专利名称：一种不含基因组dna的总rna制备方法
技术领域：
本发明涉及一 种基于硅胶柱吸附、纯化不含基因组DNA的总RNA的方法。
背景技术：
随着生命科学发展进入到后基因组时代，RNA表达模式的研究受到越来越多的重视。许多有关RNA的检测方法，如逆转录PCR(RT-PCR)，Northern印迹法，基因芯片以及高通量RNA测序技术也日趋广泛应用。获得高质量、完整且不含其它杂质的总RNA，是应用RNA 研究技术的前提。当前，提取RNA有很多种方法，主要归为两类。一类是以酚抽提为基础的方法，另一类方法采用固相吸附。现在很多基于硅胶柱的RNA纯化方法都属于这一类。这类纯化方法采用胍盐或其他方法裂解细胞，然后利用在胍盐(硫氰酸胍、盐酸胍等)存在时核酸可与硅胶膜材料结合的性质，将加入胍盐的细胞裂解物转到含有硅胶膜的离心柱上， 通过离心使裂解物穿过硅胶膜，并使其中RNA结合在膜上；再使用含乙醇的洗涤液洗涤去除杂质；最后使用低盐溶液或蒸馏水从膜上洗脱纯化的RNA。但由于小分子量的RNA的在胍盐存在时与硅胶膜结合能力较差，这类方法对小分子量的RNA的回收效率较差。对于现有的方法还存在一个让研究者困扰的问题，即这些方法本身对于基因组 DNA的污染的去除能力较差。由于基因组DNA和RNA的理化性质非常类似，通常的RNA提取方法很难将它们彻底分离。一般的硅胶柱法得到的RNA每微克约含600皮克到200纳克的基因组DNA(Agilent公司技术文档)。然而，诸如RT-PCR以及基因芯片技术需要完全不含基因组DNA的RNA样品，以避免由于基因组DNA的可扩增性造成对结果的干扰。基因组 DNA的去除可以通过DNA酶I (DNase I)的消化完成。然而用于去除RNA中的DNA所需的 DNA酶要求非常高，需要完全不含RNA酶的DNA酶(RNase-free DNase)，否则将导致RNA样品的降解，因此价格非常昂贵。DNA酶消化还大大增加了 RNA提取的时间。并且在消化过程中，很难实时监测并控制DNA消化的程度。对于不同批次的样品，酶消化程度的不同可能会造成结果的不确定性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能在纯化步骤中直接去除基因组DNA，而无需DNA酶消化的总RNA制备方法。本发明解决技术问题的技术方案为一种不含基因组DNA的总RNA制备方法，包括以下步骤a)使用重悬液重悬需要提取的生物材料；b)加入与重悬液体积相同的十二烷基硫酸钠溶液，室温裂解3-5分钟，或65度裂解0. 5-1分钟；c)加入酸性醋酸钾溶液，离心，去除出现的沉淀，取上清，醋酸钾和十二烷基硫酸钠溶液摩尔比值为1 0.9-1.1;d)将C)步骤所得上清加入酸性醋酸钾溶液，硫氰酸胍贮液，使醋酸钾终浓度为lmol/L，硫氰酸胍为1. 5mol/L ；离心5-10分钟，取上清；e)将d)步骤所得的上清加入离心式硅胶柱，离心；收集穿过液，在穿过液中加入无水乙醇，混勻后，_20°C静置10-15分钟，离心10-15分钟，弃上清。f)将所得RNA沉淀用洗涤液洗涤两次，空气中10-15分钟晾干，然后加入适量超纯水溶解，即可。所述的重悬液为50士 lOmmol/L葡萄糖和10士2mmol/L乙二酸四乙酸钠(EDTA)的混合溶液。所述的 生物材料为细菌菌体。菌体与重悬液的质量/体积比为20_50mg/100 μ L ；所述的十二烷基硫酸钠溶液液的重量浓度为为2士0. 2%。所述的酸性醋酸钾溶液包含3士0. 2mol/L醋酸钾和6. 5士0. 4mol/L醋酸，pH为 5. 0 士 0. 05。所述的硫氰酸胍贮液浓度为4. 5士0. lmol/L。所述的洗涤液为70士5%乙醇，50士5mmol/L醋酸钠，pH 5. 2士0.05。由于单个离心式硅胶柱的吸附量不超过lOOyg，若上清中基因组DNA含量超过 IOOyg时，可以减少上样量或者采用多个离心式硅胶柱进行吸附。本发明采用十二烷基硫酸钠作为裂解试剂，裂解细胞后使用醋酸钾和十二烷基硫酸钠反应生成十二烷基硫酸钾(PDS)沉淀，同时共沉淀蛋白质以及大部分基因组DNA。然后利用在硫氰酸胍存在时核酸可与硅胶柱吸附，并且吸附的核酸可按分子量大小利用一定浓度醋酸钾解离的性质，在核酸中加入一定浓度的硫氰酸胍和酸性醋酸钾，采用硅胶柱分离总RNA和残留的基因组DNA。最后采用乙醇沉淀得到总RNA样品。本法与其他采用硅胶柱的纯化方法不同，RNA并不在吸附在硅胶膜上，而在穿过液中。其优点在于通过控制醋酸钾浓度，可使结合能力较差的小分子量的RNA和其他种类的 RNA均进入穿过液，从而能得到较好的总RNA产率；同时使基因组DNA被硅胶膜吸附，以分离RNA和基因组DNA。
