR中(Hfgen和Willmitzer，植物科学(Plant Science)66(1990)，221-230)。得到的质粒被称为pBinAR-N。
2.pBinAR-Hyg-N通过标准方法(Sambrook等人，《分子克隆实验室指南》，第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，USA(1989))我们分离含有35S启动子、多接头和OCS-终止子的pBinAR-N的EcoRI/HinDIII-片段。然后将该片段连接于质粒pBIB-Hyg的相同限制位点(Becker，核酸研究18(1990)，203)。产生的质粒被称为pBinAR-Hyg-N。
3.pBinAR-pat-Hyg使用寡核苷酸Sp-pat-5′和Sp-pat-3′(SEQ ID Nos.48和SEQ ID No.49)，用质粒pgT5(Rosahl等人，分子普通遗传学203(1986)，214-220；Sonnewald等人，植物杂志1(1991)，95-106)作为模板，通过PCR方法扩增了编码马铃薯patatin蛋白前导肽的DNA分子(参见SEQ ID No.50，其不同于Sonnewald等人，植物杂志1(1991)，95-106所用的序列)。产生的PCR产物用限制酶XbaI和SalI酶切，然后连接于事先用限制酶SpeI和SalI线性化的质粒pBinAR-Hyg-N中。产生的质粒被称为pBinAR-pat-Hyg。
PCR条件缓冲液和聚合酶来自于Boehringer Mannheim(Pwo聚合酶号1644947)DNA 0，2ng10x缓冲液＋MgSO45μldNTPs(每种10 mM) 1μl引物Sp-pat-5′ 120nM引物Sp-pat-3′ 120nMPwo聚合酶1，0单位蒸馏水 加至50μl反应条件步骤195℃230分钟步骤295℃030分钟步骤364℃030分钟步骤472℃030分钟(每次循环加1秒钟)步骤572℃500分钟步骤2-4以循环方式重复35次。
4.pBinAR-FNR-Hyg利用寡核苷酸Sp-fnr-5′和Sp-fnr-3(参见SEQ ID No.51和52)，我们使用质粒p6SocFNR-15(Jansen等人，现代遗传学(Current Genetics)13，(1988)，517-522)作为模板，通过PCR法扩增了编码菠菜FNR蛋白转运肽的DNA分子。得到的PCR产物用XbaI和SalI酶切，然后克隆到SpeI/SalI-切开的pBinAR-Hyg-N中。产生的质粒称为pBinAR-fnr-Hyg。
PCR条件缓冲液和聚合酶来自Gibco BRL(铂Taq DNA聚合酶高保真号1304-011)DNA 0，2ng10x缓冲液 5μlMgSO4 2，0μldNTPs(每种10mM) 1μl引物Sp-fnr-5′150nM引物Sp-fnr-3′150nMTaq铂高保真聚合酶 1，5单位蒸馏水加至50μl反应条件步骤1 95℃230分钟步骤2 95℃030分钟步骤3 58℃030分钟步骤4 68℃020分钟(每循环加1秒)步骤5 68℃300分钟步骤2-4以循环方式重复35次。实施例1来源于肠膜明串珠菌NRRL-B1355的交替蔗糖酶的克隆交替蔗糖酶的分离及测序肠膜明串珠菌NRRL-B1355菌株在添加有5％蔗糖的1升乳酸菌MRS培养液(Difco)中28℃培养2天。以20,000xg离心培养物30分钟后，上清液与等体积的10％三氯乙酸混合，并在4℃下搅拌16小时。然后以10,000xg离心该溶液30分钟。将这样获得的沉淀物溶解于4.5ml40mM Tris-HCl，pH8.8中，随后用(约0.5ml)2M Tris碱中和。该蛋白质溶液交给公司Toplab Gesellschaft für angewandte BiotechnologiembH，Martinsried，德国，进行蛋白质测序。在该公司，在SDS聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离该蛋白质溶液，凝胶用考马斯蓝染色，随后用10％乙酸除去染色。为了蛋白质的酶促消化，从凝胶上切下蛋白质条带，加压通过筛子破碎(孔30μm×100μm)。然后用半浓缩的温育缓冲液(12.5mM Tris，0.5mM EDTA pH8.5)洗涤破碎的凝胶2分钟。随后离心，除去缓冲液，凝胶在“Speedvac”中干燥1小时(约5％残余水份，橡胶样)。随后制备内切蛋白酶LysC在400μl 12.5mM Tris/HCl，pH8.5(酶∶蛋白质＝1∶10)和0.1％月桂基麦芽糖苷(laurylmaltosite)中的溶液。向样品中加入200μl该溶液，并在加热块摇床中37℃温育过夜。为了洗脱肽片段，与1％TFA进行1小时温育两次，随后离心，之后用10％甲酸、20％异丙醇、60％乙腈洗脱3小时。通过HPLC(Superspher 60 RPselect B柱(Merck，Darmstadt)2mm×125mm；缓冲液A 0.1％三氟乙酸，缓冲液B0.085％TFA乙腈溶液；流速0.2ml/min；梯度5-60％60分钟；206nm检测)使获得的肽片段彼此分离。然后用Procise492自动测序仪(Applied Biosystems，PE)测序获得的肽片段；方法为根据Hunkapiller(Hunkapiller等人，酶学方法(Meth.Enzymol.)91(1983)，399-413)改进的分步Edman降解。
