专利名称：链霉菌s1-5及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株可防治植物病原真菌和杀螨的新菌株——链霉菌S1-5(Streptomyces sp.S1-5)及其在抗植物病原真菌和杀螨中的应用，以及用链霉菌S1-5制得的可用于抗植物病原真菌和杀螨的乳剂。
背景技术：
生物农药以其低毒、无残留、无污染、原料易得等特性被人们公认为是21世纪的绿色农药、理想农药。开发新型生物农药无疑是一种兼具社会效益和经济效益的超前行为。螨类和植物病原真菌是造成蔬菜、茶叶、果树和棉花等多种经济作物的主要危害，据统计，全国仅螨害需防治面积不少于亿亩，常年造成产量损失12％～20％，严重时达25％以上。植物病原真菌的危害造成的损失更是难以估量。传统的生物农药，不管是苏云金芽孢杆菌杀虫剂还是其它微生物源杀虫剂都有一个共同的弊端，那就是杀虫谱窄，持效期短、药效慢。阿维菌素对螨类活性高，但对很多鳞翅目害虫毒力不够理想。多氧霉素和尼可霉素是一类能抗真菌的嘧啶核苷肽类抗生素，现在两者都主要用作抗植物病原真菌的农用抗生素，但多氧霉素渗透进入真菌胞内的能力较差，活性较差不理想，随着这些药物的长期使用，又出现真菌对该类药物的耐药性。因此，开发安全高效的新型抗真菌杀螨虫生物农药十分迫切。
迄今尚没有链霉菌(Streptomyces sp.)能同时具备防治植物病原真菌和杀螨虫双重效果的报道。
发明内容
本发明目的是为了提供一株可防治植物病原真菌和杀螨的新菌株——链霉菌S1-5(Streptomyces sp.S1-5)，及其在抗植物病原真菌和杀螨中的应用。
为达到发明目的本发明采用的技术方案是 链霉菌S1-5(Streptomyces sp.S1-5)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2007年5月24日，保藏编号CCTCC NoM207073。
本发明菌株的获得从全国各地风景名胜区，如安徽黄山、江西庐山和广西桂林、海南三亚采集土壤样品55份，通过样品初筛，复筛，获得具有抗植物病原真菌和杀螨能力的纯培养物。对该纯培养物进行了形态和生理生化鉴定，将其鉴定为链霉菌(Streptomyces sp.)，命名为链霉菌S1-5(Streptomyces sp.S1-5)。
菌株的鉴定 1)菌株的培养特征孢子丝直或柔曲，无螺旋。孢子表面光滑。蔗糖查氏琼脂上菌落圆形，气丝绒状，波曲形，丛生，孢子丝分节，浅黄色至绿灰色。在葡萄糖天门冬素琼脂上菌落灰白色，圆形，有同心环，孢子丝杂乱，丛生，近松螺旋型，从上方观察为逆时针左旋，孢子呈球形或卵形，大小不均，孢子表面光滑。在高氏一号琼脂上菌落圆形，有同心环状，表面有皱状隆起，边缘整齐向四周呈放射状扩散，粉状，略呈浅黄色或浅灰色，孢子丝近松螺旋型或波曲，丛生，从上方看为逆时针左旋。在燕麦片培养基菌落圆形，有同心圆状，凹凸不平，灰白色，呈同心圆状，上生黑色圆珠状物。在克氏一号琼脂上菌落灰色或灰白色，圆形，上生小黑点，有同心圆，孢子丝近松螺旋型或波曲，丛生。菌株显微特征(15×100)和JEOL-1230电镜照片见图1。
2)菌株的生理生化特性产浅黄色可溶性色素。菌株能使液化明胶，红褐色素，水解淀粉，胨化牛乳，产生H2S，产生黑色素，在纤维素上能够生长。对棉子糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、半乳糖、纤维二糖、L-鼠李糖、麦芽糖、甘露糖、D-果糖、肌醇、甘露醇等12种糖醇均有不同程度的利用能力。结果表明，菌株S1-5的生理特征与放线菌(Actinomycete)中的链霉菌属(Streptomyces)极为相似。
