合成的和嵌合的启动子、表达盒、质粒、载体、含有它们的转基因植物和种子以及其产生方法

专利名称：合成的和嵌合的启动子、表达盒、质粒、载体、含有它们的转基因植物和种子以及其产生方法
专利说明合成的和嵌合的启动子、表达盒、质粒、载体、含有 它们的转基因植物和种子以及其产生方法 本发明涉及计划具体用于植物生物技术领域的嵌合表达启动子。
一般而言，所述表达启动子是生物技术和遗传操作领域已知的。在更具体的植物生物技术方面，将在宿主细胞中产生的多肽的编码基因的表达水平常常取决于所使用的启动子。常用的各种启动子由于其表达的组织特异性或表达强度，通常限于特定的应用或组织。作为与例如源自nos基因的启动子相比相对强的启动子，可以提及例如花椰菜花叶病毒的35S启动子，这两种启动子更尤其用于植物生物技术领域。因此需要使得有可能克服采用目前的启动子的缺点的新型启动子。在公布号为WO 97/20056的PCT专利申请中已经报道了满足这一需要的尝试，该专利申请描述了通过利用增强子在已知启动子中提高基因表达水平(即对启动子的活性有正效应)。增强子的核苷酸序列富含A和T碱基，这些碱基的总量组成超过50％的所述增强子的核苷酸序列。特别是，该申请的申请人建议利用源自豌豆质体蓝素(plastocyanine)启动子的增强子区。
用于本说明书和权利要求书的表述具有以下含义-术语“核酸”是指DNA或RNA；-术语“核酸序列”是指从5’端读至3’端的单链或双链的核苷酸碱基的寡聚体或聚合物，它包括自我复制型质粒、感染性或非感染性的基因和DNA或RNA聚合物、以及功能性或非功能性DNA或RNA。在用于本申请中的核苷酸符号中，除具体提及的以外，单链或双链核苷酸序列的左手端均为5’端；
-短语“衍生的核酸序列”是指例如通过置换、缺失、添加、突变、断裂和/或合成一个或更多个核苷酸而直接或间接从所提及的序列衍生的序列；-术语“启动子”或短语“启动子核酸序列”是指位于翻译起始密码子上游、并且涉及RNA聚合酶和其它转录蛋白的识别和结合的核酸区；-“植物启动子”是能够在植物细胞中启动转录的启动子；-“组成型启动子”是能够在所述宿主生物的整个发育过程中，在该生物的所有组织或几乎所有组织中表达与所述启动子以功能方式连接的核酸序列的启动子；-“特异性组织启动子”是指在所述宿主生物的某些特定组织中选择性地表达与所述启动子以功能方式连接的核酸序列的启动子；-短语“以功能方式连接的”或“功能性连接的”是指一段核酸序列(例如一个启动子或一个调节或功能框)与另一段核酸序列(例如另一调节或功能框、或编码待产生的蛋白的待表达的基因)的连接，使得所述序列在已经引入其的细胞、基因组、载体或表达盒中发挥其原始功能，即使得它们在这样的环境中有功能。也应该理解，就启动子而言，所述启动子的序列也包括在转录起始位点和翻译起始位点之间的转录的序列；-术语“表达盒”是指这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列能够在与这种序列相容的宿主生物中指导编码待产生的多肽的核酸序列或基因的表达。这样的盒至少包括一个启动子和一个转录终止信号、以及任选的表达所需要的或可用于表达的其它因子；-术语“载体”是指表达系统，例如DNA包被的轰击粒子、基于核酸的转运载体和已被改变以运送所述核酸的核酸分子、以及自主自我复制型环状DNA，例如质粒、粘粒、噬菌粒等。如果将重组细胞培养物或微生物称为“表达载体”的宿主，则这包括染色体外环状DNA(例如线粒体DNA或叶绿体DNA)和已经整合到宿主染色体中的DNA，所述载体能够或者作为整合到宿主基因组中的自主结构通过在有丝分裂期间由所述细胞稳定复制，或者维持在宿主的细胞核或细胞质中；-术语“质粒”是指能够在细胞中复制的自主环状DNA分子，包括所谓的“表达”质粒和所谓的“非表达”质粒。如果一种重组细胞培养物或微生物被描述为是“表达质粒”的宿主，则该术语既包括染色体外环状DNA分子，又包括已经整合到宿主染色体中的DNA。如果所述质粒被宿主细胞保持，则所述质粒或者在有丝分裂期间作为一种自主结构由所述细胞稳定地复制，或者整合到所述宿主的基因组中；-术语“异源序列”或“异源核酸序列”是指源自与其环境无关的来源或物种的序列，或者如果它源自同一环境，则其相对于其原来形式而言已经被修饰。可以通过例如用限制酶处理所述核酸，以产生能够以功能方式连接至启动子的核酸片段，对所述核酸序列进行修饰。还可以通过例如定向诱变的技术进行所述修饰；-术语“框”是指负责调节功能的核酸序列；-术语“样(like)”是指与此术语相连的盒和/或核酸序列，包含与一种框和/或称为参比序列的已知核酸序列具有一定的序列同一性或共有序列，优选与所述参比序列具有至少50％的序列同一性，更优选具有至少75％的序列同一性，更特别具有至少90％的序列同一性。序列同一性的百分比以至少6个核苷酸碱基的对比窗为基础进行计算。可以使用序列对比算法确定对比窗，以测定与参比序列同源性，所述算法例如局部同源性算法、同源性序列对比算法和相似性检索算法，这些算法还以计算机形式存在，称为GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA。通过比较参比序列与所述框和/或所述核酸序列获得序列同一性的百分比；-术语“位于”是指已鉴定元件(例如“框”、限制位点或具有特定功能的密码子)在核酸序列中的位置。以数字给出的位置是指所述元件在所述核酸序列中的起始位置，只是当具体提及时，以所述核苷酸序列的阅读方向即5′→3′方向提及；-术语“元件300”、“EM”、“胚乳基序”、“P框”或“谷醇溶蛋白样”框是指编码许多禾谷类贮藏蛋白并且参与玉米胚乳发育期间介导玉米醇溶蛋白基因同步表达的共同调节机制的调节或功能基序或元件；-术语“G样”框是指ACGT核心基序，在少数情况下其对转录调节的功能贡献已经被限定，但其看来是启动子最大表达所必需的；-术语“增强子”框是指可以在相隔一定距离的地方以顺式起作用的调节DNA序列，它与其方向以及是位于其靶启动子上游还是下游无关，并且它通常可以由多个短基序组成，所述基序结合反式因子的组合，以可能赋予诱导性、组织特异性或启动子活性的总体提高；-术语“GATA”框是指许多光调节的启动子活性可能需要的调节或功能基序或元件；-术语“as1”或“激活序列1”框是指优选源自CaMV(花椰菜花叶病毒)35S启动子的调节或功能基序或元件，它可以提供在根中的表达，它可以在启动子调节中通过与其它顺式激活元件协同相互作用而起更为复杂的作用，而且它可以任选地是水杨酸诱导型；-术语“as2”或“激活序列2”框是指优选源自CaMV(花椰菜花叶病毒)35S启动子的调节或功能基序或元件，它可以提供在光合作用组织中的表达，并且它可以具有转录激活剂的活性；-术语“禾谷类”框是指可能参与小麦种子中的特异性表达的调节或功能基序或元件；-术语“富含GC”框是指富含G或C核苷酸的调节或功能基序或元件，例如源自双粒病毒组的基序或元件；-术语“转基因植物”是指通过遗传操作技术获得的植物，并包括通过这些技术所获得的整株植物、在其基因组中已经整合了这类操作或表达这类操作的再生植物、其后代以及植物器官，例如根、茎和叶。按照本发明的转基因植物可以具有不同的倍性水平，特别可以是多倍体、二倍体或单倍体；-术语“繁殖体”是指植物细胞团块或一类植物细胞，它可以具有或没有一定的结构，它能够再生完整植株，例如外植体、愈伤组织、茎、叶、根、插条和甚至种子。
本发明的申请人已经采用了不同于先前讨论的PCT申请的申请人所采用的方法。具体地说，本发明的申请人已经令人惊奇地成功制得嵌合启动子，所述嵌合启动子使得有可能满足上述需求，特别是使得有可能在宿主细胞中、特别是在植物细胞中，相对于最常用的现有启动子而言提高编码要产生的多肽的基因或核酸序列的表达水平。而且本申请人同时已经成功地制得各种各样的启动子，以便能够按照本申请设想的用途及其实现环境选择适宜于使用、并因此使得能够以某种方式控制待表达的、编码需要产生的多肽的待表达基因的表达水平的启动子。应用这一原理的一个实例是使用本发明较弱的启动子之一，以指导和/或控制蛋白或酶的表达，所述蛋白或酶例如为用于植物选择的因子，例如对抗生素或除草剂的抗性，或例如装配更重要的蛋白所需的辅酶或辅因子；并且使用按照本发明的一种较强的启动子，例如以控制具有治疗效应的多肽的表达。
本发明的再一优点是，按照本发明制备的启动子既允许在种子中进行特异性表达，又允许进行去调节，以便适合在其它器官例如叶、茎和植物维管系统中的表达，因此，本发明的一个主要的主题是嵌合启动子，所述嵌合启动子包含至少一个衍生自高分子量小麦麦谷蛋白编码基因的核酸序列，最好是衍生自编码高分子量小麦麦谷蛋白的小麦Dx5或Bx7基因的核酸序列。
优选所述嵌合启动子包含至少一个衍生自高分子量小麦麦谷蛋白编码基因、序列鉴定号为SEQ.ID01的核酸序列。
更优选衍生自高分子量小麦麦谷蛋白的编码基因的核酸序列对应于选自以下的序列鉴定号的序列SEQ.ID02、SEQ.ID03、SEQ.ID04、SEQ.ID05、SEQ.ID06、SEQ.ID07、SEQ.ID08、SEQ.ID09、SEQ.ID10、SEQ.ID11、SEQ.ID12、SEQ.ID13、SEQ.ID16、SEQ.ID17、SEQ.ID18、SEQ.ID19、SEQ.ID20、SEQ.ID21和SEQ.ID22。
另外，本申请人注意到，有可能通过采用衍生自以上限定的高分子量小麦麦谷蛋白编码基因的核酸序列，将一定数目的调节或功能框组合，构建启动子，特别是在双子叶植物和单子叶植物中均具有有利启动子活性的植物启动子。
因此，本发明的另一个主题是嵌合表达启动子，它包含一段衍生自高分子量小麦麦谷蛋白编码基因的核酸序列，并且它在3’位置包含一个“TATA”框和一个转录起始位点(+1)。
优选所述启动子也包含至少一个在所述“TATA”框和所述转录起始位点(+1)上游5’位置中功能性连接的“增强子”框。
更优选所述启动子也包含至少一个在所述“增强子”框上游5’位置中功能性连接的“G样”框。
甚至更优选所述启动子也包含至少一个在所述“增强子”框上游5’位置中功能性连接的“P样”框。
有利的是，所述启动子也包含至少一个在至少所述“增强子”框上游5’位置中功能性连接的“GATA”框。
优选所述启动子也包含至少一个在所述“增强子”框上游5’位置中功能性连接的禾谷类框。
甚至更优选所述启动子在所述“增强子”框上游5’位置中也包含两个连续的功能性连接的禾谷类框。
按照本发明启动子的一个优选实施方案，它们也包含在所述转录起始位点上游5’位置中功能性连接的至少一个“as1”框或至少一个“as2”框、或一个“as1/as2”或“as2/as1”的框组合或这些框的重复排列(repeat permutation)。
按照本发明的另一个优选实施方案，所述“as1”框、“as2”框、“as1/as2”或“as2/as1”框组合或它(它们)的重复排列功能性地连接于所述增强子框下游3’位置中。
按照本发明的再一优选实施方案，所述启动子也包含一个功能性连接于所述“增强子”框上游的“GC”框。
特别优选所述启动子包含两个在所述“增强子[lacuna]”框上游5’位置中功能性连接的“禾谷类”框，而所述“增强子[lacuna]”框本身功能性连接于“as2/as1”框上游5’位置中。
按照本发明启动子的再一个优选实施方案，它们包含至少一个以反向功能性连接和/或在所述转录起始位点下游3’位置中功能性连接的选自以下组的元件“增强子”框、“G样”框、“P样”框、“GATA”框、“禾谷类”框、任选重复的“as1”框、“as2”框和/或“as1/as2”或“as2/as1”框组合以及“富GC”框。
最后，按照本发明的嵌合启动子有利地包含至少一个选自以下的核酸序列SEQ.ID02、SEQ.ID03、SEQ.ID04、SEQ.ID05、SEQ.ID06、SEQ.ID07、SEQ.ID08、SEQ.ID09、SEQ.ID10、SEQ.ID11、SEQ.ID12、SEQ.ID13、SEQ.ID16、SEQ.ID17、SEQ.ID18、SEQ.ID19、SEQ.ID20、SEQ.ID21和SEQ.ID22。
本发明再一主题是表达盒，所述表达盒包含至少一个启动子核酸序列，所述启动子核酸序列衍生自高分子量小麦麦谷蛋白的编码基因，并且以功能方式与待表达的、编码所要产生的多肽的核酸序列连接，而所述核酸序列本身连接于一个转录终止核酸序列。
优选该表达盒包含至少一个衍生自序列鉴定号为SEQ.ID01的高分子量小麦麦谷蛋白编码基因的启动子核酸序列。
甚至更优选所述表达盒包含至少一个衍生自高分子量小麦麦谷蛋白的编码基因、选自以下序列鉴定号的启动子核酸序列SEQ.ID02、SEQ.ID03、SEQ.ID04、SEQ.ID05、SEQ.ID06、SEQ.ID07、SEQ.ID08、SEQ.ID09、SEQ.ID10、SEQ.ID11、SEQ.ID12、SEQ.ID13、SEQ.ID16、SEQ.ID17、SEQ.ID18、SEQ.ID19、SEQ.ID20、SEQ.ID21和SEQ.ID22。
本发明的另一主题是分离的启动子核酸序列，其特征在于，它对应于衍生自序列鉴定号为SEQ.ID01的一段序列。
优选所述分离的启动子核酸序列对应于选自以下序列鉴定号的序列SEQ.ID02、SEQ.ID03、SEQ.ID04、SEQ.ID05、SEQ.ID06、SEQ.ID07、SEQ.ID08、SEQ.ID09、SEQ.ID10、SEQ.ID11、SEQ.ID12、SEQ.ID13、SEQ.ID16、SEQ.ID17、SEQ.ID18、SEQ.ID19、SEQ.ID20、SEQ.ID21和SEQ.ID22。
本发明的另一主题是包含启动子或启动子核酸序列的载体，所述启动子或启动子核酸序列能够启动编码要产生的多肽的核酸序列的转录，所述载体的特征在于，所述启动子或所述启动子核酸序列对应于如上限定的嵌合启动子或启动子核酸序列。
优选所述载体选自鉴定号为pMRT1207、pMRT1177、pMRT1178、pMRT1179、pMRT1180和pMRT1181的双元载体。
本发明的再一主题是转基因植物，所述转基因植物已经在其基因组中稳定整合了至少一个启动子或至少一个如上限定的启动子核酸序列。
最好是所述转基因植物选自双子叶植物物种，例如马铃薯、烟草、棉花、莴苣、番茄、甜瓜、黄瓜、豌豆、油料种子、甜菜或向日葵；或单子叶植物物种，例如小麦、大麦、燕麦、水稻或玉米。
本发明的另一主题是如上限定的转基因植物的繁殖体，该繁殖体最好是种子。
本发明的再一主题是含有如上限定的启动子或启动子核酸序列的细胞，所述细胞最好是植物细胞。
在本发明的优选主题中，还有在细胞中表达编码待产生的多肽的核酸序列或基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤-用包含如上限定的至少一个启动子或至少一个启动子核酸序列的载体转化所述细胞；-在允许编码所述多肽的核酸序列或基因表达的条件下制备所述细胞的培养物。
最好是，待产生的所述多肽是酶或蛋白，或是蛋白的衍生物，它在体外和/或人体内和/或动物体内有活性，所述活性包括消化活性、胰腺活性、胆汁活性、抗病毒活性、抗炎活性、肺部活性、抗微生物活性、营养活性、化妆品活性和结构活性、在血液、心血管、眼、抗原性和免疫刺激活性方面的活性、以及在脑中的活性。这类蛋白的实例是例如胰岛素、干扰素、胃、胰腺或胆汁脂酶、弹性蛋白酶、诸如α-1抗胰蛋白酶的抗蛋白酶、诸如胶原蛋白的结构形成蛋白、诸如乳铁蛋白的运铁蛋白、血液衍生蛋白诸如人血红蛋白或人白蛋白、和血液辅因子，以及诸如超氧化物歧化酶的抗氧化剂。
优选用于该方法中的所述细胞是原核细胞或真核细胞。
甚至更优选所述细胞是选自微生物细胞、真菌细胞、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞的细胞，甚至更优选是植物细胞。
最后，本发明的另一主题是获得如上限定的转基因植物或繁殖体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤-用包含如上限定的至少一个启动子或至少一个启动子核酸序列的载体转化植物细胞；-选择整合了所述启动子或启动子核酸序列的植物细胞；-或者在培养物中，或者通过再生嵌合的或转基因的整株植株，繁殖所述经转化并经选择的植物细胞。
在


图1中，它们是包含始于完整启动子的一系列缺失的构建体，所述启动子源自小麦并且编码一种高分子量小麦麦谷蛋白的Dx5基因；和包含元件重复序列的一系列构建体，所述元件包含与一个“G样”框结合的一个“增强子”框。
-图2图解说明按照本发明的其它合成和嵌合的启动子的构建体，含有包含混合“as2/as1”框的调节和/或功能元件的插入；-图3图解说明按照本发明的其它合成和嵌合的启动子的构建体，含有包含混合“as2/as2/as1”框的调节和/或功能元件的插入；-图4图解说明按照本发明的其它合成和嵌合的启动子的构建体，含有包含单独的或结合“as2/as1”框的混合“禾谷类”框的调节和/或功能元件的插入和一种包含“富GC”框的构建物，所述“禾谷类”框源自编码高分子量小麦麦谷蛋白的Bx7基因；-图5代表已经用载体转化并且在组织化学分析后的烟草叶照片，所述载体含有功能性连接于GUS(β-葡糖醛酸糖苷酶)编码基因的上述启动子或[lacuna]核酸序列，蓝色斑点显示存在用所述构建体转化的细胞，并且因此显示存在所述启动子的活性；-图6和图7是在玉米胚乳中瞬时表达后与各种构建体相关的启动子活性比较的图。轰击后3天，研磨所述胚乳，然后通过离心澄清粗提取物。通过发光术对一等份粗提取物测量β-葡糖醛酸糖苷酶活性和萤光素酶活性，然后确定GUS活性/LUC活性之比。直方图对应于相同构建体的平均比率+/-平均标准误(SEM)。
-图8显示在传粉后30天(30 DAP)玉米胚乳中稳定表达中MPr1139、MPr1200和MPr1131的启动子活性与512γ-玉米醇溶蛋白启动子活性比较的图。分别通过发光术和光谱测定法，测定β-葡糖醛酸糖苷酶活性和蛋白总量。直方图对应于每株植株的逐粒种子测定的GUS活性/总蛋白的平均比率+/-平均标准误。标明了每个转化体的名称。
-图9显示在玉米胚乳的稳定表达中由启动子MPr1139控制的时间(temporal)β-葡糖醛酸糖苷酶活性。通过发光术和光谱测定法，测定β-葡糖醛酸糖苷酶活性和蛋白总量。直方图对应于植株151.C1不同发育阶段的逐粒种子测定的GUS活性/总蛋白的平均比率+/-平均标准误。
-
图10a显示13 DAP时一粒玉米种子的纵向切片，
图10b显示20 DAP时一粒玉米种子的纵向切片，而
图10c是一粒解剖的玉米种子的顶部平面图。所有图表明在玉米种子的稳定表达中通过组织化学染色(蓝色)显现的在启动子MPr1139控制下的β-葡糖醛酸糖苷酶活性，而字母表示如下E(胚)；Em(胚乳)；AC(糊粉细胞)；P(粒壳)。
-
图11显示一曲线图，比较传粉后18天(18 DAP)时第一代玉米种子(T1)与第二代转基因玉米种子(T2)中的MPr1139启动子活性。分别通过发光术和光谱测定法，测定β-葡糖醛酸糖苷酶活性和蛋白总量。直方图对应于每株植株逐粒种子测定的GUS活性/总蛋白的平均比率+/-平均标准误。标明了每个转化体的名称。
-
图12显示一曲线图，比较了在温室适应后3周玉米叶片的稳定表达中MPr1139、MPr1200和MPr1131的启动子活性与512γ-玉米醇溶蛋白启动子的活性。分别通过发光术和光谱测定法，测定β-葡糖醛酸糖苷酶活性和蛋白总量。直方图对应于在不同玉米叶片的叶片中测定的GUS活性/总蛋白的比率。标明了每个转化体的名称。
-
图13显示一曲线图，比较了在温室适应后发育11周阶段时烟草叶片的稳定表达中MPr1130、MPr1131、MPr1135、MPr1138和MPr1139的启动子活性与参比启动子CaMV D35S和HMWG-Dx5的启动子活性。分别通过发光术和光谱测定法，测定β-葡糖醛酸糖苷酶活性和蛋白总量。直方图对应于在不同烟草植物的叶片中测定的GUS活性/总蛋白的比率。
-
图14显示一曲线图，比较了在第一代成熟烟草种子的稳定表达中MPr1130、MPr1131、MPr1135、MPr1138和MPr1139的启动子活性promotrice与参比启动子CaMV D35S的启动子活性。分别通过发光术和光谱测定法，测定β-葡糖醛酸糖苷酶活性和蛋白总量。直方图对应于在不同烟草植物的种子中测定的GUS活性/总蛋白的比率。
在以下详细描述中，按照供应商New England Biolabs的建议，进行用限制性酶和DNA修饰酶进行的酶处理。借助于“QIAquick PCRPurification”(QIAGEN)或“Concert Rapid PCR纯化系统”(GIBCOBRL Life Technologies)或如有具体说明，借助于“QIAquick凝胶提取系统”(QIAGEN)或“Concert Rapid凝胶提取系统”(GIBCO BRL LifeTechnologies)试剂盒，按照生产商的说明，在每种酶处理后，系统纯化所述DNA。所用的“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪由PerkinElmer Applied Biosystems出售。
实施例实施例1用于比较的构建体(对照)为了能够比较本专利中描述的嵌合启动子，将编码b-葡糖醛酸糖苷酶(Jefferson等，1986)、含有马铃薯patatin基因ST-LS1的内含子IV2的序列(Vancanneyt等，1990)的uidA基因(uidA-IV2)置于Promega Corp.(Madison，USA)出售的质粒pGEM3Z中所述参比启动子之一和根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的胭脂碱合酶基因终止子(term-nos)的控制之下。
1.1.阴性对照pMRT1144的构建缺乏任何启动子序列的质粒pMRT1144用作阴性对照。它衍生自质粒pGEM3Z，在其中已经引入了序列“uidA-IV2/term-nos”。
首先，5μg质粒pBI221(Clonetech，CA，USA)用限制性酶EcoRI和BamHI于37℃消化1小时。然后借助于“QIAquick凝胶提取”试剂盒，在0.8％琼脂糖凝胶上分离在胭脂碱合酶终止子控制下的uidA序列。
在平行实验中，5μg质粒pGEM3Z用限制性酶对EcoRI和BamHI于37℃消化1小时。然后借助于“QIAquick凝胶提取”试剂盒，在0.8％琼脂糖凝胶上分离所述载体片段，然后用40U牛小肠碱性磷酸酶(New England Biolabs)在缓冲液3(1X)存在下于37℃去磷酸化1小时。
在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中，在T4DNA连接酶缓冲液(1X)和400单位T4DNA连接酶(New England Biolabs)存在下，用如此处理的50ng“uidA-IV2/term-nos”片段和100ng质粒pGem3Z在10μl反应混合物中进行连接反应。该反应由10℃30秒的一个循环和200个相同的循环构成，所述每个相同的循环由以下步骤组成30℃30秒、10℃30秒和30℃30秒。用所有所述连接反应混合物转化已经预先制成感受态的大肠杆菌DH5a细菌。通过在补充氨苄青霉素(50mg/l)的Luria-Bertani培养基(LB，10g/l细菌培养用胰胨、5g/l酵母提取物、10g/lNaCl，pH7.2和15g/l琼脂)上选择而获得的克隆的质粒DNA，按照碱裂解法(Bimboim和Doly，1983)进行提取，并用酶促消化进行分析。所得的质粒称为pGEM3Z/uidA/term-nos。
