专利名称：：人类成年星形胶质细胞,它们的制备及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及的研究领域为神经生物学。更确切地讲，本发明涉及纯化的人类成年星形胶质细胞，它们的制备方法和应用，尤其是在神经退行性疾病或中枢神经系统损伤的治疗中的应用。
背景技术：
：星形胶质细胞细胞移植和转基因技术的联合为神经退行性疾病和损伤性损伤提供了一种治疗途径。几种细胞类型，如先祖细胞、神经细胞、胶质细胞、成纤维细胞及成肌细胞已被研究用于向中枢神经系统(CNS)导入基因的载体(Wolff等，1989；Horellou等，1990a，b；Fisher等，1991，1993；Gage等，1995；Sabate等，1995；Fisher，1997；Martinez-Serrano和Bjorklund，1997)。目前人们的注意力集中在基因工程改造的星形胶质细胞的治疗活性上(Cunningham等，1991，1994；LaGamma等，1993；Castillo等，1994；Pundt等，1995；Lundberg等，1996；Lin等，1997)。星形胶质细胞在脑损伤修复方面尤为重要，因为星形胶质细胞是正常中枢神经系统的组成成分，具有高效的分泌机能，且可通过释放促进神经元生存、分化和再生的营养因子来为神经元提供支持。此外，星形胶质细胞可培养扩大和经遗传改造表达外源性转基因。近来，人们培养了由合法堕胎得来的人类胎儿的星形胶质细胞，且成功地转导了可驱动活性神经生长因子(NGF)表达的反转录病毒(Lin等，1997)。人类成年星形胶质细胞更适合于人脑的损伤修复，因为它们允许自体同源的离体基因导入，从而避免了免疫学的排斥和免疫抑制剂的副作用。在目前试图培养人类成年星形胶质细胞的研究中，有人报导了小胶质细胞的污染问题(Yong等，1991，1992)。基因治疗离体基因转移涉及治疗细胞向病人的输送(Wolff等，1989；Horellou等，1990a，b；Fisher等，1991，1993，Gage等，1995；Sabate等，1995；Fisher等，1997；Martinez-Serrano和Bjorklund，1997；Taylor，1997)。无限增殖化细胞系在基因治疗方面的应用价值是有限的，因为它们仍保留肿瘤发生的特性。与此相反，原代培养细胞更为合适。对于离体基因转移及后继的移植，最好的细胞类型就是星形胶质细胞(LaGamma等，1993；Castillo等，1994；Cunningham等，1994；Ridoux等，1994；Pundt等，1995；Lundberg等，1996；Lin等，1997)，它作为主要的支撑细胞及高效分泌机器正常地存在于中枢神经系统。通过预先修饰来产生酶、神经递质或营养因子的移植性星形胶质细胞可在中枢神经系统中进行整合及发挥适当的功能(见参考文献中的Taylor，1997)。原代培养的鼠星形胶质细胞可通过基因工程改造产生神经生长因子和脑源性神经营养因子(BDNF)，且在植入脑后可生存下来(Cunningham等，1991，1994；Yoshimoto等，1995)。近来，对于人类星形胶质细胞的兴趣已经提高(Yong等，1991，1992；Aloisi等，1992；Perzelova和Mares，1993；Pundt等，1995；Lin等，1997)。Yong和他的同事们(1992)报道，高达80％的原代培养细胞是巨噬细胞/小胶质细胞。当去除大多数少突胶质细胞和小胶质细胞后，70％的细胞是星形胶质细胞(Yong等，1992)。存在于星形胶质细胞培养物中的小胶质细胞可在体外和体内引起不合需要的作用，因为它们不但增殖活跃，且又是免疫细胞群的主要组成成员。因此，需要一种可制备大量星形胶质细胞而不合有小胶质细胞污染的方法。正如下面要讨论的那样，本发明可满足这样的需求。本发明克服了星形胶质细胞制品不纯的弊端，且所提供的细胞制品适合于中枢神经系统损伤及神经退行性疾病的治疗，如帕金森氏、亨廷顿氏或阿尔茨海默氏病。这里引用的任何参考文献都不应解释为承认这一文献对于本发明是可获得的现有技术。发明概要本发明提供了纯化的星形胶质细胞和它们的制备方法。作为优选的实施方案，星形胶质细胞是人类，成年星形胶质细胞。因此，本发明提供制备基本上纯的星形胶质细胞群的方法，其包括a)将星形胶质细胞制备物导入到培养器皿中，b)在可使星形胶质细胞在培养器皿内贴壁的条件下，孵育从步骤a)获得的星形胶质细胞，和c)从步骤a)的开始算起，在大约第48小时时，去除在培养器皿内尚未贴壁的细胞。作为“基本上纯的”细胞群体至少75％为星形胶质细胞，优选至少85％为星形胶质细胞，更优选至少约95％为星形胶质细胞，最优选大于约98％的细胞为星形胶质细胞。对于一个给定的数值或范围，术语“大约”的意思是20％以内，优选为10％以内，更优选为5％以内。“培养器皿”可以是任何适合细胞贴壁和生长的支撑物，其包括，但不限于，培养皿或培养瓶。在优选的实施方案中，星形胶质细胞是人类星形胶质细胞，更为优选地，它们为人类成年星形胶质细胞。根据本发明制备的星形胶质细胞基本上没有小胶质细胞。也就是，用OX42免疫染色和从Griffoniasimplicifolia提取的B4同工凝集素标记的方法检测不到小胶质细胞的存在。在本发明方法的一个方面，一个外源核酸序列可被导入星形胶质细胞。可通过磷酸钙沉淀法、脂质体介导转染、阳离子脂质转染、或脂多胺(Lipopolyamine)介导的转染用病毒载体将该核酸序列导入星形胶质细胞内。优选地，核酸序列编码一神经活性物质。本发明还提供了基本上纯的星形胶质细胞群体。优选地，星形胶质细胞是人类星形胶质细胞。更优选地，它们是人类成年星形胶质细胞。根据本发明制备的星形胶质细胞群体基本上没有小胶质细胞。在本发明的一方面，此星形胶质细胞群体包含外源核酸序列。在一个优选的实施方案中，核酸序列编码神经活性(neuroactive)物质。该核酸序列可以是DNA或RNA。在一方面，该核酸序列是编码蛋白、多肽或肽的DNA。该蛋白、多肽或肽可以是生长因子，神经营养因子，或酶。或者，该核酸序列可以是编码反义RNA或核酶的DNA。作为一个优选的实施方案，该核酸序列被可操作地与调节区连接，该调节区包含可调节启动子、可诱导启动子、神经细胞特异性启动子或病毒启动子。本发明还提供了一种含有基本上纯的星形胶质细胞的移植物。本发明进一步提供了一种包含基本上纯的星形胶质细胞的组合物，这些基本上纯的星形胶质细胞包含编码神经活性物质的外源核酸。本发明所提到的这些和其他目标，在附图和下面的详细描述及实施例中得到了更加详细的解释。附图简要描述图1人类成年大脑皮层细胞的原代培养物。(A)，相差显微照片显示低放大倍数(x70)下的人类成年星形胶质细胞原代培养物。(B)，高放大倍数(x560)下处于分裂末期的扁平分裂细胞。图2人类成年星形胶质细胞原代培养物的免疫细胞化学特征。低放大倍数(x280)的显微照片显示所有细胞为GFAP-(A)和S100β-阳性的(B)。图3人类成年星形胶质细胞在体外的增殖。增殖率用从t0开始细胞数量增加的百分数来表示。在FCS内培养，人类成年星形胶质细胞可在体外增殖。值得注意的是，在20％FCS内培养，细胞的增殖要比在10％FCS内生长快1倍(A)。NGF和bFGF(50ng/ml)对于原代培养的人类成年星形胶质细胞没有任何促有丝分裂的效果(B)。另外值得注意的是，在培养液内加入HS，多数细胞都不能在培养皿内贴壁，且它们可随培养液被移走。图4腺病毒转导人类成年星形胶质细胞后的TH免疫细胞化学。