3)菌株的确定依据菌体形态，S1-5菌株的基丝无隔，不断裂，孢子丝呈链状直丝，确定S1-5属于链霉菌属。S1-5按培养性状鉴定种的标准，培养菌落圆形，有同心环状，表面有皱状隆起，边缘整齐向四周呈放射状扩散，粉状；气生菌丝多单叉分枝，孢子丝波曲形或近松螺旋型；明胶液化，石蕊牛乳先胨化后凝固；淀粉水解能力较强，纤维素上生长，产生硫化氢，有黑色素产生。依此查阅文献初步确定S1-5属于链霉菌(Streptomyces sp.)。
链霉菌S1-5可用于防治植物病原真菌和/或螨类害虫引起的作物病害中。所述植物病原真菌为下列之一①蕃茄叶霉病菌(褐枝孢菌Fulriafulva)、②烟草疫霉菌(Phytophthora nicotianae)、③烟草赤星病菌(长柄格孢菌Alternaria alternata)、④水稻纹枯病菌(立枯丝核菌Rhizotoniasolani)。螨类害虫以棉花、果树红蜘蛛为代表。
具体的，所述的应用为将链霉菌S1-5接种至发酵培养基，以发酵培养获得的发酵液或发酵液离心后的上清液稀释后作为药液，喷洒于作物植株上。发酵液离心后得到的滤饼，可用蒸馏水水洗后离心，得到的滤饼加无水乙醇，浸泡后离心，取上清液稀释后也可作为药液喷洒于作物植株上。
或者，所述的应用为将链霉菌S1-5接种至发酵培养基，发酵培养，发酵液离心后取上清液，用乙酸乙酯萃取，下层液体经柱层析分离得分离液，分离液经浓缩、纯化，得到生物活性物质结晶可按常规方法配制成水剂或乳剂，用于作物病害的防治。
所述生物活性物质结晶的有效质量浓度为2-3％(指水剂或乳剂母液中的浓度，实际使用时可根据需要稀释1000～5000倍)。
所述发酵培养基可为本领域中常见适用于链霉菌的培养基，本发明中按如下组成配制1％黄豆饼粉浸液20g，葡萄糖20g，碳酸钙2.0g，氯化钠2.5g，蒸馏水1000mL。
链霉菌S1-5还可应用与杀灭鳞翅目害虫。
本发明还涉及一种用所述的链霉菌S1-5(Streptomyces sp.S1-5)制备的乳剂，所述乳剂由如下方法制备得到将链霉菌S1-5接种至发酵培养基，发酵培养，发酵液离心后取上清液，用乙酸乙酯萃取，下层液体经柱层析分离得分离液，分离液经浓缩、纯化，得到生物活性物质结晶，再按生物活性物质结晶、水、二甲苯、洗衣粉质量之比为0.1∶2∶2∶0.03进行配制，得到所述的乳剂。
所述发酵培养基按如下组成配制1％黄豆饼粉浸液20g，葡萄糖20g，碳酸钙2.0g，氯化钠2.5g，蒸馏水1000mL。
本发明乃从自然界筛选得到一株链霉菌(Streptomyces sp.)，其产生的一种新型广谱抗真菌和杀虫成分，试验证明它不仅对多种危害农作物的刺吸式口器螨虫及其虫卵具有极高的杀灭活性，还对很多鳞翅目害虫毒力很高(阿维菌素对很多鳞翅目害虫毒力不够理想)，而且对植物病原真菌也有很好的防治效果。因此其优势体现在①抗菌杀虫双重效果。传统生物农药要使用2次，利用本发明制得农药使用1次即可达到杀真菌和杀螨虫的效果，大大降低农业成本，减轻农民负担。②药效快。持效期长达30天，同时也具备对人畜安全、不杀伤天敌和有益昆虫、对防治对象不易产生抗药性、不污染环境、可被土壤微生物迅速降解又不影响土壤肥力和微生物区系，无生物富集，对生态十分安全等优点，是一种关键酶抑制剂类农药，与其他抗虫药物无交叉耐药性。
图1为菌株显微特征(15×100)(A)和JEOL-1230电镜照片(B)； 图2为长柄格孢菌抑菌圈； 图3为立枯丝核菌抑菌圈； 图4为浓缩后得到的结晶HPLC色谱图。
具体实施例方式 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此 实施例1发酵液的获得 (1)斜面培养采用PDA培养基，斜面涂布链霉菌S1-5菌种，30℃下培养2～3天，获得斜面菌种； (2)种子培养斜面菌种接种至高氏1号培养基，30℃下培养2～3天，获得链霉菌S1-5菌落； (3)发酵培养原始发酵培养基配制1％黄豆饼粉浸液20mL、葡萄糖20g、蛋白胨3.0g、碳酸钙2.0g、氯化钠2.5g、蒸馏水1000ml。从高氏1号培养基培养的链霉菌S1-5菌落上刮取孢子置于无菌水中，振荡10min，配成浓度1×108个/ml的孢子悬浮液，以10％(V/V)接种量接入发酵培养基内，在摇床上250ml三角烧瓶，置于恒温摇床培养5d，得发酵液，备用。
