专利名称：：高通量生物加工装置的制作方法高通量生物加工装置
背景技术：
：本发明涉及多生物反应器系统。具体地说，本发明涉及应用加压流体的多生物反应器系统。在生物技术工业中，大部分产品通常是通过一些涉及生物反应器的生物加工产生的。大量的工艺参数影响产量，所以影响生物加工的性能。这些参数包括生产生物的性质，生长和生产培养基的组分及其浓度和比例，生长培养基的pH和依数性，氧传质(oxygenmasstransfer)等。此外，可获得一些不同的生物反应器规格，例如连续搅拌的罐式反应器(CSTR)、气升式反应器和膜生物反应器。膜生物反应器很适用，因为它们是连续操作的并且能随时间改变培养条件而提供最适的和在某些情况下本来就提供更好的特性。大部分工艺优化是凭经验确定的，因为目前不可能从最初的原理准确预计最适的一组条件。所以需要很多试验来发现对生长和产品形成合适的，那么也是最佳的条件。优选的是，能平行和/或相继进行这些试验而不用花费很多周转时间，以及以更小规模从而将应用的原料最少化。通常，应用在小规模体系如烧瓶或微滴板内的多个平行试验研究，但是它们通常不能分批进料或连续操作，并且不能升级至生产用生物反应器。膜生物反应器通过提供固体/液体(空气)界面而模拟微生物的自然环境，并且已被证实产生显著的生物加工增强效果。所以，小规模、多个小型反应器非常适用于从实验室操作到大规模单元的条件的快速筛选和优化。从,J、到大规模单元很容易进行按比例增加。文献中报导了这样的生物反应器，但是这些反应器都是通过多通道泵驱动的。这些泵驱动器对于液体方面具有脉动的和不均匀的流动，而且昂贵。通常通过调节每个生物反应器/组件上的反压，通过试验和误差保持空气流分配恒定。备选地，各个生物反应器/组件都需要单个的空气供应装置，这就变得成本高。需要一种多生物反应器系统，它在通过加压流体的源驱动的每个生物反应器中表现出基本上相同的条件。发明概述根据本发明第一方面，提供了一种多生物反应器系统，它包括-很多个生物反应器，-加压流体的源，以及-用于对生物反应器分配流体的分配器，其中，所述生物反应器系统包括由各生物反应器带有的、在各生物反应器之前或之后的反压形成构件以及加压流体的源，使得各反压形成构件提供对所述加压流体流动的阻力，该阻力大于在各反压形成构件之间流动的阻力。优选地，所述生物反应器在所述生物反应器系统内平行布置。所述生物反应器优选是膜生物反应器，是单纤维膜生物反应器或多纤维膜生物反应器。最优选地，所述生物反应器包括至少一种中空纤维膜，如毛细管膜，其优选被封闭入壳内。在本发明一个优选的实施方案中，所述反压形成构件是节流阀、喷嘴或玻璃料，如实施例l中所示。但是，应懂得，所述生物反应器本身可能带有或者本身就是反压形成构件。如果所述生物反应器是膜生物反应器，这些膜本身可以带有反压形成构件，总是经受比膜之间的阻力大得多的、穿过膜的流体压力阻力，如实施例2中所述。在本发明一个优选的实施方案中，所述流体是气体，最优选的是空气。然而，应懂得，所述流体还可以是液体，如供给中空纤维膜的腔的营养培养基。营养培养基通过中空纤维膜的腔，并且在中空纤维膜外表面上生长生物膜，其由通过中空纤维膜壁的营养培养基供养。可从所述反应器中回收包含过量的营养培养基和生物膜的产物的生物膜渗透物。从该渗透物分离从而回收产品。还可监测营养物以确定生物膜的生长动力学。在本发明的一个最优选的实施方案中，气体驱动对所述生物反应器的液体营养物供给。根据本发明第二方面，提供了一种操作多生物反应器系统的方法，其包括如下步骤提供很多个生物反应器，加压流体的源，和用于对生物反应器分配所述流体的分配器，以及操作所述系统，其中所述生物反应器系统包括由各生物反应器带有的或者位于各生物反应器和所述加压流体的源之间的反压形成构件，使得各反压形成构件提供对所述加压流体流动的阻力，该阻力大于在各反压形成构件之间流动的阻力。