图1为实施例1中所抽提大肠杆菌不同菌株的总RNA。M =DNA Marker D ；泳道1_4， 从左向右分别为大肠杆菌菌株AR1157, AB2463, AB2480, UNC1085。图2为实施例2中实时定量PCR检测本法提取RNA样品以及其他方法所得RNA样品中残留基因组DNA的含量。图3为实施例3中实时定量RT-PCR结果。模板从左向右分别为大肠杆菌菌株 ABl 157，AB2463, AB2480 和 UNC1085 的总 RNA。图4为实施例4中所抽提运动发酵单胞菌总RNA。M =DNA Marker III ；泳道1_2， 运动发酵单胞菌总RNA。泳道3-4，同法所提大肠杆菌总RNA。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作详细的说明。本实施例中酸性醋酸钾溶液为3mol/L醋酸钾和6. 5mol/L醋酸的混合溶液，pH为 5. 0。
洗涤液为体积浓度70%乙醇，50mmol/L醋酸钠的混合溶液，pH 5. 2。实施例1a)挑取平板划线培养大肠杆菌菌株ABl 157，AB2463, AB2480和UNC1085单菌落， 至LB液体培养基，37度过夜振荡培养。离心收获菌液。1. 5mL菌液离心所得菌体用100 μ L 浓度为50mmol/L葡萄糖和lOmmol/L乙二酸四乙酸钠(EDTA)的混合溶液进行重悬，通常 1. 5ml的菌液中，DNA含量为20-50 μ g。b)加入100 μ L重量浓度为2%十二烷基硫酸钠溶液液，室温裂解3分钟。c)加入2. 5 μ L酸性醋酸钾溶液。颠倒混勻，12000rpm离心10分钟去除出现的沉淀，取上清200 μ L。d)将c)步骤所得上清加入200 μ L酸性醋酸钾溶液，200 μ L浓度为4. 5mol/L硫氰酸胍贮液。12000rpm离心5分钟，取上清600 μ L。e)将d)步骤所得到上清加入离心式硅胶柱，SOOOrpm离心2分钟。收集穿过液， 在穿过液中加入1. 2ml的无水乙醇，混勻后，-20度静置10分钟，12000rpm离心10分钟，弃上清，得到RNA沉淀。f)将e)步骤所得RNA沉淀用洗涤液洗涤两次，空气中10分钟晾干。加入50 μ L 的超纯水溶解。此即所得总RNA样品。如图1 所示:ΑΒ1157, ΑΒ2463, ΑΒ2480 和 UNC1085 的三条带分别为 23S, 16S 和 5S 核蛋白体RNA，mRNA为中部弥散带。无可见基因组DNA条带。实施例2 基因组DNA残留检测将f)步中所得总RNA样品1微克，以及AGPC法(Single-st印method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction, P. Chomczynski and N. Sacchi, Anal Biochem 1987，162 :156-159.)和 SDS-酚法所得 RNA 样品，采用RNA酶处理后，采用基因组特异性引物扩增。根据与标准样品的域循环数的对比，可见本法所得样品残留基因组DNA最少，约每微克IO3拷贝(约4皮克)。采用APGC法和SDS-酚法所得样品残留基因组DNA分别约为每微克IO5拷贝和IO7拷贝(见图2)。实施例3 RNA扩增能力检测取f)步中所得总RNA样品1微克，作为模板，使用AMV逆转录酶进行逆转录。逆转录所得cDNA作为模板进行实时定量PCR反应。所用引物为大肠杆菌phr和pgi基因的特异性引物。其中Pgi基因为大肠杆菌管家基因，编码磷酸葡萄糖异构酶；Phr基因编码大肠杆菌DNA光修复酶。结果可见各菌株中phr基因表达量均低于pgi基因，大约在40% -50% 左右(见图3)，两基因表达量可见明显差异(ρ <0.01)，而在各菌株中的比值无明显差异 (P > 0. 05)。对照实验采用各菌株基因组DNA扩增，证明了不同基因的表达差异性，同时确认了本法所提总RNA的可扩增性。实施例4 a)在RM培养基(乙醇发酵重组大肠杆菌的构建——运动发酵单胞菌pdc基因在大肠杆菌中的高效表达，李学凤，潘亚平，张晶，钱名宇，杨秀山，2006，11 1120-1123)中于 30度振荡培养运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)。48小时后离心收获菌液。1.5mL菌液离心所得菌体用100 μ L浓度为50mol/L葡萄糖和lOmmol/L乙二酸四乙酸钠(EDTA)的
