通过组织非特异性碱性磷酸酶分离成人多潜能细胞的制作方法

专利名称：：通过组织非特异性碱性磷酸酶分离成人多潜能细胞的制作方法
技术领域：
：本发明涉及使用组织非特异性碱牲磷酸酶(TNAP)作为鉴定和/或分离成人多潜能细胞的标志。本发明也涉及通过本发明的方法富集细胞群和将这些细胞用于治疗。
背景技术：
：富集成人多潜能细胞无数的研究支持这个观点骨髓的非造血干细胞(包括成纤维细胞、脂肪细胞、chondroblasts、平滑肌细胞、成骨细胞和骨的其他细胞组分)是衍生自一群多潜能骨髓间充质前体细胞(MPC)，这些细胞存在于骨髓的空间中环绕着结缔组织(Bianco等，2001;GronthosandSi咖ons，1996;OwenandFriedenstein,1988;Prockop，1997)。认为这些MPC不仅能生成更多的具有同样表型和功能的细胞(一种自我更新的过程)并且能分化为链系定向的间充质祖细胞。由于缺乏很好的鉴定标志，对于在人的MPC分化和成熟为链系祖细胞的过程中精确的表型和基因表达模式的发展调节变化所知甚少。分析骨生成过程的研究己经鉴定了一个早期的标志一一转录因子CBFA1，它可以鉴定已经定向到骨生成细胞链系(lineage)的MPC(Ducy等，1997)。然而，分子标志如CBFA1不能用于在异质的细胞群体中分离和操作活细胞。这是一个主要的局限性，并且能够鉴定细胞表面抗原(该抗原是MPC细胞群所独有并且是仅限于MPC细胞群)的单克隆抗体(mAb)的量极少，这更增加了局限性。目前，STRO-1单克隆抗体是能够证明从人骨髓吸出物中形成MPC(CFU-F:克隆形成单位纤维原细胞)的所有克隆有免疫反应性而和造血干细胞没有反应的唯一试剂(Dennis等，2002:Gronthos等，2003;Simmons禾卩Torok-Storb，1991)。我们的研究显示离体扩增的人的MPC在血清存在的情况下快速分化并且开始表达很多和骨生成和其他细胞链系定向有关的标志(Gronthos等，2003)。'在体内鉴定所有MPC(CFU-F)的单克隆抗体STR0-1在随后的体外培养中下调。重要的是少量的培养细胞在体外扩增时持续表达STR0-1并且这些细胞是典型的非分化MPC(Gronthos等，1999;Stewart等，1999)。碱性磷酸酶碱性磷酸酶(AP，EC3.1.3,1)属于一个广泛存在的可催化磷酸单脂在碱性条件下水解并释放出无机磷酸盐的二聚金属酶家族(McComb等，1979)。人类四个同功酶是i)胎盘特异的碱性磷酸酶。ii)生殖细胞特异(胎盘的)的碱性磷酸酶，iii)肠碱性磷酸酶和iv)组织非特异的碱性磷酸酶(TNAP)(Harris,1990)。组织非特异的碱性磷酸酶(TNAP)在肝(LAP)、肾(KAP)和骨(BAP)中产量最高(Moss，1992)并且是在血清中最常发现碱性磷酸酶的异构体(isoform)(Mulivor，等，1985)。LAP、KAP和BAP的区别在于不同的翻译后修饰0糖基化模式的不同(Miura，等，1994)，虽然它们的氨基酸序列基本上是一致的(Weiss等，1988)，但这也导致了它们具有不同的特异活性(Nosjean等，1997)。更进一步，Nosjean等(1997)揭示tns-AP的N糖基化对于它的酶活性很重要。故组织非特异性AP是不同糖基化APs的混合物。人TNAP的基因是1986年克隆的(Weiss，etal，1986)，它编码524个氨基酸的蛋白质，其有17个氨基酸长的N端的信号序列和C端GPI锚定序列(通过该序列蛋白可以在体内锚定在细胞质膜的外面)(Hooper，1997)。已经被报道了在真核细胞如C0S-1(Fukushi，等，1998)和感染了杆状病毒的昆虫细胞表达一个重组的有生物学活性的TNAP虽然发现TNAP分子已经70多年了，可是并不清楚它在骨和骨髓组织中的确切功能。己经提出了TNAP的一些生物学功能，包括水解磷酸盐脂以提供给非磷酸盐的部分；在磷酸脂合成时起转移酶的作用；无机磷酸盐代谢的调节；phophoryl代谢稳态水平的维持；磷蛋白磷酸酶的作用(Whyte，1994)。B/L/K-TNAP也可能通过水解钙化的一种抑制剂对于骨骼矿化起着特殊的作用，而这种钙化的抑制剂在高浓度的情况下可抑制羟磷灰石结晶的增长(DeBroe和Moss，1992;Moss,1992;Whyte，1994)。或者，TNAP可能是细胞质膜无机磷的转运蛋白，一种细胞外的钙离子结合蛋白其可刺激磷酸钙沉淀和定位矿物质在骨样组织沉积。TNAP已知是一种成骨细胞分化的标志。然而，据我们所知，以前还没有任何非成熟的多潜能细胞在细胞表面表达TNAP的报道。
发明内容我们最近制备了一个新的单克隆抗体(指定为STR0-3)，该抗体可从未分极(unfractionated)的骨髓中鉴定和分离成人多潜能细胞并且能够把体内和体外的STR0-1再细分出来。我们已经确定STR0-3能够结合组织非特异的碱性磷酸酶(TNAP)。我们的结果也显示STR0-3只与成人骨髓吸出物中很少量的细胞反应并且不和成人骨髓吸出物中的CD34阳性的造血干细胞反应。这就第一次暗示TNAP是可以用于从不同组织来源中富集成人多潜能细胞的单一试剂的标志。因此，本发明涉及使用TNAP作为鉴定和/或富集成人多潜能细胞的标志。本发明也提供了一个富集成人多潜能细胞的方法，该方法包含从组织来源制备细胞样品并且富集表达TNAP标志的细胞。在一个实施例中，富集成人多潜能细胞的方法包含在容许TNAP结合到TNAP结合剂的条件下使细胞样品与TNAP接触；并且分离结合到TNAP结合剂上的细胞。本发明也提供了一个鉴定在细胞样品中存在成人多潜能细胞的方法，该方法包含鉴定样品中表达TNAP标志的细胞。在一个实施例中，鉴定在细胞样品中存在成人多潜能细胞的方法包含在适合TNAP结合到TNAP结合剂上的条件下将细胞样品和TNAP接触；并且检测结合到样品细胞上的TNAP结合剂的存在，其中结合到TNAP结合剂上的细胞暗示存在成人多潜能细胞。应了解在本发明的上下文中细胞样品可以是来自任何怀疑包含成人多潜能细胞组织来源。例如组织来源可以是脂肪组织、牙齿、牙髓、皮肤、肝脏、肾脏、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、卵巢、胰腺、骨、韧带、骨髓、腱或骨骼肌。在一个优选的实施方案中，组织来源为骨髓。优选的细胞来源是人，然而我们预期本发明也可以应用于其他的动物，包括奶牛、绵羊、猪等等农场动物、家畜如狗和猫、实验动物如小鼠、大鼠、仓鼠和兔或用于运动的动物如马。本方法也包括在第一次富集前收获多潜能细胞的来源。这可包括例如从受体上用外科手段取走组织和分离组织的细胞形成单细胞悬液。这种分离可以通过物理的或酶的方法来实现。在本发明的一个实施例中这一步骤包括用已知的技术收获骨髓细胞。用于本发明方法中的TNAP结合剂可是任何具有亲和结合TNAP的多肽或鉴定的化合物。例如TNAP结合剂可以是抗体或胶原，优选I型胶原。TNAP结合剂可结合任何一个或多个TNAP的LAP、KAP或BAP异构体。然而在一个优选的实施方案中TNAP结合剂结合BAP。在另一个优选的实施方案中，TNAP结合剂特异地结合BAP。通过"特异地结合BAP"我们指TNAP结合剂能够以一个有选择的方式在过量的其他物质如KAP和LAP存在的情况下结合BAP并且足够紧密(例如足够高的亲和力)以至于提供有用的工具来选择性的富集表达BAP的细胞。在一个优选的实施方案中，TNAP结合剂是抗TANP的抗体(任何来源的天然出现或重组的)。抗TNAP的抗体可是多克隆或单克隆抗体。在一个优选的实施方案中，抗TNAP抗体是单克隆抗体。用于本发明的合适的抗頂AP的单克隆抗体的实施例包括B4-78,50禾口B4-50(DevelopmentalStudiesHybridomaBank,UniversityofIowa);abl7973和abl7989(AbeamLtd,Cambridge,UK);和Magnusson等人提到的抗TNAP的单克隆抗体(2002)。在本发明的一个特别优选的实施方案中，抗TNAP的单克隆抗体是ATCC在2005年12月19日按照布达佩斯条约的规定保藏的编号为PTA-7282的杂交瘤细胞产生的STR0-3抗体或和STR0-3抗体结合到TNAP同样的抗原决定部位的单克隆抗体。按照本发明富集成人多潜能细胞的方法可基于单独的TNAP的存在。换句话说，富集的方法可包括单一的试剂(如TNAP结合剂)。然而，可以理解本发明不限于通过细胞只表达TNAP来富集它们，并且在一些情况下，优选的富集成人多潜能细胞的方法是基于表达TNAP且联合两个、三个或多个另外的标志。因此，富集成人多潜能细胞的方法可基于选自下面标志的一个或多个标志的额外出现LFA-3、THY-1、VCAM-1、ICAM-1、PECAM-1、P-选择素、L-选择素、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD29、CD18、CD61、P整合素，6-19，血栓调节蛋白、CDIO、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、FGF-R、瘦素-R，(STR0-2=瘦素-R)、RANKL、STR0-1(优选STR0-1bH)和CD146或其他任何这些标志的组合。例如，该方法可包括富集表达第一个成人多潜能细胞特异标志的细胞来构成第一个部分富集细胞库，随后再从部分富集细胞库中富集表达TNAP的细胞。在另一个实施例中，该方法可包括先富集表达TNAP的细胞，随后再富集有不同成人多潜能细胞标志的细胞。在另一个实施例中，该方法包括同时选择表达TNAP和一个或多个另外的成人多潜能细胞特异标志的细胞。可以理解，识别携带TNAP的细胞以此作为分离基础可以通过大量不同的方法实现，然而所以的这些方法都是基于TNAP结合剂结合到细胞的一些点，随后分离这些存在结合的细胞，可以是高水平的结合或低水平结合或不结合。最方便的结合剂是抗体或基于分子的抗体，由于单克隆抗体或基于单克隆抗体的试剂的特异性优选单克隆抗体或基于单克隆抗体的试剂。TNAP结合剂可连到固相载体上以容许做一个粗的分离。分离技术优选可以最大程度上保持收集部分的'生存力。不同效应的不同技术可用于达到一个相对粗的分离。应用的特定技术依赖于它的分离效率、相关的毒性、执行的容易程度和速度以及精密设备和/或专门技能的必要性。分离的方法可包括但不限于使用抗体包被的磁珠的磁分选、亲和层析和用连到固相基质的抗体"淘选"。提供精确分离的技术包括但不限于MACS、Dynal磁珠选择和FACS。在本发明的一个实施例中，TNAP结合剂是被标记的。在另一个实施例中，结合到TNAP结合剂上的细胞的分离是通过机械的细胞分选仪实现的。在本发明的另一个实施例中TNAP结合剂是连有荧光化合物标记的。在这个案例中，结合到TNAP结合剂的细胞是优选通过荧光激活的细胞分选仪(FACS)分离的。在本发明的另一个实施例中，TN胩结合剂连到一个固相粒子上。优选的，固相粒子是磁粒。在本发明的这个实施方案中，结合到TNAP结合剂的细胞优选通过从液相分离粒子相而得到分离。在另一个优选的实施方案中，在分离前的步骤中细胞样品和已经连有固相粒子的直接抗TNAP结合剂的抗体接触，并且其中结合到TNAP结合剂的细胞是通过从液相分离粒子相而得到分离。在本发明的另一个实施例中，细胞样品中的细胞是贴壁细胞，在固体支持物上培养，通过冲洗来去除未结合的TNAP结合剂。本发明的另一个实施例，细胞样品中的细胞是悬浮培养，通过离心细胞样品并且去除离心的上清来除去未结合的TNAP结合剂。在另一个实施例中，细胞样品用于更进一步的细胞分选过程来富集或减少表达至少另外一个多潜能细胞标志的细胞群。多潜能细胞标志可以是一个或多个选自含下列标志的组LFA-3、THY-1、VCAM-l、ICAM-1、PECAM-1、P-选择素、L-选择素、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD29、CD18、CD61、P整合素，6-19，血栓调节蛋白、CDIO、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、FGF-R、瘦素-R，(STRO-2=痩素-R)、RANKL、STRO-1(优选STRO-1bli)和CD146或其他任何这些标志的组合。本发明也提供了通过本发明方法得到的富集的成人多潜能细胞。本发明也提供了富集的TNAP的阳性成人多潜能细胞。在本发明的一个优选的实施方案中，至少总的富集的细胞的1%、2%、3%，4%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95。/。是TNAP阳性表型的成人多潜能细胞。在一个实施方案中，当比较用STRO-1作为标志分选细胞并在同样条件下培养，培养本发明富集的细胞导致更高比例的细胞是STRO阳性。优选的，这样培养大约4到6代。优选的，细胞是来源于骨髓的。在另一个实施方案中，本发明富集的细胞包含大约79%到大约99%,优选大约84%到大约94%,并且甚至更优选大约89%的细胞是CD45阳性。优选的，富集的成人多潜能细胞是通过按照本发明的方法得到的。本发明也提供了通过培养按照本发明富集的成人多潜能细胞而扩增的细胞群。在一个实施方案中，本发明富集的细胞或本发明扩增(expand)的细胞包含至少一些遗传修饰过的细胞。本发明也提供了产生组织特异定向的细胞群的方法，该方法包含在一个或多个刺激因子存在的情况下培养本发明的成人多潜能细胞并且将上述培养的细胞置于可以使成人多潜能细胞向一个特定的组织类型分化的条件下。本发明方法的一个实施方案中，组织类型是选自下列组织心肌、血管组织、骨组织、软骨组织、脂肪组织、神经组织、平滑肌和内皮组织。应该理解本发明包含包括本发叼的富集的成人多潜能细胞和/或本发明扩增的细胞群的组合物。一个更优选的实施方案中，组合物进一步包含一个刺激因子。这样的组合物很可能有益于治疗并且因此可以以制药学上接受的形式制备。在组合物中存在的刺激因子的水平可通过经验决定但大多数情况很可能是大约每毫升几纳克或几十纳克的级别(order)。用于本发明和/或存在于本发明组合物中的刺激因子可以是任何能够促进细胞分裂和/或分化的适宜因子。这些因子是本领域所熟知的，包括但不限于1a，25-二羟基维生素D3(1，25D)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子a(TNF-a)、白介素-1P(IL_1P)和基质(stromal)细胞衍生因子la(SDF-1a)。在另一个实施方案中组合物更进'一步包含能够使本发明的成人多潜能细胞分化到一个特定的组织类型的因子。优选的，组织类型是选自下面的组织:心肌、血管组织、骨组织、软骨组织、脂肪组织、神经组织、平滑肌和内皮组织。使本发明的成人多潜能细胞分化为骨前体细胞或骨的条件可能是，例如，用含有10。/。FCS、100"ML-抗坏血酸盐-2-磷酸盐、10—7M的地塞米松和3mM的无机磷酸盐的aMEM培养。这些条件己经显示可以诱导人骨髓基质细胞在体外发展成为矿化的骨基质。(Gronthos等，1994)。合适的使本发明成人多潜能细胞分化成为成骨细胞的条件可包括在I型胶原、纤维蛋白原、纤维蛋白、聚乙醇酸、聚乳酸、骨钙素或骨连接素存在的情况下培养细胞。在一个特定的实施例中细胞在I型胶原、纤维蛋白原和纤维蛋白存在的情况下培养。在另一个实施例中细胞在I型胶原、纤维蛋白原、纤维蛋白、骨钙素和骨连接素存在的情况下培养。在本方法的上下文中，I型胶原、纤维蛋白原、纤维蛋白、聚乙醇酸、聚乳酸、骨钙素或骨连接素可以单独使用或在生长因子存在下使用。可以理解本发明涵盖任何列在这段的化合物的组合的使用。在另一个实施方案中，本发明的成分中更进一步包含纤维蛋白胶。本发明也提供一个在受体上产生或修补组织的方法，该方法包含给该受体本发明的富集的或扩增的细胞群。本发明也提供在一个受体上一个产生或修补组织方法，该方法包括给该受体本发明的组合物。按照本发明得到的富集的或扩增的多潸能的细胞群可用于例如形成和修复骨骼，并且如这样的多潜能细胞及其合适的支持物的联合可被介导到需要骨形成的位点。因此，例如，由于骨损伤或切除肿瘤侵入的骨的部分引起的骨骼的缺陷可通过移植培养的或扩增的包含于磷酸钙瓷载体的成人多潜能细胞到缺陷部位来修复。对于合适的方法和技术见Caplan等的美国专利5，226，914和美国专利5,837,539，这两者比起本发明都是用的干细胞的粗制品。另外，富集的细胞群或组分可用于帮助锚定假肢装置。因此，假肢装置的表面如那些用于臀复位、膝和肩复位的装置可在移植前包被富集的多潜能细胞。多潜能细胞可然后分化为成骨细胞因此加快骨生长和结合这些假肢装置的过程(见Caplan等美国专利5，226，914和美国专利5，837，539)。富集的细胞群或组合物可用于基因治疗所以如可把外源核酸转化进一个富集的细胞群然后这样的一群细胞可被介导到病人体内来治疗疾病或不适。或者它可以用于缓解治疗(releaseoftherapeutics)。合适的技术见Gerson等的美国专利5,591,625，比起本发明其是使用干细胞的粗制品。或者聚集群或组合物可用于增加骨髓迁移，其中在导入整个骨髓前给正在骨髓移植的病人注射包含富集成人多潜能细胞的组合物。这样造血生成率可以增加，特别是在放疗或化疗后。该组合物可能也包含多潜能细胞和可以用于放疗或化疗的造血胞的组合物。也提供了本发明富集的或扩增的细胞生产用于产生或修复受体的组织的药剂的用途。也提供了本发明的组合物生产用于产生或修复受体的组织的药剂的用途。本发明也规定了根据本发明的方法分离得到的细胞或其子代，其中该细胞是被遗传修饰过的。在一个优选的实施方案中，细胞被遗传修饰来表达异源的蛋白。该异源蛋白可以是任何感兴趣的蛋白。例如，该异源的蛋白可以是刺激因子如la，25-二羟基维生素Ds(l，25D)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子a(TNF-a)、白介素-lP(IL-1P)和基质细胞衍生因子la(SDF-la)。在另一个实施例中，异源蛋白是可以促进成人多潜能细胞分化到特定的组织类型的生物活性因子。该生物活性因子可以是例如合成的糖皮质激素(如地塞米松)或一种骨形态形成蛋白(如BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-6或BMP-7)。本发明也提供了一个[STRO-3]杂交瘤细胞系，该细胞系是在2005年12月19日按照布达佩斯条约的规定保藏于ATCC的，编号为PTA-7282。本发明也提供了STR0-3的抗体，该抗体是在2005年12月19日按照布达佩斯条约的规定保藏于ATCC的编号为PTA-7282的杂交瘤细胞产生的。本发明也提供了分离的抗体，该抗体可结合多潜能细胞上和STRO-3抗体的相同的抗原决定簇，而该STRO-3抗体是在2005年12月19日按照布达佩斯条约的规定保藏于ATCC的编号为PTA-7282的杂交瘤细胞产生的。本发明也提供了包含本发明的抗体的组合物。优选的，该组合物进一步包含一个或多个适合的载体。也提供了包含本发明的富集细胞、本发明的扩增细胞、本发明的组合物、本发明分离的细胞、本发明的杂交瘤和/或本发明的抗体的试剂盒。贯穿本说明书"comprise"这个字或它的变化形式如"comprises"或"comprising"应该理解为意味这包含一个陈述的成分、整体或步骤、或成分、整体或步骤的组但不排除其它成分、整体或步骤或成分、整体或步骤的组。本发明的不同的性质和实施方案涉及到的单个部分合适的应用于其它部分的已做修正的变化(mutatismutandis)。因此，在一个部分详细说明的特性可能要和在其它部分详细说明的特性适当的结合起来。图1流式细胞分析用STRO-3分选的BAF-3细胞。逐步富集表达STRO-3表面抗原的BAF-3。通过磁珠/mAb捕获有选择的分离BAF-3细胞并且富集过程是用STRO-3单克隆抗体免疫标记的，在分选的循环一(A)、二(B)，卩三(C)后进行流式细胞分析。