(B)，低放大倍数(x70)下的显微照片显示50％-60％的细胞在感染一周后为TH-阳性(A，未感染细胞)。(C)，高放大倍数(x560)下显示被转导的星形胶质细胞含有hTH。图5在被转导的人类熟星形胶质细胞内的TH活性。TH的活性可在感染后的第一周内检测到，且在第14天增加到35650pmol[3H]H2O/mgprot./h。值得注意的是，感染14天后，TH活性在强力霉素存在下至少降低10倍。发明详述定义下面所定义的术语应用于本说明书的全部内容，并且对于理解本发明范围及实践应有很大的帮助。“多肽”是一种由共价连接的氨基酸残基组成的聚合化合物。氨基酸具有如下普遍结构根据R侧链的不同，氨基酸可被分为七组(1)脂肪族侧链，(2)侧链含有一个羟基基团(OH)，(3)侧链含有硫原子，(4)侧链含有一个酸性或氨基基团，(5)侧链含有一个碱性基团，(6)侧链含有一个芳香环，和(7)脯氨酸，一种亚氨基酸，其侧链被融合到氨基基团上。“蛋白质”是一种在活细胞内发挥结构或功能作用的多肽。本发明涉及的多肽和蛋白质可能被糖基化或非糖基化。一个多肽或蛋白质的“变体”是指由多肽或蛋白质衍生而来，且至少保留该多肽或蛋白质的一种生物特性的任何类似物、衍生物、或突变体。多肽或蛋白质的不同变体可能在自然界存在。这些变体可能是由于等位基因的变异，即以编码蛋白质的结构基因的核酸序列不同为其特征，或可能涉及不同剪接或翻译后修饰。一个熟练的技术人员可以制备具有单个或多个氨基酸的替代、缺失、加入或置换的变体。除其他的事物，这些变体可能包括(a)一个或多个氨基酸残基被保守的或非保守的氨基酸代替的变体，(b)一个或多个氨基酸加入到多肽或蛋白质内的变体，(c)一个或多个氨基酸含有一个取代基团的变体，和(d)多肽或蛋白质与另一个多肽，如血清白蛋白，融合到一起的变体。本领域普通技术人员知道用于获得这些变体的技术，其包括遗传的(抑制，缺失，突变等)，化学的，和酶的技术。如果这种等位基因变异、类似物、片段、衍生物、突变体和修饰，包括mRNA的不同剪接形式和不同翻译后修饰形式，得到的多肽衍生物保留该多肽的任何一种生物学特性，那它们都应该包括在本发明的范围内。“核酸”是一种由核苷酸亚单位共价连接组成的多聚化合物。核酸包括多聚核糖核酸(RNA)和多聚脱氧核糖核酸(DNA)，二者可以是单链或双链。DNA包括cDNA，基因组DNA，合成DNA，和半合成DNA。编码蛋白质的核苷酸序列称为有义序列。“外源核酸”是指导入一个在自然状态下不含有这种核酸序列的细胞内的遗传物质。“调节区”是指可调节第二条核酸序列表达的核酸序列。调节区可包含这样的序列，其在自然状态下负责一个特定的核酸表达(同源区)或可包含不同起源的序列(负责表达不同的蛋白质甚至合成蛋白质)。具体地，这个序列可以是真核的或病毒的基因序列，或是衍生序列，其可以以特异或非特异方式和以诱导或非诱导方式促进或抑制基因转录。调节区包括复制起点，RNA剪接位点，增强子，转录终止序列，指导多肽进入靶细胞分泌途径的信号序列，和启动子。“异源性”调节区是指在自然状态下与表达的核酸无关的调节区。异源性调节区包括来自不同种属的调节区，来自不同基因的调节区，杂合调节序列，和在自然界不存在而由本领域普通技术人员设计的调节区。“载体(vector)”是指任何可将目的核酸导入宿主细胞内的运载工具。“载体”这一术语包括将核酸导入离体、体外或体内细胞的病毒和非病毒运载工具。非病毒类载体包括质粒，脂质体，带电荷脂质(cytofectins)，DNA-蛋白质复合物，和生物聚合物。病毒载体包括反转录病毒、腺伴随病毒、痘病毒、杆状病毒、痘苗病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒和腺病毒载体。核酸序列可包含一个或多个调节区和/或选择性标记，其可用于选择、测量和监测核酸转移结果(导入到何种组织，表达持续时间等)。“可药用载体(pharmaceuticallyacceptablecarrier)”包括稀释液和填料，它们从给药方法方面应是药学上可接受的，无菌的，并可以是用适合的分散或润湿剂和悬浮剂配制的水或油性悬浮液。特定的药学上可接受的载体及活性化合物与载体的比率是由该组合物的溶解性和化学特性、特定的给药途径和标准的药学实践所决定的。星形胶质细胞本发明的一方面提供基本上纯的人星形胶质细胞群体。这些纯化的细胞可含有编码目的产物的导入的遗传物质。本发明的另一方面是要提供具有预期的治疗特性的，且适合离体(exvivo)细胞治疗的人类成年星形胶质细胞。遗传改造的人类细胞移植到鼠脑已在Sabate等的文献内公开(自然遗传学(NatureGenetics)，第9卷，第256-260页(1995))，该文的全部内容在这里通过参考文献的方式并入本文。现在，本发明提供了一种非常有效的方法来获得高纯度的成年人类星形胶质细胞，并能产生具有生物学作用的因子，比如用于离体基因治疗的神经活性物质。发明者目前已发现了成功纯化、扩增和体外修饰这些细胞的条件。在这些由重组腺病毒修饰的细胞内可得到相当高的基因表达水平。遗传修饰的星形胶质细胞可用于神经退行性疾病和中枢神经系统损伤的基因治疗。将基因转移技术与细胞移植结合为运送治疗性分子进入中枢神经系统提供了一个手段。星形胶质细胞特别适用于中枢神经系统的治疗，因为它们来源于中枢神经系统，具有有效的分泌机制并起到对神经元的支撑作用。更为重要是，人类成年星形胶质细胞作为离体基因导入的细胞载体为自体移植打开了一条新途径，由此避免了免疫排斥反应和免疫抑制剂的副作用。正如这里所提供的，这些细胞在体外可被纯化、扩增和遗传修饰。由人类成年大脑皮层分离的星形胶质细胞作为纯的原代培养物可在体外生长和保持至少10个月。此外，细胞可被编码神经活性物质的病毒载体有效地转导。当这个神经活性物质为人类酪氨酸羟化酶(hTH)时，在基于四环素的调节系统(tet-off)的负控制下，这些感染的细胞可大量合成活性的hTH和释放L-多巴。此外，强力霉素，一种很强的四环素类似物，可有效地调节转基因的表达。载体(vector)正如上述所讨论的，根据本发明，“载体(vector)”可以是任何能将核酸导入宿主细胞的工具。优选的载体是病毒载体，如反转录病毒，疱疹病毒，腺病毒，和腺伴随病毒。因此，应用病毒载体或通过DNA的直接导入，可将含有目的核酸的基因在体内、体外或离体情况下导入。导入基因在目标组织中的表达可通过将转基因载体靶向特定细胞，如用病毒载体或受体配基，或通过应用组织特异的启动子，或同时采用这两种方法来实现。普遍用于在体或离体目标打靶和治疗程序的病毒载体是以DNA为基础的载体和反转录病毒载体。在本领域，构建和应用病毒载体的方法已经很清楚[如，见Miller和Rosman，生物技术(BioTechniques)7980-990(1992)]。优选地，病毒载体是复制缺陷的，也就是，它们在目标细胞内不能自主复制。广义上讲，在本发明范围内应用复制缺陷病毒载体的基因组至少缺乏一个对于病毒在感染细胞内的复制必不可少的区域。这类区域可以采用本领域技术人员已知的任何技术删除(完全或部分)，或使其失去功能。这些技术包括完全删除、替代(由其他序列，尤其是插入的核酸)、部分删除或加入一个或多个碱基到必需的(对于复制来讲)区域。这类技术可在体外(在分离的DNA上)或在原位水平上，应用基因操作技术或通过诱变剂的处理来进行。优选的是，复制缺陷型病毒保留其为壳体化(encapsulating)病毒颗粒所必需的基因组序列。DNA病毒载体包括减毒的或缺陷DNA病毒，比如，但不局限于下列病毒单纯疱疹病毒(HSV)，乳头瘤病毒，EB病毒(EBV)，腺病毒，腺伴随病毒(AAV)，痘苗病毒等。优选完全或几乎完全丧失病毒基因的缺陷病毒。