发明详述所述系统能在很相似的空气流动、空气压力和液体压力条件下平行操作许多反应器。这样安排的优点在于，本发明的系统拥有生物效应的肯:力5即，、;见察:;午多膜上长时间平行发生的变化或牺牲个别生物反应器来分析以确定时程事件。-平行优化生长培养基的能力，从而显著缩短工艺开发的时间。-测试不同膜的过滤效率以及生物相容性和化学相容性的能力。根据本发明的生物反应器，通过改变压力和流动条件来优化涉及培养特性的工艺条件，特别是-比较一系列在同等条件下平行生产某种化合物的菌种或菌林；和/或-小规模生产许多不同产品如筛选应用(screeningapplications)。本发明的系统通常包括-单纤维或多纤维生物反应器，优选是美国专利号5,945,002中描述的那种。所述生物反应器优选小到足以限制空间或材料的应用。-流体(空气)压力源-通常是空气压缩机或气瓶。-一个将加压的流体分配给许多压力容器的集流腔，压力容器包括装有生长培养基如营养液的压力容器，该容器包括一个能正确分配压力和液体流的盖子。所述盖子有三个接头，能导入加压流体，导出生长培养基以及导入新鲜培养基或其它添加剂。-每个压力容器与生物反应器的连接要么连接到内腔，要么在毛细管膜的情况下连接到毛细管空间外(ECS)，这取决于操作要求。-所述生物反应器优选包含一层或多层具有基本同等阻力范围的膜(取决于流量耐受差异)。这确保通过不同生物反应器的均匀流量或者流量与提供的阻力成反比。-对于需氧培养物的生长来说，需要用空气压力源如压缩空气分配空气以通过膜反应器。这通常是驱动生长培养基的相同的空气供给源。-如果需要加湿，可将加湿器与空气供给源连接起来，优选在入口侧有一个无菌过滤器。这使得进行消毒操作而不需要专门的允许加湿空气流过的空气过滤器。-所述加湿器可以是具有盖子的压力容器，所述盖子适合使干燥气体在压力下流入及加压的加湿空气排出。-优选对所述流体分配器，如空气管，安装歧管以便可将空气分配流过所有生物反应器。-可将所述空气管与每个膜组件的毛细管外空间连接。-可将每个膜反应器的空气和产品出口与渗透物收集容器连接。-所述渗透物收集容器优选是压力容器，优选包括带有三个接头的盖子，一个用于将废气和产品导入容器，一个用于按要求移去产品和一个用于排出空气。-优选将所述渗透物收集容器的空气出口连接到反压形成构件，如预定规格的节流阀或喷嘴或玻璃料。-所述喷嘴基本等同，从而提供生物反应器间均匀的空气流量，或与喷嘴的阻力成比例的流量。-喷嘴的规格决定空气流速与压力的比率。-生物反应器内的膜的腔侧优选具有与灌注容器连接的灌注管8道。这样能灌注所述腔并更换培养基。-所述灌注容器可以配备具有两个接头的盖子，一个接头导入培养基，另一个接头排出培养基。_所述空气管和流体管优选具有线上可灭菌的压力计。应懂得，本发明可用于适当修饰的全蒸发应用。现在将参照如下附图描述本发明，其中图1是本发明的多生物反应器系统的示意图。图2是一个XY图，它示出了渗透物的pH，葡萄糖和磷酸盐水平与放线菌紫素产量之间的关系。图3示出了单纤维反应器(SFR)的时程曲线，即，采用含有200mMK-P04緩冲液(pH7.2)的LM5-V100-G75和l/50th接种物浓度培养。图4示出了SFR的时程曲线，即，采用含有200mMK-P04緩冲液(pH7.2)的LM5-V100-G75,以lx接种物培养，并且从顶部或底部歧管入口进料培养基。