实施例2发酵液提取物的获得与测定 取发酵液50ml，5000r/min，离心10min，上清液加等体积无水乙醇即为生物活性物质上清液粗提物。滤饼用蒸馏水水洗两次离心，弃去上清液，滤饼加无水乙醇至还原到发酵液体积，浸泡1h后，5000r/min离心10min，取上清液即生物活性物质菌丝体粗提物。将此两种粗提物与发酵液经离心后的上清液一起进行抑菌作用和杀螨试验的测定，同时以相同的乙醇水溶液作对照。
抑菌作用测定方法(四种植物病原真菌为浙江大学植保系惠赠，其它试验微生物为浙江工业大学微生物实验室保藏) 参照夏谌恩等的方法，分别采用菌饼法、滤纸片法和杯碟法，均设置3次重复。用滤纸片分别浸取少量离心后上清液、上清液粗提物和生物活性物质菌丝体提取物放到褐枝孢菌、烟草疫霉菌、长柄格孢菌、主枯丝核菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的含菌平板上。将平板在28℃条件下培养2-3天，分别用游标卡尺测定其抑菌圈直径大小。结果见表1 表1S1-5生物活性物质粗提物对植物病原真菌的抑菌作用 杀螨作用测定方法 将离心后上清液分别以原液和稀释10倍液、稀释100倍液供试，蒸馏水对照，每浓度处理设3个重复，从柑桔园采集柑桔全爪螨雌成螨于室内进行杀螨测定，每隔6h观察一次，杀螨率＝已杀螨数\原螨数。结果见表2 表2S1-5生物活性物质杀螨试验测定结果 结论S1-5生物活性物质上清液原液6h后对杀灭棉花红蜘蛛就有很好的杀灭效果，10倍稀释液12h后基本可杀灭棉花红蜘蛛，100倍稀释液18h后对棉花红蜘蛛杀灭率为100％。
实施例3生物活性物质的获得与测定 链霉菌S1-5发酵液离心后，取上清液，加入等体积的乙酸乙酯，萃取，将上层减压浓缩收集。将下层收集做抑菌测定，用乙酸乙酯作为淋洗剂走柱子，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯，柱层析硅胶(200～300目)为固定相，使用干法装柱，用试管于下端收集洗脱液，每管收集10mL，一共收集10管。生物活性跟踪将收集的10管洗脱液及萃取的下层溶液使用滤纸片法分别测定其对供试菌(长柄格孢菌和立枯丝核菌，浙江大学植保系惠赠)的抑菌效果(结果数据见图2、图3)。HPLC检测柱层析效果，样品在Carbohydrate Analysis 3.9×300mm Column分析柱上分析时，其抑菌物质主峰对应的流出液同时于Water 2996 Photodiode二极管阵列全波长(190～400nm)检测器上进行扫描，测定其最大吸收峰处的波长，并绘制紫外吸收光谱。柱温25℃；流速1.0ml/min；进样量10μL；流动相甲醇∶水(30∶70体积比)。
将以上具有抑菌活性的分离液于15000r/min下离心10min，取上清液，加入等体积二甲苯，萃取，取有机相，再用旋转蒸发器浓缩成浓稠状液体，于室温下放置一天。将结晶用甲醇洗下，离心弃去沉淀，再次旋转浓缩，于室温下放置过夜，得到生物活性物质结晶。将结晶用甲醇洗下(色谱醇)，收集做HPLC，条件同上(HPLC色谱图见图4、表3)。
表3HPLC结果数据 实施例4乳剂制备与测定 取按实施例3方法所得生物活性物质结晶，按生物活性物质结晶、胶体硫(杭州高晶精细化工有限公司)、水、二甲苯、洗衣粉(市购，雕牌普通洗衣粉)质量之比为0.1∶1∶2∶2∶0.03进行配制，先将胶体硫溶于水中，加入洗衣粉搅拌，之后慢慢地倒入二甲苯，边倒边搅，持续5～10min，最后加入生物活性物质结晶混匀，得到所述的乳剂。
室内杀螨、杀卵效果测定 从柑桔园采集柑桔全爪螨雌成螨和卵于室内进行自制乳剂2500倍液杀螨和杀卵测定，并用40％水胺硫磷1500倍液、20％三氯杀螨醇1500倍液作对比，设清水对照，杀螨率＝已杀螨数\原螨数。结果表明，自制乳剂2500倍液对柑桔全爪螨雌成虫和卵的杀伤力很强，杀虫率达92.1％～94.8％，杀卵率达89.7％～93.4％，与40％水胺硫磷和20％三氯杀螨醇500倍液效果基本一致。
