专利名称：辅助鉴定啮书虱的特异引物对及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种辅助鉴定啮书虱的特异引物对及其应用。
背景技术：
书虱(booklice)又名纸虱、米虱，隶属于啮目(Psocoptera)、书虱科 (Liposcelidiae)、书虱属(Liposcelis)，是世界储粮保护中的常见害虫。书虱属害虫个体微小(成虫体长约1mm)，活动能力强，可随储粮调运及人为携带远距离传播，极易建立种群，抗性强而防治难度大，严重危害储粮安全。随着国际贸易及储粮调运的日益频繁，储粮害虫传播扩散风险日益增大。啮书虱L. corrodens (Heymons)在国外广泛分布，而在我国尚未见发生报道，存在较大的入侵风险。书虱属(Liposcelis)包括如下种啮书虱(L. corrodens)、无色书虱(L. decolor)、小眼书虱(L. paeta)、嗜卷书虱(L. bostrychophila)、嗜虫书虱 (L. entomophila)、暗褐书風(L. brunnea)、虚伪书風(L. mendax)、三色书風(L. tricolor)、 红书虱(L. rufa)和皮氏书虱(L. pearmani)等。传统的书虱种类鉴定多以成虫形态特征为依据，由于书虱个体微小，形态鉴定对专业技术要求很高，存在耗时长且难度大的缺陷。尤其对于非成虫发育阶段的个体(如卵、 幼虫和蛹)，形态鉴定难以做到。
发明内容
本发明的目的是提供一种辅助鉴定啮书虱的特异引物对及其应用。本发明提供的辅助鉴定啮书虱(L. corrodens)的特异引物对，由序列表的序列1 所示DNA(上游引物)和序列表的序列2所示DNA(下游引物)组成。所述特异引物对可用于辅助鉴定啮书虱。所述特异引物对可用于制备辅助鉴定啮书虱的试剂盒。本发明还保护一种辅助鉴定啮书虱的试剂盒，包括所述特异引物对。本发明还保护一种辅助鉴定啮书虱的方法，包括如下步骤以待测书虱的基因组 DNA (或所述基因组DNA的稀释液)为模板，用所述特异引物对进行PCR扩增，如果得到PCR 扩增产物待测书虱为候选的啮书虱，如果没有得到PCR扩增产物待测书虱为候选的非啮书
Ml ο所述PCR扩增产物的大小具体可为24!3bp。所述PCR扩增的反应体系具体可为Q6ul) :2XTaq PCR Master Mix l!3ul，所述上游引物(IOuM) 0. 5ul，所述下游引物(IOuM) 0. 5ul，所述基因组DNA 2ul，ddH2010ul。所述PCR扩增的反应体系具体还可为:2XTaq PCR Master Mix l!3ul，所述上游引物(IOuM) 0. 5ul，所述下游引物(IOuM) 0. 5ul，所述基因组DNA的稀释液Iul，(MH2O llul。所述PCR扩增的反应参数具体可为95°C预变性:3min ；95°C变性30sec、50°C退火40sec、72°C延伸 Imin, 32 个循环；72°C 8min。所述待测书虱可为书虱属书虱，如啮书虱(L. corrodens)、无色书虱(L. decolor)、 小眼书虱(L. paeta)、嗜卷书虱(L. bostrychophila)、嗜虫书虱(L. entomophila)、暗褐书虱(L. brunnea)、虚伪书虱(L. mendax)、三色书虱(L. tricolor)、红书虱(L. rufa)或皮氏书 S, (L. pearmani)。本发明还保护一种从书虱中辅助鉴别啮书虱的方法，包括如下步骤以待测书虱的基因组DNA为模板，用所述特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物的待测书虱为候选的啮书虱。所述PCR扩增产物的大小具体可为24!3bp。所述PCR扩增的反应体系具体可为Q6ul) :2XTaq PCR Master Mix l!3ul，所述上游引物(IOuM) 0. 5ul，所述下游引物(IOuM) 0. 5ul，所述基因组DNA 2ul，ddH2010ul。所述PCR扩增的反应体系具体还可为:2XTaq PCR Master Mix l!3ul，所述上游引物(IOuM) 0. 5ul，所述下游引物(IOuM) 0. 5ul，所述基因组DNA的稀释液Iul，(MH2O llul。所述PCR扩增的反应参数具体可为95°C预变性:3min ；95°C变性30sec、50°C退火 40sec、72°C延伸 Imin, 32 个循环；72°C 8min。