直到同源抗原表达后再进行免疫磁珠^]分选和富集。图2从表达STRO-3表面抗原的BAF-3细胞基因组DNA的PCR回收的前病毒cDNA的插入片断。长链PCR从表达STRO-3表面抗原的BAF-3细胞基因组回收的cDNA插入片断(箭头)。PCR引物和逆转录病毒载体的多克隆位点临近的序列互补。按照"方法"里面的细节进行扩增，用1.0%琼脂糖凝胶分离并通过溴化乙啶染色观察到PCR扩增产物。图3FASTA比对分析STR0-3抗原衍生的PCR产物。以下的部分序列分析，获得的核苷酸序列和提交给Genbank/EMBL组合的数据库的序列通过标准"FASTA比对分析"的相比较，并显示了和ALP互补DNA序列(Genbank接受号#H37944)的BLK异构体具有100%的同源性。图4STR0-3单克隆抗体可识别BAF-3转染体中的ALP的BLK异构体。亚克隆1.7kb的BLK-ALPcDNA的BamHI-XhoI限制性酶切片断(同时具有整个编码序列和5，、3，非编码区)到pRUF新霉素载体并且随后用逆转录病毒转导入BAF-3细胞(参见"材料和方法")。得到的具有G418抗性的细胞群.，用间攀免疫荧光标记染色并且用流式细胞仪分析。根据IgGl对照的表格方式数据(listmodedata)，数据显示为1x104光散射门事件(light-scattergatedevents)的单参数荧光(FITC)柱状图(用细黑线表示)，(A)单克隆抗体STR0-3;(B)单克隆抗体B4-78;(C)单克隆抗体B4-50和(d)单克隆抗体8B6。图5STRO-3单克隆抗体鉴定ALP的酶活性形式。未转染的(A)和STR0-3阳性(B)的BAF-3细胞涂在玻璃片上制成细胞涂片，然后用70%乙醇固定。然后按照生产商的推荐的那样用Sigraa碱性磷酸酶底物试剂盒(AM0100)使涂片和碱性磷酸酶底物一起孵育。结果显示表达STR0-3的BAF-3细胞(B)包含碱性磷酸酶的活性形式(紫色/红色)。细胞用苏木精复染成蓝色。图6ALP特异PCR。如方法中所描述的提取表达STRO-3细胞表面抗原的BAF-3细胞的总RNA，用RT-PCR来鉴定cDNA编码的碱性磷酸酶的异构体。用于鉴定序列的PCR引物或者特别针对(L)肝碱性磷酸酶(216bp)或针对(B)骨碱性磷酸酶(215bp)异构体，如之前的Sato和其同事所描述的那样(1994)(Sato等，1994)。PCR扩增后，产物在1.5%的琼脂糖凝胶中电泳并且用溴化乙啶染色。结果显示STRO-3抗原表达的BAF-3细胞只表达骨特异(B)的碱性磷酸酶异构体的转录本。图7在人的骨组织中表达STRO-3抗原。用方法中所描述的免疫组化的方法在发育的骨髓切片中检测STR0-3单克隆抗体的免疫原性。五个石腊包埋的微米切片(55天的人的肢体)如方法中所描述的用STR0-3单克隆抗体染色。骨髓空间的间充质细胞(BM)、血管周围区(PV)和在生长盘区的界面都能明显看到STR0-3抗原(TNAP)的表达，骨膜(P)或软骨(C)没有观察到染色。图8克隆原细胞唯一地限制在人BM的STR0-3单克隆抗体阳性的部分。未分离的BM(Pre)的单细胞悬液和MACS分选的TNAP阳性(TNAP+)和TNAP阴性(TNAP-)的人丽接种在调节生长培养基(Gronthos等，2003)中来评估每个细胞部分的粘附的克隆形成细胞的发生率。培养12天后对克隆(合计含有50个细胞或更多)进行染色并用"方法"中所描述的对细胞打分(scored)。柱型图显示接种的每个细胞部分(王均来自两个单独的实验)的每105细胞中克隆原的克隆数量。我们的数据证明CFU-F排他地限制在BM的頂AP阳性部分。图9成人BMMNC共表达TNTAP和间充质细胞前体的标志STR0-1。双免疫荧光染色和流式细胞仪分析孵育用MACS分选的STR0-1的BMMNC，用连有FITC的山羊抗小鼠的IgM间接标记(x轴)，STR0-3单克隆抗体(小鼠IgGl)是用连有PE的山羊抗小鼠的IgG间接标记(y轴)。点图直方图代表了以表格方式(listmode)数据收集的5Xl04事件。垂直线和水平线设置为〈1.0%的同型匹配(isotype-matched)对照抗体获得的平均荧光值的反应水平，该同型匹配对照是在同样的处理条件下的iB5(IgG)和1A6.12(IgM)。结果证明STR0-1亮(bright)的细胞只有较小的部分共表达TNAP(右上象限)而其它的STR0-1阳性细胞不和STRO-3抗体反应。用FACS分离的四个象限的细胞随后用来分析CFU-F的发生率(表二)。图10通过STR0-3单克隆抗体富集的共表达TNAP以及CD45、CD34、3G%、CC9和STRO-1的细胞。图11多次传代后用STRO-3单克隆抗体分选的细胞保持高水平STRO-1的表达。图12用结合STRO-1的抗体选择骨髓衍生的细胞的STRO-1表达。图13用STR0-3单克隆抗体分选、培养扩增多潜能细胞的早期(第2代)和晚期(第5代)的表型特征。用STR0-3分选的成人多潜能细胞(P1)是一群具有CC9、STR0-1和STR0-3抗原高表达的表面表型特征的细胞。细胞培养5代后的细胞群(P5)证明是可以效果显著的保持STRO-1表达。图14用STR0-3单克隆抗体分选细胞分化成脂肪细胞。分析两种大量的STR0-3单克隆抗体分选细胞2242A和2070C的分化能力。曲线图显示与对照未诱导细胞相比用脂肪细胞生成诱导培养基诱导的平均相对荧光单位(AvgRFU)。图15STR0-3单克隆抗体分选的细胞分化成骨细胞。以已知钙浓度的样品在OD550nm的吸收值做标准曲线。两种大量的STR0-3单克隆抗体分选细胞2242A和2070C用骨生成诱导培养基诱导。制备诱导的和未诱导的细胞提取物在0D550nm测量。图16STR0-3单克隆抗体分选的细胞分化成有功能的骨细胞。A—STR0-3单克隆抗体分选出的成人多潜能细胞在含有10%FCS、100ixML-抗坏血酸-2-磷酸、10—7M的地塞米松和3mM的无机磷酸盐的aMEM培养三周后用茜素红染矿物质沉积(minerald印osits)。B一在O.5mM甲基异丁基甲基黄嘌呤、0.5uM氢化可的松和60uM吲哚美辛中培养STRO-3单克隆抗体分选出的成人多潜能细胞随后用油红0染色细胞。C一用10ng/mlTGF-P3处理细胞并用Alcian兰染色鉴定蛋白多糖的合成。D—移植后用组织学检测培养扩增的STR0-3单克隆抗体分选出的成人多潜能细胞。图17施用培养扩增的STR0-3单克隆抗体分选出的细胞后的脊骨融合率。图18用培养扩增的STR0-3单克隆抗体分选出的细胞处理的绵羊出现强的脊骨融合。图19在一个绵羊的椎弓根钉(transpedicular)螺旋固定t莫型中STR0-3单克隆抗体选择培养扩增同种基因的成人多潜能细胞。图20在临界大小的绵羊部分胫骨缺失中通过同种基因培养扩增STR0-3单克隆抗体分选出的细胞出现剂量依赖性的骨增长。图21培养扩增STRO-3单克隆抗体分选出的细胞处理的临界大小的部分胫骨缺失组有更高的连接率。图22大鼠心肌梗塞2周后培养扩增STRO-3单克隆抗体分选出的细胞显著的提高了心脏功能。图23同种基因的绵羊培养扩增STR0-3单克隆抗体分选出的细胞(第5代)在急性同时结扎对角支和冠状动脉后立即直接注射到绵羊心脏的效果。A—绵羊的射学指数的减少^;B—绵羊的心脏舒张期体积变化X;C一绵羊的心脏收縮期体积变化X。图24当与盐溶液相比时在纤维蛋白胶中运输增加细胞的存活率。具体实施方式微生物保藏的详细资料在2005年12月19日产生命名，STRO-3的单克隆抗体的杂交瘤由美国典型培养物中心(ATCC)保藏，保藏编号为PTA-7282该保藏是按照国际公认的用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的规定和其下规章进行的。这保证了从保藏日期起30年可以维持细胞的存活的培养。该生物体可以根据布达佩斯条约的条款从ATCC得到，布达佩斯条约保证在相关专利的公布后，公众可永久的不受限制的得到培养的后代。本申请的代理人同意如果当在合适的条件下培养时保藏的培养物死亡或丢失或损坏，将根据通知迅速的用同样的存活的培养样品替换。保藏株的可获得性不被解释为违反任何国家根据其专利法律所授权的权利的实施发明的许可。常规技术除非另外特殊定义，这里所用的所有的技术和科学术语都与本领域普通技术人员所理解的含义一致。(如在细胞培养、分子遗传学、免疫学、免疫组化、蛋白化学和生物化学)除非另外指出，本发明所使用的重组蛋白、细胞培养和免疫学技术是本领域所熟悉的标准程序。这些技术在贯穿以下的原始资料中进行了描述禾口角军释，如，J.Perbal，APracticalGuidetoMolecularCloning,John.Wiley禾口Sons(1984)，J.Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbourLaboratoryPress(1989)，T.A.Brown(编辑)，EssentialMolecularBiology:APracticalApproach,巻l和2，IRLPress(1991)，D.M.Glover和B.D.Hames(编辑)，DNACloning:APracticalApproach,巻l-4，IRLPress(1995和1996)和F.M.Ausubel等(编辑)，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePub，Associates禾口Wiley-工nterscience(1988，包括直到现在为止的所有补充资料)，EdHarlow禾口DavidLane(编辑)Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbourLaboratory,(1988)和J.E.Coligan等(编辑)CurrentProtocolsinImmunology,JohnWiley&Sons(包括直至U现在为止的所有补充资料)。成人多潜能细胞我们指"成人多潜能细胞"是衍生自能够产生几个成熟的细胞类型中任何一个的成人组织的细胞。如这里所用的，这个短语包含成人干细胞和祖细胞，如间充质前体细胞(MPC)和这些细胞的多潜能的后代。间充质前体细胞(MPCs)是在骨髓、血、皮肤和骨膜发现的细胞，其能够分化成间充质或结缔组织包括脂肪、骨、软骨、弹性、肌肉和纤维结缔组织。这些细胞进入的特异的链系定向和分化途径取决于不同的机械影响和/或内源的生物活性因子如生长因子、细胞因子和/或宿主组织所建立的局部的微环境条件。间充质前体细胞被定义为没有终端分化的细胞；不受限制的分裂的细胞；其分裂产生的子细胞是干细胞或在一定时期可以不逆转的分化-以产生表型细胞的祖细胞。MPCs是能够形成大量多潜能细胞的非造血祖细胞。这里所用到的术语"enriched"、"enrichment"或其变体是描述当与未处理细胞比较时某一特定细胞类型部分或大量特定细胞类型的部分是增加的细胞群。在一个本发明更优选的实施方案中，至少1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的总的富集的细胞群是具有TNAP+表型的成人多潜能细胞。在一个更优选的实施方案中，本发明的TNAP+细胞能够结合到STR0-3抗体，该抗体是由ATCC在2005年12月19日按照布达佩斯条约规定保藏的编号为PTA-7282的杂交瘤细胞系产生的。在一个实施方案中，本发明富集的种群包含大约79%到大约99%，更优选的是大约84%到大约94%,甚至更优选的是大约89.2%的细胞是CD45+。在另一个实施方案中，本发明富集的种群包含小于大约2%，更优选的是小于大约浅的细胞是CD34+。在另一个实施方案中，富集的种群不包含CD34+的细胞。在一个实施方案中，本发明富集的种群包含小于大约6%，更优选的是小于大约3.5%的细胞是CC9+。在另一个实施方案中，本发明富集的种群包含大约23%到大约3%，更优选的是大约8%到大约18%,并且甚至更优选的是大约13.2%的细胞是3G5+。在另一个实施方案中，本发明富集的种群包含大约12%到大约3%,更优选的是大约10%到大约6%，并且甚至更优选的是大约7.8%的细胞是STR0-1+。在另一个实施方案中，本发明富集的细胞群还没有在体外培养。更进一步，在一个优选的实施方案中，本发明富集的细胞群能够产生CFU-F克隆原。在一个实施方案中，与用STR0-1作为标志分选并培养在相同条件下的细胞相比，培养本发明富集的细胞群导致一个更高的STR0+细胞比例。优选的，这样的培养大约是传4或6代。优选的，细胞是骨髓来源的。在进一步的一个实施方案中，和起始细胞群相比培养本发明富集的种群导致STRO+细胞，代细胞数量的增加，例如，在2、4或6代后。作为对比，和起始(STRO-1分选)细胞群相比，培养STR0-1富集细胞导致STRO+细胞子代细胞数量降低，例如，在4或6代后。在另一个实施方案中，富集的细胞群是纯的TNAP+细胞。本发明也涉及体外培养本发明的成人多潜能细胞所产生的子代细胞(这里也指扩增的细胞)。本发明扩增的细胞具有依赖于培养条件(包括培养基中刺激因子的数量和/或类型)、传代数等等的广泛的多种表型。在一个实施方案中，这样扩增的细胞(至少传了5代以后)可以是T證-、CC9+、HLAclass1+、HLAclassI_、CD14—、CD19—、CD3—、CDlla-c—、CD31—、CD86—和/或CD80—。然而，在那些这里所描述的不同的培养条件下不同的标志表达可能有变化。同时具有这些表型的细胞也可能在扩增的细胞群中占优势，这不意味着较少部分的细胞不能具有这种表型(例如，扩增细胞的很少比例的细胞可以是CC9-)。在一个更优选的实施方案中，本发明扩增的细胞仍然有能力分化成不同的细胞类型。在一个实施方案中，本发明扩增的(expended)细胞群包含细胞其中至少25%更优选的是至少50%的细胞是CC9+。在另一个实施方案中，本发明扩增的细胞群包含细胞其中至少40%更优选的是至少45%的细胞是STRO-l+。在另一个实施方案中，培养本发明富集的细胞导致可能也表达选自以下的标记的成人多潜能细胞LFA-3、THY-1、VCAM-1、ICAM-1、PECAM-1、P-选择素、L-选择素、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD29、CD18、CD61、P-整合素、6-19、血栓调节蛋白、CDIO、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、FGF-R、Leptin-R(痩素受体)、(STR0-2二L印tin隱R)、RANKL、STRO-lbrisht和CD146或这些标记的任何组合。优选的成人多潜能细胞的显著比例能够分化成至少两种定向细胞类型。成人多潜能细胞可能定向分化的链系的非限制的示例包括骨前体细胞；肝细胞祖细胞(对于胆管上皮细胞和肝细胞是多能的)；限制在神经系统的细胞(其能够产生神经胶质细胞前体，神经胶质细胞前体可进一步生成少突细胞和星形胶质细胞)；神经元前体(其进一步生成神经元)；心肌和心肌细胞的前体细胞系、对葡萄糖起反应分泌胰岛素的胰岛P细胞系的前体细Jfe系。其它链系包括，但不限于成牙质细胞、牙质产生细胞(dentJn-producing)和软骨细胞和以下细胞的前体细胞视网膜色素上皮细胞、纤维原细胞、皮肤细胞如角质细胞(keratinocytes)、树突状细胞、毛囊细胞、输尿管上皮细胞、平滑肌和骨骼肌细胞、睾丸祖细胞、血管内皮细胞、腱、韧带、软骨、脂肪细胞、纤维原细胞、骨髓基质、心肌、平滑肌、骨骼肌、周细胞、血管、上皮的、神经胶质的、神经元的、星形胶质细胞和少突细胞。在一个更优选的实施方案中，成人多潜能细胞至少能够在体内或体外培养以产生脂肪细胞、骨细胞和/软骨细胞。在另一个是实施方案中，本发明的"成人多潜能细胞"不能够通过培养生成造血干细胞。术语"成人"是用它最广泛的意思包括出生后的对象。在一个优选的实施方案中，术语"成人"指过了青春期的对象。这里用的术语"成人"也能包括从女性所采集的脐带血。术语"成人"不包括胚胎或胎儿来源的细胞。因此，本发明的"成人多潜能细胞"也可认为是"非胚胎多潜能细胞"。当我们认为一个细胞对于某个特定的标志来说是阳性的时候，标志可能或者低(lo或dim)或者高(bright，bri)表达，这依赖于标志在细胞表面存在的程度，该术语涉及荧光或其它用于颜色分选细胞过程的颜色的密度。低(或暗或阴暗)和亮的区分在用于分选的特定细胞群的标志的背景下可以被理解。当我们这里指一个细胞对于特定的标志是"阴性"时不是指这个细胞一点也不表达该标志。是指这个细胞以相对很低的水平表达这个标志，并且当可检测的标记时它产生了非常低的信号。术语"亮"当用在这里时指当可检测的标记时在细胞表面的标志产生了相对高的信号。同时不希望被理论所约束，提议"亮"的细胞比样品中其它细胞表达更多的靶标志蛋白(如可被STR0-1识别的抗原)。例如，STRO-广i细胞当用连有FITC的STRO-l抗体标记并用流式细胞仪检测时比非亮细胞(STR0-ldl'11/dim)产生一个更强的荧光信号。优选的，"亮"细胞构成至少大约0.1%的包含在起始样品中标记最亮的骨髓单核细胞。在另一个实施方案中，"亮"细胞构成至少大约0.1%，至少大约0.5%，至少大约1%，至少大约1.5%或至少大约2%的包含在起始样品中标记最亮的骨髓单核细胞。在一个更优选的实施方案中，STR0-1bl"ight细胞有2个log级的STRO-1表面表达的较高表达。这是相当于"背景"计算的，即细胞是STRO-1—。通过比较，STRO-ldim和/或STRO-li"""细胞有少于2个log级的较高表达STR0-1表面表达，典型的是大约1个log或少于"背景"。组织非特异的碱性磷酸酶(TNAP)这里所用的术语"TNAP"包含该蛋白所有的异构体。例如，该术语包含肝异构体(isofonn)(UVP)、骨竭抅体(SAP)和肾异构体(KAP)。在一个更优选的实施方案中，TNAP指BAP。在一个特别优选的实施方案中，这里所用的TNAP指可结合STR0-3抗体的分子，而该STR0-3抗体是由ATCC在2005年12月19日按照布达佩斯条约规定保藏的编号为PTA-7282的杂交瘤细胞系产生的。'在本发明的上下文中，TNAP优选人的TNAP。例如，TNAP可以是包含SEQIDNO:l所示的氨基酸序列的人的TNAP。然而，可以理解术语"TNAP"不限于人的序列并且包括从任何来源得到的同源序列，例如同源的，特别是直系同源(orthologues)(例如，同源物是从除了人之外的其它物种来的)、等位基因变量以及如下面所讨论的片断和合成的肽或其衍生物。大量的TNAP直系同源已知，包括小鼠的TNAP(SEQIDN0:2)和大鼠的TNAP(SEQIDNO:3)。在本发明更优选的实施方案中，同源序列是在氨基酸水平上，在超过至少20、优选50或100个氨基酸上和如SEQIDNO:1,SEQIDNO:2或SEQIDN0:3所示的序列具有至少70、80或90%，优选的至少95或98%的同一性。虽然同源在本领域也能被认为是相似(例如，氨基酸残基具有相似的化学特性/功能)，在本发明的上下文中，它优先指在序列的一致性上的同源。多肽的同一性％通过FASTA(PearsonandLipman，1988)(GCG程序)用设定默认值和至少50个氨基酸长度的查询序列来进行分析，由此FASTA分析比对两个序列至少50个氨基酸的区域。更优选的，FASTA分析比对两个序列至少100个氨基酸的区域。更优选的，FASTA分析比对两个序列至少250个氨基酸的区域。甚至更优选的，FASTA分析比对两个序列至少350个氨基酸的区域。关于本发明的和/或为了用在本发明的氨基酸序列的术语"变异"或"衍生"包括任何替代、改变、修饰、交换、缺失或插入一个(或多个)氨基酸从或到序列，只要这样做之后的氨基酸序列优选的有天然存在的TNAP至少25到50°/。