专利名称：双chU6启动子双shRNA表达质粒的构建及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及双chU6启动子双ShRNA表达质粒pSilencer2. l+2chU6+VPlVP2shRNA的构建及应用，属于生物制药领域。背景技术：
传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease, IBD)是一种高度危害养鸡业的传染病，它是由传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus, IBDV)引起，以侵害雏鸡淋巴组织，特别是中枢免疫器官一法氏囊为主要特征，被称为世界三大禽病之一。IBDV 感染后，会引起鸡的免疫抑制，使鸡的免疫能力下降、疫苗免疫失败、导致易感其它疾病。长期以来，对IBDV采取了免疫预防为主的综合性防控措施，该病的大规模流行已得到有效控制，但由于近期各地变异株和超强毒株(vvIBDV)的出现使该病的防控难度加大，IBD免疫预防失败已成为各区域禽病防控中的重要问题[王永山等.近期引起免疫失败的传染性法氏囊病病毒VP2基因的分子特征.中国兽医科学，2008，38(12) 1013-1019]。目前，使用的常规弱毒疫苗和灭活疫苗，其安全性和制造工艺仍存在不足为预防变异毒株而采用中强毒力活疫苗存在着较大的生物安全问题，因为在不同IBDV毒株之间潜在着基因重配的可能，给该病的防控带来隐患；灭活疫苗存在着抗原制备的困难；以VP2 为靶基因的IBD基因工程疫苗，采用的表达系统包括大肠杆菌、酵母、鸡痘病毒载体、杆状病毒表达载体、核酸疫苗以及多表位疫苗等，各有所长，仍需改进。因此，探索新的IBDV防控技术是十分必要的。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA)诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默。RNAi现象自发现以来，其研究领域从基因功能扩展到抗肿瘤和抗病毒，RNAi被认为是机体阻止外来病毒感染、保护细胞免受病毒入侵的一种细胞自我保护机制，以病毒基因和宿主细胞分子为靶点，引入外源的小干扰RNA (short interfering RNA，siRNA)或小发夹RNA (short hairpin RNA, shRNA)能显著抑制病毒的表达。RNAi作为一种抗病毒感染的新途径已成功地应用于多种病毒，显示出了良好的应用前景。IBDV属双RNA病毒科双RNA病毒属，基因组包括大(A)小(B)两个片段。VPl是病毒的非结构蛋白，是由B片段编码的一种依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)，VPl与病毒RNA 的复制和毒力有关。VP2是病毒的主要结构蛋白之一，由A片段编码的多聚蛋白加工而成， 位于病毒粒子的外表面，占总结构蛋白量的51%，既是病毒的主要结构蛋白，又是病毒的主要保护性抗原，与病毒中和抗体的诱导、抗原和毒力的变异以及细胞凋亡的诱导等有关。因此，选择IBDV VPl和IBDV VP2基因为靶标，构建了一个同时靶向IBDV VPl和VP2基因的双 chU6启动子双shRNA表达质粒pSilencer2. l+2chU6+VPlVP2shRNA,既可以保证两个shRNA 被同时高效转录，不受转录位置先后的影响；又可以同时敲除IBDV的两个重要基因，高效抑制的IBDV复制，是一种新型IBDV防治制剂，具有良好的实用价值和推广前景。三、发明内容技术问题
