专利名称：：玉米细胞色素p450基因的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于基因工程领域。具体的说，本发明涉及利用玉米细胞色素P450基因能产生抗除草剂的农作物；以及利用该基因构建得到的反义RNA或RNAi，能获得可用除草剂选择性杀灭的转基因农作物的方法。
背景技术：
：转基因农作物目前已经在世界许多国家大量推广种植。例如转基因抗虫、抗除草剂玉米已经在北美大量推广，转基因棉花也已经在中国大量种植。改良农作物的抗除草剂能力是农作物改良的重要方面。因此发现和利用抗除草剂基因具有重要的应用价值。玉米抗草甘膦的研究非常多，但是抗其他除草剂的基因工程比较少。例如，玉米本身具有一定的抗苯达松和磺酰脲类除草剂能力，但是抗性不足；因此进一步提高玉米对抗苯达松和磺酰脲类除草剂的抗性，可以进一步提高玉米的防治杂草能力。另一方面，转基因农作物应用的重要工作之一是控制它们的传播、防止它们混入到非转基因农作物之中。特别是防止作为生物反应器生产药物蛋白质、工业酶和其他可能对人和动物有不良作用的转基因品种混入粮食和词料用品中是非常重要的。因此，开发一种简便的方法来控制转基因农作物具有重大价值。苯达松和磺酰脲类除草剂是常用的农业除草剂，其对许多宽叶杂草具有良好的杀草能力；禾本科农作物中具有这些除草剂的解毒酶，因此对此除草剂具有一定的抗性。如果通过转基因来增加解毒酶基因的表达，就可以进一步提高农作物的抗性，从而能够更好地利用这些除草剂控制杂草。此外，在转基因植物中抑制抗苯达松和磺酰脲类除草剂的解毒酶的表达、而获得的对苯达松和磺酰脲类除草剂敏感的转基因玉米，在必要时就能够上述除草剂选择性地消灭；从而起到防止、限制转基因玉米的扩散，清除混入到非转基因玉米的作用，有利转基因玉米的生物安全。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供玉米细胞色素P450基因的用途。利用该基因可以产生对抗苯达松和磺酰脲类除草剂具有更高抗性的农作物，也可以利用该基因获得可用除草剂选择性杀灭的转基因玉米。为了解决上述技术问题，本发明提供一种玉米细胞色素P450基因，其具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列；其用途是使用该基因所得的转基因农作物具有增强对苯达松和磺酰脲类除草剂更高抗性能力。本发明还提供了一种DNA质粒，该DNA质粒含有上述细胞色素P450基因或者其中的基因片断所构建得到的反义RNA或RNAi的抑制表达框。作为本发明DNA质粒的改进反义RNAi的核苷酸序列为SEQIDNO:6。本发明还提供了一种转基因玉米细胞其含有上述质粒。本发明还提供了一种转基因玉米的制备方法将上述转基因玉米细胞培育成植株。本发明还提供了上述DNA质粒的用途利用该DNA质粒所得的转基因农作物对苯达松和磺酰脲类除草剂抗性能力大幅度降低，从而利用苯达松和磺酰脲类除草剂能选择性地控制(杀灭)该转基因农作物。本发明首先提供一种玉米细胞色素P450基因，该基因的cDNA核苷酸序列为SEQIDNO:1，编码的蛋白质的氨基酸序列为SEQIDNO:2;该基因在本发明中被命名为ZM-P450A。ZM-P450A可以通过转基因导入玉米或者其他农作物而增强它们的抗苯达松和磺酰脲类除草剂的能力。增强农作物的抗除草剂能力有利于杂草的防治。ZM-P450A基因可以和一个启动子和一个终止子功能性地连接而组成表达框。启动子可以是水稻或者玉米泛素(Ubiqutin)启动子、或者水稻Actin启动子、或者是花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)、或者是其他有活性的启动子；终止子可以利用生物中功能基因的天然终止子，例如NOS终止子。ZM-P450A基因表达框可以通过基因枪方法和农杆菌介导等方法导入农作物基因组。基因枪方法和农杆菌介导方法都是已知并且成熟的方法(Hieietal.1994Effieienttransformationofrice(OryzasativaL.)mediatedbyagrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesoftheT画DNA.777e_P/a"f6:271-282)。