鉴定了6种不同的肽序列(参见Seq.ID No.5-9，Seq.ID No.21)，它们被命名为lysC-66、lysC-67、lysC-82、lysC-83、lysC-88和“N-端”。肠膜明串珠菌NRRL B1355的基因组DNA文库的制备肠膜明串珠菌NRRL-B1355(购自ATCC)在另外含有2％(w/v)葡萄糖和50mM磷酸钠缓冲液pH7.0的100ml YT培养基(Sambrook等人，同上)中28℃培养36小时。离心收集细胞后，根据Ausubel等人(《现代分子生物学方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，第1卷，Greene and John Wiley & Sons(1994)，USA)分离基因组DNA。
100μg肠膜明串珠菌NRRL-B1355基因组DNA用0.001单位限制酶Sau3A部分消化30分钟，随后用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提并用乙醇沉淀。在厂商指定条件下(Stratagene，pBK噬菌粒载体使用说明书及T4DNA连接酶连接试剂盒)用T4 DNA连接酶将从肠膜明串珠菌NRRL-B1355获得的2.5μg部分消化的DNA与1μg BamHI-酶切并去磷酸化的载体pBKCMVBamHI(Stratagene)连接。2μl连接混合液按照使用说明书用Gigapack III Gold(Stratagene)包装，并在测定噬菌体含量后贮存。用于分离交替蔗糖酶基因的探针的制备从胰蛋白酶消化纯化的交替蔗糖酶蛋白质(见上)后获得的肽序列lysC-66(Seq.ID No.5)、lysC-67(Seq.ID No.6)、lysC-82(Seq.ID No.7)、lysC-83(Seq.ID No.8)和lysC-88(Seq.ID No.9)中，选择经历反向翻译后的肽lysC-82和lysC-83用于合成简并寡核苷酸(Seq.ID No.10，Seq.ID No.11)。该寡核苷酸用作对NRRL-B1355基因组DNA进行PCR反应的引物。表示为N的寡核苷酸内的所有位点在引物合成中均替换为肌苷。
PCR反应条件用Taq聚合酶(GibcoBRL公司)缓冲液制备反应混合液。
反应混合液Taq聚合酶(Gibco)DNA 100 ng(基因组NRRL-B1355)DNTPs 2.5 mM每种核苷酸引物 10 μl溶液含0.2μMol10倍缓冲液5μl氯化镁2mM聚合酶1单位水 加至 50μl步骤1 95℃ 3’步骤2 95℃ 1’步骤3 58℃ 2’步骤4 72℃ 2’步骤5 72℃ 10’步骤2-4重复40次。
将该PCR反应产生的837bp片段(Seq.ID No.12)—其末端用T4DNA聚合酶制成平端—克隆到Smal-酶切的pBlueSkript载体(Stratagene)中。产生的质粒命名为pAlsu-PCR-lysc82/83。插入片段测序及计算机辅助翻译为相应的蛋白质序列后，用Swiss Prot数据库进行数据库比较。比较显示与已知的糖基转移酶有同源性(P49331，P11001，P68987，P13470，P27470，P29336)。
用细菌株和厂商指明的营养液(Stratagene)将肠膜明串珠菌NRRL-B1355基因组DNA文库的约5,000个噬菌体涂板，37℃温育12小时后转移到硝酸纤维素膜上。随后通过将硝酸纤维素膜浸入1.5m氯化钠、0.5M苛性钠溶液中2分钟而变性噬菌体，并通过浸入1.5M氯化钠、0.5MTris-HCl，pH8.0中5分钟中和滤膜。用0.2M Tris-HCl、2xSSC漂洗滤膜后，噬菌体DNA通过UV交联结合于膜上(Stratagene公司的Stratalinker，120,000μJ 30秒)。滤膜在预杂交液中(5xSSC，0.5％ BSA，5xDenhardt，1％SDS，40mM磷酸钠缓冲液，pH7.2，100mg/l鲱精DNA，25％甲酰胺)42℃温育6小时。30ng由质粒pAlsu-PCR-lysc82/83分离的插入片段用多引物试剂盒(Boehringer Mannheim)用α-32P dCTP(ICN Biomedicals)放射性标记。该放射性探针加入预杂交混合液中，滤膜在该预杂交混合液中42℃过夜。