目前，使用的IBDV常规弱毒疫苗和灭活疫苗，其安全性和制造工艺仍存在不足为预防变异毒株而采用中强毒力活疫苗存在着较大的生物安全问题，因为在不同IBDV毒株之间潜在着基因重配的可能，给该病的防控带来隐患；灭活疫苗存在着抗原制备的困难；以 VP2为靶基因的IBD基因工程疫苗，采用的表达系统包括大肠杆菌、酵母、鸡痘病毒载体、 杆状病毒表达载体、核酸疫苗以及多表位疫苗等，各有所长，仍需改进。SiRNA因其合成价格昂贵、稳定性差、毒性大，而使其使用受到限制；shRNA表达载体则克服了上述缺点，它具有稳定性好、毒性小，在细胞中持续抑制靶基因的表达可持续数星期甚至更久。但是，目前shRNA表达载体使用的RNA聚合酶III启动子 (pol III)主要为人源和鼠源的TO启动子和人Hl启动子，它们在禽源细胞中的转录活性并不理想，且目前市场上尚无禽源细胞特异性RNA聚合酶III启动子，因此开发高效的禽源细胞特异性shRNA启动子具有重要意义。本发明选择IBDV VPl和IBDV VP2基因为靶标，构建一个同时靶向IBDV VPl和VP2基因的双chTO启动子双shRNA表达质粒 pSilencer2. l+2chU6+VPlVP2shRNA,既可以保证两个shRNA被同时高效转录，又可以同时敲除IBDV的两个重要基因，高效抑制IBDV的复制，在IBDV新型防治制剂方面具有良好的应用前景。
技术方案
运用基因工程方法构建鸡TO启动子(chU6 )；设计两个靶向分别为IBDV VP1和VP2基因的 shRNA 分子；构建双 chU6 启动子双 shRNA 表达质粒 pSilencer2. l+2chU6+VPlVP2shRNA ； 应用表达质粒pSilencer2. l+2chU6+VPlVP2shRNA在CEF细胞和SPF鸡胚上进行功能分析。 具体包括
1、鸡冊启动子(0仙6)的构建
根据参考文献设计引物，上游引物引入EcoR I.Sal I位点，下游引物引入Hind III、 XhoI、BamH I位点，引物由Invitrogen公司合成
chU6 (F) 5- CG GAATTC kCGCGTCGAC GCGGCCGCGACAACACAAGCATCGAG-3
chU6(R) ^-CCCAAGCTTCCQCTCGAGCQGGA 7TCTAGTATATGTGCTGCCGAAGCGAGCACGGAC-3
取新鲜的鸡肝脏组织(IOOmg)充分剪碎，按TIANDZ公司的柱式动物DNAout说明书提取基因组DNA。以鸡的基因组DNA为模板，按下面50μ PCR反应体系扩增chTO启动子鸡基因组 DNA IOOng, IOXPCR Reaction Buffer 5μ ,25 mmol. T1MgCl2 4μ ,2. 5mmol. L-1 dNTP mix 4μ , lOpmol. L-1 chU6 (F) Ιμ , lOpmol. L-1 chU6 (R) lPL，Taq DNA polymerase 5U, ddH20 32μ 。PCR 扩增条件94°C 3min，94°C 45s, 62 °C 45s, 72 °C 45s，32 个循环；72 °C IOmin0 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，DNA胶回收试剂盒纯化，T4 DNA Ligase连接，转化 E. coli T0P10感受态细菌，涂布在用LB配制的1. 5%琼脂平皿上(含lOOPg/ml氨苄青霉素、100 μδ/πι1 X-gal和40 μδ/πι1 IPTG)，37°C培养14 h。挑单菌落接种入LB (含氨苄青霉素10(^g/ml)，振摇培养12 h，用MiniBEST质粒纯化试剂盒提取质粒，AcoR I和历'/ d III双酶切鉴定，获得含有chTO序列的重组质粒pMD18-chU6。测序分析。构建的ChTO启动子其特征具有RNA聚合酶III的三个上游元件0CT、PSE、TATA。
2、两个靶向分别为IBDV VPl和VP2基因的小发夹RNA (shRNA)分子设计
shRNA名称编码shRNA的DNA序列VPl-shRNA2550(F)5-GATCCCCGTACCCAGAAGTCMGAACTTCAAGAGAGTTCTTGACTTCTGGGTACTTTTTC-3VPl-shRNA2550(R)5-TCGAGAAAAAGTACCCAGAAGTCAAGAACTCTCTTGAAGTTCTTGACTTCTGGGTACGGG-3VP2-shRNA392(F)5-GATCCCCGAAGCCTGAGTGAACTGACTTCAAGAGAGTCAGTTCACTCAGGCTTCTTTTTC-3VP2-shRNA392(R)5-TCGAGAAAAAGMGCCTGAGTGAACTGACTCTCTTGAAGTCAGTTCACTCAGGCTTCGGG-3