含有ZM-P450A基因的转基因农作物，由于增强了抗苯达松和磺酰脲类除草剂的能力；因此实际田间操作中，可以提高所使用的苯达松和磺酰脲类除草剂的浓度，从而提高了杀草效果，且大大降低了对该种转基因农作物所造成的药害可能性。由于任何转基因玉米均可以通过花粉扩散或者直接通过种子传播到计划种植以外的地方，这种转基因玉米的传播是应用和推广转基因玉米中所存在的一个安全性问题。特别是表达药物蛋白质和工业酶的转基因玉米，它们的传播可能是有害的。本发明利用反义RNA或者RNAi抑制玉米中这种细胞色素P450基因的表达，可以使所得的转基因玉米对苯达松和磺酰脲类除草剂敏感，从而能达到可利用苯达松和磺酰脲类除草剂选择性地杀灭转基因玉米的目的。本发明通过使转基因玉米对苯达松和磺酰脲类产生敏感性而实现在必要时能够选择性地杀灭转基因玉米，从而保证了目的基因能够被控制。例如在种植非转基因品种的大田中，只要使用苯达松和磺酰脲类除草剂防治杂草就可以消灭可能混入的转基因品种。上述目的基因包括一种抗草甘膦基因，从而使获得的转基因农作物对草甘膦具有高抗性而对苯达松和磺酰脲类除草剂敏感。上述目的基因还可以包括抗虫等抗逆基因、工业酶基因、药物蛋白质基因以及其他有价值的适宜在植物中表达的基因；可以是其中的一个、二个或者多个基因。在本发明中，苯达松和磺酰脲类的解毒基因ZM-P450A抑制表达框可以由二个部分组成一个是启动子，它可以是水稻或者玉米泛素(Ubiqutin)启动子、或者水稻Actin启动子、或者是花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)、或者是其他在禾本科农作物中有活性的启动子；另一个部分与启动子功能性相联的是本发明的细胞色素P450基因ZM-P450A(SEQIDNO:l)的反义RNA或者RNAi。利用反义RNA和RNAi抑制表达的机理和技术已经有完整的描述，是已经有的技术(Kusaba2004RNAInterferenceincropplants,CurrentOpinioninBiotechnology,15:139-143)。产生反义RNA的DNA模板可以是全长基因，或者仅仅是其中的一个或几个片断。产生RNA干扰的序列(RNAi)可以根据SEQIDNO:l设计。同时具有目的基因表达框和苯达松和磺酰脲类的解毒基因抑制表达框的载体可以通过转基因的方法稳定导入玉米。这个方法包括基因枪方法和农杆菌介导方法，这二种方法都是成熟的已知的方法。在本发明中，由于目的基因表达框与苯达松和磺酰脲类除草剂的解毒酶基因ZM-P450A抑制表达框连接在同一个DNA导入片断上，从而达到在转基因玉米中目的基因与苯达松、磺酰脲类除草剂的解毒酶基因的抑制表达基因紧密连锁。该种转基因玉米在必要时能够被苯达松或磺酰脲类抗除草剂杀灭，从而防止它们的传播。本发明提供了利用不同的除草剂(苯达松和磺酰脲类除草剂)对转基因植物可以进行正选择和负选择的技术。当目的基因为抗草甘膦基因时，其与抑制玉米细胞色素P450基因的DNA片断构建在同一个质粒上；这样，对草甘膦的抗性和对苯达松和磺酰脲类的敏感性在转基因玉米中高度连锁。用这种方法获得的转基因植物可以利用草甘膦进行筛选和杂草防治，同时也可以利用苯达松和磺酰脲类除草剂控制和消灭转基因玉米。综上所述，本发明的优点如下1、本发明的基因是玉米自己的基因，因此利用本发明的基因进一步培育抗性更高的转基因抗除草剂农作物，其安全性更高。当某些农作物对苯达松或磺酰脲类除草剂没有抗性时，使用本发明的方法可以使其具有抗性；当某些农作物对苯达松或磺酰脲类除草剂具备抗性时，使用本发明的方法可以进一步增强其抗性。2、在转基因玉米中表达目的基因的同时，利用反义RNA或者RNAi的方法抑制水稻中这种细胞色素P450基因的表达，从而使该种转基因农作物对苯达松和磺酰脲类除草剂敏感，进而可以被选择性地杀灭。由于目的基因表达框与苯达松、磺酰脲类除草剂的解毒酶基因抑制表达框连接在同一个DNA导入片断上，从而达到在转基因玉米中目的基因与苯达松、磺酰脲类除草剂的解毒酶基因的抑制表达基因紧密连锁。因此必要时可以通过使用常用的苯达松和磺酰脲类除草剂防止转基因玉米的传播、消灭混入非转基因玉米中的转基因玉米。