图5示出了SFR的时程曲线，即，采用含有400mMK-P04緩冲液(pH7.2)的LM5-V100-75，以lx接种物培养，并且从顶部或底部歧管入口进料培养基。在图1中，压缩空气供给源1驱动分支的空气管A，B，每条管通过节流阀2调节，该节流阀后连接一个0.22jam的过滤器3。空气管B进入加湿容器4,加湿的空气离开该容器通过也装在管A上的压力计5。所述系统中包括六个单纤维生物反应器6。每个生物反应器包括一条由构成的膜中空纤维，毛细管材料如A1203(没有示出)。空气管A穿过串连的六个T型构件12进入每个生物反应器6的培养基供应容器8。每个容器8包括盖子，所述盖子包括一个空气管A的入口，一个培养基出口和一个改变或强化生长培养基的营养物含量的入口，使用时用夹子13夹住该入口。流入空气在容器8内于培养基表面形成的压力驱使培养基通过所述中空纤维膜，通过开启的夹子13进入灌注容器7，使用时用夹子13夹住关闭灌注容器7。灌注容器7具有盖子，其包括一个培养基入口，当充满时用来放空所述灌注容器的、由夹子13夹住的出口，和一个由抽滤器IO控制的空气出口。空气管B穿过串联的一组T型构件向每个生物反应器的腔供给空气，即，供给至每条中空纤维的外测。空气通过一条在使用时用夹子13夹住的排气管，或者通过排出至产品收集容器9的另一出口，离开生物反应器的壳。流过(渗过)中空纤维的培养基，包括在每条中空纤维外表面上生长的生物膜的产物，以及进入包括盖子的容器9的空气，所述盖子上有一个产品入口，一个将产品排出瓶子的出口，该出口在使用时用夹子13夹住和另一条由抽滤器IO和节流喷嘴控制的排气管。使用时，供给到每个生物反应器的空气和培养基基本相等，因为反压形成构件产生了来自每个生物反应器的压力，该压力比生物反应器之间的压力更大。这样，在生物反应器之间变化的流速在多生物反应器的平行操作中受到限制，这在相似的条件下(适用于生产)和/或工艺优化时(适用于研究和开发操作)具有高通量。应懂得，前述单纤维反应器可由多纤维反应器或甚至是要求供给流体的任何其它类生物反应器所取代。可通过手动或自动控制压力。还应懂得，手动或自动控制可用来调整或控制压力和/或供给每个反应器的流体。现在将参照如下非限制性的实施例来描述本发明。实施例1(需氧模式)对由天蓝色链霉菌(5Yre;^啤cescoe//co/or)A3(2)生产放线菌紫素的优化在该实施例中，所述反压形成构件是安装在每个SFR的空气出口的喷嘴。设计该实验以评价营养物供应速率、营养物浓度和氧化作用对于通过天蓝色链霉菌生产放线菌紫素的影响。此外，还评价了接种物数量对生物膜形成和产率的影响。对接种天蓝色链霉菌的12个SFR的每一个连续或同时执行改变的工艺参数。放线菌紫素水平以总的蓝色色素报道，如应用基于Ates等人1997所述方法的SOP通过分光光度法定量(El%,lcm=355)。灭菌根据标准的操作程序(S0P)对于SFR高压灭菌并设置用于需氧操作。在开始所述实验之前，将高压灭菌的生长培养基分配入每个培养基供应容器。接种用10mi无菌蒸馏水浸泡单一琼脂平板制备的1ml孢子悬液接种SFR1-5。用1ml在28。C下孵育4天的瓶培养物接种SFR6-10。釆用标准的无菌技术，将接种物直接注入每个SFR模件的ECS中。根据SPO完成接种物在毛细管膜外表面上的固定化。操作根据SOP在需氧条件下操作SFR。初始压力设定在约30kPa。人工设置从膜导管的腔侧经管道A供应的培养基，从而利用穿过膜表面从腔到壳侧不同的压力来控制到生物膜的营养物进料速率(流量)。收集渗透物并且每天从渗透物收集容器采样。在营养物类型和浓度的优化期间，或者用新鲜的营养物源置换现有的生长培养基，通过将旧的生长培养基排出至初始瓶，再用合适的新培养基填充所述培养基供应容器。