将合成的编码VPl-shRNA2550、VP2_shRNA392的单链DNA序列分别按照F与R的方法配对退火，分别得到双链shRNA。反应体系为正义DNA模板(100 pmol/^L)10 μ ，反义DNA 模板(100 pmol/>L)10 μ , 5 X Annealing Buffer for DNA Oligos 20 μ , Nuclease-Free Water 60 μ ,95°0 5 min，室温退火 30 min，制备双链 shRNA。
3、双 chU6 启动子双 shRNA 表达质粒 pSilencer2. l+2chU6+VPlVP2shRNA 的构建将制备的 VPl-shRNA2550、VP2_shRNA392 分别插入 pMD18_chU6 的 BamH I 与 Xho I 位点，获得重组质粒 pMD18-chU6+VPl-shRNA2550 和 pMD18_chU6+ VP2_shRNA392。将 pMD18-chU6+ VP2-shRNA392质粒用Xho I单酶切，1%琼脂糖凝胶电泳、DNA凝胶回收试剂盒回收pMD18-chU6+VP2-shRNA392 片段；将pMD18-chU6+VPl_shRNA2550质粒用 SalI 与Xho I 双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳、DNA凝胶回收试剂盒回收chTO+VPl-shRNA2550片段；T4 DNA Ligase连接，转化五coli TOPlO感受态细菌，涂布在用LB配制的1. 5 %琼脂平皿上(含氨苄青霉素100 μδ/πι1),37 °C培养14 h，挑单菌落接种入LB，振摇培养12 h，用MiniBEST 质粒纯化试剂盒提取质粒，BamH I单酶切鉴定，获得重组质粒PMD18+2chTO+VPlVP2shRNA。将质粒PMD18+2chU6+VPlVP2shRNA 和质粒 pSiIencer 2. 1-U6 neo 分别用 I 私Hind III双酶切，用1%的琼脂糖凝胶电泳回收2chU6+VPlVP2shRNA片段和pSilencer 2. 1-U6 neo载体片段，DNA凝胶回收试剂盒纯化，T4 DNA Ligase连接，转化五coli TOPlO 感受态细菌，涂布在用LB配制的1.5 %琼脂平皿上(含氨苄青霉素100 μδ/πι1),37 °C培养 14 h，挑单菌落接种入LB，振摇培养12 h，用MiniBEST质粒纯化试剂盒提取质粒，I 私 Hind III双酶切鉴定，获得表达质粒 ρ Silencer 2. l+2chU6+VPlVP2shRNA。双chU6启动子双shRNA表达质粒ρSilencer 2. l+2chU6+VPlVP2shRNA的特点为 ①启动shRNA的转录为禽源的chTO启动子；②VPl-shRNA2550和VP2_shRNA392分别由独立的ChTO启动子转录，可以同时被高效转录，不受转录位置先后的影响；③可以同时敲除 IBDV的两个重要基因，双重保证RNAi的效果，提高RNAi的成功率。所述表达质粒ρ Silencer 2. l+2chU6+VPlVP2shRNA可以在IBDV防治方面得到应用。有益效果本发明的特点和优点如下
我国是世界上养鸡大国，从近几年对鸡的传染病流行病学调查分析、发病的临床表现与检测结果来看，IBDV在我国广泛存在，鸡群的发病、免疫失败等与IBDV感染有着很大的相关性。目前，使用的常规弱毒疫苗和灭活疫苗，其安全性和制造工艺仍存在不足为预防变异毒株而采用中强毒力活疫苗存在着较大的生物安全问题，因为在不同IBDV毒株之间潜在着基因重配的可能，给该病的防控带来隐患；灭活疫苗存在着抗原制备的困难；以VP2为靶基因的IBD基因工程疫苗，采用的表达系统包括大肠杆菌、酵母、鸡痘病毒载体、杆状病毒表达载体、核酸疫苗以及多表位疫苗等，各有所长，仍需改进。因此，探索新的IBDV防控技术是十分必要的。