的生物学活性，更优选的有至少实质上的同样的活性。相关生物学活性包括变异体或衍生物结合到天然TNAP配体上的能力。一般的，与天然存在的TNAP的相应区相比，优选的变异体或衍生物少于20%、10%或5%的氨基酸残基是改变的，百分数典型的是低于更短的氨基酸序列，例如20个或更少的氨基酸的氨基酸序列的氨基酸残基改变数少于5%。术语"TNAP"也包含上述全长多肽和其变异体的片断，包括在这里列出的序列的片断。优选片断包括包括表位的那些片断。合适的片断长度至少是大约6或7个氨基酸，例如至少IO、12、15或20个氨基酸。它们的长度也可少于200、100或50个氨基酸。序列表所描述的多肽和其等位基因和其物种变体的多肽片断可包括一个或更多(如2、3、5或10)个替代、缺失或插入，包括保守替代。替代、缺失和/或插入例如通过重组技术的方法得到，优选在序列表中所描述氨基酸残基的改变数少于20%、10%或5%的。在一个实施方案中，术语TNAP不包含胎盘AP。TNAP结合试剂当用在这里，短语"TNAP结合试剂"指识别和/或结合到TNAP的部分。优选的TNAP结合试剂是经鉴定具有TNAP结合亲和力的多肽或化合物。例如，TNAP具有胶原结合环(Mornet等，2001)。因此，TNAP试剂可以是胶原，优选I型胶原。特别首选的TNAP结合试剂是抗TNAP的抗体(来自任何来源的天然存在的或重组的)。用于本发明的术语"抗体"包括完整分子和其片断，例如Fab、F(ab')2和Fv(能够结合决定表位)。这些抗体片断保留了选择性结合它的抗原或受体的一些能力，下面详细说明-(1)Fab，包含抗体分子单价的抗原结合片断的片断，能够通过用木瓜蛋白酶消化整个抗体来产生完整的轻链和一个重链的一部分。(2)Fab'，抗体分子的片断，可通过用胃蛋白酶处理整个抗体，通过还原，来产生完整的轻链和重链的一部分。每个抗体分子可以得到两个Fab'片断。(3)(Fab')2，抗体片断，通过可通过用胃蛋白酶处理整个抗体，但不通过随后的还原而得到；F(ab)2是两个Fab'片断通过两个二硫键结合在一起的二聚体；(4)Fv，基因工程的片断，作为两条链表达包含轻链的可变区和重链的可变区；和(5)单链抗体("SCA")，基因工程的分子，含轻链的可变区和重链的可变区，通过合适的多肽连接子连接为遗传上融合的单链分子。制造这些片断的方法是本领域所熟知的。(见例如，Harlow和Lane，Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbourLaboratory,NewYork(1988)，通过引用参考并入本文)。本发明的抗体可利用细胞表达TNAP、全长TNAP或其片断作为免疫抗原来制备。用于免疫动物的肽可来自翻译自cDNA或化学合成并纯化和如果需要，将其连接到载体蛋白。这些普通使用的载体化学连到肽包括以钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)，甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)和破伤风类毒素。这些偶联肽可再用来免疫动物(例如小鼠或兔子)。如果需要，多克隆抗体可被进一步纯化，例如，通过结合到抗体产生的肽结合的基质和从该基质洗脱。那些本领域技术人员知道有各种各样的在免疫学技术方面普通的用来纯化和/或浓縮多克隆抗体的技术，以及纯化和/或浓縮单克隆抗体的技术(参见例如Coligan等Unit9，CurrentProtocolsinImmunology,WileyInterscience，1991，通过引用参考并入本文)。单克隆抗体可用任何通过连续培养细胞系提供产生抗体分子的技术来制备，如例如杂交瘤技术，人B细胞杂交瘤技术和EBV-杂交瘤技术(Kohler等1975;Kozbor等，1985;Cote等，1983;Cole等，1984)本领域所熟悉的方法也容许通过抗体显示结合TNAP的能力来鉴定和从抗体表达文库中分离抗体。具有和STRO-3单克隆抗体同样或相似的表位特异性的抗体可通过它们具有和特定结合TNAP的单克隆抗体竞争的能力来得以鉴定(如，结合到携带有TNAP的细胞，如MPCs，或分离TNAP蛋白或其片段)。用受体嵌合体(Rucker等，1996)或其它本领域已知的技术，可绘制STRO-3单克隆抗体结合位点的图谱。在没有不适当的实验的情况下，通过确证是否一个单克隆抗体阻碍了STRO-3单克隆抗体结合到TNAP上有可能决定是否前者和后者有同样的特异性。如果单克隆抗体被检测可以和STRO-3单克隆抗体竞争，如显示为STRO-3单克隆抗体结合能力的降低，那么两个单克隆抗体就结合到同样的或紧密相关的表位。还有另外一个方法来确定单克隆抗体是否具有STR0-3单克隆抗体特异性即预先和TNAP—起孵育被检测的单克隆抗体，然后加STR0-3单克隆抗体来检测是否抑制了STR0-3单克隆抗体的结合TNAP的能力。如果STRO-3单克隆抗体的结合被抑制了，那么十有八九被检测的单克隆抗体具有和STRO-3单克隆抗体同样的或功能等价的表位特异性。本发明用到的单克隆抗体可被设计来改变抗体的同种型。例如，IgG2A的同种型可工程化为IgGl，IgG2B或其它同种型。可以理解，TNAP结合剂如本发明的抗体可连接到在分离细胞、治疗或诊断应用方面有用的化合物上。在实施方案中，本发明的抗体连接了标签。该标签可以任何可直接检测的实体的形式存在。例如，该标签可以是直接标签，如May等在美国专利No.5，656,503中所详细描述的那样。直接标签在它们的天然状态下是很容易用裸眼观察或在光学滤光器的帮助下观察和/或应用刺激如紫外线来激发荧光后观测。示例包括放射性激活的、化学发光的、有电活性的(electroactive)(例如氧化还原(redox)标签)和荧光化合物。直接的特定标签，如染料溶胶、金属溶胶(如金)和有色的橡胶粒子也非常合适并且和荧光化合物一起是优选的。在这些选项中有色的橡胶粒子和荧光化合物是最优选的。标记到小区域或容积的标签的浓度应该达到应该能够检测到信号的程度，如强的染色区。间接标记如酶如碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶也可以用，虽然这些通常需要在可以检测到可见的信号前加一个或多个显影剂如底物。可以通过共价或非共价(包括疏水作用)结合或吸附作用将标签连到结合试剂如本发明的抗体上。这样的连接技术在本领域是很普通的并可因为应用特定的试剂而改编。用于本发明方法中的结合试剂如本发明的抗体也可以包被到固相支持物上。例如，抗体可被包被到一种合成的塑料材料、磁珠、粒子、微滴定分析板、微分析芯片、橡胶珠、包含纤维质或合成聚合材料的滤器、玻璃或塑料片、测验片、毛细填充装置等等。用于本发明方法中的结合试剂如本发明的抗体也可以和细胞分选装置合为一体。例如，该装置可以是基于MACS技术的自动细胞分选装置。这样的装置使得可以在密闭的无菌的系统中进行大规模的磁性细胞分选。例如，该装置可以包含和其它装置合为一体的计算机、磁分离单位、蠕动泵和各种各样的夹管阀。该和其它装置合为一体计算机优选的可以控制仪器中的所有部件和指导系统以标准序列执行程序。该磁分离单位优选的包括可移动的永久磁铁和选择柱的固定器。该蠕动泵优选控制通过管路组合的流速。夹管阀可用于确保控制缓冲液和细胞悬液的流速。在分选前细胞用本发明的抗体进行磁性标记。一次性使用的管路组合包括分离柱可能连接到该装置和细胞制备袋(包括标记的细胞)可能连接到管路组合上。启动分选程序后，系统自动按照所选择的程序将细胞施加于分离柱上、进行一系列洗涤最后洗脱得到纯的目的细胞。细胞分选技术用TNAP结合因子，比如抗TNAP抗体识别成人多潜能细胞的能力不仅可以在组织样品中鉴定和定量这些细胞，也可以将它们分离和富集在悬液中。许多细胞分选技术能完成满足这些要求，其通过细胞抗体复合物或带有抗体标签的方法来物理分离细胞。这种标签可能是磁性颗粒或荧光分子。抗体可能和这些细胞结合并形成多细胞聚集体，利用密度进行细胞分离。抗体可以选择连接到固相基质，以使所需的细胞黏附上去。从未结合抗体的细胞中分离结合了抗体的细胞的多种方法是众所周知的。例如结合到细胞上的抗体(或用抗同种型的抗体)可以携带标签，然后通过可检测到标签存在的机械细胞分选仪器分离细胞。荧光激活细胞分选仪器在本领域中是众所周知的。在一个实施方案中，抗TNAP抗体连接在固相支持物。在本领域中多种固相支持物是常用的，包括但不限于琼脂糖珠、聚苯乙烯珠、中空纤维膜、聚合物和塑料陪替氏培养皿。可以通过简单的物理分离方法从细胞悬液中将与固相支持物分离出来而分选出被抗体结合的细胞。超顺磁微颗粒可用来分离细胞。例如可用抗TNAP抗体包被微颗粒。然后将携带标签的抗体、超微颗粒与含有目的细胞的溶液孵育。微颗粒结合在所需成人多潜能细胞的'表面，然后用磁性装置收集这些细胞。在另一个实施例中，允许细胞样品物理地与固相接触，该固相连接携带抗TNAP单克隆抗体。固相连接包括吸附抗体至塑料、硝化纤维素或其它表面。抗体也可以吸附到中空纤维膜的大孔表面(足够大以使细胞流过)。另外，抗体也可共价连接到表面或珠子，比如PharmaciaS印harose6MBmacrobeads。成人多潜能细胞悬液与固相耦联抗体孵育的精确条件和持续时间要根据所用系统的特定因子来决定。在本领域合适的分选条件为大家所共知。然后在成人多潜能细胞结合足够时间之后，用生理性缓冲液洗脱或洗涤未结合的细胞。在进行合适的检测并确定所需的组合物已经分离得到之后，未结合的细胞可以收集起来用于其它目的或丢弃。然后结合的细胞用合适方法从固相上分离下来，主要依据固相和抗体的特性特点来分离的。例如可以通过剧烈搅动从塑料陪替氏培养皿固相上洗脱下结合的细胞。另外，可以通过酶解或消化存在于固相和抗体之间的酶敏感的间隔子序列来洗脱分离结合细胞。结合琼脂糖珠子的间隔子可以买到，比如从Pharmacia公司购买。然后用缓冲液通过离心洗涤洗脱下来的、富集的细胞；并且用常规的技术将所述的富集的细胞或未结合的细胞冷冻保存在合适的条件下以备后用，或者移植给受体。遗传改造细胞的生产在一个实施方案中，本发明涉及遗传改造细胞，特别是本发明的遗传改造的成人多潜能细胞。优选的，细胞经遗传改造并可生产异源蛋白质。典型的，遗传改造后的细胞将可以分泌表达异源蛋白质。然而，在实施方案中，细胞可以被改造以表达功能性的非蛋白编码多聚核苷酸比如dsRNA(典型的是用于RNA沉默)，反义寡核苷酸或催化性核酸(比如核酶或DNA酶)。遗传改造后的细胞可以培养在至少存在一种足够支持改造后细胞生长的细胞因子的培养基中。因此，得到的遗传改造后细胞可以立即使用(例如移植)，培养和在体外扩增，或储存以备后用。改造后的细胞可以用本领域共知的方法储存，比如液氮冷冻保存。这里使用的遗传改造包含任何遗传改造方法，其涉及引入外源多聚核苷酸至成人多潜能细胞中或成人多潜能细胞中内源性基因的改造。遗传改造包括但不限于转导(病毒介导的从宿主或供体到受体的宿主DNA转移，可在体外或体内)、转染(将分离后的病毒DNA基因组转入细胞中)、脂质体介导的转移、电转、磷酸钙转染或共沉淀和其它方法。转导的方法包括直接与生产细胞共培养(Bregni等，1992)和在有或没有合适的生长因子和聚阳离子时(Xu等，1994)与病毒上清培养。外源性多聚核苷酸优选通过载体转入宿主细胞。载体优选包含插入编码序列的转录和翻译必需元件。在本领域中，用来构建这样的载体的方法众所周知。例如构建合适表达载体的技术在Sambrobk等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPressN.Y.(3rdEd.，2000);禾口Ausuber等，CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork(1999)中有详细的描述。载体可包括但不限于病毒载体，比如逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒载体；粘粒；质粒载体；合成载体；和其它在本领域中常用的重组载体。载体包含启动子和能将多聚核苷酸连接进去的克隆位点，这在本领域是熟知的。这种载体能够在体外或体内转录RNA，并且它们可以买到，比如从Stratagene(LaJolla，Calif.)和PromegaBiotech(Madison,Wis.)公司购买。特殊的示例包括Stratagene的pSG，pSV2CAT，pXtl，Pharmacia的pMSG，pSVL，pBPV和pSVK3。优选的载体包括逆转录病毒载体(参见Coffin等，"Retroviruses^，第9章，pp;437-473，ColdSpringsHarborLaboratoryPress,1997)。本发明中有用的载体可以通过本领域共知的方法重组制备。例如W094/29438,W097/21824和W097/21825描述了逆转录病毒包装质粒和包装细胞系的构建。示例的载体包括PCMV哺乳动物表达载体，比如pCMV6b和pCMV6c(ChironCorp.),pSFFV-Neo和pBluescript-Sk+。应用的逆转录病毒载体的非限制的示例是那些来源与小鼠、禽类或灵长类的逆转录病毒。通常的逆转录病毒载体包括那些基于小鼠莫洛尼氏白血病毒的载体(MoMLV-vector)。其它MoMLV来源的载体包含Lmily，LINGFER，MINGFR和MINT。另外的载体包括基于长臂猿白血病毒(GALV)和小鼠莫洛尼氏肉瘤病毒(M0MSV)和脾灶形成病毒(spleenfocusformingvirus)(SFFV)的那些载体。从小鼠干细胞病毒(MESV)来源的载体包括MESV-MiLy。逆转录病毒载体也包括基于慢病毒属(lentiviruses)的载体，以及非限制的示例包括基于人免疫缺陷病毒的载体(HIV-1和HIV-2)。在构建逆转录病毒载体时，病毒的gag，pol和env序列从病毒中去除以腾出空间用于插入外源DNA序列。编码外源認A的基因通常在位于长末端重复序列(LTR)中的强病毒启动子的控制下进行表达。合适的调控序列的选择依赖于所用的宿主细胞，并且这些选择在本领域中是人所共知的。除外LTR的启动子，有很多启动子也是已知的。非限制的示例包括噬菌体lambdaPL启动子、人巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子；小鼠莫洛尼氏肉瘤病毒(MMSV)的U3区域启动子、鲁斯氏肉瘤病毒(RSV)的U3区域启动子或脾灶形成病毒(SFFV)的U3区域启动子；GranzymeA启动子；和GranzymeB启动子。另外，诱导性或多步骤控制的元件也被使用。选择合适的启动子对于本领域技术人员而言是显而易见的。如果包装细胞系能够反式提供gag，pol和env的功能，则这样重组子可被有效的包装至病毒颗粒中。因此，当重组载体加入到包装细胞中时，由细胞生产的gag-pol和env蛋白与载体RNA组装以产生感染性病毒并分泌导培养基中。因此，产生的病毒可以感染和整合到靶细胞的DNA中，但是不能产生传染性的病毒颗粒，因为其缺乏必要的包装序列。目前使用的大多数包装细胞转染了分离的质粒，每一个载体包含必需的编码序列，因此产生可复制的有功能的病毒之前，多种重组元件是必需的。另,外，包装细胞系含有前,毒。,前病毒是残缺的，因此虽然它可以产生所有组装传染性病毒所需的所有蛋白质，但是它自身的RNA不能包装到病毒中。从重组病毒产生的RNA可被包装。因此，从包装病毒释放的病毒群体(stock)仅仅包含重组病毒。逆转录病毒包装细胞系的非限制的示例包括PA12,PA317,PE501，PG13，PSI.CRIP，RDI14,GP7C-tTA-G10,ProPak-A(PPA-6)和PT67。参考Miller等，1986;Miller等，1989;Danos等，1988;Pear等，1993;和Finer等，1994。其它合适的载体包括腺病毒载体(见Frey等，1998;和WO95/27071)和腺相关病毒载体。这些载体在本领域中是众所周知的，比如在Chatterjee等，1996;禾口StemCellBiologyandGeneTherapy,eds.Quesenberry等，JohnWiley&Sons,1998;禾口U.S.Pat.Nos.5，693，531和5，691，176中描述的那样。腺病毒载体的使用在某些情况下可能更有利，因为它.们不能感染未分化的细胞。并不像逆转录病毒DNA，腺病毒DNA不整合导靶细胞的基因组中。而且，腺病毒载体比逆转录病毒载体有更大的外源DNA携带容量。腺相关病毒载体是另一种有用的递送系统。这种病毒的DNA可以整合导未分化的细胞基因组中，并且用腺相关病毒载体已经将多种多聚核苷酸成功引入导不同的细胞系中。在一些实施方案中，载体包括两个或更多的异源多聚核苷酸序列。优选额外的核苷酸序列是编码选择性标记、结构基因、治疗基因或细胞因子/趋化因子基因的多聚核苷酸。包含在载体中的筛选标记可能用于检测成功的遗传改造和筛选整合了DNA的细胞。非限制的示例包括药物抗性标记，比如G418和潮霉素。另外的阴性筛选也要用到，例如标记是HSV-tk基因。这个基因将使细胞对诸如无环鸟苷(acyclovir)和gancyclovir的因子敏感。NeoR(新霉素/G148抗性)基因通常被使用，但是任何方便的标记基因都可能被使用，其基因序列不存在于靶细胞中。而且，非限制的示例包括低亲和的神经生长因子(NGFR)，增强的绿色荧光蛋白(EFGP)，二氢叶酸还原酶(DHFR)基因，细菌hisD基因，小鼠CD24(HSA)，小鼠CD8a(lyt)，给予嘌呤霉素或福来霉素(phleomycin)抗性的细菌基因和半乳糖苷酶。额外的多聚核苷酸序列可能通过相同的载体引入导宿主细胞中，或者可能通过第二个载体引入导宿主细胞中。在优选的实施方案中，筛选标记将被包含在与多聚核苷酸一样的载体中。本发明也包含遗传改造内源性基因的启动子区域以使内源性基因表达上调，最终与野生型成人多潜能细胞相比，其编码蛋白质产量增加。刺激因子的给予本发明的方法可能涉及一种或多种刺激因子的使用。而且，本发明的成分可能包含一种或多种刺激因子。在一个实施方案中，本发明的方法可能涉及给予一种或多种刺激因子，比如la，25-二羟维生素D3(1,25D)、血小板起源生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子a(TNF-a)、白介素-IP(IL-1P)和基质起源因子lci(SDF-la)，这些因子将局部的、系统的或者位于诸如移植物或装置中。在特定的实施方案中，刺激因子的优选浓度范围是0.1nM-O.1M，0.lnM-O.05M，0.05nM_15uM或0.OluM-lO"M。要注意，剂量指随着条件的改变要发生变化。对于特定的受试者来说，要根据个体需要和参与管理监督成分给予的人的职业性评价来调整剂量。这里提到的剂量范围可以效仿，但是不限于此，而且可以根据医疗实践来选择剂量范围。刺激因子在组合物中的量根据诸如个体患者的疾病状态、年龄、性别和体重等因素而变化。给药方案可以调整以得到最佳的治疗效果。例如可以给予单一的大药丸，也可以在整个时间过程中分成几份给药，或者根据治疗情况而随时成比例减少或增加剂量。为了给药方便和剂量的一致性，以剂量单位形式配制胃肠外组合物是非常有利的。这里使用的"剂量单位形式"指得是给需要治疗的患者单一剂量的合适的物理分散的单位；每单位包含可以产生所需治疗效果的经过计算并预先确定的活性成分剂量和所需药物载体。刺激因子以包含药物可接受的载体或赋形剂的组合物形式给药是可以理解的。这里使用的"制药学上可接受载体"或"赋形剂"包括任何和所有的生理兼容的溶剂、分散介质、包被材料、抗细菌和抗真菌因子、等渗和吸收延迟因子等等。在一个实施方案中，载体适合胃肠外给药。另外，载体适合于静脉内、腹腔内、肌肉内、舌下或口服给药。制药学上可接受的载体包括为了即时配制无菌可注射溶液或离散剂而使用的无菌水溶液或离散剂和无菌粉末。为了保持药物活性成分而使用的这些介质和因子在本领域是众所周知的。