专利名称：基因工程重组杆状病毒杀虫剂的制作方法
技术领域：
本发明公开了一种基因工程重组杆状病毒杀虫剂，它是利用当代先进的基因工程技术创造的一种全新的生物杀虫剂，它属于生物工程技术领域，它的国际专利分类号为C12。
目前，由于化学农药污染环境，破坏生态平衡，且害虫抗药性的增强也使其用量不断增大，因此，对害虫的生物防治倍受重视。杆状病毒作为生物杀虫剂具有严格宿主专一性，不危害人畜、天敌昆虫、爬行动物、鸟类及植物，且具有持续性和流行性；已有少数野生型杆状病毒商品化出售(Samon，1986)，但其对大田作物防治效果并不理想，主要障碍是病毒毒力不高，杀虫速度慢。为使杆状病毒成为理想的生物杀虫剂，各国研究者利用基因工程手段对其基因组进行了多方改造，这些研究大多处在实验室阶段。整合在杆状病毒基因组中的外源基因包括昆虫利尿激素基因(Maeda等，1989，Biochem.Biophy.Res.Comm.，1651177)，昆虫青春激素酯酶基因(Hammock等，1990，Nature，344451)，苏芸金杆菌(Bt)内毒素蛋白基因(Merrywheather等1990，J.G.virolo-gy，711535；Martens等1990，Appll.Environ.Microbiol.562764，Pang等，1992，J.G.Virology，7389；Vlak等，1993)，这些基因在宿主体内得到表达，但由于各种原因杀虫效果并不理想。一些人开始用蝎或螨的神经毒素基因构建重组病毒(Tomalski等，1991，Nature，35282，Stewart等，1991，Nature，35285；Cory等，1994，Nature，370138)，取得了不同程度的较好效果。为此，1994年Cory等进行了28m2的半田间试验，因为他们将重组病毒施到田里后，分别于第2，7，11，16天将害虫提回在室内隔离人工饲养，直到第11天才看到害虫死亡，没有实用价值。目前，我国国内除我们报导的两种重组杆状病毒杀虫剂vABBt101(齐义鹏等，科学通报1993，1994)和vAcPhBtT(王福山等，1995科学通报4020)外，还未见其他人关于重组杆状病毒杀虫剂的报导。
本发明的目的是为构建广谱、高效、安全且具有实际应用价值的基因工程杆状病毒杀虫剂。
为实现本发明目的所采取的技术措施是我们以苜蓿尺蠖核型多角体病毒(AcNPV)为对象，首先通过一系列基因工程操作手段，得到一种转移载体，该转移载体克隆有AcNPV的多角体基因(ocu)，在此基因5’端非调控区插入由AcNPV的P10基因启动子和3’端部分截短的苏芸金杆菌δ-内毒素CryIA(b)基因组成的表达盒，将此转移载体与多角体基因缺失(ocu-)的AcNPVDNA共转染昆虫sf9细胞，通过体内同源重组将上述表达盒整合到AcNPVocu基因5’调控区上游，经单细胞克隆法筛选得到重组病毒vACPhBtT。而后，我们另构建了另一种转移载体，该载体克隆有AcNPV的多角体外膜(PE)基因，在PE基因中插入有早期基因(IE1)启动子驱动的新霉素抗性基因(neor)，将此转移载体与重组病毒vAcPhBtT DNA共转染昆虫sf9细胞，通过体内第二次同源重组将IE1/neor表达盒整合到vAcPhBtT的PE基因中，经G418富集筛选法筛选出重组病毒vAcPhBtTPE-，以上即是我们得到的两种主要的基因工程重组杆状病毒杀虫剂的毒种。
本发明的重组杆状病毒杀虫剂，其生产同野生型杆状病毒的生产一样，可通过感染昆虫而在昆虫体内得以大量扩增，其生产工艺如下将重组病毒VAcPhBtTPE接种于昆虫组培养细胞中，收集重组病毒，再将该病毒感染昆虫来生产重组病毒感染的病死虫尸，病虫尸加入无菌水经匀浆、离心、计数，按基因工程重组杆状病毒杀虫剂的有效含量加入遮光剂、乳化剂等，分装得到的产品，贴产品标签。
以银蛾夜蛾计，每头3龄幼虫受染后可产生10亿个多角体，通过大规模养虫即可大规模生产。
与已有技术相比较，本发明已达到的技术效果本发明利用基因工程手段所得到的重组杆状病毒和国内外研究工作比较有如下多重特性，具有显著的创新性，是国内外首次报导1.保持了ocu基因完整性，能产生多角体，这是重组病毒能通过昆虫口服感染并在田间保持稳定性的必需条件。
2.具有完整的P10基因P10蛋白能启动细胞裂解和多角体从细胞和组织中释放，且对病毒复制和保持多角体结构有重要作用。
3.克隆有3’端截短的苏芸金杆菌δ内毒素CryIA(b)基因，能直接表达CryIA(b)晶体蛋白的可溶性毒素蛋白(80KDa)，而全长的CryIA(b)晶体蛋白是不具毒性的原毒素，需在昆虫中肠通过降解后才能产生有毒性的毒蛋白，我们的重组病毒能直接表达可溶性毒蛋白，提高了杀虫效力和杀虫速度。
4.多角体外膜缺失重组病毒vAcPhBtTPE-的多角体外膜(PE)基因由于插入失活，使病毒粒子不能形成多角体外膜，从而使病毒粒子的释放速度加快，因而也可提高其杀虫速度。