所述待测书虱可为书虱属书虱，如啮书虱(L. corrodens)、无色书虱(L. decolor)、 小眼书虱(L. paeta)、嗜卷书虱(L. bostrychophila)、嗜虫书虱(L. entomophila)、暗褐书虱(L. brunnea)、虚伪书虱(L. mendax)、三色书虱(L. tricolor)、红书虱(L. rufa)或皮氏书 S, (L. pearmani)。应用本发明提供的特异引物对辅助鉴定啮书虱具有如下优点(1)快速、准确和高效引物对特异针对啮书虱的基因组DNA中的片段，检测灵敏度高、耗时短、且可以实现高通量检测；(2)操作简便，经济易行传统形态鉴定方法一般需要玻片标本制作技能，对样品完整性等要求高，而特异引物分子鉴定方法可标准化，操作简便且所需费用较低，便于无专业分类学知识背景的工作人员操作与运用。应用本发明提供的特异引物对可以从分子水平辅助鉴定啮书虱，不受标本个体发育状态及样品完整性的影响，具有高效、便捷、准确的优点。本发明解决了长期以来困扰储粮保护和口岸检疫部门的书虱种类鉴定问题。本发明设计了用于鉴别啮书虱的特异引物对，并提供了一套鉴别啮书虱的方法，显著提高了啮书虱鉴定的效率和准确性，具有省时、 高效、直观等特点。该发明可在粮食储藏部门和检疫部门广泛应用。
图1为本发明的特异引物对书虱属各种书虱进行PCR鉴定的凝胶电泳图谱。图2为应用本发明的特异引物对检测啮书虱的灵敏度的凝胶电泳图谱。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中采用如下样本样本1 采集自丹麦的啮书虱(L. corrodens)；样本2 采集自捷克的啮书虱(L. corrodens)；样本3 采集自美国的啮书虱(L. corrodens)；样本4 采集自葡萄牙的啮书虱(L. corrodens)；样本5 采集自中国的无色书虱(L. decolor)；样本6 采集自捷克的无色书虱(L. decolor)；样本7 采集自美国的无色书虱(L. decolor)；样本8 采集自中国的小眼书虱(L. paeta)；样本9 采集自捷克的小眼书虱(L. paeta)；样本10 采集自美国的小眼书虱(L. paeta)；样本11 采集自中国的嗜卷书虱(L. bostrychophila)；样本12 采集自捷克的嗜卷书虱(L. bostrychophila)；样本13 采集自美国的嗜卷书虱(L. bostrychophila)；样本14 采集自中国的嗜虫书虱(L. entomophila)；样本15 采集自捷克的嗜虫书虱(L. entomophila)；样本16 采集自美国的嗜虫书虱(L. entomophila)；样本17 采集自捷克的暗褐书虱(L. brunnea)；样本18 采集自美国的暗褐书虱(L. brunnea)；样本19 采集自中国的虚伪书虱(L. mendax)；
样本20 采集自中国的三色书虱(L. tricolor)；样本21 采集自美国的红书虱(L. rufa)；样本22 采集自美国的皮氏书虱(L. pearmani)。啮书虱、无色书虱、小眼书虱、嗜卷书虱、嗜虫书虱、暗褐书虱和虚伪书虱，公众均可以从中国农业大学获得；提及以上7种书虱的参考文献为赵朔，李志红，秦萌.书虱及其分子生物学研究进展.植物保护，2009，35 (6) :17-21.。三色书虱，公众可以从中国农业大学获得；提及三色书虱的参考文献为董鹏，王进军.三色书虱体内共生微生物Wolbachia的wsp基因的分子检测.动物学研究，2004， 25(5) :456-459.。红书虱和皮氏书虱公众均可以从中国农业大学获得；提及红书虱和皮氏书虱的参考文献为李法圣.中国啮目志.北京科学出版社，2002:91-94.。实施例1、特异引物对的设计在书虱属的十种常见储粮书虱线粒体细胞色素氧化酶亚基I条形码(mtDNA COI barcode)区段的基础上，设计合成可鉴定啮书虱的特异引物对上游引物(序列表的序列1) :5，-GAACAATAATCGGGAGAGGA-3，；Tm = 58. 0°C,GC%=45. 0 ；下游引物(序列表的序列2) 5‘-GTAGAAGAATTGCTGTAATAAG-3‘ ；Tm = 52. 8°C,GC% =31. 8。实施例2、应用特异引物对鉴定啮书虱分别将22个样本进行如下实验1、提取单头书虱的基因组DNA。2、以步骤1的基因组DNA为模板(用水作为阴性对照)，用实施例1设计的特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR 反应体系:2XTaq PCR Master Mix l!3ul，上游引物(IOuM) 0. 