除非传统的介质和因子与活性成分不相容，否则其预期将在本发明药物组合物中使用。活性添加剂也可以包含在组合物中。胃肠外给药的药物配方包括脂质体。脂质体和乳状液作为疏水性药物的有用递送载体是众所周知的示例。依赖于治疗试剂的生物学稳定性，保持蛋白质稳定的额外策略也要利用。而且，可以将药物置于靶药递送系统中给药，例如用包裹靶标特异抗体的脂质体。脂质体将结合靶蛋白并且是被表达靶蛋白的细胞选择性的吸收。在制备和保存的过程中，治疗性成分应该是无菌的和稳定的。药物组合物可以配制成适合含高浓度药物的溶液、乳状液、脂质体或其它规则结构的形式。载体可以是溶剂或离散介质，包含例如水、乙醇、多羟基化合物(例如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇和类似物)及其合适的混合物。合适的流动性的维持，例如可以通过诸如卵磷脂的包被材料的使用，在离散剂中维.持所需要的颗粒大小和表面活性剂的使用来实现。在许多情况下，将优选等渗试剂，例如蔗糖、多元醇(甘露糖醇、山梨(糖)醇)或在组合物中的氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包含延迟吸收的试剂(例如单体硬脂酸盐和白明胶)来实现。而且，在释放的过程中刺激因子也要给予，例如存在于包含缓释聚合体的组合物中。结合活性组合物的载体上可以帮助组合物缓释，比如可控的释放配方，包括植入物和微胶囊化递送系统。生物可降解、生物相容性聚合体也可以用到，比如乙烯-醋酸乙烯、聚酸酐、聚乙二醇酸、胶原、聚正酯、聚乳酸、聚乙醇酸共聚物(PLG)。制备这些体系的多种方法在本领域中是有专利的或众所周知的。另外，刺激因子悬液可以制备成合适的油状悬液以方便注射。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油比如芝麻油；或合成的脂肪酸酯比如油酸乙酯或甘油三酸酯或脂质体。用来注射的悬液也可以包含增加悬液粘性的物质，比如羧甲基纤维素钠、山梨醇或右旋糖苷。悬液非必须包含合适的稳定剂或增加组合物溶解性的因子以制备高浓度的溶液。无菌的注射用溶液可以这样配制将所需剂量的活性组合物溶解在带有一种或上述成分组合的合适的溶剂中，然后过滤除菌。通常，离散液是通过合并活性组合物至包含基本离散介质和所需的来自于上述的其它组合物的无菌媒介物中来实现的。在制备无菌注射用溶液的无菌粉末时，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，产生有活性的组合物与任何来自于其预先过滤无菌的溶液的额外所需组合物。根据本发明可选的方面，刺激因子可以用一种或多种可增强其溶解性的额外化合物来配制。如果通过吸入组合物方式给药的话，则可将它们制成气雾剂形式并用压縮包装或喷雾器来喷雾给药；同时要用合适的推进物，比如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它适当的气体。在用压縮气雾剂的情况下，剂量单位可用阀来确定递送的计量的量。在吸入器中使用的胶囊和明胶药囊，可以用包含化合物粉末和适当的粉末基质比如淀粉和乳糖的物质来配制。细胞组合物本发明的细胞组合物，比如包含成人多潜能细胞的那些组合物对于多种类型的组织再生是有用的，这些组织包括骨、软骨、肌腱、韧带、肌肉、皮肤和其它结缔组织，也有神经、心脏、肝脏、肺、肾脏、胰腺、脑和其它器官组织。在一些实施方案中，本发明的组合物可能联合合适的基质一起给药，例如这些基质可以支持细胞和为骨、软骨、肌肉、神经、上皮和/或其它结缔组织的生长提供表面。基质可以是传统生物材料的形式。基质可以是细胞缓慢的释放和/或使其在合适的环境中存在。在一些实施方案中，多种胶原的或非胶原的蛋白质有望表达上调和从细胞分泌。这种现象通过增强基质沉积来加速组织再生。基质蛋白质也能在基因工程细胞中表达并且可以增强移植后的细胞在移植区域的植入和黏附。基质材料选择要根据生物相容性；生物降解能力、力学性质、装饰(cosmetic)表现和界面特性来确定。细胞组合物的特殊应用将定义适当的配方。潜在的组合物基质可以是可生物降解的化学物质，比如硫酸钙、磷酸三钙、羟磷灰石、聚乳酸和聚酸酯。其它潜在的材料是可生物降解的生物性基质，比如骨或皮肤胶原。其他的基质包括纯的蛋白质和细胞外基质组分。其它潜在的基质是不可生物降解的化学物质，比如烧结的羟磷灰石、生物玻璃、铝酸盐或其它陶瓷。基质可以由上述提到材料的组合，比如聚乳酸和羟磷灰石或胶原和磷酸三钙。生物陶瓷可以改变成分，比如在钙一铝酸盐一磷酸盐，并用来改变孔大小、颗粒大小、颗粒形状和生物降解性的改变。本发明的细胞组合物可以用来治疗由于疾病或损伤或组织发育不良而需要修复和置换软骨或骨组织的病人；或者是起到美容的作用，比如增大面部或身体的其它部位。治疗药保证使用的本发明细胞可以产生新的软骨组织或骨组织。例如包含未分化或成软骨分化前体细胞的组合物可以用来治疗软骨方面的疾病，例如风湿性关节炎或骨关节炎或软骨损伤或软骨的外科损伤。如另一个示例，包含骨前体细胞的组合物可以用来治疗骨性疾病，包括代谢性的和非代谢性的疾病。骨性疾病的示例包括半月板破裂、脊柱融合、椎间盘突出、脊柱重建、骨折、骨/脊柱变形、骨肉瘤、骨髓瘤、骨发育异常、脊柱侧突、骨质疏松症、牙齿周围疾病、牙齿骨缺损、骨软化、软骨病、纤维骨炎、肾性骨营养失调和Paget氏骨病。本发明的细胞组合物也可单独给药或与其它细胞混合后给药。与本发明的组合物联合的细胞包括但不限于其它多潜能或多能性细胞或软骨细胞、成软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、骨衬细胞、干细胞或骨髓细胞。不同类型的细胞可以在给药前立即或在给药之前和本发明的组合物混合，或者在给药前短期内将它们共培养。本发明的细胞组合物可以和其它有益的药物或生物分子(生长因子，营养因子)一起给药。当成人多潜能细胞和其它因子一起给药时，它们可以单一药物组合物的形式一起给药，或者以分离的药物组合物的形式与其它因子一起给药或者与其他因子顺序给药(或者在其它因子给药之前或之后)。共同给药的生物因子包括抗凋亡因子(比如EP0、EP0单克隆抗体(mimetibody)，TP0，IGF-1和IGF-II，HGF，半胱天冬酶抑制剂);抗炎症因子(比如:p38MAPK抑制剂，TGF-beta抑制剂，statins，IL-6和IL-1抑制剂，PEMIROLAST，TRANILAST，REMICADE，SIR0LI固S和NSAIDs(非固醇类抗炎药物，例如TEPOXALIN，T0LMETIN，SUPR0FEN));免疫抑制/免疫调节因子(比如牵丐调磷蛋白磷酸酶抑制剂例如cyclosporine，tacrolimus;mT0R抑制剂(例如:SIR0L1MUS，EVEROLIMUS);抗增殖(比如咪唑硫嘌呤，麦考酚酸吗乙酯(mycophenolatemofetil));皮质类激素(例如氢化波尼松，氢化可的松)；抗体，比如单克隆抗体抗-IL-2Ralpha受体抗体(例如巴利昔单抗(basiliximab)，达(克)珠单抗(daclizumab))，多克隆抗体，抗T细胞抗体(例如；抗胸腺细胞球蛋白(ATG);抗淋巴细胞球蛋白(ALG);抗T单克隆抗体0KT3));抗凝血酶原因子(比如肝素、肝素衍生物、尿激酶、PPack(右旋苯基丙氨酸脯氨酸精氨酸chloromehylketone)，抗凝血酶组合物，血小板受体拮抗剂，抗凝血酶抗体，抗血小板受体抗体，阿斯匹林，双嘧啶氨醇、鱼精蛋白、水蛭素、前列腺素抑制剂和血小板抑制剂)；和抗氧化剂(比如普罗布考，维生素A，抗坏血酸维生素C，，维生素E，辅酶-Q，谷光苷肽，L-半胱氨酸，N-乙酰半胱氨酸)和局部麻醉药。在另一个示例中，这些细胞可能和在美国专利No.5，827，735(作为参考文献并入本文)中描述的疤痕抑制剂因子共给药。在一个实施方案中，本发明的细胞组合物以未分化的细胞形式给药，例如在生长培养基中培养的细胞。另外，细胞组合物也可在刺激分化成所需类型(例如成骨表型)的培养条件下给药。本发明的细胞组合物可以通过外科手术移植、注射、递送(例如通过导管和注射的方式)，或者直接.或间接给药至需要修复和增大的部位。细胞可以借助基质给药(例如三维支架)。细胞可以通过传统的药学上可接受的载体给药。本发明细胞或其组合物或成分(例如ECM，细胞裂解液，条件培养基)的给药途径包括肌肉注射、眼科用药、胃肠外给药(包括静脉注射)、动脉内、皮下、口腔和经鼻给药。胃肠外给药的特定方式包括但不限于肌注、皮下、腹腔、大脑内、心室内、侧脑室内、鞘内、intracisternal、脊柱内和/或脊柱外周的给药途径。当细胞用半干或固体装置给药时，利用外科手术可以精确的将移植物植入到体内，这是很合适的方法。然而，液体或液体药物组合物可以给药于大体部位(例如通过分散分布到所需的部位)，然后它们可以迁移到特定的位置，比如对化学信号所产生的应答。其它实施方案包括通过给药包含细胞组分(例如细胞裂解液或其成分)的药物组合物或物质(例如细胞外基质，其它通过遗传改造得到的营养和生物因子)来治疗的方法根据已良好建立的医学实践，发展了这里描述的给药细胞组合物的剂量形式与给药方式，需要参考患者个体的具体情况，例如治疗疾病的特性和范围，年龄，性别，体重和常规医疗条件和其它已知的医学因素。因此，给患者的药物组合物的有效量可按照本领域中熟知的这些因素来确定。在本发明的一些实施方案中，用本发明的细胞组合物治疗开始之前，不是必须对患者进行免疫抑制的。因此，同种基因的或异种基因的成人多潜能细胞移植在一些情况下是可以耐受的。然而，在另外的情况下，在开始细胞治疗之前，要求对患者进行适当的用药以抑制免疫功能。这可以通过使用系统或局部免疫抑制剂来实现，或者通过将细胞装入胶囊装置中来实现。成人多潜能细胞装入可以使细胞和治疗因素所要求的营养成分和氧气渗透过的胶囊中，这种胶囊对免疫性体液因子和免疫细胞不渗透。优选的胶囊材料是低过敏性的，可以很容易的稳定的存在于靶组织中，并且对移植组织提供额外的保护。降低和消除对移植的细胞的免疫应答的这些和其它方法在本领域中是众所周知的。作为选择，成人多潜能细胞可被遗传改造以降低其免疫原性。在活体患者中移植细胞的存活力可以通过应用多种扫描技术来确定，比如计算机化X射线轴向分层造影(CAT或CT)扫描、核磁共振成像(MRI)或正电子X线断层摄影术(PET)扫描。移植物活力也可在摘除耙组织处死后(mortern)进行确定，可用肉眼或显微镜观察它。另外，细胞可以被针对特定链系细胞特异性的物质所标记。移植细胞的鉴定也可通过提前结合痕量示踪染料来实现，这些染料有罗丹明或荧光素标记的微球、快蓝、二苯甲酰胺、铁微粒、或遗传改造引入的报告基因产物，比如P—半乳糖苷酶或P—葡(都糖苷酸酶。移植到受体内的细胞的功能完整性可以通过检测损伤或疾病所致的功能缺陷的恢复来评价，例如关节或骨功能的恢复或功能的增加。本发明的细胞组合物可包括一种或多种生物活性因子，比如但不限于生长因子，分化诱导因子，诸如'半胱天冬酶抑制剂的细胞存活因子，或诸如p38激酶抑制剂的抗炎因子。另外，移植的细胞可被遗传工程改造以表达这些生长因子，抗氧化剂，抗凋亡因子或抗炎症因子。本发明的药物组合物可包含同源或异源细胞、细胞外基质或其细胞裂解液，或存在于制药学上可接受的载体中的其条件培养基。本发明细胞的制药学上可接受的载体包括合适的有机或无机载体物质，这些载体与本发明的细胞或组合物或其组分之间没有有害的反应。一定程度上，它们是生物相容的、合适的制药学上可接受的载体，包括水、盐溶液(比如Ringer溶液)、酒精、油、明胶和诸如乳糖、直链淀粉或淀粉、脂肪酸酯、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯垸的碳水化合物。这种制备过程是无菌的，如果必要，可以与诸如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲液和着色剂的辅助因子混合。在本发明中适合使用的药物载体在本领域中是众所周知的，并且在PharmaceuticalSciences(17thEd.，MackPub.Co.,Easton，Pa.)和WO96/05309中描述过。一种或多种其它组分也可以加入到移植的细胞中，包括筛选的细胞外基质组分，比如在本领域中熟知的一种或多种类型的胶原，和/或生长因子，富含血小板的血浆和药物。另外，本发明的细胞可以经过遗传改造以表达和生产生长因子。在这里提供了对本发明细胞的遗传工程改造的详细步骤。在非限制的实施方案中，包含本发明细胞的配方可以直接给药至一定部位以产生所需的新组织，比如骨组织。例如但不限于，细胞可以重悬在水凝胶溶液中以备注射y本发明中使用的适当水凝胶示例包括自组装肽，比如RAD16。另夕卜，包含细胞的水凝胶溶液可以变硬，例如在移植前，包含细胞的水凝胶溶液分布在模具中，形成细胞分散在其中的基质。或者，一旦基质变硬，细胞配方就可以培养以使这些细胞在移植前进行有丝分裂式的扩增。水凝胶是一种有机聚合体(天然的或合成的)，其通过共价，离子或氢键交联在一起形成可诱陷水分子形成凝胶的三维开放式栅格结构。形成水凝胶材料的示例包括多聚糖，比如海藻酸和它相关的盐、肽、聚磷腈(polyphosphazines)和聚乙烯，它们是离子交联的；或封闭聚合体，比如聚乙烯氧化聚乙二醇封闭共聚合体，它们可以分别在温度和PH的调控下交联在一起。在一些实施方案中，细胞的支持物是生物可降解材料。在本发明的一些实施方案中，配方包括原位聚合凝胶(polymerizablegel)，正如美国专利申请公开2002/0022676中描述的那样；Anseth等，2002和Wang等，2003。在一些实施方案中，聚合体至少部分可溶解在水溶液中，比如水、缓冲盐溶液，或水性乙醇溶液中，其具有带电的侧链基团或其单价盐离子盐。具有能和阳离子反应的酸性侧链基团的聚合体的示例是聚磷腈、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、丙烯酸和甲基丙烯酸共聚合体、聚乙烯乙酸和诸如磺酸聚苯乙烯的磺酸聚合体。通过丙烯酸或甲基丙烯酸与乙烯醚单体或聚合体反应形成的具有酸性侧链基团的共聚合体也能使用。酸性基团的示例是羧酸基团、磺酸基团、卤化(halogeted)(优选氟化的)乙醇基团、酚0H基团和酸性0H基团。能与阴离子反应的具有碱性侧链基团的聚合体的示例是聚乙烯胺、聚乙烯吡啶、聚乙烯咪唑和亚氨基代多磷酸盐。聚合体的铵盐或季盐也能从骨架氮或侧链(pendant)亚氨基团中形成。碱性侧链基团的示例是氨基和亚氨基。藻酸盐能够与二价阳离子形成离子性交联，室温下在水中，形成水凝胶基质。由于这些温和的条件，藻酸盐已经成为杂交瘤细胞微囊化包装中最常用的聚合体，这正如Lim的美国专利4，352，883中描述的那样。在Lim方維中，包含被微囊化的生物材料的水溶液悬浮于水溶性聚合体的溶液中，悬液依赖多价阳离子形成可分散到微胶囊中的小滴，然后微胶囊的表面与多聚氨基酸交联并在胶囊材料周围形成半渗透膜。聚磷腈是由氮和通过单或双键而分离的磷构成骨架的聚合体。每个磷原子共价结合到两个侧链上。'适合交联的聚磷腈具有多个能与二价或三价阳离子形成盐桥的酸性侧链基团。优选的酸性侧链基团是羧酸基团和磺酸基团。水解稳定的聚磷腈由具有与诸如Ca2+或八13+的二价或三价阳离子交联的羧酸侧链基团的单体形成。聚合体可以通过合并带有咪唑，氨基酸酯或甘油侧链基团的单体来合成，可以被水解降解。例如聚阴离子聚[双(羧基异苯氧基)]磷腈poly[bis(carboxylatophenoxy)]phosphazene(PCPP)能够被合成，其可以与分散在室温或低于室温的水溶液中的多价阳离子交联以形成水凝胶基质。生物可降解的聚磷腈具有至少两种不同类型侧链，酸性侧链基团能够与多价阳离子形成盐桥，和在体内条件下水解的侧链基团(咪唑基团，氨基酸酯，甘油和葡萄糖基)。侧链的水解导致聚合体的破坏。水解侧链的示例是未取代和取代的咪唑和氨基酸酯，其中的基团通过氨基连接结合到磷原子上(两个R基团这样结合的聚磷腈聚合体为已42说，在聚磷腈骨架上的一些R基团是咪唑环，通过环氮原子结合到骨架上的磷原子。其它R基团可能是并不参与水解的有机残基，比如甲基苯氧基基团或显示在Allcock等(1977)的科学文章中的其他基团。水凝胶材料合成的方法和制备这些水凝胶的方法在本领域是众所周知的。其它组分也包含在配方中，包括但不限于下列任何组分(l)提供适当PH和渗透压的缓冲液；(2)润滑剂；(3)保留细胞处于或紧邻给药位置的黏液材料，包括藻酸盐、琼脂和植物胶；和(4)在给药位置产生所需效果的其它细胞类型，这些效果比如增强或改善组织的形成或其理化性质、或作为支持物使细胞活力增强，或抑制炎症和排异。细胞可用适当的创口覆盖物覆盖以阻止细胞从给予位置脱离。这些创口覆盖物在本领域是众所周知的。纤维蛋白胶纤维蛋白胶是一类外科密封材料，可以用于多种临床处理中。可用于本发明中的多种密封剂是本领域的技术人员所熟知的。然而，本发明的优选的实施方案涉及本发明细胞和纤维蛋白胶的应用。这里的术语"纤维蛋白胶"指得是在钙离子存在时，由纤维蛋白聚合物交联而形成的不溶于水的基质。纤维蛋白胶来源于纤维蛋白原、或其衍生物或代谢物、纤维蛋白、(可溶的单体或聚合体)和/或其源自生物组织或体液的复合物，这些形成了纤维蛋白基质。纤维蛋白胶也可以形成于由重组DNA技术制备的纤维蛋白原或其衍生物或代谢物、纤维蛋白。纤维蛋白胶也可能通过纤维蛋白原和纤维蛋白胶形成的催化剂相互作用而形成(比如凝血酶和/或因子xni)。就像本领域的技术人员所了解的那样，纤维蛋白原在催化剂(比如凝血酶)的存在下被切割并且转换为纤维蛋白单体。纤维蛋白单体然后形成聚合体，这些聚合体可能交联以形成纤维蛋白胶基质。催化剂，比如因子xni的存在，可以增加纤维蛋白聚合体的交联。纤维蛋白胶形成的催化剂可能来源于血浆、冷凝沉淀或其它包含纤维蛋白原或凝血酶的胞浆成分。催化剂也可能通过重组DNA技术生产得到。血凝块形成率依赖于混有纤维蛋白原的凝血酶浓度。对于酶依赖反应来说，越高的温度(约37°C)有越快的血凝块形成率。血凝块的抗张强度依赖于所用的纤维蛋白原的浓度。纤维蛋白胶的使用和制备其的方法和使用其的方法在Hirsh等的U.S.Pat.No.5,643，192中描述过。Hirsh揭示了从单一供体来源的纤维蛋白远和凝血酶成分的提取方法，和这些成分联合用作纤维蛋白胶。Marx，U.S.Pat.No.5，651，982描述了另一个纤维蛋白胶的制备和使用的方法。Marx用一种在哺乳动物中作为局部密封剂的脂质体作为纤维蛋白胶。用在伤口愈合中的局部纤维蛋白原复合物(TFC)的制备和使用在本领域时众所周知的。美国红十字会的PCT申请No.PCT/US95/15876,PCT公开的No.W096/17633讨论TFC的制备，包含了纤维蛋白原、凝血酶和氯化钙，例如PCT公开的No.W096/17633的16—18页。几种出版物描述了用作治疗因子传递的纤维蛋白胶。例如美国专利4，983，393揭示了包含琼脂糖、琼脂、粘多糖盐溶液、胶原、纤维蛋白和酶的阴道内使用的插入物的组合物。进一步，美国专利3，089，815揭示了由纤维蛋白原和凝血酶构成的可注射药物的装置，美国专利6,468,527揭示了可以方便多种生物和非生物因子进入体内特定位置的纤维蛋白胶。骨组织补片的形成在预先设计好形状的孔中进行本发明细胞的培养或共培养能够制备与预先设计相同厚度和体积的组织补片。所得组织补片的体积取决于孔的大小和孔中成人多潜能细胞的数量。理想体积的组织获得的条件可能要通过改变前述参数进行摸索来确定。孔的细胞接触表面可以包被一层分子以阻止成人多潜能细胞黏附到表面的细胞。优选的包被因子包括基于硅的试剂，即二氯二甲硅垸或基于聚四氟乙烯的试剂，即TEFL0N。用基于硅的试剂的特别是二氯二甲硅烷的涂覆材料的方法是本领域技术人员所熟知的。例如Sambrook等(1989)，"MolecularCloningALaboratoryManual",冷泉港实验室出版，在这里作为参考文献并入本文。其它阻止细胞黏附到孔表面的生物适合因子在本发明的实践中也是有用的。