实施例5自制乳剂防治棉花红蜘蛛 乳剂的配制 取生物活性物质结晶，按生物活性物质结晶∶胶体硫∶水∶二甲苯∶洗衣粉＝0.1∶1∶2∶2∶0.03的重量比配制，先将胶体硫溶于水中，加入洗衣粉搅拌，之后慢慢地倒入二甲苯，边倒边搅，持续5～10min，最后加入生物活性物质结晶混匀，制成母液。使用时按不同浓度稀释加水。
田间防治试验 在棉花田进行了自制乳剂3000倍液田间喷雾防治棉花红蜘蛛试验，以40％水胺硫磷1500倍液、20％三氯杀螨醇1500倍液为对照。结果如下 自制乳剂3000倍液药后5d防效为87.8％，药后10d防效为89.3％，药后15d为98.5％； 40％水胺硫磷1500倍液药后5d防效为99.6％，药后10d为96.1％。药后15d仅63.5％； 20％三氯杀螨醇1500倍液药后5d防效为99.7％，药后10d为98.7％，药后15d仅为56.1％。
在自制乳剂1000ml中加入7.5％鱼藤乳油60ml混合得混合液，取其1500倍液施用，5d后虫口减退率可达90％以上，30～60d时，防治效果稳定在90％～99％之间，而水胺硫磷、三氯杀螨醇处理区仅为40％左右。
本制剂原料易得，成本低廉，配制简便，使用安全，对天敌杀伤作用小，无残毒、残留，同时可兼治其他害虫，可在果树及其他作物上广泛推广使用。
实施例6防治水稻纹枯病研究 (1)菌株S1-5在田间植株上的定殖能力测定 在水稻苗期，将按实施例1方法制得的菌株S1-5发酵液(3.6×105cfu/mL)喷施在水稻植株上，从接种后第1天开始观察记载叶片上每平方厘米的菌体数量变化。
(2)田间防治效果测定 处理分别为S1-5发酵液(3.6×105cfu/mL)，20％井岗霉素WP(湖南生物药厂)(CK1)为药剂对照和清水对照(CK2)。每个处理4次重复，每重复小区面积30m2。各小区双埂包膜隔离，小区间距和小区与保护行间距为80cm，保护行品种为岗优527。移栽前，用玉米粉培养的纹枯病菌与河沙混匀混合。每小区200g，均匀撒栽小区内，于分蘖盛期和孕穗期进行防治。根据水稻叶鞘和叶片危害症状程度分级，以株为单位每小区对角线五点取样，每点调查相连5丛，共25丛，记录总株数、病株数和病级数。0级全株无病；1级第四叶片及以下各叶鞘、叶片发病(以剑叶为第一片叶)；3级第三叶片及以下各叶鞘、叶片发病；5级第二叶片及以下各叶鞘、叶片发病；7级剑叶叶片及以下各叶鞘、叶片发病；9级全株发病，提早枯死。
链霉菌S1-5发酵液对水稻纹枯病具有显著的控制效果，4年多点田间试验结果显示，链霉菌S1-5发酵液防治纹枯病效果稳定在80％～85％之间，与对照药剂20％井岗霉素的防治效果相当。根据实际小区测产结果，供试链霉菌S1-5发酵液处理均有显著的保产作用(6.91％～18.13％)。
实施例7二次防治法突击防治桑园鳞翅目类害虫 每年的8月中下旬以后，桑园中的鳞翅目害虫特别是桑尺蠖进入高发期，正处于1龄期，虫量达2400～62000只/亩。桑园中桑螟成虫也陆续羽化，在9月初进入幼虫盛孵期。本实施例提到的二次防治法突击防治桑园鳞翅目类害虫，第一次防治时间可定在8月下旬，第二次防治时间可在9月上旬。
乳剂的配制取生物活性物质结晶，按生物活性物质结晶∶胶体硫∶水∶80％敌敌畏(湖南生物药厂)1000倍稀释液＝0.1∶1∶2∶2的重量比配制，先将胶体硫溶于水中，加入敌敌畏1000倍稀释液，边倒边搅，持续5～10min，最后加入生物活性物质结晶混匀，制成母液。使用时按不同浓度稀释加水。安全用叶间隔期5天。