导入细胞内的缺陷病毒不具有复制的能力，因此，它不会导致产毒性病毒感染。缺陷病毒载体的应用允许我们施用于特定局部区域中的细胞，而不必担心病毒会感染其他细胞。因此，可特定靶向特定的组织。独特的载体例子包括，但不局限于缺陷疱疹病毒1(HSV1)载体[Kaplitt等，分子细胞神经学(Molec.Cell.Neurosci.)，2320-330(1991)]、缺乏糖蛋白L基因的缺陷疱疹病毒[专利公开文本RD371005A]、或其他缺陷疱疹病毒载体[国际专利公开文本WO94/21807，1994年9月29日出版；国际专利公开文本WO92/05263，1994年4月2日出版]；减毒的腺病毒载体，比如Stratford-Perricaudet等描述的载体[临床研究杂志(J.Clin.Invest.)，90626-630(1992)；还可参考LaSalle等，科学(Science)，259988-990(1993)]；和缺陷腺伴随病毒载体[Samulski等，病毒学杂志(J.Virol.)，613096-3101(1987)；Samulski等，病毒学杂志，633822-3828(1989)；Lebkowski等，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)，83988-3996(1988)]。优选的是，对于在体施用，联合病毒载体如腺病毒载体一起，采用适当的免疫抑制处理，以避免病毒载体和转染细胞的免疫失活(immunodeactivation)。举例说，可施用免疫抑制性细胞因子，如白细胞介素-12(IL-12)、干扰素-γ(IFN-γ)、或抗-CD4抗体，以阻断对病毒载体的体液或细胞免疫应答[如见，Wilson等，自然医学(NatureMediciene)(1995)]。此外，利用基因工程改造来表达最少量抗原的病毒载体是很有利的。自然地，本发明试图将表达有效治疗量目的基因的载体递送到星形胶质细胞中，从而用于基因治疗。这里所用短语“有效治疗量”是指目的基因的表达量足以降低至少15％，优选至少50％，更优选至少90％，最优选避免宿主的活性、功能和反应在临床上的明显缺陷。也可以说，有效治疗量足以引起宿主的临床显著状况的改善。本发明的任何载体(vector)，包括病毒或非病毒的，都优选通过可药用载体(carrier)离体导入星形胶质细胞。短语“可药用的”是指当给人施用时分子本身和组成物在生理学上可耐受，且典型地不产生过敏或类似的不适当反应，比如胃不适、头昏眼花和其他症状。优选地，这里所用的术语“可药用的”是指由联邦或州政府的管理机构批准的、或在美国药典或在其他公认的药典上列出的可在动物，更具体地说在人身上应用的。术语“载体(carrier)”是指化合物可伴随施用的稀释液，佐剂，赋形剂，或载体(vehile)。这类药学载体可以是无菌的液体，比如水和油，包括那些石油、动物、植物或合成来源的，比如，花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。尤其是对于注射液来讲，水或水溶液、盐溶液、葡萄糖和甘油水溶液是优选的载体。合适的药学载体已在E.W.Martin所写的“Remington的药物科学”中有描述。腺病毒载体在一个优选的实施方案中，载体是腺病毒载体。腺病毒是真核细胞DNA病毒，它可被修饰以有效运送本发明的核酸序列到各种不同的细胞类型。腺病毒存在着不同的血清型。在这些不同的血清型中，在本发明的范围内，优选使用人类2型或5型腺病毒(Ad2或Ad5)或动物来源的腺病毒(见WO94/26914)。可在本发明范围内应用的那些动物来源的腺病毒，包括犬、牛、鼠(如Mavl，Beard等，病毒学(virology)75(1990)81)、绵羊、猪、鸟和猿(如，SAV)来源的腺病毒。优选的动物来源腺病毒是犬腺病毒，更为优选的是CAV2腺病毒(例如，曼哈顿(Manhattan)或A26/61株(ATCCVR-800))。优选地，本发明的复制缺陷腺病毒含有ITRs序列、壳体化序列和目的核酸序列。更为优选的是，至少腺病毒的E1区没有功能。在Ad5型腺病毒的核酸序列中，E1区的缺失优选是从第455位核苷酸扩展到3329位(内切酶PvuII-BglII的片段)或第382-3446位核苷酸(HinfII-Sau3A片段)。其他区域也可以被修饰，尤其是E3区(WO95/02697)，E2区(WO94/28938)，E4区(WO94/28152，WO94/12649和WO95/02697)，或在任一晚期基因L1-L5内。在优选的实施方案中，缺失是在腺病毒载体的E1区(Ad1.0)。E1区缺失腺病毒的例子已公开在EP185，573，其内容在这里通过参考文献的方式并入本文。在另一优选的实施方案中，缺失是在腺病毒载体的E1和E4区内(Ad3.0)。E1/E4区缺失腺病毒的实例已公开在WO95/02697和WO96/22378，其内容在这里通过参考文献的方式引入本文。而在另一优选的实施方案中，缺失是在腺病毒载体的E1区，同时E4区和一条核酸序列被插入到此区(见FR9413355，其内容在这里通过参考文献的方式引入本文)。根据本发明的复制缺陷重组腺病毒可用本领域技术人员已知的任何技术来制备(Levrero等，基因(Gene)101(1991)195，EP185573；Graham等，EMBOJ.3(1984)2917)。尤其是，它们可通过腺病毒与携带特别是目的DNA的质粒，进行同源重组来制备。同源重组是在腺病毒和质粒共转染到适当细胞系后实现的。所用细胞系应该优选是(i)可被所述元件转染，及(ii)含有能与复制缺陷病毒的部分基因组互补的序列，优选以整合的形式，从而避免再重组的危险。可使用的细胞系的例子是人胚胎肾细胞系293(Graham等，J.Gen.Virol.，36(1977)59)，其含有整合至其基因组的Ad5型腺病毒基因组左侧部分(12％)，和能与E1和E4功能互补的细胞系，如在专利WO94/26914和WO95/02697描述的。用标准的分子生物学技术即可回收和纯化重组腺病毒，而这些技术对于一般的本领域技术人员都是很清楚的。腺伴随病毒载体腺伴随病毒(AAV)是一种大小相对较小的DNA病毒，它可以以稳定和位点特异的方式整合到其感染的细胞基因组中。它们可以感染广泛的细胞，而对细胞生长、形态学或分化不产生任何影响，且似乎它们不参与人类的任何病理变化。AAV的基因组已被克隆、测序和鉴定。它有大约4700碱基，且在两末端含有约145个碱基的反向末端重复(ITR)区，其可作为病毒复制的起点。余下的基因组可被分成两个必需区，其携带壳体化(encapsulation)功能基因组的左侧部分，包含的rep基因参与病毒的复制和病毒基因的表达；基因组的右侧部分，包含的cap基因编码病毒的衣壳蛋白。由AAV衍生的载体用于体外和体内基因转移已有报道(见WO91/18088；WO93/09239；US4,797,368，US5,139,941，EP488528)。这些出版物描述了不同AAV衍生结构，它们的rep基因和/或cap基因被删除，且被目的基因所代替，同时描述了这些结构在目的基因体外(进入培养细胞)或体内(直接进入生物体)转移中的应用。依据本发明，复制缺陷的重组AAV的制备可通过含有两侧被两个AAV反向末端重复(ITR)区包围的目的核酸序列的质粒与携带AAV壳体化(encapsulation)基因(rep和cap基因)的质粒共转染到被人辅助病毒(例如腺病毒)感染的细胞系内来进行。然后，由此产生的AAV重组体可通过标准的技术进行提纯。