专利名称：甘蔗条纹花叶病毒检测用引物及其检测方法
技术领域：
本发明涉及生物检测技术，具体的说涉及甘蔗条纹花叶病毒检测用引物及其检测方法。
背景技术：
甘蔗条纹花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus，SCSMV)是从甘蔗花叶病植株上鉴定出的一种新型病原，属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae) —个新属——禾本科病毒属(Poacevirus)，是引起甘蔗花叶病的一种重要致病病原。目前世界上仅有印度、巴基斯坦、美国、泰国、斯里兰卡、越南以及印度尼西亚有过报道。我国国内对该病毒研究不是很多，仅有在广东某甘蔗基地内从引自印度的甘蔗种质资源上发现该病毒的报道。但是近年来，由于蔗糖产业科技和生产的发展与需求，我国各蔗区相继从境外和国内其它蔗区频繁引入了大批甘蔗品种及种质材料，在对甘蔗进行品种改良和种质创新的同时，也增加了像甘蔗条纹花叶病毒类危险性病害扩散的风险。如果对引种的甘蔗种质资源未检疫或检疫不到位，极有可能造成该病毒在我国蔗区内扩散，给我国蔗糖产业的可持续发展造成潜在威胁，因此建立该病毒的快速检测方法是阻截此危险性病毒扩散的重要措施。
发明内容
本发明的目的在于提供一种甘蔗条纹花叶病毒检测用引物及其检测方法，用于甘蔗条纹花叶病毒RT-PCR检测的引物序列及其检测方法能够满足需要。本发明通过分析已报道的甘蔗条纹花叶病毒的CP基因保守区序列，设计引物。所述的引物对由正向引物和反向引物组成，其核苷酸序列如序列表SCSMV-F&SCSMV-R所示。 正向引物的核苷酸序列为SCSMV-F 5 ‘ -ACAAGGAACGCAGCCACCT-3 ‘，反向引物的核苷酸序列为SCSMV-R :5' -ACTAAGCGGTCAGGCAAC-3 ‘，目的条带大小为 938bp。本发明还进一步给出了应用上述引物的RT-PCR检测方法，该方法以样品总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，转录合成cDNA，反应结束后根据特异性扩增的938bp DNA片段的位置判定结果。RT-PCR扩增过程如下RT的反应体系为10ul，即在0. 2ml的PCR反应管里加入2. 5ul的灭菌双蒸水、 2. Oul 5 X 反转录酶缓冲液、1. Oul DNTP、反向引物 SCSMV-R 0. 5ul (20um/ul)、0. 5ul RNA酶抑制剂、0. 5ul反转录酶、3ul总RNA，混勻。反应程序为25°C 10min、42°C 60min、98°C 5min, 结束后获得反转录产物cDNA。PCR反应体系25ul，即在0. 2ml的PCR反应管里加入9. 5ul的灭菌双蒸水，2. Oul cDNA、正向引物 SCSMV-F 和反向引物 SCSMV-R 各 0. 5ul (20um/ul)、12. 5ul 的 2 X PCR Taq mix ；反应程序为 94°C 5min ；94°C 30s, 50°C 30s, 72°C lmin，35 个循环；72°C延伸 lOmin。进一步，还可以将上述本发明引物及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。本发明根据甘蔗条纹花叶病毒的CP基因保守区序列设计引物，用于甘蔗条纹花叶病毒的RT-PCR检测，通过对反应体系和反应退火温度的优化，建立了甘蔗条纹花叶病毒的RT-PCR检测方法，反应结束后即可根据特异性扩增片段的位置判定样品中是否含有甘蔗条纹花叶病毒。本发明的检测方法，引物特异性好，检测方法快速简单、可用于大量甘蔗样品的检测，为甘蔗引种检疫和甘蔗条纹花叶病毒在我国蔗区的传播动态监测提供了保证。
图1是甘蔗条纹花叶病的RT-PCR检测结果，其中M为D2000plus DNA ladder, 1 为SCSMV阳性对照，2为SCMV阳性对照、3为SrMV阳性对照，4为健康植株。图2是本发明检测大量样品的试验结果，其中M为D2000plus DNA ladder, 1-8为田间采集样品，9为SCSMV阳性对照，10为健康植株。
具体实施例方式下面实施例子用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。实施例1引物的设计和合成根据GenBank数据库中已报道的甘蔗条纹花叶病毒基因组序列和外壳蛋白基因的保守序列(登录号Y17738)，采用I^emier 5. 0设计引物，引物序列为SCSMV-F (正向)5 ‘ -ACAAGGAACGCAGCCACCT-3 ‘SCSMV-R (反向)5 ‘ -ACTAAGCGGTCAGGCAAC—3 ‘实施例2总RNA的提取1)取新鲜叶片0. Ig+液氮研磨成粉状，加入到2. Oml离心管中；2)加入IOOOul TRIZOL试剂，轻轻混勻，室温放置5min ；3)加入200ul氯仿，剧烈震荡15秒，室温放置5min，4°C 12000rpm离心15min ；4)取上清液到1. 