RNA干扰(RNAi)被认为是机体阻止外来病毒感染、保护细胞免受病毒入侵的一种细胞自我保护机制，以病毒基因和宿主细胞分子为靶点，引入外源的小干扰RNA (short interfering RNA, siRNA)或小发夹 RNA (short hairpin RNA, shRNA)能显著抑制病毒的表达。RNAi作为一种抗病毒感染的新途径已成功地应用于多种病毒，可以抑制IBDV病毒粒子复制和转录模板的生成，从源头上清除IBDV。siRNA因其合成价格昂贵、稳定性差、毒性大，而使其使用受到限制；shRNA表达载体则克服了上述缺点，它具有稳定性好、毒性小，在细胞中持续抑制靶基因的表达可持续数星期甚至更久。目前，shRNA表达载体使用的RNA聚合酶III启动子(pol III)主要为人源和鼠源的U6启动子和人Hl启动子。它们在禽源细胞中的转录活性并不理想，且目前市场上尚无禽源细胞特异性RNA聚合酶III启动子，因此开发禽源细胞特异性shRNA启动子具有重要意义。本发明构建的RNA聚合酶III启动子(pol III) chTO启动子，其特征具有RNA聚合酶III的三个上游元件0CT、PSE、TATA。在RNA聚合酶III启动子的上游元件中，只要靠近起点存在TATA元件，就能起始转录。而PSE和OCT元件的存在将会提高转录效率。IBDV属双RNA病毒科双RNA病毒属，基因组包括大(A)小(B)两个片段。VPl是病毒的非结构蛋白，是由B片段编码的一种依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)，VPl与病毒RNA 的复制和毒力有关。VP2是病毒的主要结构蛋白之一，由A片段编码的多聚蛋白加工而成，位于病毒粒子的外表面，占总结构蛋白量的51%，既是病毒的主要结构蛋白，又是病毒的主要保护性抗原，与病毒中和抗体的诱导、抗原和毒力的变异以及细胞凋亡的诱导等有关。因此，本实验在前期RNAi实验的基础上，挑选高效的VPl-siRNA2550、VP2_siRNA 392 序列，设计VPl-shRNA2550、VP2_shRNA392，构建shRNA表达载体。为了防止某个基因突变和转录效率低而使RNAi失败，因而本发明选择构建一个同时针对IBDV VPl和VP2基因的双 chU6 启动子双 shRNA 表达质粒 pSilencer2. l+2chU6+VPlVP2shRNA, VPl- shRNA2550 和 VP2-shRNA392分别由独立的chU6驱动表达。双chU6启动子双shRNA表达质粒pSilencer 2. l+2chU6+VPlVP2shRNA 的优势有两点①可以保证 VPl_shRNA2550 和 VP2_shRNA392 同时被高效转录，不受转录位置先后的影响；②可以同时敲除IBDV的两个重要基因，双重保证 RNAi的效果，提高RNAi的成功率。用所构建的双chU6 启动子双 shRNA表达质粒pSilencer 2. l+2chU6+VPlVP2shRNA 转染CEF细胞，接种IBDV，进行IBDV病毒复制抑制实验，细胞形态学观察发现，可明显抑制细胞病变效应(CPE)和病毒滴度。将pSilencer2. l+2chU6+VPlVPkhRNA与IBDV混合，接种于10日龄SPF鸡胚尿囊腔，可保护鸡胚免受IBDV感染，鸡胚发育正常；用荧光定量RT-PCR 分析鸡胚组织和尿囊液中VPl和VP2基因的表达水平，pSilencer 2. l+2chU6+VPlVP2shRNA 转染组VPl基因水平与对照组(单独接种IBDV组)VPl基因水平相比降低了 92%，VP2基因水平与对照组(单独接种IBDV组)VP2基因水平相比降低了 95%。综合分析双chU6 启动子双 shRNA 表达质粒 pSilencer 2. l+2chU6+VPlVP2shRNA 在CEF和鸡胚中的实验结果，本发明设计的两个shRNA :VPl-shRNA2550和VP2_shRNA392及其构建的双chU6启动子双shRNA的表达质粒pSilencer2. l+2chU6+VPlVP2shRNA是一种新型IBDV防治制剂，具有良好的实用价值和推广前景。
四
图1 shRNA模板的设计
图2 双chU6启动子双shRNA表达质粒pSiIencer 2. l+2chU6+VPlVP2shRNA的分子图