移除杂交混合液后，用洗涤溶液(0.1xSSC，0.5％SDS)在55℃下洗滤膜3次，15分钟。然后将X光片(Kodak)置于滤膜上18小时。鉴定、分离产生杂交信号的噬菌体集落，重悬浮于SM培养基中，然后再次分散涂板使其能作为单个噬斑识别。将这些噬菌体转移到硝酸纤维素膜并在上述条件下进一步处理并杂交后，利用放射性基因探针获得杂交的噬菌体作为单个分离株。按照使用说明书(Stratagene)体外切割分离的噬菌体后，克隆AS-19B1和AS-19B2能作为质粒分离。对这两个克隆(Agowa)(Seq.ID No.13，Seq..ID No.14)完全测序后，两序列均显示1008bp的重叠。Seq.ID No.13与Seq.No.14的连接及随后所有可能的阅读框的计算机辅助翻译使得能鉴定从起始密码子ATG(对应于Seq.ID No.1的碱基678-680)开始的连续阅读框。由于在该阅读框中未发现终止密码子，故分离其他克隆以获得交替蔗糖酶的完整编码序列。
因此，如上所述，利用用多引物试剂盒(Boehringer Mannheim)放射性标记的克隆AS-19B2片段再次检测肠膜明串珠菌NRRL-B1355基因组DNA文库的约5,000个噬菌体的杂交。杂交探针用来源于AS-19B2的HindIII(AS-19B2插入片段中的限制位点)/SalI(在多接头中酶切pBKCMV噬粒载体)-片段制备。该片段含有编码上述阅读框的序列3’端的372个碱基。噬菌体文库的筛选、挑选和噬菌体对质粒的转化在上述条件下进行。对这样分离的克隆AS-28B(见Seq.ID No.15)和AS-29Ba(Seq.ID No.16)进行完全序列分析后，能鉴定克隆AS-19B2(Seq.ID No.14)与AS-28B之间960个相同碱基(对应于Seq.ID No.1的碱基4863-5823)的重叠和克隆AS-19B2与AS-29Ba(Seq.ID No.16)之间的567个相同碱基(对应于Seq.ID No.1的碱基5256-5823)的重叠。克隆AS-28B和AS-29Ba有1523个相同的碱基(对应于Seq.ID No.1的碱基5256-6779)。计算机辅助连接克隆AS-19B1、AS-19-B2和AS-28B后，出现从起始密码子ATG(完整序列中的碱基678-680)开始的连续阅读框。该阅读框也不含终止密码子。待连接克隆AS-19B1、AS-19B2、AS-28B和AS-29Ba后，能鉴定从密码子“ATG”(对应于Seq.ID No.1的碱基678-680)开始、终止于“TAA”(对应于Seq.ID No.1的破基6849-6851)的阅读框，其编码2057个氨基酸。除了编码区之外，完整分离和鉴定的组成克隆的DNA序列(Seq.ID Nos.13-16)含有5’区中的677个碱基和3’区中的2469个碱基，其代表不编码交替蔗糖酶的序列(见
图1)。实施例2质粒pAlsu-pSK的构建，用于转化大肠杆菌和检测蛋白质提取物的酶活性质粒AS-19B1、AS-19B2、AS-28B和AS-29Ba以下列方法连接(见实施例1)将克隆AS-19B1的Notl-(载体pBK CMV多接头中的限制位点，Novagen公司)/Clal-片段插入载体pBluescript SK(Stratagene公司)的相同限制位点中(＝前一克隆步骤)。向由第一个克隆步骤所获得的克隆中连续插入来自AS-19B2的Clal/Xhol片段、来自AS-28B的Xhol/Mlul片段和AS-28B的Mlul/BsaBl(克隆到载体的平端Apal限制位点中的BsaBl-酶切片段)片段，产生质粒pAlsu-pSK(见图2)。该质粒含有来源于肠膜明串珠菌NRRL-B1355的交替蔗糖酶的完整编码序列及5’区中的677bp非编码序列(启动区)和3’区中的539bp(Seq.ID No.17)。
然后用质粒pAlsu-pSK转化大肠杆菌(DH5α，Fermentas公司)。该细菌在50ml“Terrific培养液”(其组成如Sambrook等人，《分子克隆实验室指南》，第2版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY所述(补充了0.5％葡萄糖))或发酵培养基中27℃培养两天，该发酵培养基具有下列组成KH2PO41.5g/l，(NH4)2SO45.0g/l，NaCl 0.5g/l，柠檬酸钠1.0g/l，Fe2＋SO4x7H2O，0.075g/l，酵母提取物0.5g/l，胰蛋白胨1.0g/l，葡萄糖15.0g/l，MgSO4x7，H2O 0.3g/l，CaCl2x2H2O 0.014g/l，矿物盐10ml/l，H3BO32.5g/l，CoCl2x6H2O 0.7g/l，CuSO4x5H2O 0.25g/l，MnCl2x4H2O，1.6g/l，ZnSO4x7H2O 0.3g/l，Na2MoO4x2H2O 0.15g/l，维生素B1(硫胺素)0.005g/l。