另外，孔可以用本质上细胞不可黏附的柔软的或可模压的生物适合材料制备。优选的阻止细胞黏附的材料包括，但是不限于琼脂糖、玻璃、未处理的细胞培养用塑料和聚四氟乙烯(即TEFLON)。未处理的细胞培养用塑料，即指那些不经过处理或由带静电的材料制成的塑料，可以购买得到，例如从FalconLabware，Becton-Dickinson,LincolnPark,NJ.购买。当然，并不局限于上述的材料。任何其它本质上防止成人多潜能细胞黏附的柔软的或可模压的生物适合材料可以用于本发明中。本发明中悬浮培养的细胞可以接种并培养在预先成形的孔中。细胞可以被诱导分化并在孔中具有软骨细胞的(chondrogenic)或成骨细胞(osteogenic)表型，或在接种到孔之前也可诱导分化。细胞用培养基稀释到大约lx105至lxK)9细胞/ml的细胞密度。细胞可能形成细胞黏附栓子(Plug)。细胞黏附栓子可以从孔中移出，并且外科移植到组织缺陷的位置。预期任何未分化的细胞，比如本发明的成人多潜能细胞可以在原位发生分化并形成体内组织。骨缺损可以用计算机辅助的X线断层扫描(CAT扫描)，X线检查，核磁共振成像(MRI)，关节液或血清标记分析或任何本领域中己知的方法来推定和鉴定。哺乳动物的缺损也可以在关节(内窥)镜检查或关节开放性手术中直观的观察到。用这里描述的方法和组合物进行关节(内窥)镜检查或关节开放性手术时可能对缺陷的治疗有效。因此，一旦缺损被鉴定，则通过如下的步骤进行治疗(1)应用这里描述的方法将制备好的组织补片外科移植到预先确定的位置，和(2)使得组织补片与预期的位置整合。组织补片最好在大小和外形上与缺损相同，以便其边缘和缺损的边缘直接接触。另外，组织补片要通过外科手术固定。用生物可降解缝线将补片固定在缺损处和/或用生物胶(bioadhesive)粘合补片和缺损的交界处可能对过程有效。在一些例子中，在植入组织补片之前要切除损伤的组织。使用支架的细胞移植本发明的细胞组合物或其共培养.可能接种到三维支架上，并移植到体内，然后在支架上增殖并形成替代组织，比如在体内可以联合患者的细胞一起生成骨组织。例如，但不局限于，支架要这样设计(1)支持种子细胞而不会随后降解；(2)从种子细胞到在宿主组织中重建移植组织的时间内支持细胞；(3)允许组织细胞黏附、增殖和发展进入组织结构，而具有足够的机械完整性，可以在体外支持自身，在此时，支架被降解。Hutmacher，2001提供了一篇关于支架设计的综述。本发明的支架可以联合任何一种或多种生长因子、细胞使用，例如干细胞、骨髓细胞、软骨细胞、成软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、骨衬细胞、或它们的前体、刺激组织形成或增强或改进本发明方法的上述的药物或其它成分。接种到支架的本发明的细胞可能通过遗传工程操作而表达生长因子或药物。本发明的细胞可以在体外形成新的组织，这些组织然后可以用于移植或插入到患者需要修复、替换或增加的部位。在非局限的实施方案中，本发明的细胞可在体外制造三维组织结构，然后再移入体内。三维组织结构的制备示例见美国专利4，963，489，这里作为参考文献并入本文。例如本发明的细胞在体外可在三维框架或支架上接种、增殖或生长以形成能被移植到体内的活的组织。本发明的细胞可以在培养皿中自由的生长为亚融合或融合状态，从培养皿中移出并接种到三维框架上。将高浓度细胞(例如大约106至5x107细胞/ml)接种在三维框架上将在较短的时间内建立三维支持。在本发明中可以使用的支架示例包括非织毡(nonwovenmats)、多孔泡沫或自组装肽。非织毡可以由合成的可吸收的甘醇酸(glycolicacid)和乳酸(PGA/PLA)共聚物构成的纤维所形成，可以买到商标名称为VICRYL的非织毡(Ethicon，Inc.，Somerville,N.J.)。由聚e-己内酯/聚甘醇酸(PCL/PGA)共聚物构成的泡沬通过例如冷冻干燥或低压冻干的方法制备，这些方法在美国专利6，355，699中提到。泡沫也是很有用的支架。诸如自组装肽的水凝胶(例如RAD16)也可以使用。这些材料通常用作用于组织生长的支持物。三维框架可以由陶瓷材料制成，包括但不限于单、双、三、a一三、e—三、四-磷酸钙、羟基磷灰石、氟磷灰石、硫酸钙、氟化钙、氧化钙、碳酸钙、磷酸镁钙、生物活性玻璃比如BI0GLASS(UniversityofFlorida,Gainesville,Fla,)及其组合物。目前市场上有一些适合的多孔生物相容陶瓷材料，比如SURGIBON(UnilabSurgibone,Inc.，加拿大)，ENDOBON(MerckBiomaterialFrance,法国)，CEROS(Mathys，A-G.，Bettlach，瑞士)，禾卩INTERP0RE(Interpore.Irvine,Calif.，美国)和矿物化胶原骨嫁接材料(比如:HEAL0S(0rquest，Inc.,MountainView,Calif，)和VITOSS，RHAKOSS和CORTOSS(Orthovita，Malvern,Pa.))。框架可能是由天然和/和合成材料构成的混合物、掺合物或组合物。在一些实施方案中，支架是笼形的。在优选的实施方案中，支架用胶原包被。根据优选的实施方案，框架是触(felt)，其是由生物可吸收材料制造的多丝纱构成的，例如PGA，-PLA，PCL共聚物或掺合物，或透明质酸。用标准的纺织品技术制造这种纱，这些技术包括巻边、切割、梳理和针织。在另一个优选的实施方案中，本发明的细胞接种到泡沫支架上，该支架可以是组合结构的。另外，三维框架被制成有用的形状，比如需要修复、置换和增加的耳朵的、骨、关节和其它体内特定的结构的外形。在另一个优选的实施方案中，细胞被接种到包含由修补装置的框架之上并移植给患者，这就如在美国专利No.6，200，606中描述的一样，这个专利在这里作为参考文献并入本文。就像那里描述的那样，多种临床上有用的修补装置已经在骨和软骨嫁接过程中使用(见例如-BoneGraftsandBoneSubstitutions,Ed.M.B.Habal&A.H.Reddi，W.B.SaundersCo.，1992)。例如在临床中广泛使用的有效的膝和髋置换装置。许多这些装置是用多种具有低免疫原活性的无机材料制成，其可以安全的在体内发挥功能。合成材料的示例包括钛合金，磷酸钙，羟磷灰石陶瓷，和多种不锈钢和钴铬(chrome)合金。这些材料提供结构上的支持并且能形成支架，其中宿主脉管和细胞迁移也可以发生。在本发明的细胞接种之前，处理框架，目的是增强细胞的黏附。例如本发明的细胞接种之前，尼龙基质用0.1M乙酸处理并接种到多聚赖氨酸，PBS和/或用胶原中包被尼龙。聚苯乙烯能同样用硫磺酸处理。另外，三维框架的外表面可以被修饰以改善黏附性或细胞的生长和组织的分化，比如用血浆包被框架或加入一种或多种蛋白质(例如胶原、弹性纤维、网状纤维)，糖蛋白，葡萄糖胺聚糖(glycosaminoglycans)(例如硫酸肝素，4硫酸软骨素，6硫酸软骨素，硫酸皮肤素，硫酸角蛋白)，细胞基质和/或其它材料，比如但不限于明胶，藻酸盐，琼脂，琼脂糖和植物树脂，或其它。在一些实施方案中，支架是用非凝血酶的材料构成或处理的。这些处理和材料也促进和支持了内皮生长，迁移，和细胞外基质沉积。这些材料和处理的示例包括但不限于天然材料比如基膜蛋白(层粘连蛋白和IV型胶原)，合成材料比如ePTFE，和片断化的聚亚安酯硅树脂(polyurethaneurea)(比如PURSPAN(ThePolymerTechnologyGroup,Inc.，Berkeley,Calif.))。这些材料可能进一步被处理以使支架成为非凝血酶原化的。这种处理包括抗凝血因子比如肝素；也有改变材料表面电荷的处理，比如血浆包被。在一些实施方案中，支架的表面是粗糙的。例如在本发明的一些方面，支架是凹凸形式的。凹槽优选少于500微米，更优选少于100微米，并且最优选在10nm到10微米之间。这样的"微凹槽"使细胞排列，禾n/或利用表面凹槽作为向导迁移。在一些实施方案中，在体内存在的细胞微环境的重建是非常重要的，这样的话，本发明的细胞在移植到体内之前要生长或在体外使用时的程度可以改变。另外，在细胞接种以触发分化和通过细胞或其后代形成组织之前，之中或随后，生长远子、软骨分化诱导因子、成骨诱导因子和血管原(性)的因子可以被添加到培养基中。三维框架可被修饰以便增强细胞的生长和在其上的组织的生产，或者使移植排斥的风险降低。因此，一种和多种生物活性化合物，包括但不限于抗炎因子、免疫抑制剂和生长因子可添加到框架中。实施例现在参考下述并不限于下述的例子来详细描述本发明。实施例1:mAbSTRO-3的产生材料和方法人MPC培养基质培养的建立在以前已经描述过(Gronthos等，2003)。澳大利亚皇家Adelaide医院人类伦理委员会允许正常骨髓(BM)细胞应用于这些研究。在HHF(HanksBufferedSaltSolution(HBSS)中洗涤三次之后，悬浮在20mM'HEPES'禾tl5%FCS中。1-5x107骨髓单核细胞(BMMNCs)重悬在10mla改良的Eagles培养基(a-MEM:FlowLaboratories,Irvine,Scotland)中，培养基中添加了0.01mg/ml叶酸、0.4mg/ml肌醇(SigmaChemicalCo.StLouis,MO)、50mM/L2-巯基乙醇、ImM/L氢化可的松琥珀酸钠(Sigma)、12.5%FCS、12.5。/。马血清(CSL,Melbourne,Australia)并且在25cm2i咅养并瓦(BectonDickinsonLabware,FranklinLakes,NJ)中培养。当形成基质层的融合后，用0.05%(w/v)胰酶-EDTA(PBS配制)(Gibco)消化细胞并以1-2x104细胞/cm2的密度重新接种到盛有相同的培养基的2x75cm2组织培养瓶中(BectonDickinsonLabware,FranklinLakes,NJ)。结果和讨论与人MPC反应的小鼠单克隆抗体是通过免疫的小鼠脾细胞和培养的人BM基质细胞融合后产生出来的。初步扫描是鉴定与正常人骨髓细胞(NHBC)和MPC反应的单克隆抗体，但是与大多数BMMNC有部分的反应。因为其可以和不同细胞特异的反应，故选择一个STRO-3单克隆抗体用于进一步分析。通过有限稀释法在96孔板中分离出STRO-3杂交瘤第三代克隆，并且随后就像上述一样进行扫描。不基质细胞类型的STRO-3的分布模式总结在表1中。单克隆抗体STRO-3显示出可以和NHBC与MPC反应，但是与BMMNC的少部分反应。通过异构体检测试剂盒(Roche)分析发现从第三代杂交瘤上清中得到的STRO-3的免疫球蛋白异构体是IgGi。表1:应用在方法中描述的原位免疫荧光法分析从第三代杂交瘤上清中得到的STRO-3对不同类型细胞的免疫反应。<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>(+)低荧光标记所有细胞，(++)高荧光标记所有细胞，(NS)无荧光标记细胞(+/-)，(++/-)荧光标记细胞亚群。实施例2:STRO-3抗原的分子特性材料和方法STRO-3抗原编码cDNA表达克隆在先前描述的通过单克隆抗体STRO-3鉴定的细胞表面抗原的cDNA编码序列从克隆逆转录病毒载体pRUFneo中的人骨髓基质细胞cDNA文库中分离得到(Zannettino等，1996)。简言之，从HBMSC培养物中提取mRNA并逆转录合成的cDNA被克隆到逆转录病毒载体pRUFneo中。文库中的载体DNA用来转染病毒包装细胞系(PA317)。从这些细胞得到的病毒上清用于感染包装细胞系V|/2，接下来用其感染小鼠源的因子依赖细胞系BAF-3。感染的细胞有G418抗性，用STRO-3抗体标记并且将特异结合抗体的细胞通过免疫磁珠分选的方法分离出来(Dynabead,Dynal，Oslo,Sweden)。分选到的细胞扩增之后，再用免疫磁珠重新分选两次。特异结合STRO-3抗体(约60%)的BAF-3细胞通过荧光激活细胞分选(FACS)纯化，并且将分离得到的克隆培养在如前所述的半固体培养基中(Zannettino等，1996)。为了恢复相应于STRO-3抗原的前病毒cDNA，以三株表达STRO-3的BAF-3细胞克隆的基因组DNA为模板，以逆转录病毒特异引物为引物，进行如前所述的聚合酶链反应(PCR)(Zannettino等，1996)。PCR恢复cDNA克隆的部分测序和计算机分析正如先前描述的那样(Zannettino等，1996)，PCR得到的cDNA用胶纯化并根据厂商的说明克隆到pGEM-T载体中(Promega，Madison，WI)。双链DNA用标准的碱性裂解"微小制备(mini-prep)方法制备(QiagenminiprepKit)。每个测序反应用l-2吗DNA。根据厂商的说明采用PRISMReadyReactionCycle测序试剂盒进行(AppliedBiosystem,FosterCity,CA)测序反应。用AppliedBiosystems373自动测序分析仪进行两个cDNA链的测序反应的分析，每个克隆常规测序5'和3'端的500-600bp序列。然后在NationalCentreforBiotechnologicalInfoimation(NCBI)门户软件中用Genbank和EuropeanMolecularBiologylaboratory(EMBL)数据库分析测序数据。STRO-3抗原cDNA克隆再克隆到pRUFneo中并对表面抗原表达的确认。以基因组DNA为模板进行前病毒cDNA插入物的PCR回复，分别在5'和3'侧链区域引入唯一的Bamffl和Xhol限制性酶切位点，将cDNA再克隆入逆转录病毒载体pRUFneo的多克隆位点中。转化E.coliDH10B细胞并用Qiagen-tip100columns(Qiagen,Victoria,Australia,根据厂商说明书使用)提取的质粒DNA。磷酸钙转染细胞产生G418抗性的"生产"病毒的v2稳定细胞株，并且如前所述通过共培养以感染BAF-3细胞(Zannettino等，1996)，然后通过间接免疫荧光和流式细胞仪分析G418抗性的FDC-P1细胞的抗原表达。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析从STRO-3抗原表达的BAF-3细胞中按照厂商的操作说明书应用RNAzo旧提取方法制备细胞总RNA(BiotecxLab.Inc.,Houston,TX)。然后用从每个亚群中分离得到的RNA作为模板，应用第一链cDNA合成试剂盒(PharmaciaBiotech,Uppsala,Sweden)进行cDNA合成。应用PCR扩增(应用先前描述的标准方法(Gronthos等，1999))评估ALP转录本的骨髓和肝脏/肾脏异构体的表达。这里应用的碱性磷酸酶引物在以前研究中描述过(Sato等，1994)。扩增之后，每个反应组合物用1.5%琼脂糖电泳分析，并用溴化乙啶染色观察。通过GAPDH的表达来评价RNA的完整性(Gronthos等，1999)。结果和讨论在我们实验室中率先应用了逆转录表达文库策略，随后从文库中得到了通过STRO-3单克隆抗体鉴定的蛋白质的编码基因序列(Zannettino等,1996)。简言之，小鼠细胞系BAF-3被来源于培养的人MPC的cDNAs文库中的逆转录病毒颗粒感染。用绵羊抗小鼠IgG磁珠进行免疫磁珠分选与STRO-3反应的BAF-3细胞克隆。如在图1中显示的那样，通过几轮磁珠分选之后获得的细胞的流式分析显示STRO-3抗原的表达在适当的水平。正如方法中描述的那样，通过免疫磁珠分选到的表达STRO-3的BAF-3细胞克隆随后以低密度接种到半固体甲基纤维素中。然后分离随机分选到的BAF-3克隆胞并在添加小鼠IL-3和G418的液体培养基中扩增，并将经证实与STRO-3有强反应的细胞在培养基中扩增，并且用这里的方法制备基因组DNA。随后通过如前述的通过长范围PCR从前病毒回复(rescued)的cDNA插入序列(Zannettino等，1996)。STRO-3的典型细胞克隆的PCR扩增在图2中显示。在琼脂糖电泳和溴化乙啶染色之后，用QIAquick胶回收试剂盒(Q1AGENInc.Chatsworth,CA,USA)纯化从三个不同的细胞克隆中得到的相应PCR产物，并克隆到pGEM-T载体中(推荐)。用PRISMReadyReactionDyeDeoxyTMTerminatorCycle观ll序试齐!j盒(AppliedBiosystemsInc.,FosterCity,California,USA)对PCR产物的核苷酸序列进行测序(按照厂商操作说明书进行)。用AppliedBiosystems373自动测序仪进行序列测定，每个克隆测定核酸序列几百个碱基对。应用标准的FASTA比对分析方法将得到的核苷酸部分序列与提交到Genbank/EMBL数据库的序列(entries)进行比对。两种抗原的部分DNA序列显示在图3中。与EMBL/Genbank数据库的比对鉴定了碱性磷酸酶的骨/肝脏/肾脏形式的STRO-3抗原，命名为TNAP。随后，对STRO-3单克隆抗体的特异性进行了分别确认，应用免疫荧光和流式细胞仪分析表达TNAP的BAF-3细胞，一抗使用碱性磷酸酶特异性抗体B4-78,50(DevelopmentalStudiesHybridomaBank,Universityoflowa)，这些抗体可以识别ALP的骨、肝脏和肾脏异构体中的保守抗原表位(图4)。另外，先前发现的特异识别骨AP酶的单克隆抗体B4-50(DevelopmentalStudiesHybridomaBank,UniversityofIowa)也可以与转染的TNAP发生免疫反应。相反，识别仅存在于人胎盘AP抗原表位的单克隆抗体8B6(DAKO)不能与转染的TNAP反应。另外，用TNAP-BAF-3cDNA插入物再转染的BAF-3细胞可以表达有活性的碱性磷酸酶，因为当碱性磷酸酶底物存在时的阳性反应证明了这一点(图5)。用针对碱性磷酸酶的骨和肝脏形式(Sato等，1994)的特异引物进行PCR分析鉴定了骨特异的转录本(图6)。实施例3:在BM环锯(Trephine)切片中，以STRO-3单克隆抗体为一抗进行TNAP的免疫组化检测材料和方法5微米的石蜡包埋正常出生后骨切片附着在3-氨基丙基三乙氧基硅烷包被玻片上，用3%H202/甲醇孵育时失活内源性过氧化物酶。然后在1mM.EDTA,pH8.0缓冲液中进行微波抗原修复。玻片降温到40。C并用3%正常马血清室温封闭1小时以阻断非特异性结合。然后，将玻片与同种型匹配非结合的对照单克隆抗体(1B5，IgGl)或STRO-3单克隆抗体孵育过夜。用三步免疫过氧化物酶法使结合的抗体显影Gronthos等，2000;Gronthos等，2003)，该方法步骤如下(a)将玻片与亲和纯化的HRP标记山羊抗小鼠抗体孵育(Dako,Botany,NSW，澳大利亚)，(b)接着，玻片与亲和纯化的HRP标记的猪抗山羊免疫球蛋白孵育(Tago,Burlingame，CA-美国)，(c)最后，将玻片与底物过氧化氢和染料3-氨基-9-乙基咔唑(AEC，Sigma,StLouis，MO)孵育。玻片用苏木素复染并用GurrAquamont封片(BDH,Poole，英国)。结果和讨论在55天龄人肢体来源的骨髓切片中研究STRO-3单克隆抗体的免疫反应。在骨膜或软骨中没有着色(,7)。然而，在骨髓间质、外周血管区域和在生长盘区域界面的间充质细胞中有TNAP的明显表达。实施例4:用STRO-3单克隆抗体分离人骨髓细胞骨髓(BM)从健康的正常成人志愿者(20-35岁)中收集得到，得到了皇家Adelaide医院的伦理委员会批准。简言之，从髂脊后方穿刺吸取40ml骨髓到含有锂肝素抗凝血剂的管中。应用前述的(Zannettino等，1998)LymphoprepTM(NycomedPharnm,Oslo,Norway)进行密度梯度离心分离得到BMMNC。