因此，本发明还涉及了一类AAV衍生的重组病毒，其基因组含有编码两侧被AAV反向末端重复(ITR)区包围的目的核酸序列的序列。本发明还涉及了一种质粒，它包含的序列所编码的核酸可编码一个抗血管生成因子，且该核酸两侧被两个来自AAV的反向末端重复(ITR)区包围。这样的质粒可用于转移核酸序列，如必要，这种质粒可被导入到脂质体载体(假病毒)中。反转录病毒载体在另一实施方案中，基因可以在反转录病毒载体内被导入，如下面这些文献中所描述的Anderson等，美国专利号5,399,346；Mann等，1983，细胞(Cell)33153；Temin等，美国专利4,650,764；Temin等，美国专利4,980,289；Markowitz等，1988，病毒学杂志，621120；Temin等，美国专利5,124,263；EP453242，EP178220；Bernstein等，Genet.Eng.7(1985)235；McCormick，BioTechnology3(1985)689；国际专利公开文本WO95/07358，1995年3月16日出版，Dougherty等；和Kuo等，1993，血液(Blood)82845。反转录病毒是一类感染分裂细胞的整合性病毒。反转录病毒的基因组包含两个LTRs，一个壳体化(encapsulation)序列和三个编码区(gag，pol和env)。在重组反转录病毒载体上，gag，pol和env基因通常是被全部或部分缺失的，且由目的异源性核酸序列替代。这些载体可由不同类型的反转录病毒构建，如HIV，MoMuLV(“Moloney鼠类白血病病毒”)，MSV(“Moloney鼠肉瘤病毒”)，HaSV(“Harvey肉瘤病毒”)；SNV(“脾坏死病毒”)；RSV(“劳斯肉瘤病毒”)和Friend病毒。缺陷性反转录病毒载体被公开在WO95/02697。总的来讲，为了构建含有一条核酸序列的重组反转录病毒，要构建一个包含LTRs、壳体化(encapsulation)序列和编码序列的质粒。用这种结构转染包装细胞系，这个细胞系可以以反式作用(intrans)方式提供反转录病毒功能，而这些正是质粒上所缺乏的。一般地，包装细胞系因此能表达gag、pol和env基因。这类包装细胞系已在本领域现有工作中得到描述，尤其是细胞系PA317(US4,861,719)；PsiCRIP细胞系(WO90/02806)和GP+envAm-12细胞系(WO89/07150)。此外，重组反转录病毒载体可在LTRs内含有修饰，以抑制转录活性以及广泛的壳体化(encapsulation)序列，此序列内可能含有部分gag基因(Bender等，病毒学杂志61(1987)1639)。重组反转录病毒载体可由那些本领域一般技术人员都知道的标准技术分离提纯。反转录病毒载体可被构建成象感染性颗粒一样起作用或只经历一轮转染。在前一种情况，病毒被修饰后除了那些负责致癌性转化特性的基因外几乎保留了它所有的基因，且可表达异源基因。非感染性病毒载体被制备成破坏病毒包装信号，但保留了为其共同导入病毒包装所需的结构基因，这个共同导入的病毒被基因工程修饰成含有异源性基因和包装信号。因此，所产生的病毒颗粒不能再产生额外的病毒。定向基因送递描述于国际专利公开文本WO95/28494，1995年10月出版。非病毒载体另外，载体可通过脂质转染法而被转导到星形胶质细胞内。在过去的十年中，脂质体在体外被囊化和转染核酸方面的应用不断增加。为降低由脂质体介导转染的难度和危险而设计的合成阳离子脂质可用于制备在体转染标记编码基因的脂质体[Felgner等，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)847413-7417(1987)；见Mackey等，美国科学院院报858027-8031(1988)；Ulmer等，科学2591745-1748(1993)]。阳离子脂质的应用可以提高带负电荷核酸的被囊化，同时也可提高与带负电荷的细胞膜的融合[Felgner和Ringold，科学337387-388(1989)]。用于转移核酸的特别有用的脂质化合物和组合物在下列文献中进行了描述国际专利公开文本WO95/18863和WO96/17823，及美国专利5,459,127。用脂质转染法将外源性基因导入特定的离体细胞内具有一定的应用优势。对于特定的细胞，脂质体的分子靶向代表了好的一面。对于靶向目的，脂质可与其他分子进行化学上的偶联[见Mackey等，前述文献]。定向肽，如激素或神经递质，和蛋白质，比如抗体，或非肽分子可以和脂质体进行化学上的偶联。其它分子也可用于促进核酸的转染，比如阳离子寡肽(如，国际专利公开文本WO95/21931)，DNA结合蛋白的衍生肽(如，国际专利公开文本WO96/25508)，或阳离子聚合物(如，国际专利公开文本WO95/21931)。载体也可作为裸露DNA质粒导入。用于基因治疗的裸露DNA载体可通过本领域已知的方法导入到目标宿主细胞中，这些方法如转染，电穿孔，微注射，转导，细胞融合，DEAE葡聚糖，磷酸钙沉淀，基因枪的应用，DNA载体转运蛋白的应用[如见，Wu等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，267963-967(1992)；Wu和Wu，生物化学杂志，26314621-14624(1988)；Hartmut等，加拿大专利申请2,012,311，1990年3月15日提交；Williams等，美国科学院院报882726-2730(1991)]。也可使用受体介导的DNA递送方法[Curiel等，人类基因治疗(Hum.GeneTher.)3147-154(1992)；Wu和Wu，生物化学杂志，2624429-4432(1987)]。核酸依据导入的遗传物质，对星形胶质细胞进行遗传修饰和移植可使它的应用更为广泛。在神经发育领域里，报告基因，比如LacZ基因，可以帮助解决很多重要的科学难题。尤其是，对来自不同脑区的外植先祖细胞独立于其来源而生存和分化的潜能的研究，可通过在发育中的脑或成年脑不同区域植入后跟踪它们来进行。尤为感兴趣的是核酸序列含有治疗基因。这些基因可包括任何编码神经活性物质(一种能对中枢神经系统细胞发挥有益影响的物质)的基因。这类物质可以是能补偿体内的缺陷或降低内源性物质过量的物质。或者，也可能是赋予细胞新特性的物质。神经活性物质可能是反义序列、多肽或蛋白质。那些适合于本发明实践的多肽和蛋白质包括生长因子、神经营养因子、细胞因子、神经递质、酶、神经递质受体和激素受体。优选地，生长因子是集落刺激因子(G-CSF，GM-CSF，M-CSF，CSF等)、内皮细胞生长因子(ECGF，FGF1)、成纤维细胞生长因子(aFGFa，bFGF)或血管细胞生长因子(VEGF)。在神经营养因子中，优选的因子是睫状神经营养因子(CNTF)、神经胶质细胞成熟因子(GMFa，b)、GDNF、BDNF、NT-3、NT-5等。编码NT-3的完整核酸序列公开在WO91/03569，其内容在这里以参考文献的方式引入本文。优选的细胞因子是白细胞介素和干扰素。包括在本发明范围之内的酶是神经递质生物合成的酶(酪氨酸羟化酶、乙酰胆碱转移酶、谷氨酸脱羧酶)和溶酶体酶(氨基己糖苷酶、芳基硫酸酯酶、葡糖脑苷脂酶，HGPRT)。参与自由基解毒的酶(超氧化物歧化酶I、II或III，过氧化氢酶，谷胱甘肽过氧化物酶)是优选的。受体包括雄激素受体(参与了肯尼迪氏病)。这些蛋白的应用可以采用天然的形式，也可以采用其变体或片段的形式。神经活性物质还可能是反义序列。可在翻译或转录水平应用反义核酸完成对基因表达的下调。