所有培养物均含有100mg/l氨苄青霉素。然后离心收集细胞，重悬浮于2ml 50mM磷酸钠缓冲液pH7.2中，用弗氏压碎器破碎。随后，再次离心去除破碎细胞的固体颗粒，过滤除菌(Sterivex GV 0.2μm，微孔)后用上清液(下文称为(蛋白质)提取物)做进一步分析。交替糖利用蛋白质提取物的体外制备为体外制备交替糖，在2ml 100mM柠檬酸钠缓冲液pH6.5和20％(w/v)蔗糖中检测200μl获得的每种提取物在100μl 10mM麦芽糖存在与否时的活性。反应混合液在37℃下温育24小时。随后在无麦芽糖时用等体积乙醇沉淀后，未发现沉淀性聚合物。在含有麦芽糖的批次中，HPLC层析(Dionex PA-100柱，工作缓冲液150mM NaOH，洗脱缓冲液150mM NaOH＋3M乙酸钠缓冲液梯度)显示寡聚体的形成(见图3)。活性凝胶将每种20ml蛋白质提取物加于6％ SDS-PAA凝胶中，以每个凝胶20mA的电流强度分离。(加于凝胶之前，提取物不在95℃下温育)。随后，按照Miller和Robyt(分析生物化学156(1986)，357-363)的方法检测提取物的蔗糖酶活性。
对照(葡聚糖蔗糖酶NRRL-B-512F，其制备参见实施例3)显示聚合活性。上述含有质粒pAlsu-pSK的大肠杆菌细胞的蛋白质提取物不显示任何聚合物形成活性。实施例3来源于肠膜明串珠菌NRRL-B512F的葡聚糖蔗糖酶的克隆及表达基因组DNA的分离肠膜明串珠菌NRRL-B512F(从ATCC获得)在另外含有1％蔗糖和50mM磷酸钠缓冲液pH7.0的YT培养基(Sambrook等人，《分子克隆实验室指南》，第2版(1989)，Cold Spring Harbor Press，New York)中28℃培养48小时。离心收集细胞后，根据Ausubel等人(《现代分子生物学方法》，第1卷，Greene and John Wiley & Sons(1994)，USA)分离基因组DNA。葡聚糖蔗糖酶基因的PCR扩增和在pET24a中的克隆为了在大肠杆菌中重组表达葡聚糖蔗糖酶，在PCR扩增之后将编码葡聚糖蔗糖酶的基因克隆到表达载体pET24a(Novagen)中。为此，在编码葡聚糖蔗糖酶的序列的5’端引入一个Eagl限制位点，在3’端引入一个Xhol限制位点，同时使用来源于WO 89/12386的序列的PCR引物(5’b512-15’-ACTgCggCCgCATgCCATTTACAgAAAAAg-3’；Seq.IDNo.3和3’b5125’-ACTgCTCgAgTTATgCTgACACAgCATTTC-3’；Seq.ID No.4)。随后进行向pET24a多接头的相应限制位点中的克隆。得到的质粒被命名为UL5-20。
PCR反应条件使用Gibco BRL公司的缓冲液和聚合酶。
DNA 100 ng(基因组NRRL-B512F)10倍缓冲液 5 μlMgCl2 4 mM5’引物50 ng3’引物50 ngdNTP1 mM每种核苷酸Pfu聚合酶 0.5 单位水加至50μl步骤195℃ 4分钟步骤295℃ 1分钟步骤355℃ 1分钟步骤472℃ 5分钟步骤572℃ 10分钟步骤2-4重复40次。重组葡聚糖蔗糖酶的制备含有质粒UL5-20的BL21(DE3)大肠杆菌细胞在YT培养基(见上)中37℃培养，直到OD600＝0.8。随后用0.2mM IPTG诱导细胞，并在18℃下再培养24小时。离心收集细胞并重悬浮于磷酸钠缓冲液，pH5.2中后，用弗氏压碎器破碎细胞。所获得的溶液经离心不含不可溶成分，获得含葡聚糖蔗糖酶、下文称为提取物的上清液。实施例4交替蔗糖酶编码区的PCR扩增及在pET24a中的克隆用肠膜明串珠菌NRRL-B1355株的基因组DNA作为模板，经PCR反应(见以下的反应条件)扩增交替蔗糖酶的编码区。利用引物A1-4(Seq.ID No.18)在5’端引入一个Nhel限制位点，利用引物A1-5(Seq.ID No.19)在3’端引入一个Sall限制位点。分离出约6200bp的片段A1-4 5’-GGG CCC GCT AGC ATG AAA CAA CAA GAAACA GTA1-5 5’-CCC GGG GTC GAC CTT TGT CGA ATC CTT CCCPCR反应条件(Gibco BRL公司的试剂盒)DNA 1μl10x缓冲液 5μl每种dNTP 10mM 2μl50mM MgSO42μl引物每种 1μl铂DNA聚合酶 0.2μl蒸馏水37.8μl步骤1 95℃，2分钟步骤2 95℃，20秒步骤3 47℃，20秒步骤4 68℃，7分钟(每一循环延长3秒)步骤5 68℃，15分钟在进行步骤5之前步骤2-4重复35次。