400xg离心30分钟，4°C，用移液管移出层并用含有5。/。胎牛血清(FCS，CSLLimited,Victoria,澳大利亚)的Hank's平衡盐溶液(HBSS;LifeTechnologies,Gaithersburg，MD)配成的HHF洗涤三次。随后用如前所述的(Gronthos等，2003;Gronthos等，1995)磁珠分选方法分离得到TNAP+细胞。简言之，大约l-3xl08BMMNC在含有10%(v/v)正常兔血清的HHF封闭缓冲液中冰浴孵育20分钟。细胞与200^1含有10pg/mlSTRO-3单克隆抗体的封闭液冰上孵育1小时。用HHF洗涤细胞两次(400xg离心)。然后按照l:50用HHF缓冲液稀释山羊抗小鼠Y-生物素(SouthernBiotechnologyAssociates,Birmingham,英国)，并加入到细胞中在冰上孵育1小时。用MACS缓冲液(添加了1%BSA，5mMEDTA和0.01°/。叠氮钠的无Ca2+-和Mn2+的PBS缓冲液，)洗涤细胞两次，最终用0.9mlMACS缓冲液重悬细胞。100|ilstreptavidin微珠(MiltenyiBiotec;BergischGladbach.德国)力口入到细胞悬液中并在冰上孵育15分钟。洗涤两次细胞悬液并重悬在0.5mlMACS缓冲液中，随后上样于miniMACS柱子中(MSColumns,MiltenyiBiotec)，用0.5mlMACS缓冲液洗涤三次以使未结合STRO-3单克隆抗体的细胞去除。进一步加入lmlMACS缓冲液后，从磁性支架上取下柱子，并将TNAP阳性细胞收集起来。每细胞组合物均可以被streptavidin-FITC染色，用流式细胞分析检测纯度。STRO-3单克隆抗体与少部分(^lc/tOBMMNCs反应。在如前所述的(Gronthos等，1995)含有20%胎牛血清、2mML-谷氨酰氨和100pmL-抗坏血酸-2-磷酸盐的a-MEM培养基中进行MACS分离得到的TNAP+细胞的原代培养。实施例5:STRO-3单克隆抗体筛选得到人骨髓细胞形成CFU-F材料和方法磁珠激活细胞分选(MACS)为了评价TNAP+细胞的生长潜能，应用MACS分选方法从骨髓中分离顶八？+禾nTNAP-细胞。按照先前描述的方法进行操作(Gronthos和Simmons,1995;Gronthos等，2003)，只是应用了STRO-3单克隆抗体。简言之，根据操作说明书，在MiniMACS磁柱上分离之前(MiltenyiBiotecInc.,Auburn,CA)，将大约1-3x108正常人骨髓单核细胞依次与STRO-3上清、抗-IgG-生物素、streptavidin微珠和streptavidinFITC(CaltagLaboratories,Burlingame,CA)孵育。荧光激活细胞分选(FACS)在STRO-l+ve或-ve表达的基础上分选得到的STRO-3细胞中检测CFU-F生长能力。按照前述的方法进行(Gronthos禾口Simmons,1995;Gronthos等,2003)。简言之，根据厂商操作说明书，在MiniMACS磁柱上分离之前(MiltenyiBiotecInc.,Auburn,CA)，将大约1-3x108正常人骨髓单核细胞依次与STRO-1上清、抗-IgM-生物素、streptavidin微珠和streptavidinFITC(CaltagLaboratories,Burlingame,CA)孵育。STRO-1+MACS分离得到的细胞用streptavidin-FITC标记，然后与纯化的STR0-3单克隆抗体或同种型对照1B5(10pg/ml)冰上孵育30分钟，洗涤并与phycoerythrin(PE)标记的山羊抗小鼠IgG抗体(l/50;SouthernBiotechnologyAssociates,Birmingham,AL)在冰上再孵育20分钟。用FACSta/Lus流式细胞仪(BectonDickinson,Sunnyvale,CA)分选细胞。8丁尺0-1"8丁110-3+或STRO-1brVSTRO-3"细胞在含有20%胎牛血清、2mML-谷氨酰氨和100^M-抗坏血酸-2-磷酸盐的a-改良Eagle's培养基中培养，条件为5%<:02、37。C的湿润环境。结果和讨论设计实验检测单一用STRO-3单克隆抗体分选细胞以评价CFU-F生长的潜能(图8)。在TNAP表达基础上的MACS分离方法揭示了克隆原CFU-F只在TNAP+BMMNC细胞中可检测到。假定STRO-3(IgGl)是STRO-l(IgM)的不同种型，则STRO-3鉴定克隆原CFU-F的能力可以用基于其与用MACS方法分离到的STRO-1+细胞共表达的双色FACS来评估(图9)。STRO-3单克隆抗体具有特异的结合特性，可以与高水平表达STRO-1抗原的STRO-1+BMMNC反应(STRO-lbrightfraction),可以有效的分离并为MPC细胞群富集(表2)。而且STRO-3单克隆抗体不能与成人人骨髓中CD34+的造血干细胞反应(数据未显示)。表2:用基于细胞表面标记STRO-1和TNAP的共表达的双色FACS分析富集人骨髓细胞(见图9)。FACS分选的细胞在标准的克隆原条件下在含有20%胎牛血清的a-MEM培养基中培养。数据代表了每1()S细胞士SE在第14天克隆形成细胞的平均数(CFU-F)(n二3，不同骨髓吸取物)。这些数据提示了人MPC是专门限于共表达STRO-1抗原的BM细胞中的TNAP阳性细胞。<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>实施例6:培养扩增之前和之后，用STRO-3单克隆抗体筛选出的细胞的表型材料和方法按照Gronthos等(1999)描述的方法进行单色流式细胞分析。简言之，每一代细胞的培养用胰酶/EDTA消化并用封闭液在冰上孵育30分钟。按照上述前述方法洗涤大约1X105细胞，并重悬在200|il—抗中，并置于冰上l小时。对于人CC9，一抗是饱和浓度的小鼠IgM单克隆抗体STRO-l和/或小鼠IgG单克隆抗体，并且STRO-3也要用到。其它使用的抗体包含结合CD45,CD34和3G5的单克隆抗体。用相同条件处理小鼠同种型IgM和IgG阴性对照单克隆抗体。洗涤细胞之后，加入100(il含有山羊抗小鼠IgM^i链特异FITC(1/50稀释)和山羊抗小熟,IgG,y-特异-PE(l巧0稀拜)或抗兔,Ig-特异-PE.(1/50稀释)(SouthernBiotechnologyAssociates)作为二抗。细胞在冰上孵育45分钟，洗涤两次，在FACsFIX(PBS含有P/。(v/v)，2。/。(w/v)D-葡萄糖，0.01%叠氮钠)中固定。然后在Epics⑧-XL-MCL流式细胞仪分析细胞(BeckmanCoulter,Hialeah,FL)。点图单参数直方图代表了以列表排队数据方法(listmode)收集的5xl0，细胞。结果与讨论在图10中显示，人骨髓单核细胞用标记STRO-3单克隆抗体进行的免疫筛选导致许多有高水平TNAP和CD45细胞表面抗原表达的细胞得以分离(图10)，有约90%的TNAP+的细胞共表达CD45。相反，用STRO-3单克隆抗体分离的TNAP+细胞中少于1%表达造血干细胞标记CD34。另外，不多于5%的用本发明的方法富集的TNAP+细胞共表达任何一种先前用来分离MPC的标记，这些标记包括STRO-l,CC9/CD146和3G5。培养扩增之后，用本发明的方法富集的TNAP+细胞具有稳定的表型，这不同于富集的和新鲜分离的细胞(图11)。早用STRO-3筛选得到的期(二代)和晚期(5代)细胞可表达高水平的内源性CC9/CD146和HLAI类分子，但是全部是CD45,HLAII类，CD14,CD19,CD3，CDlla-c，CD31,CD86和CD80阴性。很引人注目的是，通过STRO-3单克隆抗体检测的TNAP表面表达在早期的细胞(二代)中全部为阳性，但是在晚期细胞(5代)中是阴性。图11和13显示，随着细胞的扩增，STRO-3会渐进性丢失，但是通过STRO-3筛选富集的TNAP+细胞表面的STRO-l抗原在逐渐增加。到第二代，与IgM同种型对照相比，约84%细胞是STRO-l阳性，并且约52%显著表达STRO-l(定义为比STRO-l阴性细胞高2个log数量的STRO-l表面表达)。到第五代，大多数细胞是STRO-l阳性(约69%)，较少细胞显著表达STRO-l(约21%)。这提示STRO-3筛选的TNAP+细胞的起始培养导致STRO-l抗原的上调，大概反应了无自发分化的增殖，但是进一步的培养导致STRO-l抗原的下调(从强到中等表达)。相反，人骨髓单核细胞用标记STRO-l单克隆抗体进行的免疫筛选导致许多有高水平(约50%)STRO-l和缺乏CD45表面抗原表达的细胞得以分离(图12和WO/2004/085630)。虽然，开始的STRO-l表达是高水平的，但是随着STRO-l筛选细胞的扩增，将导致在第四至六代时，STRO-l表达下调。随着细胞的扩增，相对于起始的细胞和在相同的第四至六代通过STRO-3筛选富集的TNAP+细胞而言，STRO-1水平明显下降(图11)。总而言之，这些结果显示当细胞被新鲜分离和进一步培养扩增时，通过STRO-3筛选富集的TNAP+细胞是不同于通过STRO-1+富集的细胞的表型特点。实施例7:TNAP+阳性细胞的分化——脂肪形成材料和方法脂肪形成分析步骤脂肪形成诱导培养基的制备当细胞达到100%融合时，应该使用脂肪形成诱导培养基(约5-13天)。细胞融合之前制备培养基。1.用70%v/v乙醇或异丙醇消毒脂肪形成诱导培养基(PT-3102B)和SingleQuots⑧的外表面a.h-胰岛素(重组)b.L-谷氨酰氨c.MCGSd.地塞米送e.n引哚美辛f.IBMX(3-异丁基(isobuty)-l-甲级黄嘌呤)g.Pen/Strep2.无菌条件下打开上述的SingleQuots并将内容物加入到175ml的脂肪形成诱导培养基中。3.用培养基洗涤每SingleQuot小瓶。4.使用脂肪形成诱导培养基的补给性培养基。使用前避光储存在2-8。C。配制脂肪形成维持培养基如下1.用70%v/v乙醇或异丙醇消毒脂肪形成维持培养基(PT-3102A)和8^1§16(^(^@的外表面a.h-胰岛素(重组)b.L-谷氨酰氨c.MCGSd.Pen/Strep2.无菌条件下打开上述的SingleQuots并将内容物加入到175ml的脂肪形成诱导培养基中。3.用培养基洗涤每SingleQuot小瓶。4.使用脂肪形成维持培养基的补给性培养基。使用前避光储存在2-80C。脂肪形成培养方法1.按照2.1x104STRO-3单克隆抗体筛选细胞/cn^接种细胞到组织培养表面积中，每cm2表面积用0.2-0.3mlMSCGM培养基。例如在6孔板中每一个9.6cm2孔中加入2ml培养基，接种细胞2X105，在37°C、5%C02的湿润条件下培养细胞。2.每2-3天彻底换新鲜MSCGM培养基，直到细胞达到融合的标准(5-13天)。细胞必须融合，或融合后才是脂肪形成的最理想条件。3.在达到100%融合时，三个循环的诱导和维持将刺激理想的脂肪形成分化。每一个循环包括用补给性脂肪形成诱导培养基培养细胞3天(37。C，5。/。C02)，然后在补给性脂肪形成维持培养基中培养1-3天。饲养的未诱导对照细胞按照相同的方法仅仅在补给性的脂肪形成维持培养基中培养。脂肪细胞非常娇弱，所以必须小心以避免破坏细胞中的脂肪小泡。在更换培养基时，细胞不能被干燥。4.在三个完整的诱导/维持循环之后，在补给性脂肪形成维持培养基中培养细胞7天多，每2-3天更换培养基一次。5.应用显微镜观察脂质小泡来确定诱导的细胞的脂肪形成分化的程度。为了确定脂肪形成分化，培养细胞可以用AdipoRed来染色。非诱导细胞没有直至小泡存在。6.未固定细胞的培养可能用来分析要求的脂肪细胞。.AdipoRedTM体外分析脂肪形成在6-,12-,24-和48-孔板中的方法1.以30，000/咖2接种细胞，如上所述培养并使细胞分化，应用适合的细胞培养体积。2.分析之前，用PBS洗涤每孔，并且加入AdipoRed，使用的体积见表3。表3AdipoRedTM分析的反应体系体积<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>3.加入AdipoRed之后，最好的混匀方法是每孔吸取50%内容物吹吸两次(对于6孔板要吹吸3次)。最重要的是，小心得到蓝色AdipoRed试剂的均一性分布，而不要让移液器吸头接触到细胞层或者别吸走细4.IO分钟之后，将培养板放入荧光监测器中，以激发光谱485mn和发射光谱572nm检测荧光。如果荧光监测器没有合适的滤光板，通常的激发光谱485nm和发射光谱535nm条件也可使用。结果和讨论分析两群细胞的分化能力。细胞样品标记2242A2070CP.2oP.2o-30E6细胞-30E6细胞02NOV200508NOV2005图14中提供的结果显示用STRO3单克隆抗体筛选的细胞能够分化为脂肪细胞。实施例8:TNAP+细胞的分化——骨发生材料和方法骨发生分析的步骤配制骨发生诱导培养基如下1.用70%v/v乙醇或异丙醇消毒骨发生分化基本培养基和随后的SingleQuots的外表面a.地塞米送b.L-谷氨酰氨c.抗坏血酸d.Pen/Strepe.MCGSf.卩-甘油磷酸2.无菌条件下打开上述的SingleQuots并将内容物加入到185ml的骨发生分化基本培养基中。3.用培养基洗涤每SingleQuot小瓶。4.使用前将骨发生分化培养基的补给性培养基避光储存在2-8。C。骨发生培养方法1.按照3.1x10SSTRO-3单克隆抗体筛选细胞/cn^接种细胞到组织培养表面积中，每cn^面积用0.2-0.3mlMSCGM培养基。例如在6孔板中每一个9.6cn^孔中加入2ml培养基，接种细胞3X104。2.让细胞在MSCGM中贴壁4-24小时，在37°C、5。/。C02的湿润条件下培养。3.用骨发生诱导培养基置换MSCGM以诱导骨发生。4.每3-4天彻底换新鲜骨发生诱导培养基培养，持续2-3周。用相同的步骤处理培养在MSCGM中的未诱导对照细胞。5.当细胞分化和矿物化(mineralize)时，骨发生诱导的细胞形态会发生变化，从梭形变为立方形。在融合后的细胞层可以形成间隙，而且细胞可能从培养表面分层。如果观察到这种分层，则立刻用钙沉积方法进行骨发生分化的分析，或者用这些诱导的细胞进行其它骨细胞所要求的分析。6.进行钙沉积分析时，细胞用无钙PBS洗涤几次，然后从培养皿表面刮下来转至0.5MHC1中。分析骨发生诱导培养提取物的钙含量并且与未诱导细胞提取物比较。体外骨发生的钙沉积分析材料DPBS，无韩或镁-Cambrexcatalog#17-516Q0.5NHC1转(CPC)Liquicolor试齐U盒-StanbioLaboratorycatalog#0150-250，诱导的骨发生培养物，培养板阅读机或分光光度计步骤从6孔培养板的孔中吸取所有培养基，所述的培养板包含将被检测的诱导的和对照细胞。*用lmlPBS从每个孔的侧壁加入，洗涤板中的细胞，要小心不移动细胞。*吸掉PBS并如上重新洗涤。.吸去第二次的洗涤缓冲液并在每孔中加入0.5ml0.5N的HC1，用细胞刮子将细胞从培养皿表面刮下来，并且转移细胞和HCL到聚丙烯管中(带有严密盖子的1.5mlEppendorf管或任何2-5ml聚丙烯管)。*在每孔中再加入0.5ml0.5N的HC1以回收剩余的细胞，并且转移它们到合适的管中。盖紧装样品的管子，如果不立刻检测，可保存在-20。C中1个月。.在4°C摇荡3-24小时，从细胞中提取钙。如果使用冷度的样品，包括将样品融化的额外时间。500g，2分钟离心样品。，小心的收集含有钙的上清，不要打碎沉淀，并转移到新的管中。*按照StanbioLaboratoryCalcium(CPC)Liquicolor试剂盒的操作说明书，用钙标准制备标准曲线，并确定每一个对照和骨发生诱导样品的钙数量。4羊品和试验试剂体积要调整以适应微升的盘子(200pl)和分光光度计测定杯(2ml)。10^-100样品用于每一组样品钙的确定。未用完的样品可重新冻存起来已被将来使用。结果和讨论图15提供的结果显示用STRO-3单克隆抗体筛选的细胞能够分化成骨细胞。实施例9:TNAP+细胞的分化——软骨发生、脂肪形成和骨发生如前所述(Gronfhos等，2003)用10ng/mlTGF-P3处理总培养物来评价软骨发生分化。AlcianBlue证实了STRO-3单克隆抗体筛选的细胞能够产生蛋白多糖(图16C)，并因此形成软骨细胞。STRO-3单克隆抗体筛选的细胞也能分化成功能性的造骨细胞，在添加了10%胎牛血清、100pML-抗坏血酸-2-磷酸盐、10-7M地塞米松和3mM无机磷酸盐的的a-MEM培养基中培养3周。应用阳性AlizarinRed染色鉴定矿物沉积(图16^)。63同样，如前所述，在0.5mM甲基异丁基甲基黄嘌呤，0.5pM氢化可的松和60^iM吲哚美辛存在时，脂肪形成可以被诱导(图16B)。油红0染色证实了充满脂质的脂肪细胞的存在。实施例10:在体内诱导新骨形成的扩增后人STR0-3单克隆抗体筛选细胞的移植。如前所述，约5.0xl(^个在体外扩增的STRO-3单克隆抗体筛选的骨髓细胞与40mg羟基磷灰石/磷酸三钙(HA/TCP)陶瓷粉混合(ZimmerInc，Warsaw,IN)，然后皮下移植到6周龄免疫抑制的NOD/SCID小鼠(ARC,Perth,WA,Australia)的背侧面并饲养8周(Gronthos等，2003)。这些操作根据批准的动物操作方法的说明书进行(UniversityofAdelaideEthicsNumberM19/2005)。收集到的移植组织在4%多聚甲醛中固定，再用10。/。EDTA溶液脱钙，k后包埋石蜡。显示用H&E染色的8周龄移植组织中得到有代表性的横切面切片。组织学检测证实了存在新生骨的形成(图16D)。实施例11:STRO-3单克隆抗体筛选的细胞有利于骨修复材料和方法胫骨临界大小缺损绵羊背侧斜卧，剪去绵羊左侧固定的(bind)大腿到脚的背侧皮毛。用聚维酮碘(Betadine)和酒精交替消毒胫骨皮肤以准备无菌手术。肢体上铺好手术单准备无菌手术。手术开始时要进行预防性抗生素给药(Ancef;1gm手术前，1gm手术中和1gm切口缝合后，静脉给药)。切6-cm的皮肤切口，剥离骨膜暴露胫骨骨干。骨膜和其上覆盖的软组织要与周围钝性分离。应用盐溶液浸泡并保持冷却的摆锯在骨干中部通过两次切断制备5-cm的缺损。用交锁髓内钉修复缺损。从中部直至左侧膝关节切纵向切口以方便插入骨钉。劈开关节囊，髌骨肌腱从侧面縮回，将胫骨嵴上的脂肪组织分离并暴露中部。用钻头在胫骨骨干开的6-mm入口并用手摇式括孔钻扩大以使骨钉可以插入压力固定。如果有必要，胫骨远端干骺端可以钻8-mm的孔以使钉的末端能用手工插入。用插入手柄将骨钉插入，转动头部使得与骨钉的近端连接。用瞄准装置进行近端和远端交锁。经培养扩增后的STRO-3单克隆抗体筛选的细胞和HA/TCP载体移植到绵羊胫骨临界大小缺损处。用HA/TCP载体或HA/TCP+STRO-3单克隆抗体筛选得到的培养物的扩增细胞填入缺损处，并在OR装置中孵育后检测不同浓度的处理组(25M，75M或225M)。然后用软组织覆盖缺损处以使载体和细胞紧密结合(containment)在一起。在全麻醉下对动物侧面和头-尾向(AP)进行X线照相。在下述时间点进行X照相0天(手术时)和l、2、3月时。根据下述标准解释X照片胼胝桥百分率反应了矿化组织延伸入近端和远竭缺损处的数量，这个百分率是除总的缺损长度得到的。融合用如下分值系统表征0(未融合)；1(中等融合)；2(强的交互连接融合)。脊骨融合程序麻醉绵羊并去除其腰背部的皮毛，将绵羊的胸部紧贴手术床。腰部手术区域用聚维酮碘或异丙醇乙醇多次刮擦消毒。铺手术单并进行局部麻醉(Lidocarae)，使麻醉平面接近L4和L5背侧棘状突。