其次，为了将马铃薯patatin基因的192bp内含子IV2插入pGEM3Z/uidA/term-nos的uidA编码序列中，切下该基因的内部部分(710 bp SnaBI/BstBI片段)，然后用含内含子IV2的等同序列(902 bpSnaBI/BstBI片段)取代。
为了完成这一步，10μg质粒pGEM3Z/uidA/term-nos用SnaBI(位于uidA基因的ATG起始密码子下游位置+383bp的限制位点)于37℃消化1小时，然后用BstBI(位于位置+1093bp的位点)于65℃消化1小时。借助于“QIAquick凝胶提取”试剂盒，在0.8％琼脂糖凝胶上分离由此缺失所述710bp片段的质粒，然后用40U牛小肠碱性磷酸酶(New England Biolabs)在缓冲液3(1X)存在下于37℃去磷酸化1小时。
通过用限制性酶SnaBI(位于uidA基因的ATG起始密码子下游位置+383bp的限制位点)将10μg质粒p35S GUS INT(Vancanneyt等，1990)于37℃消化1小时，然后用限制性酶BstBI(位于位置+1285bp的位点)于37℃消化1小时，获得对应于内含子IV2序列后接uidA序列的902bp BstBI/SnaBI片段。然后借助于“Concert Rapid凝胶提取系统”试剂盒，在1％琼脂糖凝胶上分离所述902bp片段。
如上所述，在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中，在T4DNA连接酶缓冲液(1X)和400单位T4 DNA连接酶(New EnglandBiolabs)存在下，用如此处理的100ng载体pGEM3Z/uidA/term-nos片段和50ng所述902bp BstBI/SnaBI片段在10μl反应混合物中进行连接反应。用所有所述连接反应混合物转化已经预先制成感受态的大肠杆菌DH5a细菌。通过在补充氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选择而获得的克隆的质粒DNA，按照碱裂解法进行提取，并用酶促消化进行分析。所得的质粒称为pMRT1144。
1.2.阳性对照pMRT1218的构建为了具有玉米胚乳SN 87 165(L2)中的启动子的参比序列，将Reina等(1990)描述的质粒p63中含有的1.7kb完整的g-玉米醇溶蛋白启动子(Prg-zein)置于序列uidA-IV2/term-nos的上游。
通过用限制性酶HindIII和BamHI将15μg质粒p63于37℃消化1小时，获得1.7 kb g-玉米醇溶蛋白启动子。借助于“Concert Rapid凝胶提取系统”试剂盒，在0.8％琼脂糖凝胶上分离由此释放的1.7kbPrg-zein片段。
在平行实验中，也用限制性酶HindIII和BamHI将10μg质粒pMRT1126(描述于实施例3的3.4一节)于37℃消化1小时。然后借助于“Concert Rapid凝胶提取系统”试剂盒，在0.8％琼脂糖凝胶上分离所述载体片段，然后用40 U牛小肠碱性磷酸酶(New EnglandBiolabs)在缓冲液3(1X)存在下于37℃去磷酸化1小时。
如上所还，在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中，在T4DNA连接酶缓冲液(1X)和400单位T4 DNA连接酶(New EnglandBiolabs)存在下，用如此处理的50ng g-玉米醇溶蛋白启动子片段和100ng质粒pMRT1126在10μl反应混合物中进行连接反应。用所有所述连接反应混合物转化已经预先制成感受态的大肠杆菌DH5a细菌。通过在补充氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选择而获得的克隆的质粒DNA，按照碱裂解法进行提取，并用酶促消化进行分析。所得的质粒称为pMRT1218。
1.3.阳性对照pMRT1092的构建为了具有烟草(Nicotiana tabacum L.，PBD6栽培品种)光合作用组织中的启动子的参比序列，将花椰菜花叶病毒的双35S启动子(CaMVPrD35S)置于序列uidA-IV2/term-nos的上游。
首先，如1.1一节中所述，将马铃薯patatin基因的192bp内含子IV2插入uidA编码序列的位置+383bp。为了做到这一点，1μg质粒pBI221(Clontech，CA，USA)用SnaBI于37℃消化1小时30分钟，然后用BstBI于65℃消化1小时30分钟。在0.8％琼脂糖凝胶上分离缺乏710bp片段的质粒，然后在Qiaquick亲和柱上纯化。在T4 DNA连接酶缓冲液(1X)和400单位T4 DNA连接酶(New England Biolabs)存在下，用20ng量的BstBI/SnaBI pBI221载体和80ng如上所述源自p35SGUS INT的902bp BstBI/SnaBI片段在10μl反应混合物中于18℃连接过夜。用一半的所述连接反应混合物转化已经预先制成感受态的大肠杆菌DH5a细菌。通过在补充氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选择而获得的克隆的DNA，按照碱裂解法进行提取，并用酶促消化进行分析。所得的质粒称为pBI221/uidA-IV2。
其次，用序列“CaMV PrD35S”取代质粒pBI221/uidA-IV2中存在的CaMV 35S启动子序列。质粒pBI221/uidA-IV2用HindIII于37℃小时消化10小时30分钟，然后用Klenow片段(New England Biolabs)于37℃处理30分钟，将粘性末端制成平端。然后该反应产物用BamHI于37℃消化过夜。在0.8％琼脂糖凝胶上分离对应于缺失828bp CaMV35S启动子片段的载体的质粒DNA片段，然后在Qiaquick亲和柱上纯化。
在平行实验中，由质粒pJIT163D中获得CaMV D35S启动子。该质粒衍生自质粒pJIT163，质粒pJIT163本身衍生自质粒pJIT160(Guérineau和Mullineaux，1993)。质粒pJIT163在多接头的HindIII和SalI位点之间具有一个ATG密码子。为了缺失该ATG，并获得质粒pJIT163D，pJIT163质粒DNA用HindIII和SalI消化，在0.8％琼脂糖凝胶上纯化，电洗脱，在1/10体积的3M乙酸钠pH4.8和2.5体积无水乙醇存在下于-80℃下沉淀30分钟，将其于12,000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥，经过Klenow片段(New England Biolabs)于37℃作用30分钟，通过用1体积苯酚抽提、然后用1体积苯酚/氯仿/异戊醇(25/24/1v/v/v)抽提，最后用1体积氯仿/异戊醇(24/1v/v)抽提而去蛋白，在1/10体积3M乙酸钠pH4.8和2.5体积无水乙醇存在下于-80℃进行沉淀30分钟，然后将其于12,000g离心30分钟，用70％乙醇洗涤，干燥，最后在T4 DNA连接酶缓冲液(1X)和2.5单位T4 DNA连接酶(Amersham)存在下于14℃连接16小时。转化已经预先制成感受态的大肠杆菌DH5a细菌。通过在补充氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选择而获得的克隆的质粒DNA，按照碱裂解法进行提取，并用酶促消化进行分析。接着，将10μg质粒pJIT163D用KpnI(位于该启动子5’的位点)于37℃消化10小时30分钟，然后用6单位T4 DNA聚合酶(New England Biolabs)于37℃处理30分钟，将粘性末端制成平端。然后该反应产物用BamHI于37℃消化过夜。在1％琼脂糖凝胶上分离所产生的对应于CaMV D35S启动子的761bp DNA片段，然后在Qiaquick亲和柱上纯化。在T4 DNA连接酶缓冲液(1X)和400单位T4 DNA连接酶(New England Biolabs)存在下，用10ng的质粒载体和100ng所述761bp片段在10μl反应混合物中于18℃连接过夜。用一半的所述连接反应混合物转化已经预先制成感受态的大肠杆菌DH5a细菌。通过在补充氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选择而获得的克隆的质粒DNA，按照碱裂解法进行提取，并用酶促消化进行分析。所得的质粒称为pMRT1092。
1.3.参比质粒pCaMV35Sluc的描述在瞬时表达中用作内部参比的质粒是pCaMV35Sluc(Torrent等，1997)，它含有在CaMV 35S启动子和RNA终止子控制下的萤光素酶(luc)报道基因的表达盒。
实施例2.
含有高分子量小麦麦谷蛋白基因的完整启动子序列和缺失或重复启动子序列的质粒的构建六倍体普通小麦Cheyenne栽培品种(Triticum aestivum L.cvCheyenne)的编码Dx5亚基(也称为GluD1-1b)的高分子量麦谷蛋白基因的完整启动子(PrHMWG-Dx5(SEQ.ID01))(Anderson等，1989)，对应于范围为位置-378bp至位置+39bp的417bp序列(登录号X12928)，在该序列上鉴定了不同的潜在调节序列，将其相对于+1的转录起始点以5’一侧向3’一侧列出(图I)-一个谷醇溶蛋白“样”框，从位置-357延伸至位置-350bp，-两个GATA框，从位置-309延伸至位置-306bp，以及从位置-292延伸至位置-289bp，-一个谷醇溶蛋白“样”框，从位置-252延伸至位置-246bp，-一个8bp“G样”框，从位置-218延伸至位置-211bp，-一个38bp激活元件，从位置-186延伸至位置-149bp，由推定的顺式激活基序的嵌合体组成·一个谷醇溶蛋白框，从位置-182延伸至位置-176bp，·一个具有不完全对称性的序列，从位置-178延伸至位置-161bp，·在位置-176和-163bp之间的一个五核苷酸GCTCC的正向重复序列，·一个“E”框，从位置-172延伸至位置-167[lacuna]，·在位置-169和-158bp之间的一个五核苷酸TTGCT的正向重复序列，-一个“TATA”框，从位置-30至-24具有共有序列TATAAAA[lacuna]，-+1转录起始点(位置1)，-一个5’非翻译区，范围为从位置+1至位置+39bp。
为了研究上述各种推定的顺式激活元件的作用，对HMWG-Dx5启动子(SEQ.ID01)进行详细的功能分析。将uidA-IV2报道基因置于完整的HMWG-Dx5启动子(SEQ.ID01)的控制之下以及置于合成HMWG-Dx5(SEQ.ID01)启动子的控制之下，所述合成HMWG-Dx5(SEQ.ID01)启动子或者具有越来越多的5’区缺失、或内部缺失或一个内部部分的重复。
2.1.质粒pMRT1125的构建质粒pMRT1125是将所述高分子量麦谷蛋白基因(PrHMWG-Dx5(SEQ.ID01)，图I)的完整启动子克隆在uidA-IV2报道基因上游的结果，并且构建在该专利中描述的所有合成HMWG-Dx5(SEQ.ID01)启动子的参比构建体。通过按照常规克隆技术将表达盒“PrHMWG-Dx5(SEQ.ID01)/uidA/term-nos”引入到pUC19质粒(Stratagene)中，获得由Anderson等描述的HMWG-Dx5启动子(SEQ.ID01)。将10μg所得的质粒(pPUC19-HMWG)用EcoRI于37℃水解1小时，然后在dNTPs各60nmol、12μl 500mM Tris-HCl，pH7.5/500mM MgCl2缓冲液和6μl 1M二硫苏糖醇(DTT)存在下，用20 U Klenow片段(New EnglandBiolabs)于37℃作用30分钟。然后所述DNA用BamHI于37℃消化1小时，借助于“QIAquick凝胶提取”试剂盒，在1.5％琼脂糖凝胶上分离由此释放和处理的HMWG-Dx5启动子片段(SEQ.ID01)。
在平行实验中，由质粒pMRT1097(未公布的法国专利申请FR9903635)制备所述载体片段。将20μg质粒pMRT1097用SphI于37℃消化1小时，并且用6单位T4 DNA聚合酶(New England Biolabs)于37℃处理30分钟，将如此线性化的载体pMRT1097的粘性末端制成平端。然后该反应产物用BamHI水解，借助于“QIAquick凝胶提取”试剂盒，在0.8％琼脂糖凝胶上分离所述载体片段，然后40U牛小肠碱性磷酸酶(New England Biolabs)在缓冲液3(1X)存在下，于37℃去磷酸化1小时。所得的克隆载体称为pGEM3Z-1。
在T4 DNA连接酶缓冲液(1X)和400单位T4 DNA连接酶(NewEngland Biolabs)存在下，用100ng如此处理的HMWG-Dx5启动子片段(SEQ.ID01)和50ng质粒pGem3Z-1在10μl反应混合物中于16℃连接过夜。用所有的所述连接反应混合物转化已经预先制成感受态的大肠杆菌DH5a细菌。通过在补充氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选择而获得的克隆的质粒DNA，按照碱裂解法进行提取，并用酶促消化进行分析。
所获得的质粒称为pMRT1125，并且通过测序确证了HMWG-Dx5启动子(SEQ.ID01)(在
图1中用图显示)。
2.2.MPr1128启动子的构建通过缺失位于核苷酸-238上游的序列，该序列包含两个谷醇溶蛋白“样”框和所述两个GATA框，从PrHMWG-Dx5(SEQ.ID01)衍生MPR1128启动子(SEQ.ID04)。在dNTPs各50nmol、Vent DNA聚合酶缓冲液(1X)和2U Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)存在下，借助于两种寡脱氧核苷酸-含有EcoRI限制位点的5’ATCGGAATTCCAGAACTAGGATTACGCCG 3’和具有BamHI限制位点的5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’各100pmol，通过PCR从5ng pMRT1125基质DNA(描述于实施例2的2.1一节)扩增所述启动子片段。在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中，进行所述PCR扩增反应。在于94℃变性5分钟后，所述DNA经过30个循环，每个循环由以下步骤组成于94℃变性1分钟，于50℃杂交1分钟和于72℃延伸1分钟30秒。在最后一个循环中，延伸反应于72℃继续进行5分钟。借助于“QIAquick凝胶提取”试剂盒，在1.5％琼脂糖凝胶上分离衍生自该扩增的DNA片段，用EcoRI于37℃水解1小时，并且在dNTPs各60nmol、12μl 500mMTris-HCl，pH7.5/500mM MgCl2缓冲液和6μl 1M DTT存在下，用20UKlenow片段(New England Biolabs)于37℃作用30分钟。然后将如此处理的DNA用BamHI于37℃消化1小时。
在T4 DNA连接酶缓冲液(1X)和400单位T4 DNA连接酶(NewEngland Biolabs)存在下，用100ng如此处理的MPR1128启动子片段(SEQ.ID04)和50ng质粒pGEM3Z-1(描述于实施例2的2.1一节)在10μl反应混合物中于16℃连接过夜。用所有的所述连接反应混合物转化已经预先制成感受态的大肠杆菌DH5a细菌。通过在补充氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选择而获得的克隆的质粒DNA，按照碱裂解法进行提取，并用酶促消化进行分析。
所获得的质粒称为pMRT1128，并且通过测序确证了在图I中图示的MPR1128启动子序列(SEQ.ID04)。
2.3.MPr1127启动子(SEQ.ID03)的构建通过缺失位于核苷酸-205上游的序列，该序列包含两个谷醇溶蛋白“样”框和所述两个GATA框以及“G”框，从HMWG-Dx5启动子(SEQ.ID01)衍生MPr1127启动子(SEQ.ID03)。以与MPR1128启动子(SEQ.ID04)相同的方式(描述于实施例2的2.2一节)，通过PCR扩增和处理所述启动子片段，只是使用的两种寡脱氧核苷酸是含有EcoRI限制位点的5’ATCGGGAATTCGCAGACTGTCCAAAAATC 3’和具有BamHI限制位点的5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’。
所获得的质粒称为pMRT1127，并且通过测序确证了在图I中图示的MPr1127启动子序列(SEQ.ID03)。
2.4.MPr1126启动子(SEQ.ID02)的构建通过缺失位于核苷酸-142上游的序列，该序列包含两个谷醇溶蛋白“样”框、两个GATA框、“G”框和所述激活元件，从HMWG-Dx5启动子(SEQ.ID01)衍生MPr1126启动子(SEQ.ID02)。以与MPR1128启动子(SEQ.ID04)相同的方式(描述于实施例2的2.2一节)，通过PCR扩增和处理所述启动子片段，只是所使用的两种寡脱氧核苷酸是含有EcoRI限制位点的5’ATCGGAATTCGTGTTGGCAAACTGC 3’和具有BamHI限制位点的5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC3’。
所获得的质粒称为pMRT1126，并且通过测序确证了在图I中图示的MPr1126启动子序列(SEQ.ID02)。
2.5.MPr1183中间启动子的构建通过将XbaI限制位点插入MPR1128启动子(SEQ.ID04)(描述于实施例2的2.2一节)上游，得到MPr1183启动子。在dNTPs各50nmol、Vent DNA聚合酶缓冲液(1X)和2U Vent DNA聚合酶(NewEngland Biolabs)存在下，借助于两种寡脱氧核苷酸-含有EcoRI和XbaI限制位点的5’ATCggAATTCTAgACgCCgATTACgTggCTTTAgC 3’和具有BamHI限制位点的5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’各100pmol，通过PCR从5ng pMRT1128基质DNA扩增所述启动子片段。在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中进行PCR扩增反应。在于94℃变性5分钟后，所述DNA经过30个循环，每个循环由以下步骤组成于94℃变性1分钟，于50℃杂交1分钟和于72℃延伸1分钟30秒。在最后一个循环中，延伸反应于72℃继续进行5分钟。
借助于“Concert Rapid凝胶提取系统”试剂盒，在1.5％琼脂糖凝胶上分离衍生自该扩增的DNA片段，用EcoRI于37℃水解1小时，然后在dNTPs各60nmol、12μl 500mM Tris-HCl，pH7.5/500mMMgCl2缓冲液和6μl 1M DTT存在下，用20U Klenow片段(NeWEngland Biolabs)于37℃作用30分钟，并用BamHI于37℃消化1小时。
在T4 DNA连接酶缓冲液(1X)和400单位T4 DNA连接酶(NewEngland Biolabs)存在下，用100ng如此处理的MPR1128启动子片段和50ng质粒pGem3Z-1(描述于实施例2的2.1一节)在10μl反应混合物中于16℃连接过夜。用所有的所述连接反应混合物转化已经预先制成感受态的大肠杆菌DH5a细菌。通过在补充氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选择而获得的克隆的质粒DNA，在dNTPs各15nmol、Taq DNA聚合酶缓冲液(1X)、75nmol MgCl2和1.25U Taq DNA聚合酶(Promega Corp.)存在下，在50μl反应体积中，通过PCR借助于以下两种寡脱氧核苷酸各25pmol进行分析5’ATCggAATTCgCAgCCATggTCCTgAACC 3’和5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’。在“GeneAmpPCR系统9700”热循环仪中进行扩增反应。在于94℃变性3分钟后，所述DNA经过25个循环，每个循环由以下步骤组成于94℃变性30秒，于55℃杂交1分钟和于72℃延伸1分钟。在最后一个循环中，延伸反应于72℃继续进行5分钟。
所获得的质粒称为pMRT1183，并且通过测序确证了MPr1183启动子序列。
2.6.MPr1197启动子(SEQ.ID16)的构建通过缺失位于核苷酸-57bp上游的启动子序列，从MPr1183(描述于实施例2的2.5一节)衍生MPr1197启动子(SEQ.ID16)，构成本专利中研究的最小HMWG-Dx5(SEQ.ID01)启动子。
为了完成这一步，连续用XbaI和NcoI将5μg质粒pMRT1183于37℃消化1小时。借助于“Concert Rapid凝胶提取系统”试剂盒，在0.8％琼脂糖凝胶上分离由此缺失MPr1183启动子的XbaI/NcoI片段的载体pMRT1183，然后在dNTPs各60nmol、12μl 550mMTris-HCl，pH7.5/500mM MgCl2缓冲液和6μl 1M DTT存在下，用20UKlenow片段(New England Biolabs)于37℃作用30分钟。
如上所述，在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中，在T4DNA连接酶缓冲液(1X)和400单位T4 DNA连接酶(New EnglandBiolabs)存在下，用150ng如此修饰的质粒在10μl反应混合物中进行连接反应。用所有的所述连接反应混合物转化已经预先制成感受态的大肠杆菌DH5a细菌。通过在补充氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选择而获得的克隆的质粒DNA，按照碱裂解法进行提取，并通过酶消化进行确证。
所获得的质粒称为pMRT1197，在图I中图式说明了MPr1197启动子序列(SEQ.ID16)。
2.7.MPr1198启动子(SEQ.ID17)的构建通过缺失从位置-59延伸至位置-135bp的内部启动子序列，从MPR1128启动子(SEQ.ID04)(描述于实施例2的2.2一节)衍生MPr1198启动子(SEQ.ID17)，该序列缺乏以上鉴定的顺式激活元件。