本发明的反义核酸序列优选是能与编码内源性神经活性物质的核酸或相应的信使RNA特异杂交的核酸片段。这些反义核酸序列可以是合成的寡聚核苷酸，可任选地修饰以改进它们的稳定性和选择性。它们也可以是DNA序列，其在细胞内表达产生的RNA与全部或部分编码内源性神经活性物质的mRNA互补。反义核酸的制备可通过以反方向表达全部或部分编码内源性神经活性物质的核酸来实现，正如在EP140308所描述的那样。反义核酸序列的任何长度均适于本发明实践，只要它能够下调或阻断内源性神经活性物质的表达即可。优选地，反义序列的长度至少是20个核苷酸。反义核酸的制备和应用，编码反义RNA的DNA和寡聚及遗传反义(oligoandgeneticantisense)的应用公开在WO92/15680，其内容在这里以参考文献的方式并入本文。核酸可以是自然的或人工来源的。尤其是，它可以是基因组DNA(gDNA)，互补DNA(cDNA)，杂合序列或合成的或半合成的序列。它可以是来源于人类、动物、植物、细菌或病毒等。它可由本领域的技术人员所知的任何技术获得，尤其是通过筛库、化学合成，或用包括对筛库得到的序列进行化学或酶修饰的混合方法。这里优选cDNA或gDNA。对于帕金森氏病来讲，更优选的治疗产品是编码酪氨酸羟化酶(TH)或有利于多巴胺能神经元生存的神经营养因子如BDNF(脑源性神经营养因子)的cDNA。以之相类似，对于阿尔茨海默病，编码胆碱乙酰转移酶和/或NGF(神经生长因子)的cDNA能阻止胆碱能神经元退变。近来的发现表明，神经营养因子如BDNF和GDNF是多巴胺能细胞的营养因子。向星形胶质细胞内导入编码神经营养因子的遗传物质预期会改善移植物的生存。一些编码治疗基因的腺病毒载体已被构建。例如，已构建了编码酪氨酸羟化酶(TH)的腺病毒。依据本发明，植入体外感染的星形胶质细胞是向脑内递送治疗量TH的非常有效的途径。其它编码治疗基因的腺病毒衍生载体包括Ad-aFGF，Ad-bFGF，Ad-GDNF，Ad-GAD。目的遗传物质还可以是反义RNA或核酶，或者是编码所述反义RNA或核酶的DNA分子。这些产物尤为有意思的是它们可以抑制毒性蛋白质如β-淀粉样蛋白前体、TAU蛋白等的产生。优选地，遗传物质是编码目的蛋白质或肽的DNA。正如上面所表明的那样，所述的蛋白或肽优选是神经活性物质，比如生长因子(即细胞因子)、神经营养因子、酶或神经递质。在另一个实施方案中，遗传物质是编码反义RNA或核酶的DNA。调节区一般而言，本发明的核酸序列与一个或多个调节区相连。所述区域可以包括可调节的或可诱导的启动子；神经细胞特异性启动子，或病毒启动子。在本领域一般的技术水平内，选择一个或多个合适的调节区是一种简单的事情。调节区可能包含用于在星形胶质细胞内功能性转录的启动子区，以及位于目的基因3′端的区域，这个区具有转录终止信号和聚腺苷酸化位点。所有这些元件组成了表达盒。可以用于本发明的启动子包括组成型启动子和可调节(可诱导)启动子。启动子可能在自然情况下就负责这个核酸序列的表达。它也可能是异源性来源的。具体地，它可以是真核或病毒基因的启动子序列。例如，它可以是由打算感染的细胞的基因组获得的启动子序列。此外，它可以是由病毒基因组获得的启动子序列，包括所用的腺病毒。在这一点上，在这里可提到的是，例如腺病毒的E1A或主要晚期启动子(MLP)，巨细胞病毒(CMV)启动子或劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子。此外，启动子可以被修饰，即加入激活或调节序列或允许组织特异性或优势表达(predominantexpression)的序列(烯醇化酶和GFAP启动子等)。而且，当核酸序列不含有启动子序列时，可以插入启动子，比如插入到该序列下游的病毒基因组中。一些对本发明实施有意义的启动子是普遍存在的启动子(如HPRT，波形蛋白，肌动蛋白，微管蛋白)，中间丝启动子(如肌纤维蛋白(desmin)，神经丝，角蛋白，GFAP)，治疗基因启动子(如MDR型，CFTR，因子VIII)，组织特异性启动子(如，平滑肌细胞内肌动蛋白启动子)，那些优先在分裂细胞中激活的启动子，对刺激反应的启动子(如，类固醇激素受体，视黄酸受体)，四环素调节的转录调节子(transcriptionalmodulator)，巨细胞病毒的立即早期、反转录病毒的LTR、金属硫蛋白、SV-40、Ela和MLP启动子。四环素调节的转录调节子和CMV启动子在下列文献中有描述WO96/01313，US5,168,062和5,385,839，其内容在这里以参考文献的方式引入本文。给药本发明使成年人类星形胶质细胞的纯化和增殖成为可能，并且它们可以成功地应用于高效率地体外运送基因。然后，这些细胞可被施用到受体生物的中枢神经系统。由此，本发明提供了重要的临床和科学研究应用，比如对中枢神经系统损伤和神经退行性疾病的治疗。依据本发明的方法可以使人们根据被转导的基因和所要治疗的疾病精确靶向中枢神经系统的特定区域，比如脑内的某一部位。因此，根据需要治疗的损伤位点，脑内可被施用的部位包括例如，纹状体，海马或黑质。优选地，它们可被移植到纹状体。依据本发明，通过立体定位注射的方法递送用于移植的星形胶质细胞是可能的。给药坐标的确定取决于所治疗的疾病，可由熟练操作人员确定。对于一个实际的治疗方案，包括注射位点、注射次数和时间表、及具体剂量，也是由熟练操作人员决定。一般地，在一个位点移植的细胞数是在1x103到1x1010之间，优选1x105至1x109，更优选1x106至1x108。提供含有如上所述的星形胶质细胞的移植物也是本发明的目标。优选地，该移植物包含增强细胞生存和体内增殖与分化的非细胞材料。该移植物可含有，例如胶原、明胶、纤连蛋白、凝集素、生物适合的支持物(如骨或聚四氟乙烯纤维等)。本发明还涉及运送治疗产品到受体中枢神经系统的方法，包括向所述受体脑内植入遗传修饰的人类星形胶质细胞，其包含编码所述治疗产品的导入遗传物质。本发明提供了治疗基因的安全、非毒性、长期的体内表达。本发明的特殊意义在于治疗神经退行性疾病，比如神经病、中风、脊髓损伤、肌萎缩性(脊髓)侧索硬化、亨廷顿氏舞蹈病、阿尔茨海默和帕金森氏病、大脑麻痹、癫痫、溶酶体缺陷症(如，TaySachs和Sandhoff病，异染色性脑白质障碍症，Gaucher’s病，粘多糖代谢病，LeshNyhan等)以及脑瘤。本发明可通过参考下列非限制性实施例得以更好地理解，这些实施例作为本发明的示例提供。实施例借助下列实施例，本发明将会得到更详细的描述，这些实施例应该被认为是说明性的和非限制性的。实施例1描述了可使人类成年星形胶质细胞的长期的纯化原代培养物复苏的细胞培养方案。实施例2证明，应用编码在基于四环素的(tet-off)调节系统控制下的人类酪氨酸羟化酶(TH)的腺病毒载体可对这些细胞进行基因修饰(Gossen和Bujard，1992年)。TH是儿茶酚胺合成的限速酶，它可将酪氨酸转化成L-多巴。一些研究已经证明了它在帕金森氏病动物模型上的治疗潜力(Wolff等，1989；Horellou等，1990a，b；Fisher等，1991)。在没有强力霉素(一种很强的四环素类似物)存在的条件下，感染的细胞可产生大量的活性hTH。普通分子生物学根据本发明，可使用本领域技术内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这类技术在文献中有全面的解释。