田间防治试验 在大蚕用叶桑园进行了自制乳剂2500倍液田间喷雾防治桑园中的鳞翅目害虫特别是桑尺蠖的试验，以40％桑宝(江苏省常州市江南农药厂)2500倍加60％敌马(江苏省常州市江南农药厂)1500倍加40％乐果(江苏省常州市江南农药厂)1000倍液为对照。结果如下 自制乳剂2500倍液药后5d防效为79.4％，药后10d防效为93.7％，药后15d为92.3％； 以40％桑宝2500倍加60％敌马1500倍加40％乐果1000倍液药后5d防效为88.4％，药后10d为96.7％。药后15d仅63.5％； 中秋期桑树枝条长、长势旺，如果再加上气候干燥，温度较高，桑条上下的叶片农药残毒期有一定的差异，因此用叶前必须做到先试后吃，谨防蚕儿农药中毒。在喷药时要使用专用喷雾器、用洁净水配药、浓度配准、喷雾要细、药液喷足，以提高防效和确保养蚕安全。
权利要求
1.链霉菌S1-5(Streptomyces sp.S1-5)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2007年5月24日，保藏编号CCTCC NoM207073。
2.链霉菌S1-5在防治植物病原真菌和/或螨类害虫引起的作物病害中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述植物病原真菌为下列之一
①蕃茄叶霉病菌、②烟草疫霉菌、③烟草赤星病菌、④水稻纹枯病菌。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为将链霉菌S1-5接种至发酵培养基，以发酵培养获得的发酵液或发酵液离心后的上清液稀释后作为药液，喷洒于作物植株上。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为将链霉菌S1-5接种至发酵培养基，发酵培养，发酵液离心后取上清液，用乙酸乙酯萃取，下层液体经柱层析分离得分离液，分离液经浓缩、纯化，得到生物活性物质结晶用于作物病害的防治。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述生物活性物质结晶的有效质量浓度为2～3％。
7.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于所述发酵培养基按如下组成配制1％黄豆饼粉浸液20mL，葡萄糖20g，碳酸钙2.0g，氯化钠2.5g，蒸馏水1000mL。
8.链霉菌S1-5在杀灭鳞翅目害虫中的应用。
9.一种用权利要求1所述的链霉菌S1-5(Streptomyces sp.S1-5)制备的乳剂，所述乳剂由如下方法制备得到将链霉菌S1-5接种至发酵培养基，发酵培养，发酵液离心后取上清液，用乙酸乙酯萃取，下层液体经柱层析分离得分离液，分离液经浓缩、纯化，得到生物活性物质结晶，再按生物活性物质结晶、胶体硫、水、二甲苯、洗衣粉质量之比为0.1∶1∶2∶2∶0.03进行配制，得到所述的乳剂。
10.如权利要求9所述的乳剂，其特征在于所述发酵培养基按如下组成配制1％黄豆饼粉浸液20mL，葡萄糖20g，碳酸钙2.0g，氯化钠2.5g，蒸馏水1000mL。
全文摘要
本发明提供了一株可防治植物病原真菌和杀螨的新菌株——链霉菌S1-5及其在抗植物病原真菌和杀螨中的应用。链霉菌S1-5(Streptomyces sp.S1-5)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2007年5月24日，保藏编号CCTCC NoM 207073。利用本发明制得农药使用1次即可达到杀真菌和杀螨虫的效果，大大降低农业成本，减轻农民负担；且持效期长达30天，同时也具备对人畜安全、不杀伤天敌和有益昆虫、对防治对象不易产生抗药性、不污染环境、可被土壤微生物迅速降解又不影响土壤肥力和微生物区系，无生物富集，对生态十分安全等优点，是一种关键酶抑制剂类农药，与其他抗虫药物无交叉耐药性。
文档编号C12N1/20GK101182483SQ200710156460
公开日2008年5月21日 申请日期2007年10月31日 优先权日2007年10月31日
发明者吴石金 申请人:浙江工业大学