接近横突切20cm的皮肤切口并将骨旁肌肉与棘状突骨板分离。将关节面和L3和L4之间的横断面暴露。使用仪器和脊骨融合程序L3f卩L4之间的横断面双面剥离。HA/TCP移植物(载体)或载体+同种细胞或自体移植物放入横断面之间。手术中采用椎弓根螺钉内固定(Medtronic-Sofamor-Danek;CD画Horozon，M8fixedscrewheadsystem)。例行缝合手术切口。4个月后，将所有的绵羊实施安乐死并且立即去除连接螺钉，将移植后的脊骨进行CT扫描和X线照相和Faxitron分析。脊骨机械试验安乐死之后立即取完整的腰脊柱并准备进行机械试验。由两个融合椎骨以及上下另外的椎骨构成的4椎骨体从腰脊柱中分离出来。将这些分离的样本与周围的软组织分离，要小心保护肌腱和关节囊的解剖结构。一些螺丝钉钻入了大多数近头端椎骨的上部终板中，而近尾端椎骨的下部终板连接了金属陶瓷頃定装置，用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)保护螺丝钉固定的椎骨复合体。样本在整个制备和检测过程中保持湿润。动力学分析——负荷应用和运动程度测定样本固定在特制的脊骨测试固定装置上。测试固定装置连接标准的伺服液压控制测试框架(MTS)，采用的是滑轮和张力金属丝系统；这种装置可以测试样本弯曲/伸展、右和左侧弯曲和右和左轴向旋转时的力矩。负荷最大为5N-m。预处理样本三次，收集第四次处理的数据。应用立体摄影测量(术)的原则计算负荷依赖三维置换。三个非共线标记连接在陶瓷固定装置的下部和上部以及融合的两个水平处。三个高分辨率照相机(ViconPeak,Centennial,CO,美国)用来检测这些标记的反光，收集数据并用用户定制设计的软件(SpinalFlexibilityTestingSoftware,MFLEX)以确定横过融合处合适的椎骨间角度。所得的数据提供了无控制作用的参数范围和包括所有三个弯曲面的相关水平和邻近片断的运动数据范围。统计分析用标准的Fisher最小显著差PLSD单通道ANOVA进行处理组中上述参数的统计显著性分析(多组之间比较的检验)(StatView,SASInstitutelnc.Cary，NC，USA)，p值小于0.05，被认为具有统计学意义。在全麻醉下对动物侧面和头-尾(AP)进行X线照相。在下述时间点进行X照相0天(手术时)和l、2、3、4月时。另外，在处死动物时应用乳房X线照相术进行Faxitron分析。根据如下标准进行X光照片的解释0(未融合)；1(中等融合)；2(强的互相连接融合).结果和讨论图17中X射线分析显示STRO-3单克隆抗体筛选后扩增的同种基因的成人多潜能细胞联合HA/TCP载体给药的羊椎弓根螺钉内固定脊柱模型与单独或自体移植物相比较具有明显的致脊骨融合作用。在最早三个月时可以观察到明显的脊骨融合，在四个月时继续增加。这种效果没有剂量依赖性，与对照载体和自体移植物相比，即使很低剂量也可导致明显的脊骨融合。图18显示当使用仪器去除并处死动物的时候，相比较对照载体和用乳房X线照相术进行Faxitron分析的区域，STRO-3单克隆抗体筛选后扩增的同种基因的成人多潜能细胞联合HA/TCP载体给药的羊椎弓根螺钉内固定脊柱模型导致强的脊骨融合。与标准的自体移植物相比较，所有的多潜能细胞可反映脊骨融合的密度。图19显示与自体移植物对照相比较，STRO-3单克隆抗体筛选培养物扩增的同种基因的成人多潜能细胞联合HA/TCP载体给药的羊椎弓根螺钉内固定脊柱模型形成的是机械融合。足量的多潜能细胞可导致融合骨具有弯曲、侧向延伸和一定范围内的机械运动负荷扭曲的特性。图20显示在羊5cm临界大小的胫骨缺损模型中，STRO-3单克隆抗体筛选的培养物扩增的同种基因的成人多潜能细胞联合HA/TCP载体给药的羊椎弓根螺钉内固定脊柱模型导致剂量依赖性的早期骨生长。在手术创伤后最早在三个月的时候，225M细胞联合HA/TCP载体导致超过60%的愈合骨形成。图21显示与单独载体对照相比较，在绵羊5cm临界大小的胫骨缺损模型中，STRO-3单克隆抗体筛选的培养物扩增的同种基因的成人多潜能细胞联合HA/TCP载体导致融合率的增加。在三个月时，仅仅75M和225M细胞剂量可导致X线分析可见的融合。这些结果显示本发明扩增的细胞能够增强骨修复。实施例12:STRO-3单克隆抗体筛选的成人多潜能细胞改善心功材料和方法胸廓切开术步骤用肥皂和水清洗并用(聚维酮碘)溶液消毒绵羊的胸部和上腹部，晾干后切开绵羊的胸腔和上腹部。手术区铺消毒后的手术单，手术台周围的所有人要穿手术衣，带面具、手套和帽子。所有的胸部手术均经左胸廓进行。应用尽可能最小的切口并在第三、第四或第五肋间进入。用解剖刀切开皮肤。皮下组织和肌肉通常用电刀分离以利于止血。打开心包并且使心脏在心包腔中维持跳动。在无菌条件下，进行心外膜超声波心动(描记)图检测。用聚丙烯缝线(糾)结扎适当的冠状动脉。先前在动物模型中已经建立了前壁心尖部心肌梗死模型。简言之，将左前降支(LAD)末梢1/3连同冠状动脉第二斜角支(D2)结扎即可建立包括左心室约20-25%的前壁心尖部心肌梗死模型。这项技术是很可靠的，可以导致心室重建和充血性心衰(CHF)。胸廓切开术切口用3-0Vicryl缝线缝合。皮肤用3-0Vicryl皮下缝线缝合。关闭胸腔之前要用bupivicaine(5cc的0.25%溶液)处理以封闭肋间神经。在左胸膜间隙留置胸腔导管，并连接在20cm的水吸引引流法排出管上，直至拔管为止。在手术中，麻醉的情况下要全程监控动物，例如BP-动脉输血导管，心脏输出-Swan-Ganz/气传导率导管，在拔管之后要在实验室仔细观察动物几个小时直至完全苏醒和站立；接下来要密切观察6-24小时以防任何的心率失常或低心输出信号和监控并处理疼痛；还要注意补充所需的液体以及食欲不振的处理。另外的胸廓切开术在裸大鼠中进行。全身麻醉下，动物的左前降支背结扎，随后注射细胞到梗死前(perinfarct)区域周围、心包腔中和缝合的伤口中。这样在处死之前，使得动物存活2周。成人多潜能细胞移植冷冻的培养基在37"C水浴中融化以培养体外扩增的STR0-3单克隆抗体筛选的绵羊骨髓细胞或对照。然后用酒精消毒4个lml小瓶，用angiocath针式注射器吸取lml体銜的样品，转移样品到4个lml注射器中。最终，4ml样品中有大约3.5ml可以使用。每lml注射器适合27规格针，将0.2ml样品注射到梗死周围区域，要注射约16-20次。对于大鼠，用27规格针注射器将含有1百万细胞的0.2ml培养基注射到梗死周围区域。超声波心动描记术为了进行绵羊横隔膜定量超声波心动描记术检测而实施的剖腹术。在大约基线，梗死后，梗死后4周，每一只绵羊均在全麻下(异氟垸)进行剖腹术以进行横隔膜定量超声波心动描记术检测。因为经胸廓或经食道的心电图影像不足以满足在绵羊中的定量分析，所以要进行剖腹术。这些动物拥有包在心脏周围,勺巨大的肺。肺中的空气使影像质量降低。在这些研究中，要严格检^i诸如血压、心率和心输出量等血液动力学指标。用肥皂和水清洗并用聚维酮碘溶液消毒上腹部，晾干后切开绵羊的上腹部。手术区铺消毒后的手术单，手术台周围的所有人要穿手术衣，带面具、手套和帽子。因为肺的覆盖，从横隔膜下进行超声波心动(描记)图。用解剖刀切开起始切口。用电刀分离皮下组织和肌肉。打开腹膜腔。将包裹在消毒塑料袋中的回声探头放入隔膜之下，所有的研究均在消毒的条件下进行。在腹膜和背面绷带的压迫协助下用简单的阻断性O-prolene方式缝合切口。用3-0runningVicryl线缝合皮下组织。用皮下3-0Vicryl线缝合皮肤。对于大鼠，2D超声波心动描记术可以用来测量心脏收縮和舒张体积参数。数据分析脱机分析所有影像资料。所有测量在鉴定为框架(identifiedastheframe)的心脏收縮末期进行，因为这是LV腔体积最小。代表三维透视的所有图是用Tecplot(Version10;AmtecEngineering,Bellevue.Washington)创建的。用Matlab计算样条曲面拟合和Gaussian曲率。所有测量以平均数SD表示。用配对t检验进行基线和梗死后之间的差异分析。在先前描述过为了在长轴和短轴方向的2DCE数据库而进行的影像加工和数据分析。简言之，梗死前1小时和之后1小时在梗死周围区域测量心脏内曲率(endocardialcurvature)(K)和心室壁厚度(h)。所有3DCE旋转切面影像进行如下分析。事先不了解本研究前体的超声心动图技术人员用超声波心动描记术探测心脏内和心外膜轮廓(UTHSCSAImageTool;DepartmentofDentalDiagnosticScience,UniversityofTexasHealthScienceCenter,SanAntonio,Texas)。通过追踪每一个个体旋转切面来重建心脏收縮末期的心内膜和心外膜。在心脏内和心外膜的每一个位置上，要确定心肌再灌注存在与否；因此再灌注状态就用LV几何学记录，以精确确定心肌的区域。然后将有代表性的数据组合起来以重建LV心内和心外表面的三维模式，并有灌注状态的说明。用平滑薄板样条(x)拟合心脏内和心外膜表面，并计算包括空间分辩(spatiallyresolved)高斯(Gaussian)曲率的表面特性。结果和讨论图22显示在急性结扎冠状动脉左前降支后24小时，培养5代的人STRO-3单克隆抗体筛选后的细胞直接注射到5只大鼠心脏中所产生的效应。两周时，与只注射培养基的对照相比，这些细胞诱导了约大于50%的区域中的改变。图23显示在急性结扎两条冠状动脉斜角支后即刻，培养5代的同种基因的绵羊STRO-3单克隆抗体筛选后的细胞直接注射到绵羊心脏中所产生的效应。在4周和8周时，与只用培养基处理的对照组相比，用STRO-3单克隆抗体筛选后细胞处理的动物表现了更高的射血分数(A)，和明显较低的心脏舒张(B)和收縮(C)体积。这些结果显示了本发明中扩增的细胞能够改善心功能。实施例13:人STR03筛选和培养后扩增的TNAP富集的细胞在那些需要(l)骨再生，或(2)心功能恢复/血管形成增加的人类患者中的用途材料和方法细胞治疗PtyLtd(附属于PeterMacCullumInstituteofCancerResearchMelbourne,Australia)的标准操作方法用于培养扩增从人BM中经STRO-3单克隆抗体免疫筛选的TNAP+阳性细胞，并随后使得这些细胞应用于需要骨再生和心脏功能恢复/血管形成的患者体内。抽取骨髓的方法1.骨髓(BM)常规取自髂骨嵴后部(髋骨)间隔大约0.5-lcm的两个或多个位点。2.在股部皮肤注射局部麻醉药以麻醉该处皮肤。在皮肤上切一小口并将针置入骨中。3.抽取5-20ml骨髓，针从位点抽出并经相同的皮肤切口至骨的不同位点再穿刺抽取骨髓，最终收集40ml骨髓。4.骨髓通常抽取到含有锂-肝素的管中，但是其它抗凝血药也可以使用。如下所述，优选在1小时内完成骨髓抽取。骨髓单核细胞制备——密度梯度分选所有技术在11级生物安全工作橱中进行。1.40ml抽取的骨髓通常放在4个管中(约10ml/管)。2.所有骨髓置于50ml管中(Falcon,BectonDickinson)以保证充分混匀。等分骨髓到两个50ml管中。加入等体积的封闭缓冲液。3.用白细胞流(WCF)估算白细胞数。评价细胞数(处理前计数)。4.应用70mm细胞滤网(strainer)(Falcon,BectonDickinson)过滤稀释的骨髓至两个50ml离心管中以去除小的血凝块和骨碎片。5.放置3mlFicoll-Hypaque(淋巴细胞分离剂(Lymphoprep))溶液到10个14ml的圆底聚苯乙烯管底部(Falcon,BectonDickinson)。6.用7.5ml骨髓小心覆盖淋巴细胞分离剂。7.400xg(1400rpm)室温离心30分钟。确保关闭离心机刹车。8.用无菌的插管、真空吸引直到达到白细胞带(血沉棕黄层)上大约—cm处。用一次性的塑料巴斯德吸管仔细的收集单个核细胞层到50ml管中。9.用洗脱缓冲液稀释细胞到40ml并400xg(1400rpm)带最大刹车离心样品10分钟。IO.吸出缓冲液直到刚刚到达细胞沉淀的上方。用涡旋混合器混合该管并添加50mlHHF。重复步骤9。磁激活细胞分选(MACS)TNAP阳性细胞1.在免疫标记前，用0.5ml封闭缓冲液重悬BMMNC(大约12x108细胞)，在冰上孵育30分钟以封闭可能的Fc受体介导的抗体的妙a5口n02.把500微升预先用封闭缓冲液稀释到10mg/ml的STRO-3单克隆抗体加到BMMNC中在4/C孵育60分钟并时而轻柔的混合。3.用HHF洗BMMNC两次，然后重悬在0.5ml含有h50稀释的生物素标记的山羊抗小鼠的IgG(重链特异的，SouthernBiotechnologyAssociates,Birmingham,UK)的HHF中，在4/C孵育45分钟。.4.用MACS缓冲液(含有1%BSA不含Ca2+Mn2+的PBS，5mMEDTA和0.01%叠氮钠)洗三次BMMNC后重悬在加了50—1链霉素微珠(MiltenyiBiotec;BergischGladbaeh,Germany)(在90—1MACS缓冲液中，10—1微珠/107个细胞)的450—1的MACS缓冲液中。混合液在4/C孵育15分钟。5.为了进一步的监控纯化过程(可选)，链霉素-PE联合(1/50)(CaltagLaboratories,SanFrancisco,CA)直接加到细胞悬液中额外孵育5分钟。'6.用冰预冷的MACS缓冲液洗一次后，每个样品取少量的细胞(大约200K)进行流式细胞仪分析。剩下的细胞然后加到迷你MACS柱中(柱体积为108细胞，MiltenyiBiotec，MScolumn)。TNAP阴性细胞(阴性部分)不被柱子所保留，通过了柱子，在地心引力的作用下进入了流出液，而TNAP阳性细胞仍然结合在磁性基质上。7.用0.5mlMACs缓冲液洗3次以去除非特异结合的TNAP阴性细胞。8.把柱子移出磁性区后用MACS缓冲液冲洗从而重新得到TNAP阳性细胞。从每个分离前、阴性和阳性部分取少量样品用FACSFix(含有1%(v/v)福尔马林、0.1MD-葡萄糖、0.02。/。叠氮钠的PBS)固定，随后用流式细胞仪分析从而得到纯度和得率。建立和体内培养用STRO-3单克隆抗体选择的细胞1.在组织培养瓶或皿中用含20%胎牛血清、100mML-抗坏血酸-2-磷酸、2mML-谷氨酰氧、50U/ml青霉素和50mg/ml链霉素(CSL)的a-改良Eagle's培养基(a-MEM)在37yC、4%C02的条件下培养TNAP+富集的细胞群(5x10Vcm勺两周。2.当培养物达到80-90%的融合时应该传代原代细胞。用不含血清的HBSS洗贴壁培养物一次并每个T75培养瓶用2ml0.5%胰酶/EDTA溶液(JRH)在37。C消化5-10分钟分散细胞。收集细胞悬液并以0.5-1.0x104/cm2的密度再接种细胞在含10%FBS的a-MEM生长培养基中。3.常规的，培养扩增的细胞的单细胞悬液是用上面所述的胰酶/EDTA消化得到的。然后稀释细胞并用冷的HFF洗涤。离心后，细胞沉淀重悬在浓度为每ml5x106细胞的FBS中并置于冰上。逐渐加入等体积的冻存混合液(含20y。DMSO的冷FBS)同时轻轻的混合细胞直到在10%DMSO/FBS中细胞的终浓度为每ml2.5x106cells。在冰上每lml分装到1.8ml冻存管(NUNC)中，即每管lml，然后用速率控制的致冷器以每分钟rc的速度冷冻。冻存管然后转移到液氮中来长期储存。复苏冻存的细胞是要快速的在37'C水浴融化细胞。细胞然后重悬在冷的HFF中280xg离心10分钟。为了评估细胞的生存能力，用0.4%胎盘兰/PBSl:5稀释后用血球仪计数细胞。典型的这个程序的存活率在80-90%之间。细胞制备的质量控制1.BMSSC培养物用胰酶/EDTA消化获得然后重悬在封闭缓冲液中30分钟。2最后的细胞规格包括革兰氏染色阴性、培养14天不含细菌和真菌，内毒素检测阴性和胎盘兰染色70%的存活率。3.细胞的免疫表型的特征为STRO-l+、TNAP+、CD146+、CD44+、CD3-、CD14-、克隆形成分析(细胞克隆形成单位-成纤维细胞原(crj-f))和诱导向成骨细胞分化。自体培养扩增的细胞然后在冰上运送给澳大利亚墨尔本的皇家墨73尔本医院，是为了移植给那些需要骨髓再生的病人，运送给在澳大利亚纽卡斯尔的JohnHunter医院是为了心肌内移植给那些需要恢复心脏功能和/或新的血管生成的病人。经皮的NOGA介导的骨髓细胞移植程序。NOGA(Biosense)左心室电机械标测利用磁技术来导航8fr心内膜标测导管，该导管可以经皮从右股动脉前进到左心室。牵引该导管然后沿着心内膜面捕获局部的R波电位。电信号传导到表面的ECG电极，因此可提供关于局部室壁运动的信息(内膜下心肌短縮率(locallinearshorteningscores))。缺血但有存活的心肌的区域可以被NOGA检测到表现为内膜下心肌短縮率减少但是保留了R波电位的区域。预先确定的NOGA的正常心肌的参数为区域的电活性>5mV且内膜下心肌短缩率>12。/。。梗塞的心肌的区域的电活性〈5mV且内膜下心肌短縮率<4%。缺血但是有存活的心肌的电位为5mV或更高且内膜下心肌短縮率为4-12%。NOGA己经作为在线评估心肌存活的工具在心导管检査实验室得到广泛验证。Biosense的Myo-StarTM注射管和标测管相似，因为在其的顶端也有磁传感器可以帮助定位。其有伸縮自如的针能够用来精确的注射骨髓细胞到目的区。当它和心脏内表面接触时，这个系统能够精确的安全的注射骨髓细胞到心内膜。结果和讨论将STR03分选的和培养扩增的TNAP富集的细胞移植给股骨骨折不愈合的病人皇家墨尔本医院一位19岁的男性患者，在9个月前由于摩托车事故股骨茎(shaft)骨折，虽然进行了外科棒椎-螺钉的植入但是不愈合。持续存在5cm的不愈合缺陷。经过知情同意，该患者进行了骨髓抽吸，STRO-3单克隆抗体分选骨髓单核细胞并如上所述的那样培养扩增这些细胞。经过大约6周的培养，收获了200-225百万的细胞并准备做外科注入。在注入时，细胞重悬在无菌的、盐/乳酸林格氏液(plasmalyte)总体积为5-10ml并和包含牛胶原(MastergraftTMMatrix)的人造合成骨基质(HA/TCP)混合。该过程是平静的没有任何不利事件并且(不愈合)缺陷被完全封闭了。将STR03分选的和培养扩增的TNAP富集的细胞移植给两个冠状动脉血管多处闭塞并且有难以控制的胸痛的患者JohnHunter医院有两个40-65岁年龄段、持续胸痛发作并且多处冠状动脉闭塞，而且也不适宜药物或手术治疗的男性患者。经过失tj情同意，该患者进行了骨髓抽吸，STRO-3单克隆抗体分选骨髓单核细胞并如上所述的那样培养扩增这些细胞。经过大约6周的培养，每个患者收获了100-120百万的细胞并准备通过NOGA(Biosense)心导管做心脏内注入。用NOGA心导管给每个患者心肌内注入了培养的细胞。在每个靶区域，含有0.2m的细胞做了10-12次注射。为了排除心室壁穿孔和随后的心包填塞在该过程中和结束后立即做了超声心动图。该过程结束后患者在冠心重症室观察24小时。在冠心重症室观察的过程中每8小时做一次心电图并检测心肌酶水平。在移植过程后的第24小时做超声心动图。在急性或手术后期没有观察到不利事件。每个患者随访2个月。在这个期间，每个患者的胸痛发作的频率和严重程度均减少了并且增加了对于劳累性的耐受性。这些数据显示移植扩增的细胞可导致由于冠状血管的闭塞所致的心肌受损区和"危险"区血管血流的增加。实施例14:当用纤维蛋白胶运送时增加了细胞的存活率材料和方法制备纤维蛋白胶按照厂家的说明制备纤维蛋白胶(TissealVH，Baxter)。简单地，装有冻干密封的蛋白浓縮物、纤维蛋白溶解抑制剂溶液和凝血酶的管在水浴中加热到37°C。用DUPLOJECT制备和应用系统提供的无菌重建组合物将纤维蛋白溶解抑制剂溶液转移到装有冻干密封的蛋白浓縮物的瓶中。该小瓶在37°C中放1分钟然后轻轻的涡旋混合并剧烈的做圆周运动(避免过多的泡沫)并再放到水浴中15分钟。一旦加热了氯化钙溶液就转移到凝血酶溶液中。重悬和注射细胞转移在PBS中的五百万培养扩增免疫分选的人MPCs到稀释的凝血酶溶液中。凝血酶/细胞溶液和再造的密封蛋白溶液然后用两种针上样到改良的DUPLOJECT应用系统，针包括lcc胰岛素注射器(BecktonDickinson)和27G5/8"的针(BecktonDickinson)。裸鼠LAD结扎和梗塞48小时后，左胸廓切开术切合重新打开并小心的消除粘连。鉴定梗塞区并注射0.3cc的总体积(包括在1:5稀释的纤维蛋白胶中的1百万细胞)以3个等分剂量到梗塞区周围。逐层闭合切口，动物痊愈。另48小时后，杀死动物，取心脏组织并用标准方法提取DNA。用大鼠提取的心脏组织DNA做人P-珠蛋白基因的PCR，来从标准曲线估计人细胞生存率。结果和讨论图24显示当用纤维蛋白胶运送时培养扩增的本发明的MPCs增加体内组织的存活率。本领域的技术人员可以理解对本方面的如在特定的实施方案中所示的那些的众多的改变和/或修饰将不背离如广泛描述的本发明的精神或范围。本发明的实施方案因此可被认为在所有的方面是描述性的而不是限制性的。所有上述讨论的出版物以整体并入这里。任何文献、技术、材料、设备、文章或那些包含在本发明说明书中的类似物的讨论只是用来提供本发明的部分内容。这不会作为承诺，即这些材料的任何或所有组成本发明