如，见Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆实验室手册(MolecularCloningALaboratoryManual)，第二版(1989)，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约(在这里称“Sambrook等，1989”)；DNA克隆实践方法(DNACloningAPracticalApproach)，卷I和II(D.N.Glover编，1985年)；寡聚核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)(M.J.Gait编，1984年)；核酸杂交(NucleicAcidHybridization)[B.D.Hames和S.J.Higgins编(1985年)]；转录和翻译(TranscriptionAndTranslation)[B.D.Hames和S.J.Higgins编(1984年)]；动物细胞培养(AnimalCellCulture)[R.I.Freshney编(1986年)]；固定化细胞和酶(ImmobilizedCellsAndEnzymes)[IRLPress，(1986年)]；B.Perbal，分子克隆的实践指南(APracticalGuideToMolecularCloning)(1984年)；F.M.Ausubel等(编)，现代分子生物学实验手册(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，JohnWiley&Sons，Inc.(1994年)。实施例1原代培养的人类成年星形胶质细胞的移植和特征分析1.1细胞培养依照医院的规章制度，在患者同意的情况下，由正在进行外科切除术患者的大脑皮层分离得到成年人组织。术后迅速地将组织在DMEM/F12(购自Sigma)中机械分散和离心，该培养液包含D-葡萄糖(3.15g/l)，HEPES(3.57g/l)，碳酸氢钠(1.2g/l)，添加10％的胎牛血清(FCS，Seromed)，2mM谷氨酰胺(Gibco)，抗生素(青霉素/链霉素混合物，100μg/ml，Gibco)和两性霉素(Gibco)，pH7.4。沉淀再悬浮在同样的培养液中，且接种在一个5cm培养瓶内(购自Costar)。在37℃，含10％CO2的湿润空气内培养。48小时后，更换培养液。此后，这些原代培养物通过每周换一次液来维持。作为冷冻/化冻程序，用0.25％胰蛋白酶和0.2％EDTA(购自Gibco)收获长满的细胞，且迅速地用磷酸缓冲盐溶液(PBS，0.1M，pH7.4)冲洗去除含有血清的培养液。然后，细胞在含有10％二甲基亚砜(DMSO，购自Sigma)的DMEM/F12中先在-20℃冷冻，最后贮存在-80℃。细胞的化冻是通过把小瓶放在40℃水浴箱内2-4分钟，然后重新接种到购自Costa的培养瓶内。48小时后，更换培养液以去除DMSO。1.2细胞增殖的评估用两种不同的方法用相差显微镜在一个预先设定好的2平方毫米的面积内，直接对细胞进行记数；和用双免疫荧光法来显示GFAP-溴脱氧尿苷的标记(BrdU，一种胸腺嘧啶的类似物，其只掺入到正在复制的DNA上)。原代培养的细胞被接种到含有DMEM/F12培养液的NUNCTM带格(2mm2)培养皿(60x15mm)内。测定了在不同培养条件下的细胞增殖率(a)未加FCS，(b)加入10％FCS，(b)20％FCS，(c)10％FCS和5％马血清(HS)，(d)10％FCS和10％HS，(e)NGF(50ng/ml，购自Sigma)，(f)bFGF(50ng/ml，购自Boehringer-Mannheim)。对于细胞增殖实验，每周换两次培养液。每10小时对培养细胞记数，持续80小时。所用NGF和bFGF的活性通过生物测定法来进行评估暴露于NGF(50ng/ml)的PC12细胞(在含有10％HS和5％FCS的RPMI溶液中，细胞培养在聚鸟氨酸包被的培养皿上)的轴突延长，及在bFGF(10ng/ml，在DMEM/HAMF12培养液中)存在下，神经上皮的先祖细胞的分化(见文献Sabate等，1995年)。对于BrdU掺入实验，接种两天后，向原代培养物内加入BrdU。在5或10μMBrdU存在的条件下，细胞继续培养4天。同时对3T3和293细胞的BrdU处理作为细胞增殖的对照。正如下面描述的那样，阳性细胞由免疫细胞化学法进行检测。1.3免疫细胞化学法原代培养的细胞用PBS溶液迅速清洗，且在室温条件下，在固定液(含4％多聚甲醛的PBS)继续温浴10分钟。用PBS清洗后，在室温条件下，用封闭液(10％山羊血清和0.2％TritonX-100的PBS)处理细胞30分钟，然后与含有5％山羊血清和0.1％TritonX-100的PBS溶液内的一抗多克隆抗体(GFAP，购自Dakopatts，1100；S100β，购自Sigma，稀释到1100；TH，购自Inst.J.Boy，稀释到1200；BrdU，购自Jakson，150；0X42，购自Cedarlane，1200)温浴。对于BrdU的免疫测定，在室温条件下，细胞首先在2NHCl内变性20分钟。用0.1N的硼酸钠中和10分钟后，样品用PBS溶液清洗，且按GFAP免疫细胞化学法描述的那样进行操作。1.4培养星形胶质细胞的特征分析为了评估人类成年星形胶质细胞的用于向中枢神经系统自体移植的潜力，首先有必要检测的是这些细胞能否作为原代培养细胞维持。以前的研究报导，原代培养的人类成年星形胶质细胞富含小胶质细胞(Yong等，1991，1992年)。改变培养液的组成和组织切除、分离到细胞接种的时间，以便优化细胞培养的程序，从而得到富含星形胶质细胞的制品。对于啮齿类星形胶质细胞的培养，在DMEM内添加血清是一种合适的培养液。添加胎牛血清(FCS)和HAM/F12营养成分的滋养DMEM可用于星形胶质细胞的培养。分离、接种后，首先在培养皿内贴壁的是星形胶质细胞。到第一次更换培养液为止，即这些培养液内含有未贴壁的和/或死细胞和细胞碎片，对不同的延迟时间(24-120小时)进行了测试。延迟48小时(2天)可最为理想地得到基本上纯化的星形胶质细胞培养。使人惊奇的是，在这些条件下，小胶质细胞不能在培养皿内贴璧。在添加10％FCS的DMEM/F12培养液内2天后，细胞在培养皿内展平生长。尽管细胞的形态学依赖于培养密度，但大多数细胞在形态学上表现为扁平的多角形(图1A-B)。对于这些展平细胞的鉴别是通过星形胶质细胞标志的免疫检测法进行的，这些标志包括GFAP，即主要的胶质纤维蛋白(gliofilamentprotein)，和S100β，一种胞浆内的钙结合蛋白(图2)。差不多所有原代培养细胞都是GFAP(图2A)和S100β阳性(图2B)。对于存在于培养液中的小胶质细胞的检测是通过OX42免疫染色和由GriffoniaSimplicifolia植物提取的B4同工凝集素标记来进行的，后者用作小胶质细胞的特异标志(Streit，1990年)。没有看到任何染色，从而进一步证明所培养的星形胶质细胞基本上没有小胶质细胞的存在。综上所述，这些结果表明，本发明可提供基本上纯化的人类成年星形胶质细胞。培养物的显微镜检查发现，很多GFAP-阳性细胞处于有丝分裂状态(图1B)。1.4.1人类成年星形胶质细胞的体外增殖初步的观察表明，不加入FCS，没有或很少培养的细胞处于分裂状态，而在10％FCS加入到DMEM/F12培养液中时通常观察到有丝分裂增殖。GFAP和BrdU的双免疫荧光标记发现，正处于分裂状态下的细胞是星形胶质细胞。对原代培养的人类成年星形胶质细胞在不同培养条件下的增殖能力进行了分析。可溶分子，包括营养因子NGF和bFGF，和不同种属的血清对于培养的啮齿类和人类胎儿星形胶质细胞具有促有丝分裂的特性(见文献，Yong等，1991，1992；和Stachowiak等，1997)。