5ml离心管中，加入600ul异丙醇，混勻后(轻混)，室温放置 IOmin, 4°C 12000rpm 离心 lOmin，沉淀 RNA ；5)弃上清，加入IOOOul 75 %乙醇洗涤RNA沉淀1次，洗涤时充分悬浮RNA沉淀 (用手指轻弹管底让沉淀漂起来)，SOOOrpm离心5min ；6)弃上清后，沉淀于空气中自然干燥6min，用30ul ddH20溶解RNA沉淀，于55°C 溶解(水浴中)lOmin，-20°C冰箱保存备用。实施例3RT-PCR扩增方法的建立以总RNA为模板，进行RT-PCR反应。IOul反应体系进行反转录反应，即在0. 2ml 的PCR反应管里加入2. 5ul的灭菌双蒸水、2. Oul 5 X反转录酶缓冲液、1. Oul DNTP、0· 5ul 反向引物SCSMV-R(20um/ul)、0. 5ul RNA酶抑制剂、0. 5ul反转录酶、3ul总RNA，混勻，放入 PCR仪，反应程序为25°C 10min、42°C 60min、98°C 5min，结束后获得反转录产物cDNA。PCR反应体系25ul，即在0. 2ml的PCR反应管里加入9. 5ul的灭菌双蒸水，2. Oul cDNA、0. 5ul 正向引物 SCSMV-F (20um/ul)、0. 5ul 反向引物 SCSMV-R (20um/ul)、12. 5ul 的 2 XPCR Taq mix ；反应程序为 94°C 5min ；94°C 30s, 50°C 30s, 72°C lmin，35 个循环；72°C延伸 IOmin0实施例4SCSMV RT-PCR的特异性确定
以SCSMV阳性对照植株的甘蔗叶片总RNA为模板，以健康叶片和引起甘蔗花叶病的另外两种病原甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus，SCMV)和高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus, SrMV)阳性植株叶片总RNA模板作为对照，通过RT-PCR进行扩增，反应结束后根据特异性扩增的938bp DNA片段判定结果。试验结果以SCSMV阳性对照的甘蔗叶片总RNA，通过RT-PCR检测可观察到93^ρ的扩增片段，而健康叶片、SCMV和SrMV则均没有特异性扩增条带的出现，说明建立的RT-PCR对 SCSMV具有良好的特异性，可将SCSMV与引起甘蔗花叶病的另外两种病原SCMV和SrMV区别开来，结果见图1。实施例5SCSMV大田样品的检测共10份样品，其中包括8份从田间随机采集的花叶病带症样品和1个健康对照、1 个SCSMV阳性对照样品。对上述样品用所建立的RT-PCR扩增方法检测，检测结果如图2，8 个大田样品均检测出带SCSMV。本发明的检测方法，引物特异性好，检测方法快速简单、可用于大量甘蔗样品的检测，为甘蔗引种检疫和甘蔗条纹花叶病毒在我国蔗区的传播动态监测提供了保证。核苷酸序列表<110>云南省农业科学院甘蔗研究所<120>甘蔗条纹花叶病毒检测用引物及其检测方法。<160>2<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列(正向引物)<400>1ACAAGGAACGCAGCCACCT 19<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列(反向引物)<400>2ACTAAGCGGTCAGGCAAC 18
权利要求
1.一种甘蔗条纹花叶病毒检测用引物，其特征在于由正向引物和反向引物组成，正向引物的核苷酸序列为SCSMV-F:5' - ACAAGGAACGCAGCCACCT-3‘，反向引物的核苷酸序列为SCSMV-R 5' -ACTAAGCGGTCAGGCAAC-3‘，目的条带大小为 938bp。
2.一种采用权利要求1所述甘蔗条纹花叶病毒检测用引物的检测方法，其特征在于包括如下步骤(1)以样品总RNA为模板，利用权利要求1所述的SCSMV-R引物进行进行RT-PCR扩增， 反转录合成cDNA ；(2)以合成的cDNA为模板，利用上述SCSMV-F和SCSMV-R引物对进行PCR扩增，反应结束后根据特异性扩增DNA片段的位置判定结果。
3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于RT-PCR反应中PCR扩增的退火温度为 50°C，循环数为35次。
4.一种如权利要求1所述甘蔗条纹花叶病毒检测用引物的试剂盒。
全文摘要
本发明提供了一种甘蔗条纹花叶病毒检测用引物及其检测方法，所述引物的核苷酸序列如序列表SCSMV-F＆SCSMV-R所示。本发明还进一步提供了检测甘蔗条纹花叶病毒的方法，该方法以样品总RNA为模板，利用上述引物进行反转录PCR(RT-PCR)扩增，反应结束后根据特异性扩增片段的位置判定结果。本发明的引物特异性好，检测方法快速简单、可用于大量甘蔗样品的检测，为甘蔗引种检疫和甘蔗条纹花叶病毒在我国蔗区的传播动态监测提供了保证。
文档编号C12Q1/68GK102363819SQ20111034961
公开日2012年2月29日 申请日期2011年11月8日 优先权日2011年11月8日
发明者尹兴祥, 尹炯, 李文凤, 王晓燕, 罗志明, 黄应昆 申请人:云南省农业科学院甘蔗研究所