按照标准方法纯化获得的PCR片段，用限制性内切核酸酶NheI和SalI处理，连接于同样用这些酶酶切的载体pET24a(来自Novagen公司)，连接产物转化大肠杆菌。制备质粒并限制酶切消化后，筛选出3个阳性克隆。它们分别被命名为pAlsu-pET24a-3、pAlsu-pET24a-7和pAlsu-pET24a-21(见图4)。均含有Seq.ID No.20所示的序列作为插入部分。实施例5重组交替蔗糖酶在摇瓶培养及发酵罐中在大肠杆菌中的表达摇瓶培养质粒pAlsu-pET24a-3、pAlsu-pET24a-7、pAlsu-pET24a-21和pET24a转化Novagen公司的大肠杆菌BL21(DE3)，在3ml YT培养基(Sambrook等人，《分子克隆实验室指南》，第2版(1989)，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)中37℃初始培养3小时后，以2份重复在摇瓶中在含有0.2％葡萄糖代替右旋糖作为碳源的50ml Davis基本培养基(DIFCO手册，《微生物用脱水培养基和试剂》，第10版，Detroit Michigan，USA(1984))中37℃培养，直到OD600达到约0.8。离心并重悬浮后，两份重复培养液之一在含有1％乳糖作为碳源并含诱导剂的Davis基本培养基(DMA)中27℃再培养16小时。离心收集各培养液的细胞，重悬浮于50mM乙酸钠缓冲液pH5.3中，如实施例2所述制备蛋白质提取物。发酵罐在下列条件下在2升发酵罐(Biostad B；B.Braun，Melsungen)中培养克隆pAlsu-pET24a-21转化的大肠杆菌BL21(DE3)培养基发酵培养基KH2PO41.5g/l，(NH4)2SO45.0g/l，NaCl 0.5g/l，柠檬酸钠1.0g/l，Fe2＋SO4x7H2O 0.075g/l，酵母提取物0.5g/l，胰蛋白胨1.0g/l，葡萄糖15.0g/l，MgSO4x7H2O 0.3g/l，CaCl2x2H2O 0.014g/l，矿物盐10ml/l，H3BO32.5g/l，CoCl2x6H2O 0.7g/l，CuSO4x5H2O 0.25g/l，MnCl2x4H2O 1.6g/l，ZnSO4x7H2O 0.3g/l，Na2MoO4x2H2O 0.15g/l，维生素B1(硫胺素)0.005g/l。
碳源培养基中含有葡萄糖(1.5％(w/v))，加入70％(w/v)葡萄糖溶液。
用氨和磷酸自动控制pH为pH7.0+/-0.1。通过用搅拌器控制调节培养基的pO2为20％浓度。
条件用50ml预培养物接种1.5升发酵培养基。
细胞首先在37℃下培养直到已有的葡萄糖耗光。然后在相同温度下以9g葡萄糖xl-1xh-1的进料速度培养，直到OD600＝40。此时，将培养液的温度降低至20℃，添加葡萄糖的量降至2gxl-2xh-1。在培养温度为20℃时，用0.2mM IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Sigma))诱导培养。在20℃下再培养18小时后，离心收集细胞，重悬浮于50mM磷酸钠缓冲液pH5.3中，并如实施例2所述制备提取物。实施例6重组交替蔗糖酶活性、高碘酸氧化和根据Schiff染色的SDSPAGE分析由大肠杆菌摇瓶培养物(BL21菌株(DE3))制备分别含有质粒pAlsu-pET24a-3、pAlsu-pET24a-7、pAlsu-pET24a-21和pET24a(对照)的蛋白质提取物。两种不同提取物均由用不同提取物转化的细胞制备，这些提取物之一在IPTG诱导前制备，另一种在培养结束时在IPTG诱导后制备。这些摇瓶培养物的提取物(参见实施例5)的活性检测包括，SDSPAGE分离蛋白质，随后用50mM乙酸钠缓冲液pH5.3洗涤除去SDS，在50mM乙酸钠pH5.3、5％(w/v)蔗糖中37℃温育凝胶16小时，随后高碘酸氧化形成的聚合物，并用酸性希夫试剂染色(Miller和Robyt，分析生物化学156，(1986)，357-363)。
图5显示，含有克隆载体pET24a的提取物(在IPTG诱导之前及之后的提取物制剂)均未发现有蔗糖酶活性。对于分别用质粒pAlsu-pET24a-3、pAlsu-pET24a-7和pAlsu-pET24a-21转化的菌株，所有蛋白质提取物在诱导期结束时均显示蔗糖酶活性(浓缩于一条带中)。
在IPTG诱导前，未发现这些活性带。
当凝胶中形成的聚合物能按照上述方法用酸性希夫试剂染色时，可以假定其不是由纯α-1，3-连接的单位组成的，因为这不能引起任何染色。