下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。图l是pCAMB1300Rice-GlyR-450i-ZM450A的T-DNA转化载体的构建示意图。图中G6为人工合成的i^ew6fomo"os/w&fe的EPSPS基因(gb:EU169459);载体pCAMB1300Rice-GlyR-450i在专利200610155661.7中有详细表述；ZM-P450A是本发明的基因；21111;^1为玉米"6/^衍"-/的启动子；35S是花椰菜花叶病毒(CaMV35S)35S启动子；在LB和RB之间是能够插入植物基因组的T-DNA片段。图2是pCAMBIA1300-G6-ZM450i的T-DNA转化载体示意图。G6为人工合成的尸ww^w2o"os/她V^的EPSPS基因(gb:EU169459);ZmUbi-l,玉米w&々w"/"-7的启动子；在LB和RB之间是能够插入植物基因组的T-DNA片段。具体实施例方式实施例l、相关玉米细胞色素P450基因的克隆根据玉米基因组数据库的序列，设计了能够通过对基因组DNA进行PCR扩增分别获得包含完整细胞色素P450基因的一个DNA片断。这个细胞色素P450基因是ZM-450A。其cDNA序列为SEQIDNO:1，所编码的蛋白质氨基酸序列为SEQIDNO:2。扩增ZM-450A的PCR的引物为zm450aF:NO:4)。PCR扩增的条件是95。Cl分钟，60°C1分钟，72。C2分钟，进行30个循环。这些细胞色素P450基因组PCR产物被克隆到T载体(上海生工)中，得到pT-zm450A质粒，测序说明克隆获得的基因和数据库的序列相同。实施例2、农杆菌转化ZM-450A基因的T-DNA载体的构建农杆菌转化T-DNA载体pCAMB1300Rice-GlyR-450i被用作构建在水稻中表达玉米细胞色素P450基因ZM-450A的T-DNA载体(申请号200610155661.7《选择性地消灭禾本科转基因植物的方法》)。pCAMB1300Rice-GlyR-450i中的T-DNA包含一个抑制水稻中降解苯达松和磺酰脲类除草剂基因P450表达的RNAi片断和一个耐草甘膦除草剂的基因。因此pCAMB1300Rice-GlyR-450i将导致转基因水稻对苯达松和磺酰脲类除草剂的敏感。但是如果在pCAMB1300Rice-GlyR-450i中同时导入能够提高苯达松和磺酰脲类除草剂抗性的外源基因，所获得的转基因水稻仍然能够表现为对苯达松和磺酰脲类除草剂的高抗性。含有ZM-450A的表达框的农杆菌转化T-DNA载体pCAMB1300Rice-GlyR-450i-ZM450A构建如图1所示。载体pCAMB1300Rice-GlyR-450i在5amM和双酶切后，与玉米启动子ZmUbi-l(///m/in和5amHl酶切pCAMB1300Rice-GlyR-450i而获得)以及ZM-450A基因(BawHl和《;"I酶切质粒pT-zm450A而获得)3个片断连接，获得农杆菌转化T-DNA载体pCAMB1300Rice-GlyR-450i-ZM450A(SEQIDN0:5)。实施例3、转基因水稻的获得将pCAMB1300Rice-GlyR-450i-ZM450A和pCAMB1300Rice隱GlyR-450i二个转化载体通过电击方法分别导入农杆菌LBA4404。水稻的转基因植物的获得方法是采用现有技术(卢雄斌龚祖埙1998生命科学10:125-131;刘凡等，2003分子植物育种1:108-115)。选取成熟饱满的秀水IIO种子去壳，诱导产生愈伤组织作为转化材料。取含pCAMB1300Rice-GlyR-450i-ZM450A和pCAMB1300Rice-GlyR-450i的农杆菌划板，分别挑单菌落接种准备转化用农杆菌。将待转化的愈伤组织放入适当浓度的农杆菌液中(含乙酰丁香酮)，让农杆菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到共培养基中，共培养23天。用无菌水冲洗转化后的愈伤，转移到含1—4mM草甘膦的筛选培养基上，筛选培养两个月(中间继代一次)。把筛选后，生长活力良好的愈伤转移到预分化培养基上培养20天左右，然后将预分化好的愈伤组织移到分化培养基，14小时光照分化发芽。