5.具有筛选标记在重组病毒vAcPhBtTPE-的基因组中由于新霉素抗性基因的插入和表达，使此重组病毒感染的细胞在G418压力下得以存活，而无neo基因的病毒被G418杀死，使重组病毒得以富集，十分简单和快速地得到筛选和纯化。
国外虽有一些重组杆状病毒杀虫剂构建成功的报导，但一般都有不足之处，有的是ocu-，有的是P10-，有的是全长cry基因，本发明构建的重组病毒vAcPhBtT具有ocu+、P10+和截短cryIA(b)，巧妙地既利用了非必需超表达P10基因的启动子，表达出80KDa的可溶性毒蛋白，又保持了原ocu基因和P10基因的完整性，这是国外未报道的。特别是在此基础上，经过第二次共转染和同源重组，在亲本重组病毒vAcPhBtT的PE基因中插入IE1/neo表达盒，使PE基因失活，造成囊膜表型缺失，同时获得筛选标记基因neo，根据湖北省情报所的查新报告，我们构建的有多重表型的重组病毒vAcPhBtTPE-是国内外的首创，具有国际领先水平。
国外重组杆状病毒杀虫剂除用神经毒基因的有一定效果外，其余重组病毒均不能提高杀虫效率和速度，更未发现在田间施用。
本发明的这两种主要重组杆状病毒有十分明显的效果。室内毒力测定结果，vAcPhBtT72小时杀死小菜蛾3龄幼虫75-80％；对4龄甜菜夜蛾幼虫的LD50，72小时vAcPhBtT为424PIB/cm2，vAcPhBtTPE-为360PIB/cm2，比新本野生型病毒(LD50 3289PIB/cm2)低近十倍(即毒力提高10倍)。
田间应用效果我们首次于1995年8月在汉阳农村1亩蔬菜地施用重组病毒防治害虫，蔬菜为花菜和豆角，有甜菜夜蛾、小菜蛾和菜青虫等发生，结果证明对这三种害虫都有显著的效果，以2～3龄甜菜夜蛾幼虫计，vAcPhBtT杀虫率为45％(48小时)、80.4％(72小时)，vAcPhBtTPE-为66.9％(48小时)，81.1％(72小时)；化学农药(coscack)为91.1％(48小时和72小时)，说明重组病毒对害虫的效率比亲本病毒[29.8％(48小时)，32.6％(72小时)]提高一倍多，和化学农药几乎接近。9月我们又于汉阳江堤乡的萝卜地对小菜蛾幼虫进行了第二次田间试验，取得了比第一次更好的结果。重组病毒vAcPhBtTPE-杀虫率为56.7％(24小时)，81.8％(48小时)，远优于亲本病毒，超过了化学农药(氯氢菊酯)的效果(24和48小时分别为23％和22.8％)。在生物农药中如此快速的控制害虫危害，在整个学术界和农业实践中还是第一次。
基因工程杆状病毒杀虫剂，为有别于化学农药和天然的生物农药可称之为基因农药，它具有广谱、安全，对人畜无毒害，高效、快速、不污染环境，保持生态平衡等优点，可以代替或部分代替化学农药，将引起传统的农药行业的根本革新，产生巨大的社会和经济效益。
权利要求
1.一种利用基因工程技术的基因工程重组杆状病毒杀虫剂，其特征在于由苜蓿尺蠖核型多角体病毒(AcNPV)经基因工程而得到一种转移载体，在该转移载体克隆有AcNPV的多角体基因(ocu)，在ocu基因5’端非调控区插入由AcNPV的P10基因启动子和3’端截短的苏芸金杆菌δ内毒素CryIA(b)基因组成的表达盒，再将此转移载体与多角体基因缺失(ocu-)的AcNPV DNA共转染昆虫Sf9细胞，通过体内同源重组将上述表达盒整合到AcNPV ocu基因5’调控区上游，经单细胞克隆法筛选得到重组病毒vAcPhBtT；
2.一种利用基因工程技术的基因工程重组杆状病毒杀虫剂，其特征在于经基因工程技术得到一种转移载体，在该载体上克隆有AcNPV的多角体外膜(PE)基因，在PE基因中再插入早期基因(IE1)启动子驱动的新霉素抗性基因(neor)，再将此转移载与重组病毒vAcPhBtT DNA共转染昆虫Sf9细胞，通过体内同源重组将IE1/neor表达盒整合到vAcPhBtT的基因中，经G418富集筛选法筛选出重组的杆状病毒vAcPhBtTPE-；
3.按权利要求1和2所述的基因工程重组杆状病毒杀虫剂，其特征在于本发明的生产工艺为将重组病毒VAcPhBtTPE接种于昆虫组培养细胞中，收集重组病毒，再将该病毒感染昆虫来生产重组病毒感染的病死虫尸，病虫尸加入无菌水经匀浆、离心、计数，按基因工程重组杆状病毒杀虫剂的有效含量加入遮光剂、乳化剂等，分装得到的产品，贴产品标签。
全文摘要
本发明公开了一种全新的基因工程杆状病毒杀虫剂，其主要内容是用基因工程手段对苜蓿尺蠖核型多角体病毒(AcNPV)基因组进行多方改造构建两类转移载体，并克隆毒素基因或报道基因的表达盒，与野生的或重组的AcNPV共转染昆虫细胞，通过体内同源重组将表达盒整合到病毒基因组中，筛选得到两种重组病毒，vAcPhBtT和vAcPhBtTPE
文档编号A01N63/00GK1147555SQ95117749
公开日1997年4月16日 申请日期1995年10月9日 优先权日1995年10月9日
发明者齐义鹏, 黄永秀, 王福山, 李凌云, 杜全胜, 李晓峰, 吕利群, 朱印, 周湘鄂, 杨芳 申请人:武汉大学