专利名称：Dc-sign启动子荧光素酶报告质粒的构建方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，涉及DC-SIGN启动子荧光素酶报告质粒的构建方法。
背景技术：
DC-SIGN是DCs表面重要的功能分子，在机体免疫过程中起重要的作用。通过DCs的 抗原呈递作用，DC将机体感染的病毒、细菌和原虫呈递到效应细胞周围，通过效应细胞的 直接和间接杀伤，发挥机体的免疫作用，从而消除或者抑制感染机体的病原微生物。在这个 过程中，位于DC表面的DC-SIGN起着核心作用。到目前位置，已经知道，DC-SIGN是多 种病原微生物的受体，包括HIV， HCV， CMV， SARS，登革热病毒，埃博拉病毒，结核杆 菌，大肠杆菌核心成份，利什曼原虫等等。
以HIV为例，DC-SIGN可以和HIV-gpl20蛋白高亲和力结合，这种亲和力比HIV-gpl20 一CD4分子间的亲和力更高。DC-SIGN通过识别、结合和携带HIV颗粒，将HIV病毒颗粒 从外周感染部位运送到所在部位的二级引流淋巴结，在淋巴节内感染T细胞，从而进一步将 病毒向全身传播。在此过程中，DC-HIV-CD4+细胞形成一个结合体，这种结合体，在空间 上拉近了 HIV和CD4+ T细胞的距离，使HIV的配体和CD4+T细胞的受体易于对合，增加 了 CD4+T细胞感染的机会。另外，HIV还可以和DCs表面的TLR (Toll Like Receptor)结 合，通过TLR下游的反应，使DCs分泌细胞因子，上调DC-IGN的表达。这说明DC-SIGN 在DC细胞的表达，不仅受内在因素的调节作用，也受外界因素的影响。
在体外的表达模型中，DC-SIGN主要受IL-4作用调控。从人外周血分离的单个核细胞， 经过IL-4和GM-CSF的联合刺激，或者血液系统来源的细胞株THP-1, Jurknt等经过IL-4 和PMA的剌激，都可以使这些细胞表达活性DC-SIGN，在体外作为DC-SIGN表达模型。 而在体内，DC-SIGN仅仅表在皮肤表皮粘膜下的某些种类的DCs上，以及在肠道淋巴结和 胎盘等处，表达相对局限。
在真核细胞，基因表达调控机制相对复杂，但是，基因的启动子在基因的表达调控中仍 然起主要作用。DC-SIGN基因启动子区对于病毒感染有着重要意义，因此，我们首先分离 DC-SIGN基因启动子，并构建在荧光素酶报告载体中，分别转染Hela、Hacat 、 Wish和HuVEC 细胞株，通过荧光素酶的活性测定，对DC-SIGN启动子的活性进行调查，研究DC-SIGN的 生物学特点，探讨DC-SIGN表达机制以及DC-SIGN启动子在DC-SIGN表达过程中的意义。
发明内容
本发明的目的是提供DC-SIGN启动子荧光素酶真核报告质粒的构建方法。 本发明DC-SIGN启动子荧光素酶报告质粒的构建方法包括以下步骤
(1) 参考GeneBank AF209479的DC-SIGN启动子序列，设计DC-SIGN启动子的一对引物， 在5'端和3，端分别引入MluI和BglII识别位点ACGCGT禾n AGATCT,用PCR法高保 真扩增DC-SIGN启动子片段，并纯化PCR产物，备用；
(2) 对DC-SIGN启动子片段和它的表达载体pGL3-basic分别进行双酶切，并将纯化后的酶 切产物进行连接，连接产物转化DH-5a感受态细胞，挑单个白色菌落扩增，抽提重组质粒 DNA，作双酶切鉴定。
上述DC-SIGN启动子的 一对引物序列如下 sense primer: ATCATACGCG TATGAGTCCT TCTCCCTGTC ，含有MluI酶切位点； antisense primer: TGTAAGATCT GTCACCCCAC TCTCCCCCAG ，含有Bgl II酶切位点。
图1为pGL3-basic和pGL3-contro1的结构图。
图2为DC-SIGN启动子扩增结果图，DNAmarker为lOObp marker。 图3为DC-SIGN启动子的序列特征图。
图4为DC-SIGN-promoter-pGL3-Basic酶切结果图。左边第1泳道为200bp DNA ladder,第 2泳道为DC-SIGN promoter PCR产物对照，3-7泳道为DC-SIGN-promoter-pGL3-Basic双 酶切结果，第8泳道为pGL3-Basic双酶切结果，第9泳道为VHind III DNAladder。 图5为DC-SIGN启动子在不通细胞中得相对活性图。
具体实施例方式
1.构建dc-sign启动子荧光素酶报告质粒 1.1扩增dc-sign启动子
取正常人外周血，分离PBMC，使用PCR引物扩增DC-SIGN基因的启动子。所用的 上游引物为sense primer:: ATC ATACGC GTATGAGTC CTT CTC CCT GTC,含有MluI酶 切位点，antisense primer: TGT AAG ATC TGT CAC CCC ACT CTC CCC CAG，含有Bgl II酶 切位点。使用Invtrigon的Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity, PCR反应体系如下