检测了不同组合，包括FCS、HS、bFGF和NGF，对细胞增殖的影响0、10和20％FCS，10％FCS添加5或10％HS，DMEM添加50ng/mlbFGF，DMEM添加50ng/mlNGF(图3A-B)。在FCS存在的条件下，接种12小时后，细胞已在培养皿的表面上贴壁和展平。细胞只有在FCS存在的条件下增殖(图3A)，在20％FCS时，细胞增殖达最高水平。当在10％或20％FCS存在下培养时，星形胶质细胞数目可分别在40和20小时增加一倍(图3A)。在20％FCS存在的条件下，细胞增殖率适合于细胞移植，可使从一次组织活检中得到的人类成年星形胶质细胞数在一个月内达到1-5x106。出乎意料的是，NGF或bFGF(50ng/ml培养液)不能加速人类成熟星形细胞的增殖(图3B)。当在FCS添加5或10％HS的条件下培养时，大多数的人类成年星形胶质细胞不能贴附到培养皿上，且只悬浮在培养液中。不过，一些球状细胞在培养皿上贴壁，但不展平。从接种3天后，一些细胞展平并缓慢增殖(图3B)。总之，在FCS存在的条件下，人类成年星形胶质细胞可以在体外扩增。20％FCS可使细胞迅速增殖到适合于细胞移植的数量。1.4.2冷冻/化冻程序后的细胞特征一个患者可能会接受不止一次的移植。因此，要在人类发展自体移植的一个重要课题就是从一次活检中得到的原代培养星形胶质细胞的深低温保藏。在冷冻/化冻程序后，测试了人类成年星形胶质细胞的生长情况。在第一次传代，相当于在含有10％FCS的DMEM/F12培养液中体外生长3-4周时，冷冻培养细胞，且在-80℃内保存2-6个月。然后，细胞被迅速化冻，且接种于含有10％FCS的EMEM/F12培养液中。每天仔细观察细胞。细胞化冻和接种10小时后，细胞可在培养皿上贴壁和展平。与没有经过冷冻程序的细胞相比，它们表现出相似的形态学和免疫细胞化学特征。GFAP和S100β免疫染色证实，这些细胞保留了星形胶质细胞的表型。在接种的第一天内，细胞不增殖。在第2-3天内，观察到了第一次的有丝分裂增殖。然后，细胞扩增加速，且在10％FCS存在下平均分裂时间是60小时(图3A)。因此，在经过冷冻/化冻程序后，依据本发明所获得的人类成年星形胶质细胞保持着它们的分裂能力。实施例2培养的星形胶质细胞的遗传修饰2.1腺病毒载体近来的研究表明，腺病毒载体是转移外源基因到神经细胞的有效工具，在这些研究中对啮齿脑直接进行脑内注射来提供中枢神经系统的基因治疗(WO94/08026)。为了扩大细胞数量以适合移植，发明者已经证明，重组腺病毒可有效地使基因导入培养的人类星形胶质细胞。很多腺病毒衍生载体已在文献上公开，且可由本领域的技术人员制备。这类载体可用于本发明(见，尤其是EP185573，Perricaudet等，FEBS通讯267(1990年)60；Levrero等，基因101(1991年)195；FR9305954，FR9308596，WO94/12649)。Ad.RSVβgal载体已经在文献上公开。例如，见Stratford-Perricaudet等(临床研究杂志，90，626-630(1992))。这个载体包含大肠杆菌的LacZ基因，其插入到删除E1和E3区的Ad5型腺病毒上。2.2用AdPGKtethTH-1感染人类成年星形胶质细胞将细胞在没有血清(FCS)的DMEM/F12培养液内以6x104个细胞/每孔的密度接种到6孔培养板内。然后，使细胞与AdPGKtethTH-1一起温育4-6小时，在这里人类酪氨酸羟化酶基因(hTH-1)受基于四环素的“tet-off”调节系统的控制(Gossen和Bujard，1992年)。hTH基因和反式激活蛋白分别由一个最小CMV和磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子驱动。测试了各种的感染复数(MOI)(75，150和300pfu/细胞)。加入强力霉素到培养液中，其终浓度为10ng/ml。每隔一天换培养液。2.3被转导的人类成年星形胶质细胞内TH活性和L-多巴产量的评估感染后的第3，7和14天，收获细胞，且经过一定程序来测定TH活性和估算L-多巴的产量。细胞沉淀内的TH活性的检测是按照以前描述的方法(Reinhard等，1986年)进行。L-多巴产量是在人类星形胶质细胞在没有FCS的DMEM/F12培养液内生长24小时后估算的。收集条件细胞培养液，每份0.5ml的样品与0.05MTris-HCl，pH8.6的氧化铝悬浮液(40mg/ml)混合。然后，不间断地搅拌每份混合物10分钟，用Tris-HCl缓冲液洗涤，且最后氧化铝通过离心(800g，5分钟，4℃)收集。被吸附到氧化铝凝胶上的儿茶酚用0.6N高氯酸(每个样品0.1ml)洗脱，且洗脱液用2M，pH7.4的磷酸钾(每个样品20μl)中和。离心(30,000g，15分钟，4℃)后，取10μl透明的上清液注射到高效液相(HPLC)的柱子上(UltrasphereIP，25cm长，0.46cm外径，5μm)对L-多巴进行电化学定量，按文献上的详细描述(Adrien等，1989)进行。2.4人类成年星形胶质细胞基因工程改造的效果培养的人类成年星形胶质细胞可被重组的腺病毒载体修饰。用300pfu/细胞的病毒制品感染细胞6小时，可获得理想的转导。未观察到明显的毒性作用。用免疫细胞化学法进行评估，50-60％的细胞是hTH-阳性(图3A-B)。采用由Reinhard和同事(1986年)发展的酶检测法测定hTH在感染后第3，7和14天是否有活性。TH活性在感染后第3天可以检测到(1,290pmol/mgprot/h)，且在第7天(19,000pmol/mgprot/h)和第14天(35,650pmol/mgprot/h)升高。此外，HPLC分析表明，感染14天后，TH-转导的人类星形胶质细胞产生1μgL-多巴/106细胞/24小时。为了检测基于四环素的调节系统的有效性，用强力霉素(10ng/ml)，一种很强的四环素类似物，处理星形胶质细胞。强力霉素可有效地降低TH的表达。在强力霉素存在的条件下，TH的活性在感染14天时至少被降低了10倍(强力霉素处理的细胞3,590pmol/mgprot/h对未处理的培养物35，650pmol/mgprot/h)(图4)。这表明，hTH-1的表达可被强力霉素有效地控制。然而，正如图4所示，在强力霉素处理的星形胶质细胞内，TH活性并未回到基线水平。这一观察提示，驱动AdPGKtethTH-1载体内hTH-1基因表达的最小启动子P*hCMV，在原代培养的人类成年星形胶质细胞内具有一定的基础活性。确实，过去的研究报道，hCMV启动子在一定的实验条件下比如损伤后，可具有活性，提示了hCMV启动子的环境性调节(McCarthy等，1995年；Fritschy等，1996年)。2.5其他载体的应用如上所提，依据本发明，其他类型的载体可用于星形胶质细胞的遗传修饰。它们可以是病毒性的或非病毒性的(化学的)载体。优选的病毒性载体包括AAV，反转录病毒，疱疹病毒和痘苗病毒。非病毒性载体包括磷酸钙沉淀，脂质体介导的转染，阳离子脂质转染和脂多胺介导的转染。在这里讨论的所有文献都以参考文献的方式引入。本领域的技术人员将会很容量理解本发明非常适合于实施本发明的目标，并获得本文所提到的以及其内在的结果和优点。这里所描述的肽、多核苷酸、方法、程序和技术作为优选实施方案的代表呈现，且旨在作为举例说明，而不是对本发明范围的限制。本领域技术人员将会想到本发明精神之内所包括的或附及权利要求的范围所定义的本发明的变化和其它应用。