当从除交替蔗糖酶之外至少表达一种葡聚糖蔗糖酶的肠膜明串珠菌NRRL-B1355株中分别分离载体pAlsu-pET24a-3、pAlsu-pET24a-7和pAlsu-pET24a-21中所含的基因时，不能用该染色法准确确定质粒中所含的核酸序列是否编码一种交替蔗糖酶。葡聚糖和交替糖都能用该方法检测，因为这两种聚合物均含有α-1，6键。实施例7热处理后重组制备的交替蔗糖酶的酶活性及交替蔗糖酶特异性的检测为了证明聚合活性，使用摇瓶培养的提取物(参见实施例5)。100μl提取物加入2ml反应缓冲液(50mM乙酸钠pH5.3、20％蔗糖)中，并在37℃下温育24小时。为了比较，使用95℃处理10分钟灭活的提取物和含有载体pET24a的大肠杆菌BL21(DE3)的提取物。聚合物形成只在未灭活的批次中发现，而95℃处理10分钟的批次和含有pET24a的BL21(DE3)提取物的批次不显示任何聚合物形成。向所有批次中加入等体积的无水乙醇后，只有未灭活的批次中沉淀出聚合物。这一发现清楚地表明了交替蔗糖酶的活性，因为NRRL B-1355中存在的葡聚糖蔗糖酶经45℃处理30分钟灭活，而交替蔗糖酶在这些条件下仍有活性(Lopez-Munguia等人，酶与微生物技术15(1993)，77-85)。分别用偶联酶学检测释放的葡萄糖和果糖及24小时后反应混合液中仍含的蔗糖的酶测定显示，果糖只存在于未灭活的提取物中。
为进行酶学检测，以不同稀释度向含有5％蔗糖和50mM乙酸，pH5.5的1ml批次中加入纯化的蛋白质或粗蛋白质提取物，并在37℃下温育。待5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟和30分钟后，从这些批次中每个取出10μl，通过立即加热到95℃终止交替蔗糖酶的酶活性。随后，在偶联光度测定中分别测定交替蔗糖酶释放的果糖和葡萄糖部分和耗用的蔗糖部分。为此，1μl至10μl灭活样品置于1ml 50mM咪唑缓冲液，pH6.9、2mM MgCl2、1mM ATP、0.4mM NAD和0.5U/ml己糖激酶中。顺序加入约1单位葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(来自于肠膜明串珠菌)，约1单位磷酸葡萄糖异构酶和约5单位蔗糖酶后，测定340nm处光吸收的改变。随后根据Lambert-Beer法则分别计算释放的果糖和葡萄糖和耗用的蔗糖的量。
在对照批次中(95℃处理灭活提取物和含有pET24a的大肠杆菌提取物)，24小时后在反应批次中未发现有明显的果糖释放及蔗糖减少。
这些结果证实，质粒pAlsu-pET24a-3、pAlsu-pET24a-7和pAlsu-pET24a-21分别编码的蔗糖酶的特异性是葡糖基转移酶的特异性。排除了果糖基转移酶的特异性—对于明串珠菌属的某些菌株已描述了其存在，因为否则应发现葡萄糖。实施例8利用在大肠杆菌中制备的交替蔗糖酶产生交替糖将发酵含有质粒pAlsu-pET24a-3(见实施例4)的大肠杆菌BL21(DE3)获得的100ml提取液加入900ml反应缓冲液(50mM乙酸钠pH5.3、20％蔗糖)中，37℃温育24小时。向反应混合液中加入等量的无水乙醇使形成的交替糖沉淀。用50％乙醇洗涤沉淀物两次后冷冻干燥。基于反应中使用的蔗糖的量，干燥聚合物的产率为60％。实施例9葡聚糖酶消化后交替糖和葡聚糖的HPLC分析实施例7中制备的100mg聚合物和100mg葡聚糖T10(Pharmacia)均溶解于1ml水中。将这些溶液每种40μl加入700μl反应缓冲液(50mM磷酸钾pH5.7、8单位葡聚糖酶，ICN Biomedicals Inc.No.190097)中，37℃温育16小时。未用葡聚糖酶处理的50μl聚合物溶液(见图6)和50μl用葡聚糖酶处理的聚合物溶液(图7)经HPLC(Dionex，PA-100柱，NaOH/NaOH-NaAc梯度)分析。
对于葡聚糖T10，能清楚地看到聚合物切割为低分子量的不同分子。完整的高分子量葡聚糖被葡聚糖酶转化为较小的单位(主要是异麦芽糖)。相反，对于交替糖，在葡聚糖酶温育后只有少量短链寡糖。大多数交替糖不可被葡聚糖酶消化。这一发现提示，通过重组交替蔗糖酶制备的产物不是葡聚糖，而是已知几乎不能被葡聚糖酶酶促消化的交替糖(Lopez-Mungia等人，酶与微生物技术15，(1993)，77-85)。实施例10无葡聚糖酶时交替糖的体外制备100μl摇瓶培养提取物(参见实施例5)加入2ml反应缓冲液中(50mM乙酸钠，pH5.3、20％蔗糖)。另外向另一批中加入50单位葡聚糖酶(Biomedicals Inc.No.190097)。相应的含有来源于肠膜明串珠菌NRRL-B512F的葡聚糖蔗糖酶代替酶提取物的两批作为对照这两批之一还混合有葡聚糖酶。
乙醇沉淀后，含葡聚糖蔗糖酶和葡聚糖酶的反应批次不显示任何聚合物形成。其他所有批次均发现有聚合物形成。实施例11寡聚交替糖的体外制备和HPLC分析寡聚交替糖如实施例2所述在麦芽糖存在下用蛋白质提取物制备，随后经HPLC-层析法检测(见图8)(参见实施例2)。为了比较，在制备寡聚交替糖后将该批次的一部分与50单位葡聚糖酶(Biomedicals Inc.190097)混合，随后也进行通过HPLC层析的分离(见图9)。两种层析谱的比较显示，不仅属于寡聚交替糖(α和β-异头物)的两个峰(保留时间为15.87-16.61分钟)的高度，而且其他所有峰的高度均未改变，其首要标志不用葡聚糖酶即已可见。这一发现提示，重组制备的交替蔗糖酶使得能制备寡聚交替糖而同时不产生寡葡聚糖。寡葡聚糖易于被葡聚糖酶消化，如果存在寡葡聚糖，则显现HPLC层析谱中峰高度降低。实施例12交替糖的甲基化分析为了进一步分析在体外产生的交替糖，进行甲基化分析。
全甲基化全甲基化如Ciucanu和Kerek(碳水化合物研究131(1984)，209-218)所述进行，使用溶于DMSO的NaOH/MeI，或使用根据Hakomori(生物化学杂志55(1964 FEB)，205-208)的改进方法，该方法依赖于在室温下使用新鲜制备的溶于DMSO的Li-Dimsyl/MeI(Dimsyl＝甲磺酰负碳离子)。
所有反应都在氮环境下进行。利用二氯甲烷抽提过量的碘甲烷，并在最后洗去盐分离全甲基化产物。
降解为部分甲基化的乙酸山梨糖醇(甲基化分析)全甲基化的葡聚糖用2N三氟乙酸在120℃下水解1-3小时。冷却后，用氮除去酸。然后将产生的葡聚糖与少量甲苯共同蒸馏，之后用溶于1N氨的NaBD4还原，最后用嘧啶/乙酸酐(acetanhydrid)乙酰化(3h，90℃)。用二氯甲烷抽提产物，并用NaHCO3洗涤。通过气相层析分析有机相中的产物。
乙酰化产物的分析乙酰化产物通过气相层析分析，这用Carlo-Erba公司生产的装备有柱上注射器、25m CPSol8CB和FID-检测仪的GC 6000 Vega型层析仪进行。用氢作为载体气体(80kPa)。
峰的鉴定和积分如Sweet等人(碳水化合物研究40(1975)，217)所述进行。
结果下列主要成分经气相层析鉴定。
此外，也发现了少量(相对含量为0.2-0.4mol％)的下列成分1，4，5-和1，3，4，5-山梨糖醇和另一种四乙酰基成分(1，5，x，y)。假定这些成分是由于不完全甲基化产生的。
对于上述成分，在通过改变水解长度(按小时数以粗体表示)而进行的不同实验中发现有下列含量(MA＝甲基化分析1；MA-b＝甲基化分析2)数值，单位为mol％乙酰化位置 MA(1h) MA(2h)MA(3h) MA-b(2h)1，5 10，49 10，569，17 12，711，3，5 31，69 34，7032，95 23，121，4，5 0，70 0，30 0，36 0，331，5，6 47，02 44，1747，23 54，621，3，4，50，27 0，22 0，25 0，311，5，x，y0，19 0，32 0，36 0，241，3，5，69，64 9，73 9，68 8，67实施例13用于植物的表达盒的构建交替蔗糖酶的液泡和质体表达利用质粒Alsu-pET24a作为模板，使用PCR引物Al-5′-1.2和Al-3′-2.2(参见SEQ ID NO 53和54)，我们扩增了来源于肠膜明串珠菌的交替蔗糖酶的编码区，然后用限制酶SalI和PstI酶切。之后将得到的片段克隆到SalI和SdaI消化的质粒a)pBinAR-pat-Hyg和b)pBinAR-fnr-Hyg中。
得到的质粒称为a)pat-Alsu-Hyg(见
图11)和b)fnr-Alsu-Hyg(见
图12)。
注意通过选择PCR引物从cds中除去细菌分泌信号肽。
PCR条件缓冲液和聚合酶来自Boehringer Mannheim(Pwo聚合酶No.1644947)DNA 0，5ng10x缓冲液＋MgSO45μldNTPs(每种10 mM)2μl引物Sp-AS-5′ 100nM引物Sp-AS-3′ 100nMPwo聚合酶 1，0单位蒸馏水 加至50μl反应条件步骤1 95℃230分钟步骤2 95℃030分钟步骤3 47℃030分钟步骤4 68℃700分钟(每一循环加3秒)步骤5 68℃1500分钟步骤2-4以循环方式重复35次。实施例14对于转基因植物中交替蔗糖酶表达的Northern印迹分析由分别含质粒pat-Alsu-Hyg和fnr-Alsu-Hyg的农杆菌转化的马铃薯植物的叶或块茎在MM 200型粉碎机(Retsch GmbH & Co.KG，42781Haan，德国)中粉碎，30Hz 50秒。根据Logemann等人(分析生物化学163(1987)，16-20)提取RNA。将每一样品50μg RNA加样于含甲醛的1％琼脂糖凝胶上。电泳后，用毛细管转移法(Sambrook等人，《分子克隆实验室指南》，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，USA(1989))将RNA转移到尼龙膜上(Hybond N，Amersham，UK)。核酸在膜上的固定通过UV交联完成(Stratalinker by Stratagene)。