谱
图3 chTO启动子的酶切图谱
图 4 双 chU6 启动子双 shRNA 表达质粒 ρ Silencer 2. l+2chU6+VPlVP2shRNA 的酶切
图谱
图 5 双 chU6 启动子双 shRNA 表达质粒 pSilencer2. l+2chU6+VPlVP2shRNA 对 IBDV 致 CEF病变的抑制效果(CPE)
图 6 双 chU6 启动子双 shRNA 表达质粒 pSilencer2. l+2chU6+VPlVP2shRNA 对 IBDV 在 CEF中复制的抑制效果(TCID5tl)
图 7 双 chU6 启动子双 shRNA 表达质粒 pSilencer2. l+2chU6+VPlVP2shRNA 对 IBDV 在 SPF鸡胚中复制的抑制效果(形态学观察)
图 8 双 chU6 启动子双 shRNA 表达质粒 pSilencer2. l+2chU6+VPlVP2shRNA 对 IBDV 在 SPF鸡胚中复制的抑制效果(荧光定量RT-PCR检测结果)
五具体实施方式
1实验材料
鸡抗IBDV高免血清系用IBD弱毒疫苗(B87株，购自南京天邦生物科技有限公司)对 SPF鸡(购自南京天邦生物科技有限公司)免疫5次获得，用DEAE纤维素(DE32)纯化(刘玉斌，苟仕金主编.动物免疫学实验技术.长春吉林科学技术出版社，1989，8-15);
HRP标记的鸡抗IBDV IgG抗体参照文献制备(刘玉斌，苟仕金主编.动物免疫学实验技术.长春吉林科学技术出版社，1989，150-151 ；王永山，郝崇，侯世宽，刘子，马从林，殷震.抗鸡IgG单克隆抗体的研究.兽医大学学报，1989，9 (2): 109-114)。Ex Taq DNA 合成酶、T4 DNA 连接酶、Sal I、Hind III、XhoI、BamH I、EcoRI、DNA Marker、X_gal、IPTG、MiniBEST质粒纯化试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、克隆载体pMD18_T simple Vector、SYBR PrimeScript RT-PCR Kit 均购自 TaKaRa 公司。Ε. coli TOPlO购自hvitrogen公司。引物合成、DNA序列测定由hvitrogen公司完成。实验方法
2. 1鸡TO启动子(chU6)的构建
根据参考文献设计引物，上游引物引入EcoR I.Sal I位点，下游引物引入Hind III、 XhoI、BamH I位点，引物由Invitrogen公司合成
chU6 (F) 5- CG GAATTC kCGCGTCGAC GCGGCCGCGACAACACAAGCATCGAG-3
chU6(R) ^-CCCAAGCTTCCQCTCGAGCQGGA 7TCTAGTATATGTGCTGCCGAAGCGAGCACGGAC-3
取新鲜的鸡(白来航鸡)肝脏组织(IOOmg)充分剪碎，按TIANDZ公司的柱式动物 DNAout说明书提取基因组DNA。以鸡的基因组DNA为模板，按下面50μ PCR反应体系扩增 chU6 启动子鸡基因组DNA IOOng, IOXPCR Reaction Buffer 5μ ,25 mmol. T1MgCl2 4μ ,2. 5mmol. L-1 dNTP mix 4μ , lOpmol. L-1 chU6 (F) μ , lOpmol. L-1 chU6 (R) μ , Taq DNA polymerase 5U, ddH20 32PL。PCR 扩增条件94 °C 3min，94°C 45s, 62 °C 45s, 72 °C 45s，32 个循环；72 °C IOmin0 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，DNA胶回收试剂盒纯化(chTO基因片段59!3bp)， T4 DNA Ligase连接(pMD18-T载体)，转化五coli T0P10感受态细菌，涂布在用LB配制的 1.5%琼脂平皿上(含 lOOPg/ml 氨苄青霉素、100 μδ/πι1 Χ-gal 和 40 μδ/πι1 IPTG)，37°C培养14 h。