参考文献ADRIEN，J.，LANFUMEY，L.，GOZLAN，H.，FATTACCINI，C.M.，和HAMON，M.(1989)。CM57493在脑内对神经前后突触上5-HT1A受体激动作用的生物化学和电生理学证据。J.Pharmacol.Exp.Ther.248，1222-1230。ALOISI，F.，BORSELLINO，G.，SAMOGGIA，P.，TESTA，U.，CHELUCCI，C.，RUSSO，G.，PESCHLE，C.LEVI，G.(1992)。人胎脑星形胶质细胞培养表面分子的特征和炎性细胞因子引起的调节。神经科学研究杂志(J.Neurosci.Res.)32，494-506。AUBERT，I.，RIDET，J.L.，和GAGE，F.H.(1995)。成年哺乳动物中枢神经系统的再生由发育指导。现代神经生物学观点(Curr.Opin.Neurobiol.)5，625-635。BILANG-BLEUEL，A.，REVAH，F.，COLIN，P.，LOCQUET，I.，ROBERT，J.J.，MALLET，J.和HORELLOU，P.(1997)。在大鼠帕金森氏病模型中纹状体内注射表达GDNF的腺病毒载体可阻止多巴能神经元的变性和行为学损伤。美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)94，8818-8823。CASTILLOJr.，B.，DELCERRO，M.，BREAKFIELD，X.O.，FRIM，D.M.，BARNSTABLE，C.J.，DEAN，D.O.，和BOHN，M.C.(1994)。用于分泌脑源性神经营养因子(BDNF)的遗传修饰的星形胶质细胞可提高视网膜神经节细胞的生存。脑研究(BrainRes.)647，30-37。CORTI，O.，HORELLOU，P.，COLIN，P.，CATTANEO，E.，和MALLET，J.(1996)。在神经前体移植物中脑内基因表达的四环素依赖性调节。神经科学报告(NeuroReport)7，1655-1659。CUNNINGHAM，L.A.，HANSEN，J.T，SHORT，M.P.，和BOHN，M.C.(1991)。用遗传改造的星形胶质细胞为移植到脑纹状体的肾上腺嗜铬细胞提供神经生长因子(NGF)。脑研究561，192-202。CUNNINGHAM，L.A.，SHORT，M.P.，BREAKFIELD，X.O.，和BOHN，M.C.(1994)。在大鼠帕金森氏病模型上转基因星形胶质细胞释放的神经生长因子增强肾上腺嗜铬细胞细胞移植物的功能。脑研究558，219-223。FISHER，L.J.，和GAGE，F.H.(1993)。在哺乳动物中枢神经系统的移植。生理学综述(Physiol.Rev.)73，583-616。FISHER，L.J.(1997)。神经前体细胞在中枢神经系统研究和修复中的应用。神经生物学疾病(Neurobiol.Dis.)4，1-22。FISHER，L.J.，JINNAH，H.A.，KALE，L.C.，HIGGINS，G.A.，和GAGE，F.H.(1991)。纹状体内移植的用于产生L-多巴的遗传修饰成纤维细胞的生存和功能。神经元(Neuron)6，371-380。FRITSCHY，J.M.，BRANDNER，S.，AGUZZI，A.，KOEDOOD，M.，LUSCHER，B.，和MITCHELL，P.J.(1996)。在转基因小鼠中人类巨细胞病毒立即早期启动子的脑细胞类型特异性和由神经胶质过多症诱导的激活。神经科学杂志(J.Neurosci.)16，2275-82。GAGE，F.H.，RAY，J.，和FISHER，L.J.(1995)。中枢神经系统干细胞的分离，特征和应用。神经科学年度综述(Ann.Rev.Neurosci.)18，159-192。GOODMAN，J.C.，TRASK，T.W.，CHEN，S.H.，WOO，S.L.C，GROSSMAN，R.G.，CAREY，K.D.，HUBBARD，G.B.，CARRIER，D.A.，BAJAGOPALAN，S.，AGUILAR-CORDOVA，E.，和SHINE，H.D.(1996)。在全身性施用9-(1，3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤之前腺病毒介导的胸苷激酶基因向灵长类动物脑内的转移病理的，放射学的和分子的研究。人类基因治疗(HumanGeneTher.)7，1241-1250。GOSSEN，M.，和BUJARD，H.(1992)。在哺乳动物细胞内四环素响应的启动子对基因表达的严格控制。美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89，5547-5551。GOSSEN，M.，FREUNDLIEB，S.，BENDER，G.，MULLER，G.，HILLEN，W.，和BUJARD，H.(1995)。在哺乳动物细胞内四环素引起的转录激活。科学(Science)268，1766-1769。HORELLOU，P.，BRUNDIN，P.，KALEN，P.，MALLET，J.，和BJRKLUND，A.(1990a)。在移植到去神经纹状体内的基因工程化细胞中多巴和多巴胺的在体释放。神经元5,393-402。HORELLOU，P.，MARLIER，L.，PRIVAT，A.，和MALLET，J.(1990b)。可合成L-多巴或多巴胺的工程化细胞在移植到大鼠新纹状体后对行为学上的影响。欧洲神经科学杂志(Eur.J.Neurosci.)2，116-119。HORELLOU，P.，VIGNE，E.，CASTEL，M.N.，BARNEOUD，P.，COLIN，P.，PERRICAUDET，M.，DELAERE，P.和MALLET，J.(1994)。在帕金森氏病的大鼠模型上可表达酪氨酸羟化酶的腺病毒载体的直接脑内基因转移。神经科学报告(NeuroReport)6，49-53。JUORIO，A.V.，LI，X.M.，WALZ，W.，和PATERSON，I.A.(1993)。由培养的小鼠星形胶质细胞引起的L-多巴脱羧基化。脑研究(BrainRes.)626，306-309。KISTNER，A.，GOSSEN，M.，ZIMMERMANN，F.，JERECICJ.，ULLMER，C.，LUBBERT，H.，和BUJARD，H.(1996)。在转基因小鼠上强力霉素介导的基因表达的定量性和组织特异性控制。美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)93，10933-10938。KOJIMA，H.，ABIRU，Y.，SAKAJIRI，K.，WATABE，K.，OHISHI，N.，TAKAMORI，M.，HATANAKA，H.和YAGI，K.(1997)。腺病毒介导的人类胶质细胞系来源神经营养因子基因的转移在小鼠纹状体内可阻止由1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢嘧啶诱导的多巴胺损耗。生物化学生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)238，569-573。LAGAMMA，E.F.，WIESINGER，G.，LENN，N.J.，和STRECKER，R.E.(1993)。遗传修饰的原代星形胶质细胞可作为细胞载体用于脑内基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