在dNTPs各50nmol、Vent DNA聚合酶缓冲液(1X)和2U VentDNA聚合酶(NeW England Biolabs)存在下，借助于两种寡脱氧核苷酸-含有EcoRI和XbaI限制位点的5’ATCggAATTCTAgACgCCgATTACgTggCTTTAgC 3’和具有NcoI限制位点的5’CATgCCATggCCAACACAAAAgAAgCTgg 3’各100pmol，通过PCR从5ng pMRT1128基质DNA进行扩增一个片段，将所扩增的片段融合于pMRT1183(描述于实施例2的2.5一节)的NcoI限制位点，构建MPr1198启动子。在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中，进行PCR扩增反应。在于94℃变性10分钟后，所述DNA经过25个循环，每个循环由以下步骤组成于94℃变性1分钟，于55℃杂交1分钟和于72℃延伸1分钟30秒。在最后一个循环中，延伸反应于72℃继续进行5分钟。借助于“Concert Rapid凝胶提取系统”试剂盒，在1.5％琼脂糖凝胶上分离由所述扩增得到的DNA片段，将其连续用NcoI和XbaI于37℃水解1小时。
在平行实验中，通过缺失位于NcoI限制位点5’的MPr1183启动子区，由质粒pMRT1183制备所述载体片段。为了完成这一步，连续用XbaI和NcoI将5μg质粒pMRT1183于37℃消化1小时，借助于“Concert Rapid凝胶提取系统”试剂盒，在0.8％琼脂糖凝胶上分离pMRT1183的所述载体片段，然后在缓冲液3(1X)存在下，用40 U牛小肠碱性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃去磷酸化1小时。
如上所述，在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中，在T4DNA连接酶缓冲液(1X)和400单位T4 DNA连接酶(New EnglandBiolabs)存在下，用50ng所述启动子片段和100ng如此处理的质粒在10μl反应混合物中进行连接反应。用所有的所述连接反应混合物转化已经预先制成感受态的大肠杆菌DH5a细菌。通过在补充氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选择而获得的克隆的质粒DNA，按照碱裂解法进行提取，并用酶促消化进行分析。
所获得的质粒称为pMRT1198，通过测序确证了在图I中图示的MPr1198启动子序列(SEQ.ID17)。
2.8.MPr1216启动子(SEQ.ID21)的构建通过重复从核苷酸-225延伸至-136bp的序列，该序列包含所述“G”框和所述激活元件，从MPR1128(SEQ.ID04)(描述于实施例2的2.2一节)衍生MPr1216启动子(SEQ.ID21)。
该序列的构建通过在载体pGEM3Z-1(描述于实施例2的2.1一节)中克隆以下两种启动子片段来进行-“MPr1216(SEQ.ID21)5’片段”，该序列通过PCR合成，即在dNTPs各50nmol、Vent DNA聚合酶缓冲液(1X)和2U Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)存在下，借助于两种寡脱氧核苷酸-含有EcoRI限制位点的5’ATCggAATTCgCCgATTACgTggCTTTAgC 3’和具有XbaI限制位点的5’gCTCTAgACCAACACAAAAgAAgCTgg 3’各100pmol，通过PCR从5ng pMRT1128基质DNA进行扩增。PCR扩增反应在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中进行。在于94℃变性10分钟后，所述DNA经过25个循环，每个循环由以下步骤组成于94℃变性1分钟，于55℃杂交1分钟和于72℃延伸1分钟30秒。在最后一个循环中，延伸反应于72℃继续进行5分钟。借助于“Concert Rapid凝胶提取系统”试剂盒，在1.5％琼脂糖凝胶上分离由所述PCR扩增得到的DNA片段，将其用EcoRI于37℃水解1小时。在dNTPs各60nmol、12μl 500mM Tris-HCl，pH7.5/500mMMgCl2缓冲液和6μl1M DTT存在下，所述DNA片段用20U Klenow片段(New England Biolabs)于37℃作用30分钟，并用XbaI于37℃消化1小时。-“MPr1216(SEQ.ID21)3’片段”，借助于“Concert Rapid凝胶提取系统”试剂盒，在1.5％琼脂糖凝胶上分离用限制性酶XbaI和BamHI水解5μg质粒pMRT1183所获得的该片段。
如上所述，在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中，在T4DNA连接酶缓冲液(1X)和400单位T4 DNA连接酶(New EnglandBiolabs)存在下，用如此处理的50ng“MPr1216(SEQ.ID21)5’片段”和50ng“MPr1216(SEQ.ID21)3’片段”和50ng质粒pGem3Z-1在10μl反应混合物中进行连接反应。用所有的所述连接反应混合物转化已经预先制成感受态的大肠杆菌DH5a细菌。通过在补充氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选择而获得的克隆的质粒DNA，如上所述，在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中，借助于各10 pmol的两种寡脱氧核苷酸5’ATCggAATTCgCCgATTACgTggCTTTAgC 3’和5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’，通过PCR进行分析。
所获得的质粒称为pMRT1216，通过测序确证了在图I中图示的MPr1216启动子序列(SEQ.ID21)。
2.9.MPr1217启动子(SEQ.ID22)的构建通过正向重复三次从核苷酸-225延伸至-136bp的序列，该序列包含所述“G”框和所述激活元件，从MPR1128(SEQ.ID04)(描述于实施例2的2.2一节)衍生MPr1217启动子(SEQ.ID22)。
将通过在dNTPs各50nmol、Vent DNA聚合酶缓冲液(1X)和2UVent DNA聚合酶(New England Biolabs)存在下，借助于各100pml的两种寡脱氧核苷酸-含有EcoRI和XbaI限制位点的5’ATCggAATTCTAgACgCCgATTACgTggCTTTAgC 3’和具有XbaI限制位点的5’gCTCTAgACCAACACAAAAgAagCTgg 3’，通过PCR从5ng基质DNA合成的两个相同的启动子片段，插入pMRT1183(描述于实施例2的2.5一节)的XbaI限制位点中，构建MPr1217启动子(SEQ.ID22)。PCR扩增反应在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中进行。在于94℃变性10分钟后，所述DNA经过25个循环，每个循环由以下步骤组成于94℃变性1分钟30秒，于55℃杂交1分钟和于72℃延伸1分钟。在最后一个循环中，延伸反应于72℃继续进行5分钟。借助于“Concert Rapid凝胶提取系统”试剂盒，在1.5％琼脂糖凝胶上分离由所述PCR扩增得到的DNA片段，将其用XbaI于37℃水解1小时。
在平行实验中，通过于37℃对位于MPr1183 5’的XbaI限制位点酶促消化1小时，由10μg质粒pMRT1183制备所述载体片段。如此线性化的所述载体片段在缓冲液3(1X)存在下，用40U牛小肠碱性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃去磷酸化1小时。
如上所述，在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中，在1X T4DNA连接酶缓冲液(New England Biolabs)和400单位T4 DNA连接酶(New England Biolabs)存在下，用50ng启动子片段和100ng如此制备的载体片段在10μl反应混合物中进行连接反应。用所有的所述连接反应混合物转化已经预先制成感受态的大肠杆菌DH5a细菌。通过在补充氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选择而获得的克隆的质粒DNA，如上所述在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中，借助于各10pmol的两种寡脱氧核苷酸5’ATCggAATTCgCCgATTACgTggCTTTAgC 3’和5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’，通过PCR进行分析。
所获得的质粒称为pMRT1217，通过测序确证的在图I中图示的MPr1217启动子序列(SEQ.ID22)，在“G”样框上游4bp的位置-317[lacuna]缺失一个C。
实施例3含嵌合启动子序列的质粒的构建3.1.MPr1130启动子(SEQ.ID05)的构建通过在PrHMWG-Dx5(SEQ.ID01)的位置-65bp，插入对应于CaMV 35S的重复的as-2基序(Lam和Chua，1989)以及as-1基序(Lam等，1989)的55bp序列，产生MPr1130启动子(SEQ.ID05)。通过将经PCR合成的“MPr1130(SEQ.ID05)5’片段”和“MPr1130(SEQ.ID05)3’片段”重叠延伸而进行剪接，构建MPr1130启动子(SEQ.ID05)。
在dNTPs各10nmol、Vent DNA聚合酶缓冲液(1X)和2U VentDNA聚合酶(New England Biolabs)存在下，借助于各20pmol的两种寡脱氧核苷酸-含有EcoRI限制位点的5’TACgAATTCCCAgCTTTgAgTggCCgTAg 3’和具有对应于CaMV35S的重复的as-2基序(Lam和Chua，1989)以及as-1基序(Lam等，1989)的55 bp序列的5’TgCgTCATCCCTTACgTCAgTggAgATATCACATCAATCTTgATATCACATCAATCACggTgAggTTTgTTTAgCCTAAg 3’，通过PCR从5ng pUC19-HMWG基质DNA(描述于实施例2的2.1一节)在50μl反应体积中扩增“MPr1130(SEQ.ID05)5’片段”。PCR扩增反应在“GeneAmpPCR系统9700”热循环仪中进行。在于94℃变性5分钟后，所述DNA经过15个循环，每个循环由以下步骤组成于94℃变性1分钟，于55℃杂交1分钟和于72℃延伸1分钟30秒。在最后一个循环中，延伸反应于72℃继续进行5分钟。在dNTPs各20nmol存在下，40μl所述PCR反应介质然后经过12.5U Klenow片段(New England Biolabs)于37℃作用10分钟。借助于“QIAquick凝胶提取”试剂盒，在1.5％琼脂糖凝胶上分离如此处理的PCR产物。
以与“MPr1130(SEQ.ID05)5’片段”的相同方式，合成并处理“MPr1130(SEQ.ID05)3’片段”，只是所用的两种寡脱氧核苷酸是具有对应于CaMV 35S的重复的as-2基序(Lam和Chua，1989)以及as-1基序(Lam等，1989)的55bp序列的5’ATTgATgTgATATCAAgATTgATgTgATATCTCCACTgACgTAAgggATgACgCACACgCAgCCATggTCCTgAACCTTC 3’和含有BamHI限制位点的5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC3’。
然后通过重叠延伸，装配所述“MPr1130(SEQ.ID05)5’片段”和所述“MPr1130(SEQ.ID05)3’片段”，产生“MPr1130片段(SEQ.ID05)”。为了完成这一步，在dNTPs各10nmol、Vent DNA聚合酶缓冲液(1X)和2U Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)存在下，借助于各20pmol的寡脱氧核苷酸-含有EcoRI限制位点的5’TACgAATTCCCAgCTTTgAgTggCCgTAg 3’和具有BamHI限制位点的5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’，用各7.5μl的如此处理的所述两种PCR产物在50μl反应体积中，进行PCR扩增。PCR扩增反应在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中进行。在于94℃变性5分钟后，所述DNA经过15个循环，每个循环由以下步骤组成于94℃变性1分钟，于55℃杂交1分钟和于72℃延伸1分钟30秒。在最后一个循环中，延伸反应于72℃继续进行5分钟。借助于“QIAquick凝胶提取”试剂盒，在1.5％琼脂糖凝胶上分离如此合成的“MPr1130片段(SEQ.ID05)”。然后该片段用EcoRI于37℃水解1小时，并且在dNTPs各60nmol、12μl 500mM Tris-HCl，pH7.5/500mM MgCl2缓冲液和6μl 1M DTT存在下，用20U Klenow片段(New England Biolabs)于37℃作用30分钟。最后用BamHI于37℃消化MPr1130片段(SEQ.ID05)1小时。
在1μl T4 DNA连接酶缓冲液(1X)和400单位T4 DNA连接酶(New England Biolabs)存在下，用100ng如此处理的“MPr1130片段(SEQ.ID05)”和50ng质粒pGem3Z-1(描述于实施例2的2.1一节)在10μl反应混合物中，于16℃进行连接反应过夜。用所有的所述连接反应混合物转化已经预先制成感受态的大肠杆菌DH5a细菌。通过在补充氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选择而获得的克隆的质粒DNA，如上所述在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中，借助于各25pmol的两种寡脱氧核苷酸5’TACgAATTCCCAgCTTTgAgTggCCgTAg 3’和5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’，通过PCR进行分析。
所获得的质粒称为pMRT1130，通过测序确证了在图III中图示的MPr1130启动子序列(SEQ.ID05)。
3.2.MPr1131启动子(SEQ.ID06)的构建通过在PrHMWG-Dx5(SEQ.ID01)(描述于实施例2的2.1一节)的位置-65bp，插入对应于CaMV 35S的as-2基序(Lam和Chua，1989)以及as-1基序(Lam等，1989)的38bp序列，产生MPr1131启动子(SEQ.ID06)。通过将经PCR合成的“MPr1131(SEQ.ID06)5’片段”和“MPr1131(SEQ.ID06)3’片段”重叠延伸而进行剪接，构建MPr1131启动子(SEQ.ID06)。
以与“MPr1130(SEQ.ID05)5’片段”(描述于实施例3的3.1一节)相同的方式，合成并处理“MPr1131(SEQ.ID06)5’片段”，只是所用的两种寡脱氧核苷酸是含有EcoRI限制位点的5’TACgAATTCCCAgCTTTgAgTggCCgTAg 3’和具有对应于CaMV35S的as-2基序(Lam和Chua，1989)以及as-1基序(Lam等，1989)的38bp序列的5’TgCgTCATCCCTTACgTCAgTggAgATATCACATCAATCACggTgAggTTTgTTTAgCCTAAg 3’。
以与“MPr1130(SEQ.ID05)5’片段”(描述于实施例3的3.1一节)的相同方式，合成并处理“MPr1131(SEQ.ID06)3’片段”，只是所用的两种寡脱氧核苷酸是具有对应于CaMV 35S的as-2基序(Lam和Chua，1989)以及as-1基序(Lam等，1989)的38bp序列的5’ATTgATgTgATATCTCCACTgACgTAAgggATgACgCACACgCAgCCATggTCCTgAACCTTC 3’和含有BamHI限制位点的5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’。
然后通过重叠延伸，装配所述“MPr1131(SEQ.ID06)5’片段”和所述“MPr1131(SEQ.ID06)3’片段”，产生“MPr1131片段(SEQ.ID06)”。为了完成这一步，在dNTPs各10nmol、Vent DNA聚合酶缓冲液(1X)和2U Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)存在下，借助于各20pmol的寡脱氧核苷酸-含有EcoRI限制位点的5’TACgAATTCCCAgCTTTgAgTggCCgTAg 3’和具有BamHI限制位点的5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’，用各7.5μl的如此处理的所述两种PCR产物，在50μl反应体积中进行PCR扩增。PCR扩增反应在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中进行。在于94℃变性5分钟后，所述DNA经过15个循环，每个循环由以下步骤组成于94℃变性1分钟，于55℃杂交1分钟和于72℃延伸1分钟30秒。在最后一个循环中，延伸反应于72℃继续进行5分钟。借助于“QIAquick凝胶提取”试剂盒，在1.5％琼脂糖凝胶上分离如此合成的“MPr1131片段(SEQ.ID06)”。然后该片段用EcoRI于37℃水解1小时，并且在dNTPs各60nmol、12μl 500mM Tris-HCl，pH7.5/500mM MgCl2缓冲液和6μl 1M DTT存在下，用20UKlenow片段(New England Biolabs)于37℃作用30分钟。最后用BamHI于37℃消化MPr1131片段(SEQ.ID06)1小时。
在1μl T4 DNA连接酶缓冲液(1X)和400单位T4 DNA连接酶(New England Biolabs)存在下，用100ng如此处理的“MPr1130片段(SEQ.ID05)”和50ng质粒pGem3Z-1(描述于实施例2的2.1一节)在10μl反应混合物中，于16℃进行连接反应过夜。用所有的所述连接反应混合物转化已经预先制成感受态的大肠杆菌DH5a细菌。通过在补充氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选择而获得的克隆的质粒DNA，如上所述在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中，借助于各25 pmol的两种寡脱氧核苷酸5’TACgAATTCCCAgCTTTgAgTggCCgTAg 3’和5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’，通过PCR进行分析。
所获得的质粒称为pMRT1131，通过测序确证了在图II中图示的MPr1131启动子序列(SEQ.ID06)。
3.3.MPr1135启动子(SEQ.ID09)的构建通过缺失位于核苷酸-293上游的序列，该序列包含两个谷醇溶蛋白“样”框和两个GATA框，从MPr1130启动子(SEQ.ID05)(描述于实施例3的3.1一节)衍生MPr1135启动子(SEQ.ID09)。
在dNTPs各50nmol、Vent DNA聚合酶缓冲液(1X)和2U VentDNA聚合酶(New England Biolabs)存在下，借助于各100pmol的两种寡脱氧核苷酸-含有EcoRI限制位点的5’ATCGGAATTCCAGAACTAGGATTACGCCG 3’和具有BamHI限制位点的5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’，通过PCR从5ng pMRT1130基质DNA扩增所述启动子片段。PCR扩增反应在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中进行。在于94℃变性5分钟后，所述DNA经过25个循环，每个循环由以下步骤组成于94℃变性1分钟，于55℃杂交1分钟和于72℃延伸1分钟30秒。在最后一个循环中，延伸反应于72℃继续进行1分钟。
借助于“QIAquick凝胶提取”试剂盒，在2％琼脂糖凝胶上分离由所述扩增得到DNA片段，该片段用EcoRI于37℃水解1小时，然后在dNTPs各60nmol、12μl 500mM Tris-HCl，pH7.5/500mMMgCl2缓冲液和6μl 1M DTT存在下，用20U Klenow片段(NewEngland Biolabs)于37℃作用30分钟。然后，如此处理的DNA片段用BamHI于37℃消化1小时。
在T4 DNA连接酶缓冲液(1X)和400单位T4 DNA连接酶(NewEngland Biolabs)存在下，用100ng如此处理的MPR1135启动子片段(SEQ.ID09)和50ng质粒pGEM3Z-1(描述于实施例2的2.1一节)在10μl反应混合物中，于16℃进行连接反应过夜。用所有的所述连接反应混合物转化已经预先制成感受态的大肠杆菌DH5a细菌。通过在补充氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选择而获得的克隆的质粒DNA，如上所述在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中，借助于各25pmol的两种寡脱氧核苷酸5’ATCGGAATTCGTGTTGGCAAACTGC3’和5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTITgTggTgC 3’，通过PCR进行分析。
所获得的质粒称为pMRT1135，通过测序确证了在图III中图示的MPr1135启动子序列(SEQ.ID09)。
3.4.MPr1138启动子(SEQ.ID012)的构建通过缺失位于核苷酸-276上游的序列，该序列包含两个谷醇溶蛋白“样”框和两个GATA框，从MPr1131启动子(SEQ.ID06)(描述于实施例3的3.2一节)衍生MPr1138启动子(SEQ.ID12)。
以与MPr1135启动子(SEQ.ID09)(描述于实施例3的3.3一节)相同的方式，通过PCR从5ng pMRT1131基质DNA扩增、处理并获得所述启动子片段。
所获得的质粒称为pMRT1138，通过测序确证了在图II中图示的MPr1138启动子序列(SEQ.ID12)。
3.5.MPr1137启动子(SEQ.ID11)的构建通过缺失位于核苷酸-243上游的序列，该序列包含两个谷醇溶蛋白“样”框、两个GATA框和“G”样框，从MPr1131启动子(SEQ.ID06)(描述于实施例3的3.2一节)衍生MPr1137启动子(SEQ.ID11)。
以与MPr1135启动子(SEQ.ID09)(描述于实施例3的3.3一节)相同的方式，借助于各100pmol的两种寡脱氧核苷酸-含有EcoRI限制位点的5’ATCGGGAATTCGCAGACTGTCCAAAAATC 3’和具有BamHI限制位点的5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC3’，通过PCR从5ng pMRT1131基质DNA扩增、处理并获得所述启动子片段。