膜在杂交缓冲液(25％(v/v)甲酰胺、250mM磷酸钠，pH7.2、250mM氯化钠、1mM EDTA 7％(w/v)SDS、25％(w/v)聚乙二醇6000、0，25mg/ml剪切的鲑精DNA)中42℃预杂交6小时。之后在另外含放射性标记探针的杂交缓冲液中42℃杂交过夜。放射性探针用随机引物DNA标记试剂盒(Boehringer Mannheim，1004760)和来源于质粒pAlsu-pSK的大约4kb KpnI/XhoI片段根据使用说明书制备。用3xSSC在50℃下洗膜一次20分钟(Sambrook等人，《分子克隆实验室指南》，第2版；Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，USA(1989))，随后用0.5xSSC洗涤一次20分钟，之后将膜暴露于X光片过夜。
权利要求
1.一种编码具有交替蔗糖酶生物活性的蛋白质的核酸分子，其选自(a)编码至少成熟形式的蛋白质的核酸分子，所述蛋白质包含Seq.IDNo.2所示的氨基酸序列或质粒DSM 12666中所含cDNA编码的氨基酸序列；(b)包含Seq.ID No.1所示核苷酸序列或质粒DSM 12666中所含cDNA的核苷酸序列或相应核糖核苷酸序列的核酸分子；(c)编码一种蛋白质的核酸分子，该蛋白质的氨基酸序列与Seq.ID No2所示的氨基酸序列有至少40％的同源性；(d)核酸分子，其一条链可与如(a)或(b)所述的任一核酸分子杂交；(e)包含一种核苷酸序列的核酸分子，该核苷酸序列编码由(a)、(b)、(c)或(d)所述的任一种核酸分子编码的蛋白质之生物活性片段；和(f)核酸分子，其核苷酸序列由于遗传密码的简并而不同于如(a)、(b)、(c)、(d)或(e)所述的核酸分子的序列。
2.一种可与权利要求1的核酸分子特异杂交的寡核苷酸或多核苷酸。
3.一种含有根据权利要求1的核酸分子的载体。
4.根据权利要求3的载体，其中核酸分子以有义方向与确保可翻译RNA在原核或真核细胞中转录和合成的调节元件连接。
5.以保藏号DSM 12666保藏的质粒pAlsu-pSK。
6.用权利要求1的核酸分子或权利要求3或4的载体转化的宿主细胞，或这种细胞的后代。
7.根据权利要求6的宿主细胞，它是一种微生物细胞。
8.根据权利要求6的宿主细胞，它是大肠杆菌细胞。
9.一种制备具有交替蔗糖酶的生物活性的蛋白质或其生物活性片段的方法，其中权利要求6-8任一项的宿主细胞在允许蛋白质合成的条件下培养，从培养的细胞和/或培养基中分离蛋白质。
10.由权利要求1的核酸分子编码的或按照权利要求9的方法制备的蛋白质或其生物活性片段。
11.一种用权利要求1的核酸分子或权利要求3或4的载体转化的转基因植物细胞，或这种细胞的后代，其中编码具有交替蔗糖酶生物活性的蛋白质的该核酸分子受允许可翻译mRNA在植物细胞中转录的调节元件控制。
12.一种含有权利要求11的植物细胞的植物。
13.根据权利要求12的植物，它是一种有用植物。
14.根据权利要求12或13的植物，它是一种贮糖或贮淀粉植物。
15.根据权利要求12-14任一项的植物的繁殖材料，其含有权利要求11的植物细胞。
16.一种制备交替糖的方法，其包括从根据权利要求12-14任一项的植物中提取并分离交替糖的步骤。
17.可从根据权利要求12-14任一项的植物中，从根据权利要求15的繁殖材料中，或通过根据权利要求16的方法获得的交替糖。
18.一种制备交替糖和/或果糖的方法，其中(a)权利要求6-8任一项的宿主细胞向含蔗糖培养基中分泌交替蔗糖酶；和(b)从该培养基中分离交替糖和/或果糖。
19.根据权利要求18的方法，其中宿主细胞是固定化的。
20.一种制备交替糖和/或果糖的方法，其中(a)使一种含蔗糖溶液与权利要求10的蛋白质在可使蔗糖转化为交替糖和/或果糖的条件下接触；和(b)从该溶液中分离交替糖和/或果糖。
21.根据权利要求20的方法，其中蛋白质固定于一种载体材料上。
22.一种制备交替糖和/或果糖的方法，其中(a)使含蔗糖溶液与权利要求10的蛋白质和接纳体分子在可使蔗糖转化为交替糖和/或果糖的条件下接触；和(b)从该溶液中分离交替糖和/或果糖。
23.根据权利要求22的方法，其中接纳体分子选自麦芽糖、异麦芽糖、异麦芽三糖和甲基-α-D-葡聚糖。
24.根据权利要求22或23的方法，其中蛋白质是固定化的。
25.含有如权利要求17所述或按照权利要求16和18-24任一项制备的交替糖的化妆品或食品。
26.一种制备化妆品或食品的方法，其包括根据权利要求16和18-24任一项的步骤，所得交替糖制剂呈适宜用作化妆品或食品的形式。
全文摘要
提供了编码交替蔗糖酶的核酸分子。此外也提供了载体、宿主细胞和用此处所述核酸分子转化的植物细胞和含有它们的植物。此外也描述了制备由于插入编码交替蔗糖酶的核酸分子而可合成碳水化合物交替糖的转基因植物的方法。此外还提供了制备交替糖和由其衍生的产品的方法。
文档编号C12P19/04GK1341148SQ00802662
公开日2002年3月20日 申请日期2000年2月7日 优先权日1999年2月8日
发明者J·科斯曼, T·韦尔什, M·奎恩兹, K·克努特 申请人:普兰泰克生物技术研究与开发有限公司, 马普科技促进协会