5X PCR bufferlOjiL
2.5mM dNTP mix4pL
50mM MgS042|jL
1 OmM sense primer2pL
1 OmM antisense primer2pL
High Fidelity Taq(2U/pL)O单
DNA(lng/pL)l^L
DdH2028.5pL
Total volumes50pL
按如下程序在PCR仪器上进行扩增
1. 95。CX3min
2. 94。CX20sec 58。CX30sec
72。CX25sec 共30个循环
3. 72。CX5min 4 4"C保存
1.2 PCR产物纯化
使用过柱离心的方法，操作步骤和方法按着产品说明书进行 1.3构建DC-SIGN启动子荧光素酶报告质粒
pGL3-basic质粒经过大肠杆菌DH-5a扩增后，使用质粒小量抽提试剂盒进行抽提，操作 按说明书进行。然后将所得质粒和在l.l中所得PCR经Bgl II和Mlu双酶切,所用内切酶为 Takara公司得内切酶，体系如下A.B
10 X Buffer H10 X Buffer H4^1
BglII (10，)BglII (10U/|il)l^il
Mlu (10U/(xl)1^1Mlu (lOU/pDl^d
PGL3-Basic/Enhancer(0. lug/pl)10plDC-SIGN promoter(50ng/nl)20|_il
ddH202Vd胆2014(xl
total volume40nltotal volume40^1
将上述体系轻混匀，离心，37'C酶切过夜。酶切产物在1%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳电压 大小根据水平电泳槽两个电极间得距离进行设定，大小为5V/cm，电泳完毕后，进行DNA 凝胶回收。然后将所得纯化得DC-SIGN启动子片段(40ng4d)和pGL3-Basic质粒切割片 段(80ng/pl)用T4连接酶进行连接
10 X T4 ligation Buffer 1単
pGL3-Basic 3単 DC-SIGN promoter 1単
T4 ligase (5U/W) 1.5pl
ddH20_3，
Total volume 10|al
将上述混合物混匀，离心，在16'C反应3小时。 1.4将连接产物导入感受态细胞将事先用一步法感受态细胞制备溶液制好并且分装在灭菌Ep管中的DH-5a感受态细胞 lOOpl至于冰上，然后按如下步骤操作
(1) 感受态细胞冰上预冷20min
(2) 向感受态细胞中加入5nl的连接产物，轻轻混匀，冰上放置30分钟
(3) 42'C水浴箱中热休克90sec，立即冰上放置20分钟
(4) 加入800W无抗性的LB培养基
(5) 在水平恒温摇床中37°C 200rpm摇动1小时
(6) 4000rpm离心5分钟，去掉800^1上清
(7) 将剩余的100nl液体和沉淀混匀，均匀涂在含有氨苄青霉素(100吗/mL)的LB固体培养 平板上
(8) 先将平板在37'C细菌培养箱中正放30min，然后底面向上，细菌面向下，37"培养过夜。
(9) 挑取单克隆菌落，放于3mL含有氨苄青霉素的LB培养基中，以300rpm在37'C振荡12-16 小时
卿提取质粒，进行PCR和双酶切鉴定
(11)将经过鉴定含有正确克隆的菌液放于300mL(含有100pg/mL)的LB进行扩增 (19使用质粒中量高纯质粒抽提试剂盒抽提DC-promoter-pGL3-Basic
1.5抽提DC-promoter-pGL3-Basic
(1) 平衡液EQ平衡质粒抽提过滤柱
(2) 将300mL菌液8000rpm离心5min，彻底去上清
(3) 加入Lysis Buffer,彻底混匀，室温放置5min
(4) 加入中和液N buffer中和5min， 13000rpm高速离心15min
(5) 小心取上清，加入以被平衡的过滤柱，过滤，收集过滤所得液体
(6) 向收集的过滤液体中加入70%体积的异丙醇，混匀
(7) 13000rpm高速离心15分钟，小心去上清
(8) 70%乙醇洗涤沉淀一次，然后高速离心10min，小心去掉乙醇
(9) 干燥仪中将沉淀风至半干
(10) 加入ddH2O400^L融解质粒
1.6质粒DC-SIGN-promoter-pGL3-Basic (DSPGB)转染真核细胞
(1) 转染前一天，使用无不含抗生素的培养基培养细胞，并按0.6X104cell/ L，接种细胞到 96孔板
(2) 质粒按0.2叱/孑L(约2pL)， Opti-MEM reduced medium按25^L/孔的标准，将2pL的ddH20
作为空白对照，2nLpGL3-basic空载体作为阴性对照，2pLDSPGB，禾Q 2pLpGL3-control作 为阳性对照，分别稀释到Opti-MEM reduced medium中，混匀