所获得的质粒称为pMRT1137，通过测序确证了在图II中图示的MPr1137启动子序列(SEQ.ID11)。
3.6.MPr1134启动子(SEQ.ID08)的构建通过缺失位于核苷酸-260上游的序列，该序列包含两个谷醇溶蛋白“样”框、两个GATA框和“G”样框，从MPr1130启动子(SEQ.ID05)(描述于实施例3的3.1一节)衍生MPr1134启动子(SEQ.ID08)。
以与MPr1135启动子(SEQ.ID09)(描述于实施例3的3.3一节)相同的方式，借助于各100pmol的两种寡脱氧核苷酸-含有EcoRI限制位点的5’ATCGGGAATTCGCAGACTGTCCAAAAATC 3’和具有BamHI限制位点的5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC3’，通过PCR从5ng pMRT1130基质DNA扩增、处理并获得所述启动子片段。
所获得的质粒称为pMRT1134，通过测序确证了在图III中图示的MPr1134启动子序列(SEQ.ID08)。
3.7.MPr1136启动子(SEQ.ID10)的构建通过缺失位于核苷酸-180上游的序列，该序列包含两个谷醇溶蛋白“样”框、两个GATA框、“G”样框和激活元件，从MPr1131启动子(SEQ.ID06)(描述于实施例3的3.2一节)衍生MPr1136启动子(SEQ.ID10)。
以与MPr1135启动子(SEQ.ID09)(描述于实施例3的3.3一节)相同的方式，借助于各100pmol的两种寡脱氧核苷酸-含有EcoRI限制位点的5’ATCGGAATTCGTGTTGGCAAACTGC 3’和具有BamHI限制位点的5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’，通过PCR从5ng pMRT1131基质DNA扩增、处理并获得所述启动子片段。
所获得的质粒称为pMRT1136，通过测序确证了在图II中图示的MPr1136启动子序列(SEQ.ID10)。
3.8.MPr1133启动子(SEQ.ID07)的构建通过缺失位于核苷酸-197上游的序列，该序列包含两个谷醇溶蛋白“样”框、两个GATA框、“G”样框和激活元件，从MPr1130启动子(SEQ.ID05)(描述于实施例3的3.2一节)衍生MPr1133启动子(SEQ.ID07)。
以与MPr1135启动子(SEQ.ID09)(描述于实施例3的3.3一节)相同的方式，借助于各100pmol的两种寡脱氧核苷酸-含有EcoRI限制位点的5’ATCGGAATTCGTGTTGGCAAACTGC 3’和具有BamHI限制位点的5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’，通过PCR从5ng pMRT1130基质DNA扩增、处理并获得所述启动子片段。
所获得的质粒称为pMRT1133，通过测序确证了在图III中图示的MPr1133启动子序列(SEQ.ID07)。
3.9.MPr1139启动子(SEQ.ID13)的构建通过在MPr1131(SEQ.ID06)(描述于实施例3的3.2一节)的位置-405bp，插入一段61bp的序列，该序列包括六倍体小麦普通小麦Cheyenne栽培品种的编码Bx7亚基的高分子量麦谷蛋白基因启动子(PrHMWG-Bx7)(Anderson等，1998)的“禾谷类”框的重复，产生MPr1139启动子(SEQ.ID13)。
在dNTPs各50nmol、Vent DNA聚合酶缓冲液(1X)和2U VentDNA聚合酶(New England Biolabs)存在下，借助于各100pmol的两种寡脱氧核苷酸-含有EcoRI限制位点和两个上述的“禾谷类”框的5’TACgAATTCCTCgACATggTTAgAAgTTTTgAgTgCCgCCACTACTCgACATggTTAgAAgTTTTgAgTggCCgTAgATTTgC 3’和具有BamHI限制位点的5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’，通过PCR从5ng pMRT1131基质DNA扩增MPr1139启动子(SEQ.ID13)。PCR扩增反应在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中进行。在于94℃变性5分钟后，所述DNA经过25个循环，每个循环由以下步骤组成于94℃变性1分钟，于55℃杂交1分钟和于72℃延伸1分钟30秒。在最后一个循环中，延伸反应于72℃继续进行1分钟。
借助于“QIAquick凝胶提取”试剂盒，在2％琼脂糖凝胶上分离由所述扩增得到DNA片段，该片段用EcoRI于37℃水解1小时。然后在dNTPs各60nmol、12μl 500mM Tris-HCl，pH7.5/500mMMgCl2缓冲液和6μl 1MDTT存在下，所述DNA片段用20UKlenow片段(New England Biolabs)于37℃作用30分钟，然后用BamHI于37℃消化1小时。
在T4 DNA连接酶缓冲液(1X)和400单位T4 DNA连接酶(NewEngland Biolabs)存在下，用100ng如此处理的MPr1139启动子片段(SEQ.ID13)和50ng质粒pGem3Z-1(描述于实施例2的2.1一节)在10μl反应混合物中，于16℃进行连接反应过夜。用所有的所述连接反应混合物转化已经预先制成感受态的大肠杆菌DH5a细菌。通过在补充氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选择而获得的克隆的质粒DNA，如上所述在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中，借助于各25pmol的两种寡脱氧核苷酸5’ATCGGAATTCCAGAACTAGGATTACGCCG 3’和5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’，通过PCR进行分析。
所获得的质粒称为pMRT1139，通过测序确证了在图IV中图示的MPr1139启动子序列(SEQ.ID13)。
3.10.MPr1200启动子(SEQ.ID19)的构建通过在MPr1138(SEQ.ID12)(描述于实施例3的3.4一节)的位置-263bp，插入一段79bp的序列，该序列包括六倍体小麦普通小麦Cheyenne栽培品种的编码Bx7亚基的高分子量麦谷蛋白基因启动子(PrHMWG-Bx7)(Anderson等，1998)的“禾谷类”框的重复，产生MPr1200启动子(SEQ.ID19)。
MPr1200启动子(SEQ.ID19)的构建通过在载体pGEM3Z-1(描述于实施例2的2.1一节)中克隆以下两种启动子片段来进行-“MPr1200(SEQ.ID19)5’片段”，该序列通过PCR合成，即在dNTPs各50nmol、Vent DNA聚合酶缓冲液(1X)和2U Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)存在下，借助于各100pmol的两种寡脱氧核苷酸-含有EcoRI限制位点的5’TACgAATTCCTCgACATgg 3’和具有XbaI限制位点的5’gCTCTAgAgCAAATCTACggCCACTC 3’，通过PCR从5ng pMRT1139基质DNA(描述于实施例3的3.9一节)进行扩增。PCR扩增反应在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中进行。在于94℃变性10分钟后，所述DNA经过25个循环，每个循环由以下步骤组成于94℃变性1分钟，于55℃杂交1分钟和于72℃延伸1分钟30秒。在最后一个循环中，延伸反应于72℃继续进行5分钟。借助于“Concert Rapid凝胶提取系统”试剂盒，在1.5％琼脂糖凝胶上分离由所述PCR扩增得到的DNA片段，将其用EcoRI于37℃水解1小时。在dNTPs各60nmol、12μl 500mM Tris-HCl，pH7.5/500mM MgCl2缓冲液和6μl 1M DTT存在下，所述DNA片段用20UKlenow片段(New England Biolabs)于37℃作用30分钟，然后用XbaI于37℃消化1小时。-“MPr1200(SEQ.ID19)3’片段”，该序列通过PCR合成，即在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中，在与“MPr1200(SEQ.ID19)5’片段”相同的条件下，在dNTPs各50nmol、Vent DNA聚合酶缓冲液(1X)和2U Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)存在下，借助于各100pmol的两种寡脱氧核苷酸-含有EcoRI限制位点和XbaI限制位点的5’ATCggAATTCTAgACgCCgATTACgTggCTTTAgC 3’和具有BamHI限制位点的5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’，通过PCR从5ng pMRT1138基质DNA进行扩增。借助于“Concert Rapid凝胶提取系统”试剂盒，在1.5％琼脂糖凝胶上分离由所述PCR扩增得到的DNA片段，将其连续用XbaI和BamHI于37℃水解1小时。
如上所述，在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中，在T4DNA连接酶缓冲液(1X)和400单位T4 DNA连接酶(New EnglandBiolabs)存在下，用如此处理的50ng“MPr1200(SEQ.ID19)5’片段”、50ng“MPr1200(SEQ.ID19)3’片段”和50ng质粒pGem3Z-1在10μl反应混合物中进行连接反应。用所有的所述连接反应混合物转化已经预先制成感受态的大肠杆菌DH5a细菌。通过在补充氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选择而获得的克隆的质粒DNA，如上所述，在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中，借助于各10pmol的两种寡脱氧核苷酸5’ATCggAATTCgCAgCCATggTCCTgAACC 3’和5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’，通过PCR进行分析。
所获得的质粒称为pMRT1200，通过测序确证了在图IV中图示的MPr1200启动子序列(SEQ.ID19)。
3.11.MPr1213启动子(SEQ.ID20)的构建通过在MPR1128(SEQ.ID04)(描述于实施例2的2.2一节)的位置-225bp上游，插入一段79bp的序列，该序列包括六倍体小麦普通小麦Cheyenne栽培品种的编码Bx7亚基的高分子量麦谷蛋白基因启动子(PrHMWG-Bx7)(Anderson等，1998)的“禾谷类”框的重复，产生MPr1213启动子(SEQ.ID20)。
MPr1213启动子(SEQ.ID20)的构建通过在载体pGEM3Z-1(描述于实施例2的2.1一节)中克隆以下两种启动子片段来进行-“MPr1213(SEQ.ID20)5’片段”，该序列通过PCR合成，即在dNTPs各50nmol、Vent DNA聚合酶缓冲液(1X)和2U Vent DNA聚合酶(New England Biolabs)存在下，借助于各100pmol的两种寡脱氧核苷酸-含有EcoRI限制位点的5’TACgAATTCCTCgACATgg 3’和具有XbaI限制位点的5’gCTCTAgAgCAAATCTACggCCACTC 3’，通过PCR从5ng pMRT1139基质DNA(描述于实施例3的3.9一节)进行扩增。PCR扩增反应在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中进行。在于94℃变性10分钟后，所述DNA经过25个循环，每个循环由以下步骤组成于94℃变性1分钟，于55℃杂交1分钟和于72℃延伸1分钟30秒。在最后一个循环中，延伸反应于72℃继续进行5分钟。借助于“Concert Rapid凝胶提取系统”试剂盒，在1.5％琼脂糖凝胶上分离由所述PCR扩增得到的DNA片段，将其用EcoRI于37℃水解1小时。在dNTPs各60nmol、12μl 500mM Tris-HCl，pH7.5/500mM MgCl2缓冲液和6μl 1M DTT存在下，所述DNA片段用20UKlenow片段(New England Biolabs)于37℃作用30分钟，并用XbaI于37℃消化1小时。-“MPr1213(SEQ.ID20)3’片段”，借助于“Concert Rapid凝胶提取系统”试剂盒，在1.5％琼脂糖凝胶上分离用XbaI和BamHI限制性酶水解5μg质粒pMRT1183(描述于实施例2的2.5一节)所获得的该片段。
如上所述，在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中，在T4DNA连接酶缓冲液(1X)和400单位T4 DNA连接酶(New EnglandBiolabs)存在下，用如此处理的50ng“MPr1213(SEQ.ID20)5’片段”和50ng“MPr1213(SEQ.ID20)3’片段”和50ng质粒pGem3Z-1在10μl反应混合物中进行连接反应。用所有的所述连接反应混合物转化已经预先制成感受态的大肠杆菌DH5a细菌。通过在补充氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选择而获得的克隆的质粒DNA，如上所述，在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中，借助于各10pmol的两种寡脱氧核苷酸5’TACgAATTCCTCgACATgg 3’和5’gCTCTAgAgCAAATCTACggCCACTC 3’，通过PCR进行分析。
所获得的质粒称为pMRT1213，通过测序确证了在图IV中图示的MPr1213启动子序列(SEQ.ID20)。
3.12.MPr1199启动子(SEQ.ID18)的构建通过在MPR1128(SEQ.ID04)(描述于实施例2的2.2一节)的位置-224bp，插入一段27bp的序列，该序列包括玉米条纹病毒(MSV)的基因间隔区的“富GC”元件(Fenoll等，1990)，产生MPr1199启动子(SEQ.ID18)。
在dNTPs各50nmol、Vent DNA聚合酶缓冲液(1X)和2U VentDNA聚合酶(New England Biolabs)存在下，借助于各100pmol的两种寡脱氧核苷酸-含有上述“富GC”元件以及EcoRI和XabI限制位点的5’ATCGGAATTCAAATGGGCCGGACCGGGCCGGCCCAGCGCCGATTACGTGGCTTTAGC 3’和具有BamHI限制位点的5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’，通过PCR从5ngpMRT1128基质DNA扩增MPr1199启动子(SEQ.ID18)。PCR扩增反应在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中进行。在于94℃变性5分钟后，所述DNA经过25个循环，每个循环由以下步骤组成于94℃变性1分钟，于55℃杂交1分钟和于72℃延伸1分钟30秒。在最后一个循环中，延伸反应于72℃继续进行1分钟。
借助于“Concert Rapid凝胶提取系统”试剂盒，在1.5％琼脂糖凝胶上分离由所述扩增得到DNA片段，该片段用EcoRI于37℃水解1小时。然后在dNTPs各60nmol、12μl 500mM Tris-HCl，pH7.5/500mM MgCl2缓冲液和6μl 1M DTT存在下，所述片段用20U Klenow片段(New England Biolabs)于37℃作用30分钟，然后用BamHI于37℃消化1小时。
在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中，在上述条件下，用100ng如此处理的MPr1199启动子片段(SEQ.ID18)和50ng质粒pGem3Z-1(描述于实施例2的2.1一节)通过PCR循环进行连接反应。用所有的所述连接反应混合物转化已经预先制成感受态的大肠杆菌DH5a细菌。通过在补充氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选择而获得的克隆的质粒DNA，如上所述在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中，借助于各25pmol的两种寡脱氧核苷酸5’ATCGGAATTCCAGAACTAGGATTACGCCG 3’和5’TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3’，通过PCR进行分析。
所获得的质粒称为pMRT1199mut；通过测序确证的相应的MPr1199(SEQ.ID18)mut启动子序列，在非翻译前导序列中的位置+27[lacuna]具有一个突变。为了重新建立未突变的MPr1199序列(SEQ.ID18)，克隆从位置-251延伸至-58bp的“MPr1199(SEQ.ID18)5’片段”，以取代从位置-225延伸至-58bp的“MPr11835’片段”。
为了完成这一步，用EcoRI将10μg质粒pMRT1199mut于37℃消化1小时，并且在dNTPs各60nmol、12μl 500mM Tris-HCl，pH7.5/500mM MgCl2缓冲液和6μl 1M DTT存在下，用20U Klenow片段(New England Biolabs)于37℃作用30分钟。在用NcoI于37℃消化1小时后，借助于“Concert Rapid凝胶提取系统”试剂盒，在1.5％琼脂糖凝胶上分离“MPr1199(SEQ.ID18)5’片段”。
在平行实验中，用XbaI将5μg质粒pMRT1183(描述于实施例2的2.5一节)于37℃消化1小时，并且在dNTPs各60nmol、12μl 500mM Tris-HCl，pH 7.5/500mM MgCl2缓冲液和6μl 1M DTT存在下，用20U Klenow片段(New England Biolabs)于37℃作用30分钟。在用NcoI消化后，借助于“Concert Rapid凝胶提取系统”试剂盒，在0.8％琼脂糖凝胶上分离如此缺失“MPR11835’片段”的载体pMRT1183，然后在缓冲液3(1X)存在下，用40U牛小肠碱性磷酸酶(New EnglandBiolabs)于37℃去磷酸化1小时。
如上所述，在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中，在T4DNA连接酶缓冲液(1X)和400单位T4 DNA连接酶(New EnglandBiolabs)存在下，用100ng“MPr1199(SEQ.ID18)mut 5’片段”和50ng如此处理的质粒pMRT1183在10μl反应混合物中进行连接反应。用所有的所述连接反应混合物转化已经预先制成感受态的大肠杆菌DH5a细菌。通过在补充氨苄青霉素(50mg/l)的LB培养基上选择而获得的克隆的质粒DNA，按照碱裂解法进行提取，并通过酶消化进行分析。
所获得的质粒称为pMRT1199，在图IV中图示了MPr1199启动子序列(SEQ.ID18)。
实施例4用于烟草稳定转化的含MPr1130(SEQ.ID05)、MPr1131(SEQ.ID06)、MPr1135(SEQ.ID09)、MPr1138(SEQ.ID12)、MPr1139(SEQ.ID13)和MPr1092启动子的双元质粒的构建4.1.双元质粒pMRT1177的构建通过将pMRT1130(描述于实施例3的3.一节)的表达盒“MPr1130(SEQ.ID05)/uidA-IV2/term-nos”插入双元质粒pMRT1118(未公布的专利申请FR 9911112)的EcoRI位点中，获得双元质粒pMRT1177。
为了完成这一步，连续用EcoRI和XmnI于37℃将10μg质粒pMRT1130消化1小时。然后，借助于“ConcertRapid凝胶提取系统”试剂盒，在0.8％琼脂糖凝胶上分离所述表达盒。
在平行实验中，用EcoRI将10μg双元质粒pMRT1118于37℃消化1小时。然后，在缓冲液3(1X)存在下，用40U牛小肠碱性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃将所述线性化载体片段去磷酸化1小时。
在T4 DNA连接酶缓冲液(1X)和400单位T4 DNA连接酶(NewEngland Biolabs)存在下，用50ng所述表达盒和100ng如此处理的质粒pMRT1118在10μl反应混合物中，于16℃进行连接反应过夜。用所有的所述连接反应混合物转化已经预先制成感受态的大肠杆菌DH5a细菌。通过在补充卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上选择而获得的克隆的质粒DNA，按照碱裂解法进行提取，并且用酶促消化进行分析。
所获得的质粒称为pMRT1177，按照Holsters等(1978)描述的技术，将其转移到根癌土壤杆菌菌株LBA4404中。通过在补充利福平(50mg/l)和卡那霉素(50mg/l)的2YT培养基(10g/l细菌培养用胰胨、10g/l酵母提取物、5g/l NaCl，pH7.2和15g/l琼脂)上选择而获得的克隆的质粒DNA，按照通过将溶菌酶(25mg/ml)加入细胞再悬浮缓冲液中而修改的碱裂解法进行提取。用酶促消化分析质粒DNA，所获得的土壤杆菌克隆称为A1177。
4.2.双元质粒pMRT1178的构建如实施例4的4.1一节中所述，通过将表达盒“MPr1131(SEQ.ID06)/uidA-IV2/term-nos”插入双元质粒pMRT1118的EcoRI位点中，获得双元质粒pMRT1178，只是从质粒pMRT1131(描述于实施例3的3.2一节)分离所述表达盒。
所获得的质粒称为pMRT1178，按照以上实施例4的4.1一节中所述的方案，将其转移到根癌土壤杆菌菌株LBA4404中。所获得的土壤杆菌克隆称为A1178。
4.3.双元质粒pMRT1179的构建如实施例4的4.1一节中所述，通过将表达盒“MPr1135(SEQ.ID09)/uidA-IV2/term-nos”插入双元质粒pMRT1118的EcoRI位点中，获得双元质粒pMRT1179，只是从质粒pMRT1135(描述于实施例3的3.3一节)分离所述表达盒。
所获得的质粒称为pMRT1179，按照以上实施例4的4.1一节中所述的方案，将其转移到根癌土壤杆菌菌株LBA4404中。所获得的土壤杆菌克隆称为A1179。
