专利名称：一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的双色荧光定量pcr联合检测方法及其试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的检测方法，具体涉及一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒双色荧光定量PCR联合检测方法，进一步涉及一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的双色荧光定量PCR联合检测试剂盒。
背景技术：
猪瘟是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV)引起的一种高度接触性热性传染病，该传染性高，致病性强，猪是本病唯一的自然宿主，感染的病猪主要表现为特征性病理变化，内脏出血，梗塞和坏死，死亡率很高，给养猪业造成重大的经济损失。 病猪是最主要的传染源，易感猪与病猪的直接接触是病毒传播的主要方式。在我国，猪瘟流行呈现典型猪瘟和非典型猪瘟共存、持续感染与隐性感染共存、免疫耐受和带毒综合征共存等形式；在国外，比利时、德国、荷兰最近爆发猪瘟也说明猪瘟流行形式发生了改变。 猪瘟新的流行形式给全世界养猪业提出了新的挑战。CSFV与牛病毒性腹泻病毒(bivine viral disease virus, BVDV)禾口羊边界病毒(border disease virus, BDV)同属黄病毒禾斗 (Flaviviridae)瘟病毒属(pestivirus)。猪瘟病毒基因组为单股正链RNA长约12. 3KB， 含有一个大的开放阅读框架。病毒粒子呈球形，直径40-50nm，二十面体对称，其芯髓直径四-30歷，有囊膜。猪蓝耳病即猪繁殖与呼吸综合征，是由猪蓝耳病病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)引起的一种高度接触性传染病，在大多数国家中呈流行性感染。猪发病后临床表现差异极大，是该病的显著特征之一。临床症状主要是繁殖障碍，包括怀孕后期流产、早产和死胎，育成猪的呼吸道症状。发病母猪体温升高，厌食， 部分患猪的背侧、双耳的耳尖及边缘呈红蓝色。发病公猪性欲减退，生产性能下降。发病仔猪出生时死亡或产出后个体小。患猪死亡后的主要病理变化是眼球肿胀突出，头、臀部皮下水肿，胸腔、心包积水，心室扩张，心肌变化萎缩，肾脏皮质部点状出血，肺脏呈间质性肺炎病变。1991年病原首次鉴定，病毒是单链RNA病毒，属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，但是病毒的来源并未确定。1985年美国猪群猪繁殖与呼吸综合征病毒血清抗体的存在说明该病毒在发病之前就已经存在。常规的猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的实验室检验方法是根据免疫反应原理，利用 ELISA及双夹心ELISA法进行检测。目前，国内外已对猪瘟的结构蛋白基因进行了详尽的研究，国外有学者分别对CSFV Alfort株和Brescia株基因进行了全序列测定，并通过免疫学方法证明囊膜糖蛋白El是CSFV诱导保护性中和抗体的重要抗原，而国内则对于石门株 (shimen)的基因序列进行了测定。通过RT-PCR技术将编码相应结构蛋白的mRNA反转录成 cDNA，转入载体进行表达，并将表达产物进行纯化、定量以及作为抗原包板做ELISA进行感染检测。另外猪瘟兔化弱毒E2蛋白A/D区的高效表达和蛋白纯化后亦可以作为包被抗原进行ELISA测定，但是由于不能区分自然感染的和免疫接种。PRRSV可以从各种临床样品中分离到，包括血清、血浆、外周血单核细胞、骨髓、扁桃体、肺脏、淋巴结、胸腺、脾脏、心、 脑、肝、睾丸、附睾、输精管、尿道球腺、阴茎组织、口咽拭子、鼻甲、鼻拭子、胎盘、唾液、尿液、 粪便以及精液中。一般来说，肺脏深处积液以及血清都是病毒分离最理想的材料。送检材料通常应包括新鲜采集的肺、扁桃体以及淋巴结。但是只有当特定滴度的标准病毒在新巨噬细胞生长良好，方可使用。冰冻切片免疫荧光抗体试验(IFA)以及免疫组化试验(IHC) 可以检测组织中的PRRSV抗原。冰冻切片直接FA试验成本较低并且快速，这两种方法的特异性很高，但相对来说敏感性不够。样品的质量对FA结果影响非常大，要求组织应该新鲜。IHC可以检测甲醛固定的组织，比FA的敏感性要高，但更费时而且成本更高。通过组织病理学切片，结合IHC以及FA试验的结果可以对PRRSV感染做出准确的诊断。另外，针对上述两种病毒可以用RT-PCR技术进行检测。通常是用异硫氰酸胍-酚-仿一步抽提法提取病料细胞总RNA并进行反转录，再以此产物为模板对可疑的猪瘟或者猪蓝耳病病料进行了 PCR扩增。如果扩增出相应的片段则说明病毒的存在，敏感性要高于荧光抗体染色法、酶标单克隆抗体染色法和电镜负染法，可以作为一种有效的诊断方法。概括来说猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的检测方法主要包括免疫学检测方法和核酸检测方法两大类。