混合溶液进行重悬重悬。b)加入100 μ L裂解液，室温裂解3分钟。c)加入2. 5 μ L酸性醋酸钾溶液。颠倒混勻，12000rpm离心10分钟去除出现的沉淀，取上清200 μ 1。
d)将c)步骤所得上清加入200 μ L酸性醋酸钾溶液，200 μ L浓度为4. 5mol/L硫氰酸胍贮液。12000rpm离心5分钟，取上清600 μ L。e)将d)步骤所得到的上清加入离心式硅胶柱，SOOOrpm离心2分钟。收集穿过液， 穿过液中加入1. 2ml的无水乙醇，混勻后，-20度静置10分钟，12000rpm离心10分钟，弃上清，得到RNA沉淀。f)将e)步骤所得RNA沉淀用洗涤液洗涤两次，空气中10分钟晾干。加入50 μ L 的超纯水溶解。此即所得总RNA样品。其结果如图4所示，与大肠杆菌来源的的总RNA相比，运动发酵单胞菌的23S，16S 核蛋白体RNA位置有显著差异，且均无可见基因组DNA条带。
权利要求
1.一种不含基因组DNA的总RNA制备方法，包括以下步骤a)使用重悬液重悬需要提取的生物材料；b)加入与重悬液体积相同的十二烷基硫酸钠溶液，室温裂解3-5分钟，或65度裂解 0. 5-1分钟；c)加入酸性醋酸钾溶液，离心，去除出现的沉淀，取上清，醋酸钾和十二烷基硫酸钠溶液摩尔比值为1 0.9-1. 1 ；d)将c)步骤所得上清加入酸性醋酸钾溶液，硫氰酸胍贮液，使醋酸钾终浓度为lmol/ L，硫氰酸胍为1. 5mol/L ；离心5-10分钟，取上清；e)将d)步骤所得的上清加入离心式硅胶柱，离心；收集穿过液，在穿过液中加入无水乙醇，混勻后，_20°C静置10-15分钟，离心10-15分钟，弃上清。f)将所得RNA沉淀用洗涤液洗涤两次，空气中10-15分钟晾干，然后加入超纯水溶解， 即可。
2.根据权利要求1所述的、一种不含基因组DNA的总RNA制备方法，其特征在于所述的重悬液为50士 lOmmol/L葡萄糖和10士2mmol/L乙二酸四乙酸钠(EDTA)的混合溶液。
3.根据权利要求1所述的、一种不含基因组DNA的总RNA制备方法，其特征在于所述的生物材料为细菌菌体，菌体与重悬液的质量/体积比为20-50mg/100 μ L。
4.根据权利要求1所述的、一种不含基因组DNA的总RNA制备方法，其特征在于所述的十二烷基硫酸钠溶液液的重量浓度为2士0. 2%。
5.根据权利要求1所述的、一种不含基因组DNA的总RNA制备方法，其特征在于所述的酸性醋酸钾溶液包含3士0. 2mol/L醋酸钾和6. 5士0. 4mol/L醋酸，pH为5. 0士0. 05。
6.根据权利要求1所述的、一种不含基因组DNA的总RNA制备方法，其特征在于所述的硫氰酸胍贮液浓度为4. 5士0. lmol/L。
7.根据权利要求1所述的、一种不含基因组DNA的总RNA制备方法，其特征在于所述的洗涤液包含70士5%乙醇，50士5mmol/L醋酸钠，pH 5. 2士0. 05的混合溶液。
全文摘要
本发明公开了一种不含基因组DNA的总RNA制备方法，本发明采用十二烷基硫酸钠作为裂解试剂，裂解细胞后使用醋酸钾和十二烷基硫酸钠反应生成十二烷基硫酸钾(PDS)沉淀，同时共沉淀蛋白质以及大部分基因组DNA，由于在酸性醋酸钾溶液、硫氰酸胍存在时核酸可与硅胶柱吸附，并且吸附的核酸可按分子量大小利用一定浓度醋酸钾解离的性质，利用硅胶柱分离总RNA和残留的基因组DNA。最后采用乙醇沉淀得到总RNA样品。其优点在于通过控制醋酸钾浓度，可使结合能力较差的小分子量的RNA和其他种类的RNA均进入穿过液，从而能得到较好的总RNA产率；同时使基因组DNA被硅胶膜吸附，以分离RNA和基因组DNA。
文档编号C12N15/10GK102250877SQ20111014684
公开日2011年11月23日 申请日期2011年6月2日 优先权日2011年6月2日
发明者徐蕾, 徐雷雷, 曹正宇, 朱国萍, 李雪, 王文才, 王鹏, 靳明明 申请人:安徽师范大学