4.4.双元质粒pMRT1180的构建如实施例4的4.1一节中所述，通过将表达盒“MPr1138(SEQ.ID12)/uidA-IV2/term-nos”插入双元质粒pMRT1138的EcoRI位点中，获得双元质粒pMRT1180，只是从质粒pMRT1138(描述于实施例3的3.4一节)分离所述表达盒。
所获得的质粒称为pMRT1180，按照以上实施例4的4.1一节中所述的方案，将其转移到根癌土壤杆菌菌株LBA4404中。所获得的土壤杆菌克隆称为A1180。
4.5.双元质粒pMRT1181的构建如实施例4的4.1一节中所述，通过将表达盒“MPr1139(SEQ.ID13)/uidA-IV2/term-nos”插入双元质粒pMRT1118的EcoRI位点中，获得双元质粒pMRT1181，只是从质粒pMRT1139(描述于实施例3的3.9一节)分离所述表达盒。
所获得的质粒称为pMRT1181，按照以上实施例4的4.1一节中所述的方案，将其转移到根癌土壤杆菌菌株LBA4404中。所获得的土壤杆菌克隆称为A1181。
4.6.双元质粒pMRT1182的构建通过将CaMV PrD35S启动子片段和序列uidA-IV2/term-nos插入双元质粒pMRT1118中，获得双元质粒pMRT1182。
通过连续用KpnI和HindIII于37℃将10μg质粒pJIT163D消化1小时，分离CaMVPrD35S。在0.8％琼脂糖凝胶上分离对应于CaMVPrD35S的743bp片段，然后借助于“QIAquick凝胶提取”试剂盒将其纯化。
通过用HindIII和EcoRI于37℃将4μg质粒pMRT1092消化1小时，获得序列uidA-IV2/term-nos。在0.8％琼脂糖凝胶上分离对应于序列uidA-IV2/term-nos的2.2kb片段，然后借助于“QIAquick凝胶提取”试剂盒将其纯化。
在平行实验中，连续用KpnI和EcoRI将10μg双元质粒pMRT1118于37℃消化1小时。然后，在缓冲液3(1X)存在下，用40U牛小肠碱性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃将所述线性化载体片段去磷酸化1小时。
在T4 DNA连接酶缓冲液(1X)和400单位T4 DNA连接酶(NewEngland Biolabs)存在下，在100ng双元质粒、50ng所述CaMVPrD35S片段和50 ng对应于序列uidA-IV2/term-nos的片段存在下，在20μl反应体积中进行连接反应。如上所述在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中通过PCR循环进行所述温育。用一半的所述连接反应介质转化已经预先制成感受态的大肠杆菌DH5a细菌。通过在补充卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上选择而获得的克隆的质粒DNA，按照碱裂解法进行提取，并且用酶促消化进行分析。
所获得的质粒称为pMRT1182，按照以上实施例4的4.1一节中所述的方案，将其转移到根癌土壤杆菌菌株LBA4404中。所获得的土壤杆菌克隆称为A1182。
实施例5用于玉米稳定转化的含MPr1139启动子(SEQ.ID13)的双元质粒pMRT1207的构建通过将pMRT1139的表达盒“MPr1139(SEQ.ID13)/uidA-IV2/term-nos”插入双元质粒pMRT1195(未公布的专利申请FR9911112)的HpaI位点中，获得双元质粒pMRT1207。
为了完成这一步，连续用EcoRI和XmnI于37℃将7μg质粒pMRT1139消化1小时。然后，借助于“Concert Rapid凝胶提取系统”试剂盒，在0.7％琼脂糖凝胶上分离所述表达盒，并且在dNTPs各60nmol、12μl MgCl2缓中液(500mM)和6μl DTT(IM)存在下，用20UKlenow片段(New England Biolabs)于37℃作用30分钟。
在平行实验中，用HpaI将5μg双元质粒pMRT1195于37℃消化1小时。然后，在缓冲液3(1X)存在下，用40U牛小肠碱性磷酸酶(New England Biolabs)于37℃将所述线性化载体片段去磷酸化1小时。
如上所述，在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中，通过PCR循环，用100ng所述表达盒和10ng如此处理的质粒pMRT1195进行连接反应。用所有的所述连接反应混合物转化已经预先制成感受态的大肠杆菌DH5a细菌。通过在补充卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上选择而获得的克隆的质粒DNA，按照碱裂解法进行提取，并且用酶促消化进行分析。
所获得的质粒称为pMRT1207，按照实施例4的4.1一节中所述的方案，将其转移到根癌土壤杆菌菌株LBA4404-pSB1中，该菌株衍生自根癌土壤杆菌菌株LBA4404，按照上述用于产生A1177的方案，在质粒pSB1(未公布的专利申请FR9911112)整合后，而得到根癌土壤杆菌菌株LBA4404-pSB1。通过在补充利福平(50mg/l)、卡那霉素(50mg/l)和四环素(5mg/l)的2YT培养基上选择而获得的克隆的质粒DNA，按照通过将溶菌酶(25mg/ml)加入细胞再悬浮缓冲液中而修改的碱裂解法进行提取。用酶促消化分析质粒DNA，所获得的土壤杆菌克隆称为A1207。
实施例6在玉米和烟草中不同启动子在瞬时表达中活性的测定和比较6.1植物提取物的制备6.1.1.玉米种子的产生和制备在24℃、60％湿度和16小时光/8小时黑暗的光周期的人工气候室中，培育玉米植株，在从所述玉米植株取出的玉米胚乳SN 87 165(L2)上进行瞬时表达实验。
在传粉后12天(DAP)，取下玉米，将其在搅拌下在20％domestos浴中消毒5分钟。在除去domestos并且在无菌去离子水中连续漂洗后，在无菌条件下小心地除去粒壳和糊粉细胞层。制备如此提取的胚乳的切向切片，并将其置于浸泡在基本murashige和Skoog培养基(MS5524，Sigma)中的滤纸上。
6.1.2.烟草的体外培养、叶片的制备在6周大的烟草(Nicotiana tabacum L.)栽培品种PBD6的叶片上，进行瞬时表达实验。烟草栽培品种PBD6的成熟种子在次氯酸钙(70 g/l)的饱和溶液中消毒10分钟，然后在无菌去离子水中漂洗3次，每次5分钟。将经消毒的种子置于MS20培养基(Murashige和Skoog，1962)上，并且在培养室(24℃恒温、光周期为16小时光照/8小时黑暗)中温育6周。
为了在通过基因枪法进行转化期间最大限度地减小对叶肉细胞的破坏，在转化之前24小时从6周大的PBD6烟草植株取下2片主要叶片，叶片上表面(upper side)面向上置于BY3温和质壁分离培养基(4.4g/l MS-5519盐、100mg/l肌醇、1mg/l硫胺素、200mg/l KH2PO4、30g/l蔗糖、45.5g/l山梨醇、1mg/l 2，4-D、8g/l琼脂，pH5.8)上，并且置于培养室(25℃恒温、光周期为16小时光照/8小时黑暗)中。
6.2.钨微粒或金微粒上的质粒DNA的吸收通过基因枪进行转化，需要将DNA预先沉积到由钨或金制成的球形微粒上，并且在无水乙醇(99.98％，含有低于0.02％的水)中消毒10分钟，在无菌去离子水中洗涤4次，并且于-20℃保存在50％甘油溶液中最多达4周。
将转化期间所用的所有对照和受试质粒的浓度调至1mg/ml。在采用发光术测定(luminometric assay)评估所研究的启动子活性的每个转化实验中，用一种内部参比对照(pCaMV35Sluc)进行共转化，以便将不同实验之间的GUS活性的变化归一化(Leckie等，1994)。然而，当用组织化学测定测量所研究的启动子活性时，不用所述参比质粒共转化。
在无菌层流室中将所述DNA包被到如此制备的微粒上。将1.8mg等份的无菌微粒在30μl 50％甘油中的悬浮液通过涡旋剧烈混合1分钟，然后与20μl含有5μg待测试质粒之一和2μg参比质粒pCaMV35Sluc的DNA悬浮液一起混合10秒。然后加入20μl 2.5MCaCl2，并且剧烈混合10秒。接着，将20μl 0.1M亚精胺加入混合物中，将所有该混合物通过涡旋再搅拌30秒。通过将该混合物在冰上保温15分钟，继续将所述DNA包被到所述珠粒上，然后将包被的珠粒低速离心5秒，并且在无水乙醇中洗涤2次。将如此包被的微粒冲重新悬浮于32μl无水乙醇中，通过涡旋剧烈混合15秒，然后立即作为4个相同的等份分配到已经按照生产商的建议(Bio-Rad，Hercule，USA)制备的PDS-1000/He基因枪(Biolistic)系统的无菌“微载体”盘上。“带有微粒沉积物的微载体支持体/微载体”装置干燥5分钟。
6.3.通过基因枪法瞬时转化植物提取物6.3.1.轰击玉米胚乳和瞬时表达用PDS-1000/He基因枪系统，按照供应商(Bio-Rad，Hercule，USA)关于该设备各种元件的处理和装配的一般建议，对玉米胚乳进行轰击。按照以下射击特征，用直径为0.6μm的钨微粒连续2次轰击每个胚乳-选择用以加速微粒的氦压为6200kPa(900psi)，-将植物样品置于距离珠粒加速区6cm之处，-在27mm汞的减压氛围下进行射击。
在轰击后，将胚乳留在相同条件下，在26℃培养室中于黑暗中温育24小时，以使得可以瞬时表达引入所述细胞中的转基因。
6.3.2.轰击烟草叶片组织和瞬时表达除以下两点以外，以与轰击玉米胚乳的相同方式，对烟草叶片进行轰击-用直径为1μm的金微粒轰击样品，-将样品置于距离珠粒加速区9cm之处。
在轰击后，将叶片留在相同条件下，在培养室(25℃恒温、光周期为16小时光照/8小时黑暗)中温育48小时，以使得可以瞬时表达引入所述细胞中的转基因。
6.4.通过组织化学染色显示并评估各种启动子的活性6.4.1.β-葡糖醛酸糖苷酶表达的显示如Jeffersson等(1987)所述，通过组织化学染色进行b-葡糖醛酸糖苷酶表达的显示。在培养室中温育期后，在0.1M磷酸缓冲液、0.05％Triton X100，pH 7.0中的β-葡糖醛酸糖苷酶底物X-Gluc(500mg/l 5-溴-4-氯-3-吲哚基葡糖苷酸)存在下，将植物提取物于37℃温育24小时。
染色后，直接分析玉米胚乳，或将其于4℃无菌保存数周，而使烟草叶片连续2次通过95％乙醇浴，时间分别为3小时和12小时，使烟草叶片除色素，然后在蒸馏水中漂洗，并且干燥两张玻璃纸之间的平面。
通过估计每种植物提取物上显示的蓝色斑点的数目和强度，评估不同构建体的启动子活性。
6.4.2.在玉米胚乳中所述启动子活性的定量评估b-葡糖醛酸糖苷酶表达的组织化学显示，使得有可能鉴定出三类启动子-用pMRT1197、pMRT1126、pMRT1127和pMRT1199构建体轰击的胚乳，系统地表现出低于10个的多个蓝色斑点。在用pMRT1197构建体转化的胚乳上出现蓝色斑点，表明MPr1197(SEQ.ID16)的96 bp序列构成了HMWG-Dx5启动子(SEQ.ID01)的最小启动子序列，它能够在玉米胚乳中指导基本的转录活性。在用缺乏启动子序列的pMPRT1144构建体(阴性对照)轰击的胚乳上没有蓝色斑点，证明了归入该类别的启动子的功能性。
-用pMRT1128、pMRT1213、pMRT1216、pMRT1217、pMRT1136、pMRT1137、pMRT1135和pMRT1138构建体轰击的胚乳，表现出的蓝色斑点平均数等于用pMRT1125(PrHMWG-Dx5(SEQ.ID01))和pMRT1218(Pre-zein，阳性对照)构建体轰击的胚乳表现出的蓝色斑点平均数。
-最后，用pMRT1130、pMRT1131、pMRT1139和pMRT1200构建体轰击的胚乳表现出强的弥散的蓝色染色，这使得难以对蓝色斑点数进行计数，但这得出暗示MPr1130(SEQ.ID05)、MPr1131(SEQ.ID06)、MPr1139(SEQ.ID13)和MPr1200(SEQ.ID19)启动子在传粉后12天时在玉米胚乳中的活性非常高。
6.4.3.烟草叶片中所述启动子活性的定量评估在用pMRT1125(PrHMWG-Dx5(SEQ.ID01))、pMRT1130、pMRT1131、pMRT1133、pMRT1134、pMRT1135、pMRT1136、pMRT1137、pMRT1138和pMRT1092(CaMV PrD35S，阳性对照)构建体转化的烟草叶片上进行的组织化学测定的结果在图5中给出，所述结果使得有可能将所研究的启动子分为4类。在用pMRT1125(PrHMWG-Dx5(SEQ.ID01))构建体轰击的叶片上没有观察到蓝色斑点。用pMRT1133、pMRT1134、pMRT1136和pMRT1137构建体轰击的叶片表现出蓝色斑点的平均数在50和100之间。用pMRT1135、pMRT1138和pMRT1139构建体转化的叶片(结果未显示)表现出相当多数目的蓝色斑点，这与在用参比构建体pMRT1092(CaMV PrD35S)轰击的叶片上观察到的蓝色斑点数相当。最后，用pMRT1130和pMRT1131构建体轰击的叶片表现出的弥散的强蓝色斑点数目比用参比构建体pMRT1092(CaMV PrD35S)轰击的叶片上的蓝色斑点数多得多。
根据这些结果，可以得出几点基本信息-CaMV 35S as-1和as-2激活序列将HMWG-Dx5启动子(SEQ.OD01)在烟草叶片中的活性去调节，-CaMV 35S as-1和as-2激活序列与HMWG-Dx5启动子(SEQ.ID01)中存在的顺式调节基序协同作用。“G”样框看来是这种联合控制的关键元件之一。GATA框与“G”样框和CaMV 35S as-1和as-2激活序列结合，大概负责MPr1130(SEQ.ID05)和MPr1131(SEQ.ID06)的非常高的活性，-将CaMV 35S as-2激活序列重复不提供显著的额外的正效应，-“禾谷类框”与CaMV 35S as-1和as-2激活序列结合，看来提供在烟草叶片中的负转录效应。
总之，由于CaMV D35S启动子在文献中常常被报道为是一种嵌合启动子，它提供GUS报道基因的启动子活性的增加，其提供的活性比CaMV 35S启动子所提供的活性高约8-12倍(Kay等，1987)，因此MPr1135(SEQ.ID09)、MPr1138(SEQ.ID12)、MPr1139(SEQ.ID13)、MPr1130(SEQ.ID05)和MPr1131(SEQ.ID06)启动子肯定是迄今描述的在烟草叶片中活性最强的嵌合启动子。
在烟草叶片中活性较弱的MPr1133(SEQ.ID07)、MPr1134(SEQ.ID08)、MPr1136(SEQ.ID10)和MPr1137(SEQ.ID11)启动子也有优点，因为它们可以指导抗性基因的表达，以允许以与例如“nos”型启动子相同的方式进行转基因植物的选择。
6.5.通过β-葡糖醛酸糖苷酶表达的发光术测定定量测定玉米胚乳中各种启动子的活性将先前通过基因枪法转化的胚乳在液氮中冷冻，并且借助于固定在钻子上的玻棒进行研磨。然后以每250mg组织1ml缓冲液的比率，将粉末在提取缓冲液(25mM Tris磷酸盐，pH7.8、2mM二硫苏糖醇、2mM 1，2-二氨基环己烷、N，N，N’N’-四乙酸、10％甘油、 1％Triton X100)中解冻。在通过以16060g离心5分钟进行澄清之前，将混合物匀浆，然后于4℃温育1小时。
借助于“GUS-光化学发光报道基因测定”检测试剂盒(Tropix Inc.，Bedford，USA)，按照生产商的建议，在10μl澄清的粗提取物上测定GUS活性。用Lumat LB 9507发光计(EGG-Berthold，Bad Wildbad，德国)进行光发射的测量。
在平行实验中，借助于“萤光素酶测定系统”检测试剂盒(PromegaCorp.，Madison，USA)，按照生产商的建议，在10μl澄清的粗提取物上测定萤光素酶活性。借助于置于4℃冷房中的Lumat LB 9507发光计进行光发射的测量。
结果在图6和图7中给出。对于每种测定(3个半个胚乳＝一个粗提取物)，计算用发光计测定的β-葡糖醛酸糖苷酶活性和萤光素酶活性之间的比率。确定每种构建体的至少5个独立测定的平均值和平均值的标准误。
为了分析该专利中描述的对每种所述启动子进行的各种修饰的效应，将所述启动子分为两个不同的组。组I(图6)由使得有可能对HMWG-Dx5启动子(SEQ.ID01)进行详细的功能分析的启动子组成，而组II(图7)含有使得有可能确定在该专利中研究的不同顺式激活元件结合HMWG-Dx5启动子(SEQ.ID01)的效应的启动子。
组I含有MPr1128、MPr1127(SEQ.ID03)、MPr1126(SEQ.ID02)、MPr1197(SEQ.ID16)、MPr1198(SEQ.ID17)、MPr1216(SEQ.ID21)和MPr1217(SEQ.ID22)启动子、HMWG-Dx5参比启动子(SEQ.ID01)和缺乏启动子序列的参比构建体pMRT1144(阴性对照)(图6)。发光术测定的结果使得有可能得出几种观察结果-逐渐缺失HMWG-Dx5启动子(SEQ.ID01)的5’区导致这些启动子提供的平均相对活性的逐渐降低。完整的417 bp的PrHMWG-Dx5启动子序列(SEQ.ID01)因此看来是为了提供HMWG-Dx5启动子(SEQ.ID01)最大活性所需的。
-在MPR1128(SEQ.ID04)和PrHMWG-Dx5(SEQ.ID01)启动子之间记录的活性的轻微差异表明，位于核苷酸-238上游的序列不含负责HMWG-Dx5启动子(SEQ.ID01)活性的主要顺式激活元件。
-MPR1128(SEQ.ID04)和MPr1127(SEQ.ID03)启动子之间的活性的显著降低所得到的提示是，位于核苷酸-205上游、含有一个“G”样框的序列对于HMWG-Dx5启动子(SEQ.ID01)活性起重要作用。
-MPr1127(SEQ.ID03)和MPr1126(SEQ.ID02)启动子之间记录的活性的轻微差异不能得到关于所述增强子元件的真正作用的结论。
-MPr1197(SEQ.ID16)启动子的活性非常弱，但比用不含启动子的pMRT1144构建体获得的活性强，这表明96bp的最小PrHMWG-Dx5(SEQ.ID01)序列提供基本的转录水平。
-与MPR1128(SEQ.ID04)相比MPr1198(SEQ.ID17)的活性弱，表明从核苷酸-59延伸至核苷酸-135的PrHMWG-Dx5(SEQ.ID01)序列虽然缺乏推定的顺式激活元件，但在HMWG-Dx5启动子(SEQ.ID01)的活性中起主要作用。这一结果暗示，所述反式激活因子对“G”框和对所述激活元件的功能性以及作为结果的可及性，取决于它们与TATA框分开的距离。
-将带有“G”框和所述激活元件的从核苷酸-136延伸至核苷酸-225的MPR1128(SEQ.ID04)序列重复，在MPr1216启动子(SEQ.ID21)上提供b-葡糖醛酸糖苷酶活性，该活性至少与PrHMWG-Dx5(SEQ.ID01)所指导的活性一样高。相反，在MPr1217启动子(SEQ.ID22)中将这一相同的序列三份复制，没有任何额外的相加作用。
组II含有MPr1128、MPr1213(SEQ.ID20)、MPr1199(SEQ.ID18)、MPr1136(SEQ.ID10)、MPr1137(SEQ.ID11)、MPr1138(SEQ.ID12)、MPr1131(SEQ.ID06)、MPr1135(SEQ.ID09)、MPr1130(SEQ.ID05)、MPr1139(SEQ.ID13)和MPr1200(SEQ.ID19)启动子、HMWG-Dx5参比启动子(SEQ.ID01)和用作阳性对照的g-玉米醇溶蛋白启动子(图7)。利用用与组I启动子的相同方式，所述发光术测定的结果使得有可能得出几种观察结果-在HMWG-Dx5启动子(SEQ.ID01)和HMWG-Dx5启动子(SEQ.ID01)衍生物的位置-65bp融合CaMV 35S as-2(Lam和Chua，1989)和as-1(Lam等，1989)激活序列，非常强地增强了所产生的MPr1130(SEQ.ID05)、MPr1131(SEQ.ID06)、MPr1136(SEQ.ID10)、MPr1137(SEQ.ID11)、MPr1135(SEQ.ID09)和MPr1138(SEQ.ID12)启动子的活性。作为说明，MPr1131(SEQ.ID06)和MPr1130(SEQ.ID05)启动子的活性比HMWG-Dx5启动子(SEQ.ID01)分别高3.2倍和3.8倍。
-CaMV 35S as-2和as-1激活序列与HMWG-Dx5启动子(SEQ.ID01)的顺式激活元件协同作用。MPr1131(SEQ.ID06)、MPr1138(SEQ.ID12)、MPr1137(SEQ.ID11)和MPr1136(SEQ.ID10)启动子活性的逐渐降低分别与HMWG-Dx5启动子(SEQ.ID01)的逐渐5’缺失同时发生，证实了这一点。
-将MPr1130(SEQ.ID05)和MPr1135(SEQ.ID09)启动子分别与MPr1131(SEQ.ID06)和MPr1138(SEQ.ID12)启动子比较，表明将CaMV 35S as-2激活序列重复不产生显著的相加激活效应。
-在MPr1131(SEQ.ID06)和MPr1138(SEQ.ID12)启动子上游融合六倍体小麦普通小麦Cheyenne栽培品种的编码Bx7亚基的高分子量麦谷蛋白基因(Anderson等，1998)启动子的“禾谷类框”，大大提高了所产生的MPr1139(SEQ.ID13)和MPr1200(SEQ.ID19)启动子的活性。作为说明，MPr1139(SEQ.ID13)和MPr1200(SEQ.ID19)的活性比HMWG-Dx5启动子(SEQ.ID01)的活性高大约5.5倍。
-对应于在MPr1128启动子上游融合“禾谷类框”的MPr1213(SEQ.ID20)的活性弱，暗示“禾谷类框”与CaMV 35S as-2和as-1激活序列协同作用，以便增强MPr1139(SEQ.ID13)和MPr1200(SEQ.ID19)启动子的活性。
-最后，在MPR1128(SEQ.ID04)启动子上游融合玉米条纹病毒(MSV)的基因间隔区的“富GC”元件，不导致所产生的MPr1199启动子(SEQ.ID18)活性的增加。相反，“富含GC”元件看来提供轻微的抑制效应。
总之，由于MPr1139(SEQ.ID13)和MPr1200(SEQ.ID19)启动子的活性比通常用于植物生物技术中以指导高水平蛋白表达的Prg-zein启动子的活性分别高4倍和3.9倍，因此毫无疑问，MPr1139(SEQ.ID13)和MPr1200(SEQ.ID19)启动子是能够提高异源蛋白在玉米胚乳中表达水平的强有力的工具。此外，注意到MPr1130(SEQ.ID05)、MPr1131(SEQ.ID06)、MPr1135(SEQ.ID09)、MPr1138(SEQ.ID12)、MPr1137(SEQ.ID11)和MPr1136(SEQ.ID10)启动子在玉米胚乳中提供b-葡糖醛酸糖苷酶活性，其提供的活性至少与用Prg-zein启动子获得的活性一样高。最后，效力较低的启动子也是非常有价值的，因为它们可以用以提供对抗性基因或酶蛋白编码基因的表达控制。