此外，通过简单灌注剩下的生长培养基来实现营养物或添加剂简单添加到初始生长培养基中，从而得到所需营养物的已知最终浓度。当评价提高氧化作用的影响时，用工业级氧气瓶供应的氧气来取代压缩空气。表l:12个SFR的每一个的培养条件如下表:<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>生物膜形成采用菌丝体的或孢子接种物，随着天蓝色链霉菌沿着膜的长度方向发育成小的黄色菌落，在24-28小时内生物膜生长很明显。菌落扩展开，颜色从黄色变成橘红色并且相互连接(72-120小时)，形成一个稍微变细的生物膜。使用国际链霉菌规划(InternationalStreptomycesProject,ISP)2培养基的生长迅速。随着生物膜开始分化，由于发生分化和孢子形成(240-300小时)，有光泽的橘红色变得不透明，变白并然后变灰。在所有情况下，分化始于竖直的SFR顶部附近的膜部分。这似乎是培养基流量的函数。红色色素的出现表明培养基中的放线菌紫素与孢子形成同时发生。分化的生物膜变成蓝黑色，用过的培养液的pH增大，随着孢子形成的增多而释放更多的色素。相似地，随着用过的培养液pH的增大，由于放线菌紫素的指示剂特性，着色的培养基从红色变为蓝紫色。用孢子接种的SFR(1-5)不如用菌丝体接种的SFR(6-10)中观察到的那样发育迅速或形成一样厚的生物膜。当在相同的DP下操作时，由于更稠密的生物膜的发育导致用孢子接种的反应器显示出更低的流速，促使对营养物流过所述膜/生物膜并进入ECS产生更大的阻力。在相同的贮器内分化和着色程度的差异是供给发育中的生物膜的营养物(流量)改变的结果，这是由膜/生物膜阻力和/或反应器历史的差异引起的。在相同的接种和/或培养条件下，可利用膜阻力的固有差异来决定生产工艺的稳定性。然而这受到更慢的流速的影响，即使对SFR的两个贮器应用相似的AP。甚至在重复试验中，分化和着色显示似乎取决于流速和/或反应器历史的差异。产率在表2中记录了360小时期间(接种后14天)计算的放线菌紫素浓度和SFR体积产率。平均起来，菌丝体接种的SFR显示更迅速的生物膜形成和更早地开始生产放线菌紫素，而那些接种孢子并且在60kPa空气下操作的SFR则显示更大的放线菌紫素总产量。通过将生物膜暴露在纯氧中诱导放线菌紫素的生产；然而没有保持增加的放线菌紫素水平。在选定的3种生长培养基中，包含4g/1葡萄糖的ISP2生长培养基产率最高。表2:不同SFR的放线菌紫素的产量SFR放线菌紫素(mg/1)体积产率(mg/l/h/反应器体积)最大值平均值SD最大值平均值SD1129.2730.1828.5716.502.093.112119.6513.1620.8613.73^lTT^2.473219.7668.8857,5630.156.106.864181.6429.0533.605.781.971.54567.4224.0114.856,621.821.326110.0917.7023.345.751.301.557223.6248.9756.3811.332.723,068206.0558.4454.3215.733.613.599269.6269.6092.2415.993.163.791025.237.347.981.170.410.37SFR的动力学分析表明，在更高的pH和更低的葡萄糖或砩酸盐水平下，有增加放线菌紫素产量的趋势(如图2)。统计分析证实了这种趋势。然而，这些关系不明显(表3)。13表3:显示为Pearsons相关系数(+1>r>-l)的底物利用与放线菌紫素产量的相互关系如下。