技术领域：
的现有技术基础或本领域普通常识，因为它存在于本申请每个权利要求优先权之前。参考文献Allcock等，(1977)SynthesisofPoly[(aminoacidalkylester)phosphazenes]，Macromolecule10，824-830。Anseth等，(2002)，Insituformingdegradablenetworksandtheirapplicationintissueengineeringanddrugdelivery.JControlRelease78，199-209。Bianco等，(2001)，Bonemarrowstromalstemcells:nature,biology,andpotentialapplications,StemCells19，180-92。Bregni等，(1992)，Humanperipheralbloodhematopoieticprogenitorsareoptimaltargetsofretroviral-mediatedgenetransfer,Blood80,1418-22。Chatterjee等，(1996)Adeno-associatedvirusvectorsforgenetherapyofthehematopoieticsystem，CurrTopMicrobiolImmunol218,61-73。Cole等，(1984)Humanmonoclonalantibodies,Mol.CellBiochem，62，109-20。Cote等，(1983)Generationofhumanmonoclonalantibodiesreactivewith,cellularantigens,Proc.NatlAcad.Sci.USA80，2026-30。Danos等，(1988)Safeandefficientgenerationofrecombinantretroviruseswithamphotropicandecotropichostranges,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85，6460-4。DeBroe等，(1992)，Introduction:recentdevelopmentsinalkalinephosphataseresearch,ClinChem38,2485。Dennis等，(2002)，TheSTRO画l+marrowcellpopulationismultipotentialCellsTissuesOrgans170;73-82。Ducy等，(1997)，Osf2/Cbfal:atranscriptionalactivatorofosteoblastdifferentiation.Cell89,747-54。Finer等，(1994)kat:ahigh-efficiencyretroviraltransductionsystemforprimaryhumanTlymphocytes，Blood，83,43-50。Frey等,(1998)High-efficiencygenetransferintoexvivoexpandedhumanhematopoieticprogenitorsandprecursorcellsbyadenovirusvectors，Blood91，2781-92。Fukushi等，(1998),Intracellularretentionanddegradationoftissue-nonspecificalkalinephosphatasewithaGly317-〉Aspsubstitutionassociatedwithlethalhypophosphatasia，Biochem，Biophys.Res.Commun，246,613-8。Gronthos等，(1994)，TheSTRO-l+fractionofadulthumanbonemarrowcontainstheosteogenicprecursors，Blood84，4164-73。Gronthos等，(2000)，Postnatalhumandentalpulpstemcells(DPSCs)invitroandinvivo，ProcNatlAcadSciUSA97,13625-30。Gronthos筹，(1與5)，Thegrowthfactorrequirements—ofSTRO-1-positivehumanbonemarrowstromalprecursorsunderserum-deprivedconditionsinvitro，Blood85,929-40。Gronthos等，(1996)，Thebiologyandapplicationofhumanbonemarrowstromalcellprecursors，JHematother5,,15-23。Gronthos等，(1999)，DifferentialcellsurfaceexpressionoftheSTRO-landalkalinephosphataseantigensondiscretedevelopmentalstagesinprimaryculturesofhumanbonecells,JBoneMinerRes14，47-56。Gronthos等，(2003)，Molecularandcellularcharacterisationofhighlypurifiedstromalstemcellsderivedfromhumanbonemarrow，JCellSci116,1827-35。Harris(1990)Thehumanalkalinephosphatases:whatweknowandwhatwedon'tknow,Clin.Chim.Acta186,133-50，Hooper(1997)，Glycosyl-phbsphatidylinositolanchoredmembraneenzymes,Clin.Chim.Acta266，3-12。Hutmacheretat(2001)Scaffolddesignandfabricationtechnologiesforengineeringtissues-stateoftheartandfUtureperspectives.JBiomaterSciPolymEd，12,107-124。Kohler等，(1975)，Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity,Nature256,495-7。Kozbor等，(1985)，Specificimmunoglobulinproductionandenhancedtumorigenicltyfollowingascitesgrowthofhumanhybridomas，J.Immunol.Methods81，31-42，Magnusson等，(2002)，Monoclonalantibodiesagainst<formula>formulaseeoriginaldocumentpage79</formula>Pearson等，(1988)，Improvedtoolsforbiologicalsequencecomparison,Proc，Natl.Acad.SciUSA85，24444-8。Prockop(1997)，Marrowstromalcellsasstemcellsfornonhematopoietictissues.Science276，71-4。Quesenbery等，(eds)(1998)StemCellBiologyandGeneTherapy,JohnWiley&Sons。Ruck:er等，(1996)Regionsinbeta-ehemokiiereceptorsCCR5andCCR2bthatdetermineHIV-Icofactorspecificity,Cell87，437-46。Sato等，(1994)，Preferentialusageofthebone-typeleadersequenceforthetranscriptsofliver/bone/kidney-typealkalinephosphatasegeneinneutrophilicgranulocytes,Blood83，1093-101。Simmons等，(1991)，Identificationofstromalcellprecursorsinhumanbonemarrowbyanovelmonoclonalantibody,STRO-1，Blood78,55-62。Stewart等，(1999)，FurthercharacterizationofcellsexpressingSTRO-1inculturesofadulthumanbonemarrowstromalcells,JBoneMinerRes14，1345-56。Wang等，(2003)Synthesisandcharacterizationofanoveldegradablephosphate-containinghydrogel，Biomaterials24，3969-3980。Weiss等，(1986)，IsolationandcharacterizationofacDNAencodingahumanliver/bone/kidney-typealkalinephosphatase,Proc.Natl,Acad.SciUSA83,7182-6。Weiss等，(1988)，StructureofthehumanJiver/bone/kidneyalkalinephosphatasegene，JBiolChem263,12002-10。Whyte(1994)，Hypophosphatasiaandtheroleofalkalinephosphataseinskeletalmineralization,EndocrRev15,439-61。Xu等,(1994)，CorrectionoftheenzymedeficiencyinhematopoieticcellsofGaucherpatientsusingaclinicallyacceptableretroviralsupernatanttransductionprotocol,Exp.Hemat，22,223-30。Zannettino等，(1996)，Apowerfulnewtechniqueforisolatinggenesencodingcellsurfaceantigensusingretroviralexpressioncloning,JImmunol156，611-20。Zannettino等，(1998)ThesiabmucinCD164(MGC-24V)isanadhesiveglycoproteinexpressedbyhumanhematopoieticprogenitorsandbonemarrowstromalcellsthatservesasapotentnegativeregulatorofhematopoiesis,Blood92,2613-28。权利要求1.TNAP作为标记用于鉴定和/或富集成人多潜能细胞的用途。2、富集成人多潜能细胞的方法，该方法包含从组织来源准备细胞样品并富集表达TNAP标记的成人多潜能细胞。3、根据权利要求2的方法，其包括用TNAP结合试剂在允许TNAP结合到TNAP结合试剂的条件下与该细胞样品接触；且分离结合到TNAP结合试剂的细胞。4、根据权利要求2或3的方法，其中该组织来源是选自脂肪组织、牙齿、牙髓、皮肤、肝脏、肾脏、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、脾、淋巴结、胸腺、胰腺、骨、韧带、骨髓、腱或骨骼肌。5、根据权利要求3或4的方法，其中该TNAP结合试剂结合到TNAP的异构体LAP、KAP和/或BAP。6、根据权利要求3或4的方法，其中该TNAP结合试剂特异的结合到TNAP的异构体BAP。7、根据权利要求3到6中任何一项的方法，其中该TNAP结合试剂是抗TNAP的抗体。8、根据权利要求7的方法，其中该抗TNAP的抗体是结合到和STRO-3抗体同样的表位的抗体，该STRO-3抗体是在2005年12月19日根据布达佩斯条约的规定保藏于ATCC的编号为PTA-7282的杂交瘤细胞产生的。9、根据权利要求7或8的方法，其中该抗TNAP的抗体是单克隆抗体。10、根据权利要求9的方法，其中该抗TNAP的抗体是于2005年12月19日根据布达佩斯条约的规定保藏于ATCC的编号为PTA-7282的杂交瘤细胞产生的STRO-3抗体。11、根据权利要求3到10中任何一项的方法，其中该方法更进一步包含细胞与结合试剂接触，该结合试剂与选自下面的标记结合LFA-3、THY-1、VCAM-1、ICAM-1、PECAM-1、P-选择素、L-选择素、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD29、CD18、CD61、P整合素，6-19,血栓调节蛋白、CDIO、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、FGF-R、瘦素-R,(STR0-2-瘦素-R)、RANKLSTRO-lbri、CD146或这些标记的任何组合。12、根据权利要求3到11中任何一项的方法，其中该TNAP结合试剂是标记的。13、根据权利要求3到11中任何一项的方法，其中该TNAP结合试剂连有荧光标记化合物。14、根据权利要求13的方法，其中结合到TNAP结合试剂上的细胞是用荧光激活细胞分选仪(FACS)分离的。15、根据权利要求3到11中任何一项的方法，其中该TNAP结合试剂是连到固相粒子上。16、根据权利要求15的方法，其中该固相粒子是磁粒子。17、在细胞样品中鉴定成人多潜能细胞存在的方法，该方法包括鉴定在样品中表达TNAP标记的细胞。18、通过根据权利要求1到16中任何一项的方法得到富集的成人多潜能细胞群。19、富集的TNAP+成人多潜能细胞群。20、通过培养根据权利要求18或19的富集的成人多潜能细胞群得到的扩增的细胞群。21、富集的权利要求18或19的群或扩增的权利要求20的细胞群，其包含遗传修饰的细胞。22、产生组织特异定向细胞群的方法，该方法包括在一个或多个刺激因子的存在下培养根据权利要求18、19或21的成人多潜能细胞群；和将上述培养群置于成人多潜能细胞向特定组织类型进行分化的偏好条件下。23、根据权利要求21的方法，该组织类型是选自心肌、血管组织、骨组织、神经组织、平滑肌或内皮组织。24、根据权利要求22或23的方法，其中该刺激因子选自la，25-二羟基维生素D3(1，25D)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子a(TNF-a)、白介素-1P(IL-1P)或基质细胞衍生因子la(SDF-1a)。25、包含根据权利要求18或19富集的成人多潜能细胞群和/或权利要求20扩增的细胞群的组合物。26、根据权利要求24的组合物进一步包含刺激因子。27、根据权利要求26的组合物，其中该刺激因子选自1a，25-二羟基维生素D3(1,25D)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子a(TNF-a)、白介素-10(IL-1P)或基质细胞衍生因子la(SDF-1a)。28、根据权利要求25到27中任何一项的组合物，其更进一步包含胶原纤维蛋白胶。29、产生或修复受试者的组织的方法，该方法包含向受试者给药根据权利要求18到21中任何一项的富集的或扩增的细胞群。30、产生或修复受试者的组织的方法，该方法包括向受试者给药根据权利要求25到28中任何一项的组合物。31、根据权利要求29或30的方法，其中该组织是骨或软骨组织。32、根据权利要求29或31中任何一项的方法，其中该组织是用于锚定修复术装置。33、根据权利要求29或30的方法，其中该组织是心脏组织。34、根据权利要求29或30的方法，其中该受试者已经或将要实施骨髓移植。35、根据权利要求29到34中任何一项的方法，其中至少一些细胞是遗传学修饰的细胞。36、根据权利要求18到21中任何一项富集的或扩增的细胞群用来制造用于在受试者中产生或修复组织的药物中的用途。37、根据权利要求25到28中任何一项的组合物来制造用于在受试者中产生或修复组织的药物中的用途。38、通过根据权利要求1到16中任何一项的方法获得的分离的细胞或其子代细胞，其中该细胞是遗传学修饰的。39、根据权利要求38分离的细胞，其中该成人多潜能细胞或其子代细胞是遗传学修饰的以表达异源的蛋白。40、根据权利要求39分离的细胞，其中该异源蛋白选自la，25-二羟基维生素D3(1，25D)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子a(TNF-a)、白介素-10(IL-ie)、基质细胞衍生因子la(SDF-1a)、BMP-2、BMP画3、BMP-4、BMP-6或BMP-7。41、STRO-3杂交瘤细胞系，于2005年12月19日根据布达佩斯条约的规定保藏于ATCC，编号为PTA-7282。42、STRO-3抗体，其由于2005年12月19日根据布达佩斯条约的规定保藏于ATCC，编号为PTA-7282的杂交瘤细胞产生。43、分离的抗体，其结合多潜能细胞上和STRO-3抗体同样的表位，该STRO-3抗体是由于2005年12月19日根据布达佩斯条约的规定保藏于ATCC，编号为PTA-7282的杂交瘤细胞产生的。44、包含根据权利要求42或43的抗体的组合物。45、包含根据权利要求18或19富集的细胞群、根据权利要求20扩增的细胞群、根据权利要求25到28中任何一项或44的组合物、根据权利要求38到40中任何一项分离的细胞、根据权利要求41的杂交瘤和/或根据权利要求42或43的抗体的试剂盒。全文摘要本发明涉及组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP)作为标记用于鉴定和/或分离成人多潜能细胞的用途。本发明还涉及通过本发明的方法富集的细胞群以及这些细胞的治疗用途。文档编号C12Q1/42GK101248171SQ200680020870公开日2008年8月20日申请日期2006年4月12日优先权日2005年4月12日发明者A·C·W·赞内蒂诺,P·J·西蒙斯,S·格龙托斯申请人:成血管细胞系统公司