(3) 将Lipofectamine 2000 Transfection Reagent按0.5pL/孔的用量稀释到25^iL的Opti-MEM 中，室温孵育5min
(4) 将稀释的Lipofectamine 2000 Transfection Reagent加入质粒-Opti-MEM中，轻轻混匀，室 温孵育20分钟
(5) 吸去96孔培养板细胞的培养基，加入50pL的Lipofectamine 2000-质粒混合物书，水平 方向轻轻摇动，使加入的液体混合物均匀分布于培养板底部
(6) 6小时后吸去上述液体，加入普通培养基
(7) 在细胞培养箱柱孵育30小时，然后检测荧光素活性
1.7荧光素酶活性检测 转染后30小时检测荧光素酶活性，按以下步骤进行(在室温下进行)
(1) 将Bright-Glo Luciferase buffer禾fl Bright-Glo Luciferase substrate混匀，做成Bright-Glo Luciferase Assay reagent,分装,置于-80。C备用
(2) Bright-Glo Luciferase Assay reagent中的试剂从-80。C取出，融化，在室温放置30min
(3) 将细胞从培养箱中取出，在室温放置5min，吸去培养板中细胞培养上清，用PBS洗涤1-2 次，去掉PBS
(4) 力口入100|jLBright-Glo Luciferase Assay reagent,
(5) 水平振荡Glo Lysis Buffer几次，确保Bright-Glo Luciferase Assay reagent覆盖底壁所有细 胞
(6) 室温孵育5min
(7) 在Orion II microplate luminometer进行检测，每孔检测时间为5sec
结果分析
1. DC-SIGN启动子的扩增
将PCR扩增的结果在2%的琼脂糖凝胶上进行电泳，所得的DNA片段大小为237bp，如 图l所示；
2. DC-SIGN启动子报告载体的构建
将DC-SIGN启动子和pGL3-Basic双酶切后，进行连接，连接产物转化大肠杆菌后，提 取质粒，进行酶切鉴定，结果如图3;
3. DC-SIGN基因启动子在不通细胞中活性结果的测定
我们发现，DC-SIGN启动子在Hacat和Hela细胞中的活性相对较高，而在HuVEC和Wish中的活性相对较低，这说明，DC-SIGN启动子在不同的细胞中，有着不同的表达活性， 这种表达活性，可能与细胞内的微环境有关。与含有SV40启动子的pGL3-contro1相比， DC-SIGN启动子报告基因产生得荧光素酶活性要低得多。 结论
我们成功构建了 DC-SIGN启动子荧光素酶报告质粒，并将其分别导入Hela、 HaCat、 Wish和HuVEC304中，通过荧光素酶活性检测，发现在不同细胞株中表达活性不同，在表 皮细胞来源的HaCat和上皮来源的Hela细胞株中表达活性相对较高。 序列表
sense primer: ATCATACGCG TATGAGTCCT TCTCCCTGTC antisense primer: TGTAAGATCT GTCACCCCAC TCTCCCCCAG
权利要求
1、DC-SIGN启动子荧光素酶报告质粒的构建方法，其特征在于下述步骤(1)参考GeneBank AF209479的DC-SIGN启动子序列，设计DC-SIGN启动子的一对引物，在5’端和3’端分别引入Mlu I和Bgl II识别位点ACGCGT和AGATCT，用PCR法高保真扩增DC-SIGN启动子片段，并纯化PCR产物，备用；(2)对DC-SIGN启动子片段和它的表达载体pGL3-basic分别进行双酶切，并将纯化后的酶切产物进行连接，连接产物转化DH-5α感受态细胞，挑单个白色菌落扩增，抽提重组质粒DNA，作双酶切鉴定。
2、 根据权利要求1所述DC-SIGN启动子荧光素酶报告质粒的构建方法，其特征在于所述 DC-SIGN启动子的一对引物序列如下sense pri證ATCATACGCG TATGAGTCCT TCTCCCTGTC antisense primer: TGTAAGA丁CT GTCACCCCAC TCTCCCCCAG 。
全文摘要
本发明公开了DC-SIGN启动子荧光素酶报告质粒的构建方法。通过构建DC-SIGN启动子片段与荧光素酶报告载体pGL3-Basic的重组真核表达质粒DC-promoter-pGL3-Basic，并将该质粒在Hela、Hacat、Wish和HuVEC细胞株中进行表达和活性鉴定，本发明成功构建了DC-promoter-pGL3-Basic DC-SIGN启动子荧光素酶报告质粒。通过在Hela、Hacat、Wish和HuVEC细胞株进行表达和荧光素酶活性检测，证明了DC-SIGN启动子在不同细胞株中表达活性不同，在表皮细胞来源的HaCat和上皮来源的Hela细胞株中表达活性相对较高。
文档编号C12N15/65GK101182539SQ20071015650
公开日2008年5月21日 申请日期2007年11月6日 优先权日2007年11月6日
发明者吴南屏, 许利军, 靳昌忠 申请人:浙江大学