实施例7在玉米和烟草中不同启动子在稳定表达中活性的表达和评估7.1用根癌土壤杆菌稳定地基因转化玉米所用的技术由Ishida等(1996)描述。长度为1.0-1.2mm(传粉后9-14天)的未成熟胚在LS-inf培养基中洗涤，然后浸入按照Ishida等(1996)所述而制备的土壤杆菌悬浮液中，涡旋混合30秒，并且于室温下温育5分钟。如此处理的未成熟胚于25℃、黑暗中在LS-AS培养基中培养3天，然后转移至补充5mg/1膦丝菌素和250mg/l头孢噻肟的LSD 1.5培养基上，于25℃黑暗中培养2周，最后将其置于补充10mg/1膦丝菌素和250mg/1头孢噻肟的LSD1.5培养基上，于25℃黑暗中培养3周。分离如此产生的I型愈伤组织，将其断裂，并转移至补充10mg/l膦丝菌素和250mg/1头孢噻肟的LSD1.5培养基上，于25℃黑暗中培养3周。然后，分离已经增殖的I型愈伤组织，并且将其置于补充5mg/1膦丝菌素和250mg/l头孢噻肟的LSZ培养基上，于25℃、16小时光照/8小时黑暗的光周期下培养2-3周。然后将再生的小植株转移至LSF 1/2培养基上，于25℃、16小时光照/8小时黑暗的光周期下培养1-2周，然后将其转移至人工气候室和转移至温室。
7.2用根癌土壤杆菌稳定地基因转化烟草按照Horsch等(1985)描述的方法，用重组土壤杆菌体外感染从6周大烟草小植株分离的叶圆盘，进行烟草(Nicotiana tabacum L.，PBD6栽培品种)的转化。
在光强为200μE.m-2.s-1、光周期为16小时光照/8小时黑暗并且温度为25℃的空调区中，制备所有的体外培养物。
除初始共培养步骤外，再生、发育和生根步骤均在补充制菌剂即400mg/l augmentin和选择剂即200mg/l或100mg/l卡那霉素的不同选择培养基上进行。
所用的不同步骤和培养基如下-在将土壤杆菌在补充终浓度为6mM的CaCl2和合适的抗生素的5ml 2YT培养基(10g/l细菌培养用胰胨、5g/l酵母提取物、5g/lNaCl，pH 7.2)中于28℃预培养48小时后，于28℃过夜制备在补充CaCl2和抗生素的10ml 2YT培养基中的培养物。然后将培养物以3000g离心10分钟，将细菌重悬于10ml液体MS30(4.4g/l由SIGMA出售的M0404，补充30g/l蔗糖，pH5.7)中。
-通过使从体外小植株叶片切下的约1cm2叶片外植体与液体MS30中稀释10倍的土壤杆菌悬浮液接触20分钟，进行共培养。然后，将如此处理的外植体在滤纸上快速干燥，并将其置于空调区中的固体共培养培养基(CM)(MS30，1mg/l苄氨基嘌呤(BAP)、0.1mg/l吲哚-3-乙酸(IAA)、8g/l琼脂)上48小时。
-然后将经处理的外植体置于固体再生培养基(固体CM，400mg/l augmentin、200mg/l卡那霉素)。2周后将外植体在相同培养基上传代培养。
-2周后，将芽在固体发育培养基(4.4g/l由SIGMA出售的M0404，补充20g/l蔗糖，pH5.7(液体MS20)、400mg/l augmentin、100mg/l卡那霉素、8g/l琼脂)上传代培养。
-2周后，将转化的小植株在与所述发育培养基相同的固体生根培养基上传代培养。生根持续2-3周，在生根结束时，将小植株移至人工气候室的瞬间(jiffy)花盆中达10天(光周期为16小时光照/8小时黑暗，23℃和70％的湿度)，然后转移至温室。
7.3.测量玉米植株和烟草植株中的β-葡糖醛酸糖苷酶活性为了测定β-葡糖醛酸糖苷酶活性，将取自转基因植物的样品在液氮中冷冻，并且借助于固定在钻子上的玻棒进行研磨。然后以每250mg组织1ml缓冲液的比率，将粉末重悬于提取缓冲液(25mM Tris磷酸盐，pH7.8、2mM二硫苏糖醇、2mM 1，2-二氨基环己烷、N，N，N’N’-四乙酸、10％甘油、1％Triton X100)中。在通过以16060 g离心5分钟进行澄清之前，将混合物匀浆，然后于4℃温育1小时。
借助于“GUS-光化学发光报道基因测定”检测试剂盒(Tropix Inc.，Bedford，USA)，按照生产商的建议，在10μl澄清的粗提取物上测定GUS活性。用Lumat LB 9507发光计(EGG-Berthold，Bad Wildbad，德国)进行光发射的测量。
用“Bio-Rad蛋白测定”试剂(Bio-Rad，Munich，德国)，按照Bradford技术(1976)，测量所述粗提取物中存在的总蛋白的量。
7.4.在玉米胚乳和叶片中的稳定表达和嵌合启动子活性7.4.1.在种子中的表达将在玉米胚乳的稳定表达中由嵌合HMWG启动子控制的β-葡糖醛酸糖苷酶活性与由参比启动子512γ-玉米醇溶蛋白控制的β-葡糖醛酸糖苷酶活性进行比较，已知参比启动子512γ-玉米醇溶蛋白在玉米胚乳中的活性高(Marzabal等，1998)。每个玉米穗轴研究6粒种子，在生长的不同阶段，从玉米穗轴顶部开始向基部取种子。作为说明，30DAP阶段对应于在传粉后30天取出的玉米种子。按照实施例7的7.3一节描述的方法，测量每粒种子的β-葡糖醛酸糖苷酶活性的发光量。
如图8中报道的结果反映了在30 DAP收获的成熟玉米种子中在稳定表达期间在所述嵌合HMWG-Dx5衍生启动子(MPr1139、MPr1200和MPr1131)和参比启动子512γ-玉米醇溶蛋白控制之下的β-葡糖醛酸糖苷酶活性。对每个植株群体活性的比较给出了对不同启动子的相应强度的良好说明。在启动子MPr1139、MPr1200和MPr1131控制之下的β-葡糖醛酸糖苷酶活性平均为参比启动子512γ-玉米醇溶蛋白控制下活性的约1.5-2倍。然而，分别在启动子MPr1139和MPr1131控制下表达GUS蛋白的植株302.A3和347.H1的种子，表现出的β-葡糖醛酸糖苷酶活性，比由参比启动子512γ-玉米醇溶蛋白控制的活性分别高7倍和14倍。注意到在启动子MPr1139、MPr1200和MPr1131控制下表达GUS蛋白的植物中，在β-葡糖醛酸糖苷酶活性方面没有显著差异。然而，在每个植株群体中β-葡糖醛酸糖苷酶活性的变化相当大。已经在大多数引入植物的基因中观察到的这种现象可以解释为所述转基因的位置效应和拷贝数。在发育的13DPA阶段和18DAP阶段进行发光术测定(结果未显示)，表明β-葡糖醛酸糖苷酶活性随时间变化，但是30DAP阶段产生最高β-葡糖醛酸糖苷酶活性的启动子也是分别在发育的较早阶段中13DAP和18DAP时的最强启动子。因此，在发育期间维持所述启动子的分类。图9所示的直方图显示在启动子MPr1139控制下β-葡糖醛酸糖苷酶活性的时间波动。这些结果表明，GUS活性从10DAP开始可检测到，在16DAP和28DAP之间达到稳定水平，此后下降直至30DAP。在12DAP和20DAP之间的发育期中也观察到从取自夏季的植株获得的GUS活性稳定水平(结果未显示)。在取自13DAP(
图10a)、18DAP(
图10b)的玉米种子的纵向切片上、或在解剖的玉米种子(
图10c)上进行的组织化学试验表明，在玉米种子中启动子MPr1139特异性地在胚乳中表达，在胚、糊粉或粒壳中检测不到任何染色。此外，
图11中描述的直方图表明，MPr1139的表达是稳定的，或甚至在第二代(T2)中更强。
根据上述数据，可以总结出以下信息-与启动子序列HMWG-Dx5融合的CaMV 35S启动子的激活序列as-1和as-2看来是玉米胚乳中非常强的顺式激活元件。
-CaMV 35S启动子的激活序列as-1和as-2没有将玉米种子中的所述HMWG-Dx5启动子的活性去调节(
图10)。
-在玉米种子中禾谷类框在稳定表达中没有显著的顺式调节效应，启动子MPr1131的活性至少与启动子MPr1139一样。
-位于“G”框上游、从核苷酸-238延伸至-378bp的启动子序列HMWG-Dx5在衍生自HMWG的嵌合启动子中不起重要的调节作用，在玉米种子的稳定表达中启动子MPr1200的活性至少与启动子MPr1139一样。
总之，最佳表达子302.A3和347.H1的衍生自HMWG的嵌合启动子(MPr1139、MPr1131和MPr1200)的活性，平均大约是参比启动子512γ-玉米醇溶蛋白活性的1.5-2倍或甚至更高，不容质疑，所述嵌合启动子是能够提高异源蛋白在玉米胚乳中表达的非常有用的工具。按照本发明的衍生自HMWG的嵌合启动子也可以用来在单子叶植物种子中超量表达内源蛋白，因此有农业价值，例如用于产生与淀粉生产相关的水稻或小麦。
7.4.2.在叶片中的稳定表达通过在玉米叶片中的稳定表达，测量在启动子MPr1139、MPr1131和MPr1200控制下的β-葡糖醛酸糖苷酶活性。按照实施例7的7.3一节中描述的方法，从两个叶圆盘进行β-葡糖醛酸糖苷酶活性的发光术测量，每个叶圆盘的直径为2厘米，取自在温育中适应后3周的玉米植株。
每个植株群体的活性比较表明，由嵌合启动子MPr1139、MPr1200和MPr1131控制下的β-葡糖醛酸糖苷酶活性，比在512γ-玉米醇溶蛋白启动子控制下表达GUS蛋白的植株中测量的背景噪声最多高30倍(
图12)，还表明的结果是，启动子MPr1139、MPr1200和MPr1131在温室适应后3周的发育阶段的玉米植株的叶片中略有活性或根本无活性。然而，在体外培养的生根期间，在处于衍生自HMWG的所述嵌合启动子控制下表达GUS蛋白的原始转化体(小植株)的叶片上进行的组织化学试验，系统地显示出蓝色染色(结果未显示)。
这些结果是非常有趣的，因为在转基因玉米的叶片中，启动子MPr1139、MPr1200和MPr1131的活性低，但足以进行早期试验，而没有任何主要的毒性风险。
7.5.在烟草叶片和种子中嵌合启动子的稳定表达活性7.5.1在叶片中的稳定表达在烟草叶片中，将在启动子MPr1130、MPr1131、MPr1135、MPr1138和MPr1139控制下的稳定表达β-葡糖醛酸糖苷酶活性与由CaMV D35S启动子控制的活性进行比较。按照实施例7的7.3一节中描述的方法，在温室适应后2、5、8和11周的发育阶段由两个叶圆盘进行β-葡糖醛酸糖苷酶活性的发光术测量，每个叶圆盘的直径为2厘米，取自位于原始转化体上部1/3的基部的不同叶片。为了限制主要通过随机整合而引入的所述报道基因表达程度以及所述表达盒拷贝数的变异，每种构建物研究10-30个独立的转化体。
示于
图13的结果反映出在温室适应后11周时，在烟草叶片中在衍生自HMWG的所述嵌合启动子和参比启动子HMWG-Dx5和CaMVD35S的β-葡糖醛酸糖苷酶活性的稳定表达。对每个植株群体的活性比较提供了对所述不同启动子相应强度的良好说明。在由衍生自HMWG的本发明的嵌合启动子控制的β-葡糖醛酸糖苷酶活性显著高于在HMWG-Dx5启动子控制下测量的活性，但比在CaMVD35S启动子控制下的活性低大约5-10倍。在所述不同HMWG嵌合启动子中，除启动子Mpr1139活性略低外，没有观察到任何显著的活性差异。在温室适应后2、5和8周发育阶段进行的发光术测定(结果未显示)表明，在任何特定植株中β-葡糖醛酸糖苷酶活性随时间而增加，而与所用的启动子无关。然而，在11周发育阶段最强的启动子在发育早期(在温室适应后2、5和8周)也提供最高的β-葡糖醛酸糖苷酶活性。因此，在11周阶段的所述启动子的分类也适用于烟草中的所有其它发育阶段。
从该数据可明显看出，衍生自HMWG的所述嵌合启动子是有功能的，但在烟草叶片的稳定表达中仅有弱活性。本申请人的结论是，所述激活序列as-1和as-2将HMWG-Dx5启动子在烟草叶片中的活性去调节，但不提供与HMWG-Dx5启动子序列中存在的顺式调节序列相关的强激活效应。
为了解释这些结果与在瞬时表达实验中所获得的结果中的这种明显的矛盾，提出两种假说-衍生自HMWG的所述嵌合启动子由烟草叶片的基因枪转化期间的损伤和/或胁迫诱导；-在稳定的烟草表达中，衍生自HMWG的所述嵌合启动子基本上在发育的每一早期阶段中都表达。再生步骤期间在体外原始烟草转化体(小植株)的叶片上进行的组织化学试验表明衍生自HMWG的所述嵌合启动子的β-葡糖醛酸糖苷酶活性高(结果未显示)。
衍生自HMWG的嵌合启动子即MPr1130、MPr1131、MPr1135、MPr1138和MPr1139尽管在烟草叶片的稳定表达中活性弱，但可以例如用于控制涉及所述植物代谢的生物合成途径中的酶的表达。它们也可以用来控制赋予植物抗性的基因的表达，所述抗性例如是对可用作选择剂的抗生素或除草剂的抗性。
7.5.2.在烟草种子中的稳定表达通过发光术，在取自每种构建物独立获得的10-30个独立的原始转化体的成熟T1烟草种子(每个转化体100mg)中，测定β-葡糖醛酸糖苷酶活性。在特定构建体中所述活性在植株与植株之间不同(参见
图14)，这可以用在基因组中的位置效应和所述转基因的拷贝数来解释。
所述结果表明，衍生自HMWG的某些嵌合启动子可以在烟草种子中启动β-葡糖醛酸糖苷酶活性，所述活性至少与CaMV D35S启动子一样高。实际上，所述启动子可以如下分类-启动子MPr1130、MPr1131和Mpr1139，它们促进β-葡糖醛酸糖苷酶活性的程度与CaMV D35S启动子的相同；-启动子MPr1135和MPr1138，它们在烟草种子中的活性是CaMV D35S启动子的2倍。
所获得的结果表明-CaMV 35S启动子的激活序列as-1和as-2提供衍生自HMWG、仅含一个“G样”框和所述“增强子”元件的启动子序列中的重要的顺式激活效应，如在启动子MPr1135和MPr1138中观察到的。因此，CaMV 35S启动子的激活序列as-1和as-2与HMWG-Dx5启动子中存在的顺式调节元件协同作用。所述“G样”框和所述“增强子”元件看来是烟草种子中这种联合控制中的关键元件。
-位于所述“G”框上游从核苷酸-378延伸至-238的HMWG-Dx5启动子序列赋予启动子MPr1130、MPr1131和MPr1139在烟草种子中的负顺式调节效应。
-CaMV启动子的激活序列as-2的重复在烟草种子中不提供任何明显的正相加相应。实际上，MPr1130相对于Mpr1131没有获得任何活性差异，MPr1135相对于MPr1138也没有获得任何活性差异。
-所述“禾谷类”框在烟草种子中不提供任何明显的相加顺式激活效应，因为启动子MPr1131和MPr1139获得的结果是相似的。
启动子MPr1135和MPr1138在烟草种子的稳定表达中是高活性的，它们是用于控制异源蛋白在双子叶植物中表达、例如在农业上非常有价值的那些植物中表达的强有力的工具。
实施例8用于烟草稳定转化、包含HMWG-Dx5启动子(SEQ.ID01)的双元质粒pMRT1231的构建通过将来自pMRT1125的表达盒“HMWG-Dx5(SEQ.ID01)/uidA-IV2/term-nos”插入双元质粒pMRT1195的限制位点HpaI中，获得双元质粒pMRT1231。pMRT1195描述于将公布的法国专利申请FR9911112中，所述申请通过引用而将与相关信息相关的内容结合到本文中。
为了完成这一步，连续用EcoRI和XmnI于37℃将7μg质粒pMRT1125消化1小时。然后，用“Concert Rapid凝胶提取系统”试剂盒，在0.7％琼脂糖凝胶上分离所述表达盒，并且在dNTPs各60nmol、12μl MgCl2(500 mM)和6μl DTT(1M)存在下，用20单位Klenow片段(New England Biolabs)于37℃作用30分钟。
在平行实验中，用HpaI将5μg双元质粒pMRT1195于37℃消化1小时。然后，在缓冲液3存在下，用40单位牛小肠碱性磷酸酶(NewEngland Biolabs)于37℃将所述线性化载体片段去磷酸化1小时。
如先前所述，在“GeneAmp PCR系统9700”热循环仪中，通过连续的PCR循环，用100ng所述表达盒和10ng以上获得的pMRT1195质粒进行连接反应。用所有的所述连接反应混合物转化预先制备的感受态大肠杆菌DH5α。通过在补充卡那霉素(50mg/l)的LB培养基上选择而获得的克隆的质粒DNA，按照碱裂解法进行提取，并且通过酶促消化进行分析。
所获得的质粒命名为pMRT1231，然后按照先前实施例4的4.1一节中所述的方案，将其转移到根癌土壤杆菌菌株LBA4404-pSB1中，该菌株按照最近描述的用于获得A1177菌株的方案，在pSB1质粒整合后由根癌土壤杆菌菌株LBA4404衍生得到。pSB1质粒描述于将公布的法国专利申请FR9911112中，所述申请的相关信息的内容通过引用结合到本文中。通过在补充利福平(50mg/l)、卡那霉素(50mg/l)和四环素(5mg/ml)的2YT培养基上选择而获得的克隆的质粒DNA，按照通过将溶菌酶(25mg/l)加入细胞再悬浮缓冲液中而修改的碱裂解法进行提取。用酶促消化分析所获得的质粒DNA，所获得的土壤杆菌命名为A1231。
按照实施例7的7.2一节的描述，进行烟草的稳定遗传转化，只是用于再生培养基和发育培养基中的所述选择剂分别是0.5(0，5)mg/l和2mg/l的草铵膦。
实施例9用于玉米稳定遗传转化、包括启动子MPr1131、MPr1200和512γ-zein的双元质粒的构建9.1.双元质粒pMRT1263的构建通过将表达盒“MPr1131(SEQ.ID06)/uidA-IV2/term-nos”插入双元质粒pMRT1195的限制位点HpaI中，获得双元质粒pMRT1263。质粒pMRT1195描述于尚未公布的法国专利申请FR9911112中，所述申请的相关信息通过引用结合到本文中。如实施例5所述进行所述插入，只是所述表达盒从描述于实施例3的3.2一节中的质粒pMRT1131中分离。
所获得的质粒命名为pMRT1263，按照先前实施例5的5.1一节中所述的方案，将其转移到根癌土壤杆菌菌株LBA4404-pSB1中。所获得的土壤杆菌克隆命名为A1263。
9.2.双元质粒pMRT1266的构建通过将表达盒“MPr1200(SEQ.ID19)/uidA-IV2/term-nos”插入双元质粒pMRT1195的HpaI限制位点中，获得双元质粒pMRT1266。质粒pMRT1195描述于尚未公布的法国专利申请FR9911112中，其相关信息通过引用结合到本文中。如实施例5所述进行所述插入，只是所述表达盒从描述于实施例3的3.10一节中的质粒pMRT1200中分离。
所获得的质粒命名为pMRT1266，按照先前实施例5的5.1一节中所述的方案，将其转移到根癌土壤杆菌菌株LBA4404-pSB1中。所获得的土壤杆菌克隆命名为A1266。
9.3.双元质粒pMRT1209的构建为了在玉米胚乳SN87 165(L2)的稳定表达中有一参比启动子序列，如先前实施例5中所述，将Marzabal等(1998)描述的526γ-玉米醇溶蛋白质粒中含有的启动子512γ-zein和nos终止子控制下的uidA基因，插入双元质粒pMRT1195中，只是所述表达盒从526γ-zein质粒中分离。
将所获得的质粒pMRT1209，按照实施例5的5.1一节中所述的方案，转移到根癌土壤杆菌菌株LBA4404-pSB1中。所获得的土壤杆菌克隆命名为A1209。
所引用的参考文献Anderson O.D.，Green F.C.，Yip R.E.，Halford N.G.，Shewry P.R.和Malpica-Romero J-M.(1989).得自六倍体面包小麦普通小麦Cheyenne栽培品种D基因组的两个高分子量麦谷蛋白基因的核苷酸序列。Nucleic Acids Research 17.461-462。
Anderson O.D.，Abraham-Pierce F.A.和Tam A.(1998).在小麦高分子量麦谷蛋白基因启动子序列中的保守性在基因座和GLU-B1-1基因座的等位基因中的比较。Theor Appl Genet 96，568-576。
Birnboim H.C.和Doly J.(1979).用于筛选重组质粒DNA的快速碱提取法。Nuc.Ac.Res.7，1513。
Bradfbrd M.(1976).用于利用蛋白-染料结合的原理检测微克量蛋白的快速而灵敏的方法。Anal.Biochem.72，248-254。
Fenoll C.，Schwarz J.J.，Black D.M.，Schneider M.和Howell S.H.(1990).玉米条纹病毒的基因间隔区含有一个激活右向转录并且结合玉米核因子的富GC元件。PMB 15，865-877。
Guérineau和Mullineaux(1993).载于Plant molecular biologylabfax，Croy R.R.D.(编著)，BioS Scientific Publishers，BlackwellScientific Publications。
Jefferson R.A.，Burgess S.M.和Hirsh D(1986).作为基因融合标记的β-葡糖醛酸糖苷酶。Proc.Nat.Acad.Sci.USA，83，8447-8451。
Jefferson R.A.，Kavanagh T.A.和Bevan M.W.(1987).GUS融合体在高等植物中作为灵敏的通用基因融合标记的β-葡糖醛酸糖苷酶。EMBO J.6，3901-3907。
Holsters M.，Dewaele D.，Depicker A.，Messenf E.，Van Montagu M.和Schell J.(1978).根癌土壤杆菌的转染和转化。Mol.Gen.Genet.136，181-187。
Horsch R.B.，Fry J.E.，Hoffmann N.L.，Eiholtz D.，Rogers S.G.和Fraley R.T.(1985).一种将基因转移到植物中的简单而通用的方法。Science 227，129-1231。
Kay R.，Chan A.，Daly M.和McPherson J.(1987).重复CaMV 35S启动子序列产生一种用于植物基因的强增强子。Science 236，1299-1302。
Lam E.，Benfey P.N.，Gilmartin P.M.，Fang R.X.和Chua N.H.(1989).定点突变改变体外因子的结合并且改变转基因植物中的启动子表达模式。Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，7890-7894。
Lam E.和Chua N.H.(1989).ASF-2一种结合于花椰菜花叶病毒35S启动子和Cab启动子中保守的GATA基序的因子。Plant Cell，1，1147-1156。
Leckie L.，Devoto A.和De Lorenzo G.(1994).根据来自相同细胞提取物的LUC活性将GUS归一化降低了转化变异性。Biotechniques17，52-56。
Murashige T.和Skoog F.(1962).一种改进的用于烟草组织培养物快速生长和生物测定的培养基。Physiol.Plant.15，473-497。
Reina M.，Ponte I.，Guillen P.，Boronat A.和Palau J.来自玉蜀黍W64 A的编码Zc2蛋白的基因组克隆的序列分析。Nucleic AcidsResearch 18，6426。
Torrent M.，Alvarez I.，Geli M.I.，Dalcol I.和Ludevid D.(1997).富赖氨酸修饰的g-玉米醇溶蛋白在瞬时转化的玉米胚乳中的蛋白体积累。Plant Mol.Biol.34，139-149。