SFR1234」567S910放线菌紫素对pH0.5430.3640.829」0.4110.5380.4910.5"0.6570.4290.402放线菌紫素对葡萄糖0.2510.0650.0950.3040.3470.4420.3920.4470.2810.270放线菌紫素对磷酸盐Nd0,165ndndndnd0.243nd实施例2(厌氧模式)乳酸乳球菌(丄ac/^c0cci/s/ac〃s)中生产P-内酰胺酶的优化在该实施例中，反压形成构件本身是膜。设计该实验以评价生长培养基中增加的緩冲液浓度在SFR中作为稳定pH和重组蛋白质生产的方法的影响。此外，还评价了接种物数量对生物膜形成的影响以及顶部或底部培养基进料配置对营养物供应和利用的影响。应用基于Nithocefin法(oxoid)的SOP通过分光光度法对测定|3-内酰胺酶活性定量。灭菌将SFR高压灭菌并且根据(SOP)装配用于厌氧操作。在开始所述实验之前，将过滤灭菌的培养基分配入各培养基供应容器。接种用1mlIX或l/50th，在30。C下的M17-G5生长培养基中培养了16小时的乳酸乳球菌PRA290(p-内酰胺酶)前接种物接种每个SFR。根据SOP将接种物直接注入各SFR的ECS中。接种后将培养基以8kPa过夜供给至各SFR。操作在6个SFR的贮器中对SFR装歧管。对每个SFR从其自己的供应容器供应培养基。在每个贮器中，从位于玻璃歧管顶部或底部的培养基入口进料，对复制的SFR供应含有200mM或400mMK-P04緩冲液(pH7.2)的LM5-V100-G75。对新鲜样品评估流量、pH和p-内酰胺酶活性。一起监测葡萄糖和蛋白质的水平。对每个l&器，用压力控制阀来调节培养基供给。接种后，每2小时监测SFR。利用渗透物的pH曲线来监测生长并且还用作通调节流量的根据。如下调节压力<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>生物膜形成接种后50小时，在全部SFR中都出现了具有浓酸乳稠度的致密的生物膜。这种生物膜似乎是通过保持乳酸乳球菌细胞指数增长，由高压下的膜形成的。随着生物膜的增长，流动的阻力也增大。在接近实验结束时，压力接近100kPa，流量减小到低于固定化所需的临界点，导致浮游生物的生长。与对照接种的SFR相比较，用更小的接种物数量培养的SFR显示出pH下降和P-内酰胺酶生产(图2)延迟4-6小时(图3)。在用不同的接种物培养的SFR之间，最大酶活性和生产稳定性都没有显著不同。初始生长似乎被400mMK-PO4緩冲的培养基所抑制。在这些SFR中，重复试验中酶生产的起始在接种后12-22小时之间变化，在底部进料的SFR中最明显(图3和4)。然而，在高緩冲液浓度下记录了最大P-内酰胺酶水平(20000-24000U.L1)。认为将下列参考文献并入本文作参考1.AtesS.，ElibolM.andMavit廳F.(1997)ProductionofactinorhodinbyStreptomycescoelicolorinbatchandfed-batchcultures;rocess"yoc力e/z32:273-278.2.BystrykhL.V，Ferna，ndez-MorenoM.A，HerremaJ.K,MalparidaF.，Hopwoo线AandDijkhuizenL(1996)ProductionofActinorhodin-Related"BluePigments"byStreptomycescoelicolorA3(2);J.Bacteriol.178:2238—2248.权利要求1.