5ul，下游引物(IOuM) 0. 5ul，基因组 DNA 2ul, ddH20 10ul。PCR 反应参数95 °C 预变性 3min ；95°C 变性 30sec、50°C 退火 40sec、72°C 延伸 lmin，32 个循环；72°C 8min ；4°C保存。3、将4ul步骤2的PCR扩增产物进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭(EB)染色， 在凝胶系统中观察并成像分析。各个样本的电泳结果见图1。图1中，M :DNA相对分子量标准(D2000)；泳道1至泳道22依次为样本1至样本22，泳道23为阴性对照。采集自不同国家的啮书虱(样本1 至样本4)均显示一条250bp左右的特异条带，而其他样本均不显示任何条带。4、分别回收PCR扩增产物并进行测序，样本1至样本4的PCR扩增产物均为M!3bp。 样本1的测序结果见序列表的序列3，样本2的测序结果见序列表的序列4，样本3的测序结果见序列表的序列5，样本4的测序结果见序列表的序列6。实施例3、特异引物对的灵敏度检测将样本1进行如下实验1、提取单头书虱的基因组DNA。2、检测基因组DNA的浓度，将其用TE缓冲液进行系列稀释，得到8种稀释液；8种稀释液中的基因组 DNA 浓度分别为0. lng/ul、lng/ul、5ng/ul、10ng/ul、25ng/ul、50ng/ ul、75ng/ul和lOOng/ul，依次为稀释液1至稀释液8。3、分别以每种稀释液为模板，用实施例1设计的特异引物对进行PCR扩增，得到 PCR扩增产物。PCR 反应体系:2XTaq PCR Master Mix l!3ul，上游引物(IOuM) 0. 5ul，下游引物(IOuM)0. 5ul，稀释液(含基因组 DNA)lul，ddH20 Ilul0PCR 反应参数95°C 预变性 3min ；95°C 变性 30sec、50°C 退火 40sec、72°C 延伸 Imin, 32 个循环；72°C 8min ；4°C保存。4、将4ul步骤3的PCR扩增产物进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭(EB)染色， 在凝胶系统中观察并成像分析。各个稀释液的PCR扩增产物的电泳结果见图2。图2中，M =DNA相对分子量标准 (D2000)；泳道1至泳道8依次为稀释液1至稀释液8。结果显示，反应体系中基因组DNA的浓度为lng/ul以上均能扩增出目的条带，而且电泳图上目的条带随基因组DNA浓度的递增而增强。
权利要求
1.辅助鉴定啮书虱的特异引物对，由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示 DNA组成。
2.权利要求1所述特异引物对在辅助鉴定啮书虱中的应用。
3.权利要求1所述特异引物对在制备辅助鉴定啮书虱的试剂盒中的应用。
4.一种辅助鉴定啮书虱的试剂盒，包括权利要求1所述特异引物对。
5.一种辅助鉴定啮书虱的方法，包括如下步骤以待测书虱的基因组DNA为模板，用权利要求1所述特异引物对进行PCR扩增，如果得到PCR扩增产物待测书虱为候选的啮书虱， 如果没有得到PCR扩增产物待测书虱为候选的非啮书虱。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述PCR扩增产物的大小为M!3bp。
7.一种从书虱中辅助鉴别啮书虱的方法，包括如下步骤以待测书虱的基因组DNA为模板，用权利要求1所述特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物的待测书虱为候选的啮书虱。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述PCR扩增产物的大小为M!3bp。
全文摘要
本发明公开了一种辅助鉴定啮书虱的特异引物对及其应用。本发明提供的特异引物对，由序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA组成。应用本发明的特异引物对可以从分子水平辅助鉴定啮书虱，不受标本个体发育状态及样品完整性的影响，具有高效、便捷、准确的优点。本发明解决了长期以来困扰储粮保护和口岸检疫部门的书虱种类鉴定问题。本发明可在粮食储藏部门和检疫部门广泛应用。
文档编号C12Q1/68GK102367482SQ201110349328
公开日2012年3月7日 申请日期2011年11月7日 优先权日2011年11月7日
发明者李志红, 杨倩倩 申请人:中国农业大学