Vancanneyt G.，Schmidt R.，O’Connor-Sanchez A.，Willmitzer L.和Rocha-Sosa M.(1990).含内含子的标记基因的构建剪接转基因植物中的内含子及其在监测土壤杆菌介导的植物转化中的早期事件中的应用。Mol.Gen.Genet.220，245-250。
Marzabal P.，Busk P.K.，Ludevid M.D.和Torrent M.(1998).g-玉米醇溶蛋白基因的双因子胚乳框Pb3和GZM顺式作用元件的表征和功能。The Plant Journal 16(1)，41-52。
序列表<110>MERISTEM THERAPEUTICS<120>合成的和嵌合的启动子、表达盒、质粒、载体、含有它们的转基因植物和种子以及其产生方法<130>PrHMWG1<140><141><160>37<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>417<212>DNA<213>普通小麦(Triticum aestivum)<220><221>misc_feature<222>(22)..(29)<223>谷醇溶蛋白样框<220><221>misc_feature<222>(70)..(73)<223>GATA框<220><221>misc_feature<222>(87)..(90)<223>GATA框<220><221>misc_feature<222>(127)..(133)<223>谷醇溶蛋白样框<220><221>misc_feature<222>(161)..(168)<223>G样框<220><221>增强子<222>(193)..(230)<223>增强子框<220><221>TATA信号<222>(349)..(355)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(379)<223>转录起始位点<400>1agctttgagt ggccgtagat ttgcaaaagc aatggctaac agacacatat tctgccaaac 60cccaagaagg ataatcactt ttcttagata aaaaagaaca gaccaatata caaacatcca 120cacttctgca aacaatacat cagaactagg attacgccga ttacgtggct ttagcagact 180gtccaaaaat ctgttttgca aagctccaat tgctccttgc ttatccagct tcttttgtgt 240tggcaaactg cgcttttcca accgattttg ttcttctcgc gctttcttct taggctaaac 300aaacctcacc gtgcacgcag ccatggtcct gaaccttcac ctcgtcccta taaaagccta 360gccaaccttc acaatcttat catcacccac aacaccgagc accacaaact agagatc417<210>2<211>181<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1126启动子<220><221>TATA信号<222>(113)..(119)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(143)<223>转录起始位点<400>2gtgttggcaa actgcgcttt tccaaccgat tttgttcttc tcgcgctttc ttcttaggct 60aaacaaacct caccgtgcac gcagccatgg tcctgaacct tcacctcgtc cctataaaag 120cctagccaac cttcacaatc ttatcatcac ccacaacacc gagcaccaca aactagagat 180c 181<210>3<211>244<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1127启动子<220><221>增强子<222>(20)..(57)<223>增强子框<220><221>TATA信号<222>(176)..(182)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(206)<223>转录起始位点<400>3gcagactgtc caaaaatctg ttttgcaaag ctccaattgc tccttgctta tccagcttct 60tttgtgttgg caaactgcgc ttttccaacc gattttgttc ttctcgcgct ttcttcttag 120gctaaacaaa cctcaccgtg cacgcagcca tggtcctgaa ccttcacctc gtccctataa 180aagcctagcc aaccttcaca atcttatcat cacccacaac accgagcacc acaaactaga 240gatc 244<210>4<211>277<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1128启动子<220><221>misc_feature<222>(21)..(28)<223>G样框<220><221>增强子<222>(53)..(90)<223>增强子框<220><221>TATA信号<222>(209)..(215)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(239)<223>转录起始位点<400>4cagaactagg attacgccga ttacgtggct ttagcagact gtccaaaaat ctgttttgca 60aagctccaat tgctccttgc ttatccagct tcttttgtgt tggcaaactg cgcttttcca 120accgattttg ttcttctcgc gctttcttct taggctaaac aaacctcacc gtgcacgcag 180ccatggtcct gaaccttcac ctcgtcccta taaaagccta gccaaccttc acaatcttat 240catcacccac aacaccgagc accacaaact agagatc 277<210>5<211>472<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1130启动子<220><221>misc_feature<222>(22)..(29)<223>谷醇溶蛋白样框<220><221>misc_feature<222>(70)..(73)<223>GATA框<220><221>misc_feature<222>(87)..(90)<223>GATA框<220><221>misc_feature<222>(127)..(133)<223>谷醇溶蛋白样框<220><221>misc_feature<222>(161)..(168)<223>G样框<220><221>增强子<222>(193)..(230)<223>增强子框<220><221>misc_feature<222>(314)..(368)<223>As2/As2/As1框<220><221>TATA信号<222>(404)..(410)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(434)<223>转录起始位点<400>5agctttgagt ggccgtagat ttgcaaaagc aatggctaac agacacatat tctgccaaac 60cccaagaagg ataatcactt ttcttagata aaaaagaaca gaccaatata caaacatcca 120cacttctgca aacaatacat cagaactagg attacgccga ttacgtggct ttagcagact 180gtccaaaaat ctgttttgca aagctccaat tgctccttgc ttatccagct tcttttgtgt 240tggcaaactg cgcttttcca accgattttg ttcttctcgc gctttcttct taggctaaac 300aaacctcacc gtgattgatg tgatatcaag attgatgtga tatctccact gacgtaaggg 360atgacgcaca cgcagccatg gtcctgaacc ttcacctcgt ccctataaaa gcctagccaa 420ccttcacaat cttatcatca cccacaacac cgagcaccac aaactagaga tc 472<210>6<211>455<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1131启动子<220><221>misc_feature<222>(22)..(29)<223>谷醇溶蛋白样框<220><221>misc_feature<222>(70)..(73)<223>GATA框<220><221>misc_feature<222>(87)..(90)<223>GATA框<220><221>misc_feature<222>(127)..(133)<223>谷醇溶蛋白样框<220><221>misc_feature<222>(161)..(168)<223>G样框<220><221>增强子<222>()..)<223>增强子框<220><221>misc_feature<222>()..)<223>As2/As1框<220><221>TATA信号<222>()..(393)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>()<223>转录起始位点<400>6agctttgagt ggccgtagat ttgcaaaagc aatggctaac agacacatat tctgccaaac 60cccaagaagg ataatcactt ttcttagata aaaaagaaca gaccaatata caaacatcca 120cacttctgca aacaatacat cagaactagg attacgccga ttacgtggct ttagcagact 180gtccaaaaat ctgttttgca aagctccaat tgctccttgc ttatccagct tcttttgtgt 240tggcaaactg cgcttttcca accgattttg ttcttctcgc gctttcttct taggctaaac 300aaacctcacc gtgattgatg tgatatctcc actgacgtaa gggatgacgc acacgcagcc 360atggtcctga accttcacct cgtccctata aaagcctagc caaccttcac aatcttatca 420tcacccacaa caccgagcac cacaaactag agatc455<210>7<211>332<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1135启动子<220><221>misc_feature<222>(21)..(28)<223>G样框<220><221>增强子<222>(53)..(90)<223>增强子框<220><221>misc_feature<222>(174)..(228)<223>As2/As2/As1框<220><221>TATA信号<222>(264)..(270)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(294)<223>转录起始位点<400>7cagaactagg attacgccga ttacgtggct ttagcagact gtccaaaaat ctgttttgca 60aagctccaat tgctccttgc ttatccagct tcttttgtgt tggcaaactg cgcttttcca 120accgattttg ttcttctcgc gctttcttct taggctaaac aaacctcacc gtgattgatg 180tgatatcaag attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca cgcagccatg 240gtcctgaacc ttcacctcgt ccctataaaa gcctagccaa ccttcacaat cttatcatca 300cccacaacac cgagcaccac aaactagaga tc 332<210>8<211>219<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1136启动子<220><221>misc_feature<222>(78)..(115)<223>As2/As1框<220><221>TATA信号<222>(151)..(157)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(181)<223>转录起始位点<400>8gtgttggcaa actgcgcttt tccaaccgat tttgttcttc tcgcgctttc ttcttaggct 60aaacaaacct caccgtgatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacacgc 120agccatggtc ctgaaccttc acctcgtccc tataaaagcc tagccaacct tcacaatctt 180atcatcaccc acaacaccga gcaccacaaa ctagagatc219<210>9<211>282<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr11137启动子<220><221>增强子<222>(20)..(57)<223>增强子框<220><221>misc_feature<222>(141)..(178)<223>As2/As1框<220><221>TATA信号<222>(214)..(220)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(244)<223>转录起始位点<400>9gcagactgtc caaaaatctg ttttgcaaag ctccaattgc tccttgctta tccagcttct 60tttgtgttgg caaactgcgc ttttccaacc gattttgttc ttctcgcgct ttcttcttag 120gctaaacaaa cctcaccgtg attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca 180cgcagccatg gtcctgaacc ttcacctcgt ccctataaaa gcctagccaa ccttcacaat 240cttatcatca cccacaacac cgagcaccac aaactagaga tc282<210>10<211>315<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1138启动子<220><221>misc_feature<222>(21)..(28)<223>G样框<220><221>增强子<222>(53)..(90)<223>增强子框<220><221>misc_feature<222>(174)..(211)<223>As2/As1框<220><221>TATA信号<222>(247)..(253)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(277)<223>转录起始位点<400>10cagaactagg attacgccga ttacgtggct ttagcagact gtccaaaaat ctgttttgca 60aagctccaat tgctccttgc ttatccagct tcttttgtgt tggcaaactg cgcttttcca 120accgattttg ttcttctcgc gctttcttct taggctaaac aaacctcacc gtgattgatg 180tgatatctcc actgacgtaa gggatgacgc acacgcagcc atggtcctga accttcacct 240cgtccctata aaagcctagc caaccttcac aatcttatca tcacccacaa caccgagcac 300cacaaactag agatc 315<210>11<211>505<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1139启动子<220><221>misc_feature<222>(4)..(26)<223>禾谷类框<220><221>misc_feature<222>(39)..(61)<223>禾谷类框<220><221>misc_feature<222>(120)..(123)<223>GATA框<220><221>misc_feature<222>(137)..(140)<223>GATA框<220><221>misc_feature<222>(72)..(79)<223>谷醇溶蛋白样框<220><221>misc_feature<222>(177)..(183)<223>谷醇溶蛋白样框<220><221>misc_feature<222>(211)..(218)<223>G样框<220><221>增强子<222>(243)..(280)<223>增强子框<220><221>misc_feature<222>(364)..(401)<223>As2/As1框<220><221>TATA信号<222>(437)..(443)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(467)<223>转录起始位点<400>11ctcgacatgg ttagaagttt tgagtgccgc cactactcga catggttaga agttttgagt 60ggccgtagat ttgcaaaagc aatggctaac agacacatat tctgccaaac cccaagaagg 120ataatcactt ttcttagata aaaaagaaca gaccaatata caaacatcca cacttctgca 180aacaatacat cagaactagg attacgccga ttacgtggct ttagcagact gtccaaaaat 240ctgttttgca aagctccaat tgctccttgc ttatccagct tcttttgtgt tggcaaactg 300cgcttttcca accgattttg ttcttctcgc gctttcttct taggctaaac aaacctcacc 360gtgattgatg tgatatctcc actgacgtaa gggatgacgc acacgcagcc atggtcctga 420accttcacct cgtccctata aaagcctagc caaccttcac aatcttatca tcacccacaa 480caccgagcac cacaaactag agatc 505<210>12<211>96<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1197启动子<220><221>TATA信号<222>(28)..(34)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(58)<223>转录起始位点<400> 12catggtcctg aaccttcacc tcgtccctat aaaagcctag ccaaccttca caatcttatc 60atcacccaca acaccgagca ccacaaacta gagatc 96<210>13<211>187<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1198启动子<220><221>misc_feature<222>(8)..(15)<223>G样框<220><221>增强子<222>(40)..(77)<223>增强子框<220><221>TATA信号<222>(119)..(125)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(149)<223>转录起始位点<400>13acgccgatta cgtggcttta gcagactgtc caaaaatctg ttttgcaaag ctccaattgc 60tccttgctta tccagcttct tttgtgttgg ccatggtcct gaaccttcac ctcgtcccta 120taaaagccta gccaaccttc acaatcttat catcacccac aacaccgagc accacaaact 180agagatc 187<210>14<211>290<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1199启动子<220><221>misc_feature<222>(6)..(25)<223>富GC框<220><221>misc_feature<222>(34)..(41)<223>G样框<220><221>增强子<222>(66)..(103)<223>增强子框<220><221>TATA信号<222>(222)..(228)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(252)<223>转录起始位点<400>14caaatgggcc ggaccgggcc ggcccagcgc cgattacgtg gctttagcag actgtccaaa 60aatctgtttt gcaaagctcc aattgctcct tgcttatcca gcttcttttg tgttggcaaa 120ctgcgctttt ccaaccgatt ttgttcttct cgcgctttct tcttaggcta aacaaacctc 180accgtgcacg cagccatggt cctgaacctt cacctcgtcc ctataaaagc ctagccaacc 240ttcacaatct tatcatcacc cacaacaccg agcaccacaa actagagatc290<210>15<211>381<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1200<220><221>misc_feature<222>(4)..