一种多生物反应器系统，它包括-很多个生物反应器，-加压流体的源，以及-用于对生物反应器分配流体的分配器，其中，所述生物反应器系统包括由各生物反应器带有的、在各生物反应器之前或之后的反压形成构件以及加压流体的源，使得各反压形成构件提供对所述加压流体流动的阻力，该阻力大于在各反压形成构件之间流动的阻力。2.权利要求1的多生物反应器系统，其中所述生物反应器在所述生物反应器系统内平行布置。3.权利要求1或2的多生物反应器系统，其中所述生物反应器是膜生物反应器。4.权利要求1至3中任一项的多生物反应器系统，其中所述膜生物反应器包括单纤维膜生物反应器或多纤维膜生物反应器。5.权利要求1至4中任一项的多生物反应器系统，其中所述生物反应器包括至少一种中空纤维膜。6.权利要求1至5中任一项的多生物反应器系统，其中所述至少一种中空纤维膜包括毛细管膜。7.权利要求1至6中任一项的多生物反应器系统，其中所述反压形成构件包括节流阀、喷嘴或玻璃料。8.权利要求1至7中任一项的多生物反应器系统，其中所述反压形成构件由生物反应器带有或者就是生物反应器。9.权利要求3至8中任一项的多生物反应器系统，其中所述反压形成构件由膜带有。10.权利要求1至9中任一项的多生物反应器系统，其中所述加压流体的源是气体。11.权利要求1至10中任一项的多生物反应器系统，其中所述加压流体的源是空气。12.权利要求1至11中任一项的多生物反应器系统，其中所述加压流体的源是液体。13.权利要求1至12中任一项的多生物反应器系统，其中所述液体是营养培养基。14.权利要求1至13中任一项的多生物反应器系统，其中将所述营养培养基供给至所述中空纤维膜的腔。15.权利要求5至14中任一项的多生物反应器系统，其中所述营养培养基通过所述中空纤维膜的腔。16.权利要求1至14中任一项的多生物反应器系统，其中气体驱动对所述反应器的液体营养物供给。17.权利要求1至16中任一项的多生物反应器系统，其中在所述中空纤维膜的外表面上生长生物膜，该生物膜由通过中空纤维膜壁的营养培养基供养。18.权利要求1至17中任一项的多生物反应器系统，其中从所述反应器中回收包含过量的营养培养基和所述生物膜的产物的生物膜渗透物。19.操作多生物反应器系统的方法，其包括提供很多个生物反应器，加压流体的源，和用于对所述生物反应器分配所述流体的分配器，以及操作所述系统，其中所述生物反应器系统包括由各生物反应器带有的或者位于各生物反应器和所述加压流体的源之间的反压形成构件，使得各反压形成构件提供对所述加压流体流动的阻力，该阻力大于在各反压形成构件之间流动的阻力。20.基本如前述的或列举的，本发明的多生物反应器系统。全文摘要本发明涉及一种多生物反应器系统，它包括很多个生物反应器，加压流体的源，以及用于对生物反应器分配流体的分配器，其中所述生物反应器系统包括由各生物反应器带有的、在各生物反应器之前或之后的反压形成构件以及加压流体的源，使得各反压形成构件提供对所述加压流体流动的阻力，该阻力大于在各反压形成构件之间流动的阻力。本发明还涉及操作多生物反应器系统的方法，其包括提供很多个生物反应器，加压流体的源，和用于对生物反应器分配流体的分配器，以及操作所述系统，其中所述生物反应器系统包括由各生物反应器带有的或者位于各生物反应器和加压流体的源之间的反压形成构件，使得各反压形成构件提供对所述加压流体流动的阻力，该阻力大于在各反压形成构件之间流动的阻力。文档编号C12M1/12GK101460606SQ200780020518公开日2009年6月17日申请日期2007年3月27日优先权日2006年4月12日发明者S·J·弗拉瑟尔,W·D·鲁克斯,W·爱德华兹申请人:辛尼克萨生命科学(私人)有限公司