2—3周后，把抗性再生植株转移到生根培养基上壮苗生根，最后将再生植株洗去琼脂移植于温室，作为鉴定材料。每个转化载体获得了15个以上独立的再生水稻株系。T-DNA的插入及其基因的表达可以通过PCR和western印迹分析检测。基因组DNA可以根据现有的方法从转化再生植株和非转化水稻中提取。实施例4、转基因水稻抗性能力的测定将每个转化载体获得的不同10个独立转化株系水稻植株和没有转化的水稻植株在温室中单株培养。这些再生植株分为4个处理，处理l:喷20mM草甘膦；处理2:喷1000mg/L苯达松；处理3:4mg/L苄嘧磺隆；处理4:喷水。处理后7天记录植株的成活率，结果如表l所示。表l、不同10个独立转化株系在不同的除草剂下的成活率<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>ZM450A的表达使本来应该对苯达松和磺酰脲类除草剂敏感的水稻又获得了抗性。因此说明ZM450A是抗苯达松和磺酰脲类除草剂的基因。实施例5、pCAMB1300-G6-ZM450i玉米转化载体的构建根据玉米的细胞色素P450基因(包括ZM-P450A)设计和合成了能够产生RNAi的DNA片断(SEQIDNO:6)。这个DNA片断用^Y7zo1酶切后被连接到用屈ol预先酶切切除去抗潮霉素(/^g)基因的pCambia1300载体(gb:AF234296)，获得的新载体进一步用五co及I和/fi'mmi酶切，然后用含有抗草甘膦基因G6的用同样的酶酶切而获得的DNA片断连接，获得载体pCAMB1300-GlyR-ZM450i(图2)。这个载体包含有一个CaMVS35启动子控制下的能够产生RNAi的抑制表达框。实施例6、苯达松和磺酰脲类除草剂敏感的转基因玉米的产生-取授粉后8—10天的Hi-II玉米穗。收集所有的未成熟胚(大小为1.0—1.5mm)。将含有T-DNA载体pCAMB1300-GlyR-ZM450i的农杆菌与未成熟胚共培育共培养2—3天(22°C)。转移未成熟胚到愈伤诱导培养基上(M3，含200mg/L的Timentin杀农杆菌)，28"C暗培养10—14天。将所有的愈伤转到带有2mM草甘膦的筛选培养基上(M4)，28""C暗培养2—3周。转移所有的组织到新鲜草甘膦的筛选培养基上(M4)，28"C暗培养2—3周。然后，转移所有筛选后成活的胚性组织到再生培养基上(M5)，28"C暗培养10—14天，每皿一个株系。转移胚性组织到新鲜的再生培养基上(M5)，26'C光照培养10—14天。转移所有发育完全的植株到生根培养基上(M6)，26'C光照培养直到根发育完全,然后移植到温室中单株培养，并且镇定它们的抗除草剂能力。实施例7、转基因玉米敏感性的测定获得的转化pCAMB1300-G6-ZM450i玉米植株和没有转化的玉米植株在温室中单株培养。这些再生植株分为3个处理，每个处理包括pCAMB1300-G6-ZM450i转化植株和非转化植株各20株。处理1:喷10mM草甘膦；处理2:喷2000mg/L苯达松；处理3:喷水。处理后10天记录植株的成活率，结果如表2所示。表2、转化玉米植株在不同的除草剂下的成活率<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。序列表SEQIDNO1:1atggataaggcctacgtggccgtgctctccttcgccttectcttcgtgatccactacctc61gtgggacgtgctggccgcaagggcaatggcaagggcaagggaacgcagcggttgcctccc121agccctccggccgtcccgttcctcggccacctccacctcgtcaagacgccgttccacgag181gcgctggccggcctcgccgcgcgccacgggccggtgttctccatgcgcatggggtcccgc241cgcgcgctggtcgtgtcctcgcccgagtgcgccaaggagtgcttcacggagcacgacgtg301gtgttcgccaaccggccgaggttcgccacgcaggacctcgtgtccttcgggggcgccgcg361ctcgccgcggccagctacgggccctactggcgcaacctccggcgcgtggccaccgtgcag421ctcctctccgcgcaccgcgtcgcctgcatgtccgccgtcgtcgccgccgaggtgcgcgcc481atggcgcgccgcatgggccgcgcggccgcggcggcgcccggcggcgccgcgcgcgtccag541ctcaagcggaggctgttcgaggtctccctcagcgtgctcatggagaccatcgcgegcacc601aagacgtcccgcgccgaggcggacgccgactcggacatgtcgcccgaggcgcacgaattc661aagcagatcgtcgacgagatcgtgccgcacctcggcacggccaacct魄ggactacctg721ccggtgctgcggtggctcgacgtgttcggcgtgaggaacaagatcacggccgctgtgggc781aggagggacgcgttcctgcggcggctcatcgacgcggagcggcggaggctggacgacggc841ggcggcgacagcgacagcgacaagaagagcatgatagccgtgctgctctcgttgcagaag901tcagagccggaggtgtacacggataccatgatcatggcactttgcgggaacttatttggc961gecggaacggagaccacgtcgaccacgacagaatgggccatgtcgctcctcctgaaceac1021ccggaggcgctgaagaaggcacaggcagagatcgacgcagtcgtgggcacctcccgccta1081ctcgccgcagaggacgtgccccgactcggctacctgcaccgcgtcatcagcgagaccctg1141cgcatgtacccggccgccccgctgctcctgccgcacgagtcgtcggcggactgcaaggtc1201ggcggctacgacgtggcccgcggcacgctgctcatcgtgaacgcgtacgccatccacagg1261gacccgctggtgtgggaggacccggacgagttcaggccggagcggttcgaggacggcaag1321gcegaggggcggctcctgatgccgttcgggatggggcggcgcaagtgccctggggagacc1381ctcgcgctgcggaccatcagcctggtgctcggcacgctgatccagtgcttcgactgggac1441cgagtcgacggcctcgagatcgacatggccgcgggcggcgggctcactctgcccagggcc1501gteccgttggaggccacgtgcaagcctcgtgcagctgtgcgccatcttcttctggagctc1561tgaatctgatgcSEQIDNO2:1MetAspLysAlaTyrValAlaValLeuSerPheAlaPheLeuPheVallieHisTyrLeu21ValGlyArgAlaGlyArgLysGlyAsnGlyLysGlyLysGlyThrGinArgLeuProPro41SerProProAlaValProPheLeuGlyHisLeuHisLeuValLysThrProPheHisGlu61AlaLeuAlaGlyLeuAlaAlaArgHisGlyProValPheSerMetArgMetGlySerArg81ArgAlaLeuValValSerSerProGluCysAlaLysGluCysPheThrGluHisAspVal101ValPheAlaAsnArgProArgPheAlaThrGinAspLeuValSerPheGlyGlyAlaAla121LeuAlaAlaAlaSerTyrGlyProTyrTrpArgAsnLeuArgArgValAlaThrValGin141LeuLeuSerAlaHisArgValAlaCysMetSerAlaValValAlaAlaGluValArgAla161MetAlaArgArgMetGlyArgAlaAlaAlaAlaAlaProGlyGlyAlaAlaArgValGin181LeuLysArgArgLeuPheGluValSerLeuSerValLeuMetGluThrHeAlaArgThr201LysThrSerArgAlaGluAlaAspAlaAspSerAspMetSerProGluAlaHisGluPhe221LysGinlieValAspGlulieValProHisLeuGlyThrAlaAsnLeuTrpAspTyrLeu241ProValLeuArgTrpLeuAspValPheGlyValArgAsnLysIkThrAlaAlaValGly261ArgArgAspAlaPheLeuArgArgLeulieAspAlaGluArgArgArgLeuAspAspGly281GlyGlyAspSerAspSerAspLysLysSerMetlieAlaValLeuLeuSerLeuGinLys301SerGluProGluValTyrThrAspThrMetlieMetAlaLeuCysGlyAsnLeuPheGly321AlaGlyThrGluThrThrSerThrThrThrGluTrpAlaMetSerLeuLeuLeuAsnHis341ProGluAlaLeuLysLysAlaGinAlaGlulieAspAlaValValGlyThrSerArgLeu361LeuAlaAlaGluAspValProArgLeuGlyTyrLeuHisArgVallieSerGluThrLeu381ArgMetTyrProAlaAlaProLeuLeuLeuProHisGluSerSerAlaAspCysLysVal401GlyGlyTyrAspValAlaArgGlyThrLeuLeulieValAsnAlaTyrAlalieHisArg421AspProLeuValTrpGluAspProAspGluPheArgProGluArgPheGluAspGlyLys441AlaGluGlyArgLeuLeuMetProPheGlyMetGlyArgArgLysCysProGlyGluThr461LeuAlaLeuArgThrlieSerLeuValLeuGlyThrLeuHeGinCysPheAspTrpAsp481ArgValAspGlyLeuGluIkAspMetAlaAlaGlyGlyGlyLeuThrLeuProArgAla501ValProLeuGluAlaThrCysLysProArgAlaAlaValArgHisLeuLeuLeuGluLeuSEQIDNO:31GgatccaccatggataaggcctacgtggccgtgSEQIDNO:41c汪gtat3caggac肌cctgc3g肌gscc3caatttSEQIDNO:51cgtaatacgactcactatagggegacatatgatcgatgatatcccatgggcggccgcctg61cagaccaggtctacagtatacaggacaacctgcagaagaccacaatttgctataaaccat121actgtgaaccaactactgattgattgttcacgcaaacgactgtacaacacattttacaga181agataacacgcacgagggtattacgcactcaagcttatttagtttagcacacaccatcag241gcaaagcatactagggatcatatgcatgccaagatgttactacagcatcagattcagagc301tccagaagaagatggcgcacagctgcacgaggcttgcacgtggcctccaacgggacggcc361ctgggcagagtgagcccgccgcccgcggccatgtcgatctcgaggccgtcgactcggtcc421cagtcgaagcactggatcagcgtgccgagcaccaggctgatggtccgcagcgcgagggtc481tccccagggeacttgcgccgceccatcccgaacggcatcaggagccgcccctcggccttg541ccgtcctcg犯ccgctccggcctgasctcgtccgggtcctcccscaccagcgggtccct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