(26)<223>禾谷类框<220><221>misc_feature<222>(39)..(61)<223>禾谷类框<220><221>misc_feature<222>(87)..(94)<223>G样框<220><221>增强子<222>(119)..(156)<223>增强子框<220><221>misc_feature<222>(240)..(277)<223>As2/As1框<220><221>TATA信号<222>(313)..(319)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(343)<223>转录起始位点<400>15ctcgacatgg ttagaagttt tgagtgccgc cactactcga catggttaga agttttgagt 60ggccgtagat ttgctctaga cgccgattac gtggctttag cagactgtcc aaaaatctgt 120tttgcaaagc tccaattgct ccttgcttat ccagcttctt ttgtgttggc aaactgcgct 180tttccaaccg attttgttct tctcgcgctt tcttcttagg ctaaacaaac ctcaccgtga 240ttgatgtgat atctccactg acgtaaggga tgacgcacac gcagccatgg tcctgaacct 300tcacctcgtc cctataaaag cctagccaac cttcacaatc ttatcatcac ccacaacacc 360gagcaccaca aactagagat c 381<210>16<211>343<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1213启动子<220><221>misc_feature<222>(4)..(26)<223>禾谷类框<220><221>misc_feature<222>(39)..(61)<223>禾谷类框<220><221>增强子<222>(119)..(156)<223>增强子框<220><221>misc_feature<222>(87)..(94)<223>G样框<220><221>TATA信号<222>(275)..(281)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(305)<223>转录起始位点<400>16ctcgacatgg ttagaagttt tgagtgccgc cactactcga catggttaga agttttgagt 60ggccgtagat ttgctctaga cgccgattac gtggctttag cagactgtcc aaaaatctgt 120tttgcaaagc tccaattgct ccttgcttat ccagcttctt ttgtgttggc aaactgcgct 180tttccaaccg attttgttct tctcgcgctt tcttcttagg ctaaacaaac ctcaccgtgc 240acgcagccat ggtcctgaac cttcacctcg tccctataaa agcctagcca accttcacaa 300tcttatcatc acccacaaca ccgagcacca caaactagag atc 343<210>17<211>358<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1216启动子<220><221>misc_feature<222>(7)..(14)<223>G样框<220><221>增强子<222>(39)..(76)<223>增强子框<220><221>misc_feature<222>(102)..(109)<223>G样框<220><221>增强子<222>(134)..(171)<223>增强子框<220><221>TATA信号<222>(290)..(296)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(320)<223>转录起始位点<400>17cgccgattac gtggctttag cagactgtcc aaaaatctgt tttgcaaagc tccaattgct 60ccttgcttat ccagcttctt ttgtgttggt ctagacgccg attacgtggc tttagcagac 120tgtccaaaaa tctgttttgc aaagctccaa ttgctccttg cttatccagc ttcttttgtg 180ttggcaaact gcgcttttcc aaccgatttt gttcttctcg cgctttcttc ttaggctaaa 240caaacctcac cgtgcacgca gccatggtcc tgaaccttca cctcgtccct ataaaagcct 300agccaacctt cacaatctta tcatcaccca caacaccgag caccacaaac tagagatc 358<210>18<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脱氧核苷酸<400>18atcggaattc gtgttggcaa actgc25<210>19<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脱氧核苷酸<400>19atcgggaatt cgcagactgt ccaaaaatc29<210>20<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脱氧核苷酸<400>20atcggaattc cagaactagg attacgccg29<210>21<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脱氧核苷酸<400>21tacgaattcc cagctttgag tggccgtag 29<210>22<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脱氧核苷酸<400>22atcggaattc tagacgccga ttacgtggct ttagc35<210>23<211>83<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脱氧核苷酸<400>23tacgaattcc tcgacatggt tagaagtttt gagtgccgcc actactcgac atggttagaa 60gttttgagtg gccgtagatt tgc 83<210>24<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脱氧核苷酸<400>24atcggaattc gccgattacg tggctttagc 30<210>25<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脱氧核苷酸<400>25atcggaattc gcagccatgg tcctgaacc 29<210>26<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脱氧核苷酸<400>26tacgaattcc tcgacatgg 19<210>27<211>63<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脱氧核苷酸<400>27attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca cgcagccatg gtcctgaacc 60ttc 63<210>28<211>80<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脱氧核苷酸<400>28attgatgtga tatcaagatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacacgc 60agccatggtc ctgaaccttc 80<210>29<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脱氧核苷酸<400>29tacggatccc cggggatctc tagtttgtgg tgc 33<210>30<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脱氧核苷酸<400>30gctctagagc aaatctacgg ccactc 26<210>31<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脱氧核苷酸<400>31gctctagacc aacacaaaag aagctgg 27<210>32<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脱氧核苷酸<400>32catgccatgg ccaacacaaa agaagctgg 29<210>33<211>63<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脱氧核苷酸<400>33tgcgtcatcc cttacgtcag tggagatatc acatcaatca cggtgaggtt tgtttagcct 60aag 63<210>34<211>80<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡脱氧核苷酸<400>34tgcgtcatcc cttacgtcag tggagatatc acatcaatct tgatatcaca tcaatcacgg 60tgaggtttgt ttagcctaag 80<210>35<211>236<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1133启动子<220><221>misc_feature<222>(78)..(132)<223>As2/As2/As1框<220><221>misc_feature<222>(198)<223>转录起始位点<400>35gtgttggcaa actgcgcttt tccaaccgat tttgttcttc tcgcgctttc ttcttaggct 60aaacaaacct caccgtgatt gatgtgatat caagattgat gtgatatctc cactgacgta 120agggatgacg cacacgcagc catggtcctg aaccttcacc tcgtccctat aaaagcctag 180ccaaccttca caatcttatc atcacccaca acaccgagca ccacaaacta gagatc 236<210>36<211>299<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1134<220><221>增强子<222>(20)..(57)<223>增强子框<220><221>misc_feature<222>(141)..(195)<223>As2/As2/As1框<220><221>misc_feature<222>(261)<223>转录起始位点<400>36gcagactgtc caaaaatctg ttttgcaaag ctccaattgc tccttgctta tccagcttct 60tttgtgttgg caaactgcgc ttttccaacc gattttgttc ttctcgcgct ttcttcttag 120gctaaacaaa cctcaccgtg attgatgtga tatcaagatt gatgtgatat ctccactgac 180gtaagggatg acgcacacgc agccatggtc ctgaaccttc acctcgtccc tataaaagcc 240tagccaacct tcacaatctt atcatcaccc acaacaccga gcaccacaaa ctagagatc 299<210>37<211>453<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述MPr1217启动子<220><221>misc_feature<222>(8)..(15)<223>G样框<220><221>增强子<222>(40)..(77)<223>增强子框<220><221>misc_feature<222>(102)..(109)<223>G样框<220><221>增强子<222>(134)..(171)<223>增强子框<220><221>misc_feature<222>(197)..(204)<223>G样框<220><221>增强子<222>(229)..(266)<223>增强子框<220><221>TATA信号<222>(385)..(391)<223>TATA框<220><221>misc_feature<222>(415)<223>转录起始位点<400>37acgccgatta cgtggcttta gcagactgtc caaaaatctg ttttgcaaag ctccaattgc 60tccttgctta tccagcttct tttgtgttgg tctagacgcg attacgtggc tttagcagac 120tgtccaaaaa tctgttttgc aaagctccaa ttgctccttg cttatccagc ttcttttgtg 180ttggtctaga cgccgattac gtggctttag cagactgtcc aaaaatctgt tttgcaaagc 240tccaattgct ccttgcttat ccagcttctt ttgtgttggc aaactgcgct tttccaaccg 300attttgttct tctcgcgctt tcttcttagg ctaaacaaac ctcaccgtgc acgcagccat 360ggtcctgaac cttcacctcg tccctataaa agcctagcca accttcacaa tcttatcatc 420acccacaaca ccgagcacca caaactagag atc 45权利要求
1.嵌合表达启动子，其包含至少一段衍生自高分子量小麦麦谷蛋白的编码基因的核酸序列。
2.按照权利要求1的嵌合启动子，其特征在于，其包含至少一段衍生自编码高分子量小麦麦谷蛋白的小麦Dx5或Bx7基因的核酸序列。
3.按照权利要求1的嵌合启动子，其特征在于，其包含至少一段衍生自高分子量小麦麦谷蛋白的编码基因、序列鉴定号为SEQ.ID01的核酸序列。
4.按照权利要求1的嵌合启动子，其特征在于，衍生自高分子量小麦麦谷蛋白的编码基因的所述核酸序列由选自以下序列鉴定号的一种序列组成SEQ.ID02、SEQ.ID03、SEQ.ID04、SEQ.ID05、SEQ.ID06、SEQ.ID07、SEQ.ID08、SEQ.ID09、SEQ.ID10、SEQ.ID11、SEQ.ID12、SEQ.ID13、SEQ.ID16、SEQ.ID17、SEQ.ID18、SEQ.ID19和SEQ.ID20、SEQ.ID21和SEQ.ID22。
5.嵌合表达启动子，其特征在于，它包含一段衍生自编码高分子量小麦麦谷蛋白的基因的核酸序列，并且它在3’位置包含一个“TATA”框和一个转录起始位点(+1)。
6.按照权利要求5的嵌合表达启动子，其特征在于，它也包含在所述“TATA”框和所述转录起始位点(+1)上游的5’位置中功能性连接的至少一个“增强子”框。
7.按照权利要求6的嵌合表达启动子，其特征在于，它也包含在所述“增强子”框上游的5’位置中功能性连接的至少一个“G样”框。
8.按照权利要求6和7中任一项的嵌合表达启动子，其特征在于，它也包含在所述“增强子”框上游的5’位置中功能性连接的至少一个“P样”框。
9.按照权利要求6-8中任一项的嵌合表达启动子，其特征在于，它也包含在至少所述“增强子”框上游的5’位置中功能性连接的至少一个“GATA”框。
10.按照权利要求6-9中任一项的嵌合表达启动子，其特征在于，它也包含在所述“增强子”框上游的5’位置中功能性连接的至少一个禾谷类框。
11.按照权利要求6的嵌合启动子，其特征在于，它包含在所述“增强子”框上游的5’位置中功能性连接的两个连续的“禾谷类”框。
12.按照权利要求5的嵌合启动子，其特征在于，它也包含在所述转录起始位点上游的5’位置中功能性连接的至少一个“as1”框或至少一个“as2”框或一个“as1/as2”框组合或“as2/as1”框组合或这些的重复排列。
13.按照权利要求12的嵌合启动子，其特征在于，所述“as1”框、“as2”框、“as1/as2”框或“as2/as1”框或其重复排列功能性地连接于所述增强子框下游的3’位置中。
14.按照前述权利要求6-13中任一项的嵌合启动子，其特征在于，它也包含在所述“增强子”框上游功能性连接的一个“富GC”框。
15.按照前述权利要求6-14中任一项的嵌合启动子，其特征在于，它包含在所述“增强子”框上游的5’位置中功能性连接的两个“禾谷类”框，而所述“增强子”框本身功能性地连接于一个“as2/as1”框上游的5’位置中。
16.按照前述权利要求5-15中任一项的嵌合启动子，其特征在于，它包含至少一个以反向功能性连接和/或在所述转录起始位点下游3’位置中功能性连接的选自以下组的元件“增强子”框、“G样”框、“P样”框、“GATA”框、“禾谷类”框、任选重复的“as1”框、“as2”框和/或“as1/as2”或“as2/as1”框组合以及“富GC”框。
17.按照前述权利要求6-16中任一项的嵌合启动子，其特征在于，它包含至少一种选自以下的序列SEQ.ID02、SEQ.ID03、SEQ.ID04、SEQ.ID05、SEQ.ID06、SEQ.ID07、SEQ.ID08、SEQ.ID09、SEQ.ID10、SEQ.ID11、SEQ.ID12、SEQ.ID13、SEQ.ID16、SEQ.ID17、SEQ.ID18、SEQ.ID19、SEQ.ID20、SEQ.ID21和SEQ.ID22。
18.表达盒，其包含至少一段衍生自编码高分子量小麦麦谷蛋白的基因的核酸序列，并且所述序列以功能性方式连接于待表达的、编码所要产生的多肽的核酸序列，而所述多肽编码序列本身连接于一个转录终止核酸序列。
19.按照权利要求18的表达盒，其特征在于，它包含至少一段衍生自编码高分子量小麦麦谷蛋白的基因、序列鉴定号为SEQ.ID01的核酸序列。
20.按照权利要求18的表达盒，其特征在于，衍生自编码高分子量小麦麦谷蛋白的基因的所述核酸序列由选自以下序列鉴定号的至少一种序列组成SEQ.ID02、SEQ.ID03、SEQ.ID04、SEQ.ID05、SEQ.ID06、SEQ.ID07、SEQ.ID08、SEQ.ID09、SEQ.ID10、SEQ.ID11、SEQ.ID12、SEQ.ID13、SEQ.ID16、SEQ.ID17、SEQ.ID18、SEQ.ID19、SEQ.ID20、SEQ.ID21和SEQ.ID22。
21.分离的启动子核酸序列，其特征在于，它对应于衍生自序列鉴定号为SEQ.ID01的序列。
22.分离的启动子核酸序列，其特征在于，它对应于选自以下序列鉴定号的序列SEQ.ID02、SEQ.ID03、SEQ.ID04、SEQ.ID05、SEQ.ID06、SEQ.ID07、SEQ.ID08、SEQ.ID09、SEQ.ID10、SEQ.ID11、SEQ.ID12、SEQ.ID13、SEQ.ID16、SEQ.ID17、SEQ.ID18、SEQ.ID19、SEQ.ID20、SEQ.ID21和SEQ.ID22。
23.包含一个启动子或一个启动子核酸序列的载体，所述启动子或启动子核酸序列能够启动编码所要产生的多肽的核酸序列的转录，所述载体的特征在于，所述启动子或所述启动子核酸序列对应于按照权利要求1-17或21或22中任一项的启动子或启动子核酸序列。
24.按照权利要求23的载体，其特征在于，所述载体选自鉴定号为pMRT1207、pMRT1177、pMRT1178、pMRT1179、pMRT1180和pMRT1181的双元载体。
25.在其基因组中稳定整合了分别按照权利要求1-17或21或22中任一项的至少一个启动子或至少一个启动子核酸序列的转基因植物。
26.按照权利要求25的转基因植物，其特征在于，所述转基因植物选自双子叶植物物种，例如马铃薯、烟草、棉花、莴苣、番茄、甜瓜、黄瓜、豌豆、油料种子、甜菜或向日葵；或单子叶植物物种，例如小麦、大麦、燕麦、水稻或玉米。
27.按照权利要求25和26中任一项的转基因植物的繁殖体。
28.按照权利要求27的转基因植物的繁殖体，其特征在于，它是种子。
29.含有分别按照权利要求1-17或21或22中任一项的一个启动子或一个启动子核酸序列的细胞。
30.按照权利要求29的细胞，其特征在于，它是植物细胞。
31.在细胞中表达编码待产生的多肽的核酸序列或基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤-用包含按照权利要求1-17或21或22中任一项的至少一个启动子或至少一个启动子核酸序列的载体转化所述细胞；-在允许编码所述多肽的核酸序列或基因表达的条件下制备所述细胞的培养物。
32.按照权利要求31的方法，其特征在于，所述细胞是原核细胞或真核细胞。
33.按照权利要求31和32中任一项的方法，其特征在于，所述细胞是选自微生物细胞、真菌细胞、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞的细胞。
34.按照权利要求31-33中任一项的方法，其特征在于，所述细胞是植物细胞。
35.获得按照权利要求25和26中任一项的转基因植物或按照权利要求27的繁殖体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤-用包含按照权利要求1-17或21或22中任一项的至少一个启动子或至少一个启动子核酸序列的载体转化植物细胞；-选择整合了所述启动子或启动子核酸序列的植物细胞；-或者在培养物中，或者通过再生嵌合的或转基因的整株植株，繁殖所述经转化并经选择的植物细胞。
全文摘要
本发明涉及合成的和嵌合的启动子,所述启动子包含至少一种衍生自高分子量小麦麦谷蛋白(HMWG)的编码基因的启动子的核酸序列。本发明也涉及含有所述启动子的表达盒、载体和转基因植物,还涉及产生所述转基因植物和种子的方法。
文档编号C12N15/09GK1339067SQ00803238
公开日2002年3月6日 申请日期2000年9月28日 优先权日1999年9月30日
发明者V·格鲁伯, F·诺雷, M·泰森 申请人:默里斯坦治疗公司