挑单菌落接种入LB (含氨苄青霉素lOOPg/ml)，振摇培养12 h，用MiniBEST质粒纯化试剂盒提取质粒，重组质粒pMD18-chTO经I和历·/ (! III双酶切鉴定，用含EB的1 %琼脂糖凝胶电泳分析，可见2条长度分别约593bp和2. 7 Kb的DNA片段，与chTO基因片段和PMD18-T载体大小理论值相符合(图3中1，2泳道)。测序分析。将克隆的序列提交 GenBank,用Nucleotide blast程序进行比对分析，发现克隆的chTO启动子序列其173-566 位核苷酸序列与已发表的鸡U6-3(DQ531569)启动子序列同源性为96%，据此将173-566位核苷酸序列定为chTO启动子区域。构建的chTO启动子其特征具有RNA聚合酶III的三个上游元件0CT、PSE、TATA。
2. 2两个靶向分别为IBDV VPl和VP2基因的shRNA分子设计
根据shRNA设计原则，选择IBDV VPl基因(DQ403M9)的2550和IBDV VP2基因 (AF508177)的392序列为靶标，设计shRNA，同时设立阴性shRNA对照，设计的序列见表1
表1 shRNA的设计
权利要求
1. 一种双chTO启动子双shRNA表达质粒，其构建方法为 1)鸡TO启动子chTO的构建设计引物，上游引物引入EcoR I.Sal I位点，下游引物引入Hind 111,XhoI,BamH I位占.chU6 (F) 5- CG GAATTC kCGCGTCGAC GCGGCCGCGACAACACAAGCATCGAG-3 chU6(R) ^-CCCAAGCTTCCQCTCGAGCQGGA 7TCTAGTATATGTGCTGCCGAAGCGAGCACGGAC-3 以鸡的基因组DNA为模板，按下面50μ PCR反应体系扩增chTO启动子鸡基因组 DNA IOOng, IOXPCR Reaction Buffer 5μ ,25 mmol. T1MgCl2 4μ ,2. 5mmol. Γ1 dNTP mix 4μ , lOpmol. L-1 chU6 (F) Ιμ , lOpmol. L-1 chU6 (R) Ιμ , Taq DNA polymerase 5U, ddH20 32μ ；PCR 扩增条件94°C 3min，94°C 45s, 62°C 45s, 72°C 45s，32 个循环；72°C IOmin ； PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，DNA胶回收试剂盒纯化，T4 DNA Ligase连接，转化五 coli T0P10感受态细菌，纯化，I和历·/ (! III双酶切鉴定，获得含有chTO序列的重组质粒pMD18-chU6，构建的chTO启动子具有RNA聚合酶III的三个上游元件0CT、PSE、TATA ； 2)两个靶向分别为IBDV VPl和VP2基因的shRNA分子设计
2.权利要求1所述表达质粒在IBDV防治方面的应用。
全文摘要
本发明涉及双chU6启动子双shRNA表达质粒的构建及应用，属于生物制药领域。构建鸡U6启动子(chU6)，设计两个靶向分别针对IBDVVP1和VP2基因的小发夹RNA(shRNA)VP1-shRNA2550和VP2-shRNA392。构建表达质粒pSilencer2.1+2chU6+VP1VP2shRNA，转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，接种IBDV，可抑制病毒复制。将表达质粒pSilencer2.1+2chU6+VP1VP2shRNA与IBDV混合，接种于10日龄SPF鸡胚尿囊腔，可保护鸡胚免受IBDV感染。本发明构建的双chU6启动子双shRNA表达质粒是一种新型IBDV防治制剂，具有良好的实用价值和推广前景。
文档编号C12N15/85GK102226203SQ201110127319
公开日2011年10月26日 申请日期2011年5月17日 优先权日2011年5月17日
发明者张海彬, 欧阳伟, 王永山, 马金荣 申请人:江苏省农业科学院