免疫学方法主要是检测血清中是否存猪瘟和猪蓝耳病病毒的特异性抗体，具体是用ELISA的方法进行检测，然而这种方法必须是建立在已经发生病毒感染并产生抗体的基础上，而且鉴于上述病毒的高度变异性以及与其他病毒血清学的交叉性，其特异性难以保证，容易出现假阳性和假阴性。病毒分离和培养法比较敏感，但是这种方法操作繁琐，不宜在所有检测实验特别是一些基层实验室推广。用普通PCR的方法进行猪瘟或者猪蓝耳病病毒核酸，虽然灵敏度有所提高，但是容易产生非特异性扩增，甚至会因为操作的原因出现假阳性，而且普通PCR扩增法其结果的判断需要对产物进行凝胶电泳分析，操作方法不够简化。荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，该方法操作方便快捷。CN101058830A公开了 “猪瘟病毒荧光定量RT-PCR诊断试剂盒”，CN101328506A公开了“一种特异检测猪瘟病毒野毒感染的荧光定量PCR快速诊断试剂盒及其应用方法”。两篇文献均只对猪瘟病毒进行了单独检测。猪瘟和猪蓝耳病是严重危害猪的病毒性疾病，常以单独或混合感染的方式感染猪，发病率和死亡率都较高。目前针对猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒感染的联合检测方法还未完善。多色荧光定量PCR技术是指在同一个荧光定量PCR扩增试验中同时扩增多个目的基因，而每个目的基因采用的不用波长的荧光探针进行检测。荧光标记的探针有多种，比如卩八1^1(、(^、服0、冊乂等，每种荧光标记的探针在PCR扩增过程中所产生的荧光信号不同。
发明内容
本发明提供了一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的双色荧光定量PCR联合检测方法， 该方法可以实现在同一个待测样本中同时检测猪瘟病毒(CSFV)和猪蓝耳病病毒(PRRSV) 的存在，并能对两种病毒的负载水平进行定量。本发明还提供了一种用于猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒双色荧光定量PCR联合检测的试剂盒。本发明所采用的猪瘟病毒(CSFV)和猪蓝耳病病毒(PRRSV)的双色荧光定量PCR联
5合检测方法，包括如下步骤
(1)提取待测样品中的病毒RNA；
(2)以得到的总RNA为模板，使用猪瘟病毒(CSFV)的
上游引物CSFV-F :5，-AGCTCCCTGGGTGGTCTAAGT-3，(SEQ ID NO. 1)； 下游引物CSFV-R :5，-CCCTCGTCCACATAGCATCT-3，(SEQ ID NO. 2)； 荧光探针CSFV-P :5，-AGTTCGACGTGAGCAGAAGCCCACC-3，(SEQ ID NO. 3)禾口猪蓝耳病病毒(PRRSV)的
上游引物:PRRSV-F :5，-GGACACCAAGGGCAGACTCT-3，(SEQ ID NO. 4)； 下游引物PRRSV-R :5，-CACCTCCAACCTCAATTTTACC-3，(SEQ ID NO. 5)； 荧光探针PRRSV-P :5，-CTGGCGGTCACCCGTCATCATAGAG-3，(SEQ ID NO. 6) 进行双色荧光定量PCR检测，其中，猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的荧光探针报告基团不相同；
(3)结果分析反应结束后，根据待测样品的荧光Ct值判断待测样品是否为CSFV、 PRRSV阳性。所述荧光定量PCR反应的反应体系总体积为25 μ 1，组成如下双色荧光定量PCR MIX 20μ1、反转录酶系 μ 、Taq酶系 μ 以及提取的猪瘟和猪蓝耳病病毒RNA或者阳性质控品或者阴性质控品3μ1 ；其中双色荧光定量PCR MIX中含有IOX双色荧光定量PCR buffer、dNTPS。所述10X双色荧光定量PCR buffer中含有以下成分500m MTris-HCl (pH8. 0)、 50mM MgCl2,250mM KCl 以及 15%(v/v)的 DMSO。所述的检测方法的一个优选方案是，双色荧光定量PCR MIX的组成为 10X双色荧光定量PCR buffer 2. 5μ1
CSFV-F (10μΜ) μ
μ μ μ 0. 5μ1 0. 5μ1 μ 11. 5μ1 20. 0μ 1。所述检测方法的一个优选方案是，双色荧光定量PCR反应条件为93°C 2分钟，然后93 °C 30秒，55 58 °C 45秒，采集荧光信号，40个循环。一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的双色荧光定量PCR联合检测试剂盒，包括如下成分病毒核酸提取液A、病毒核酸提取液B、反转录酶系、Taq酶系、双色荧光定量PCRMIX、阳性质控品、阴性质控品，所述双色荧光定量PCRMIX中含有10X双色荧光定量PCR buffer、 dNTPS、及猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的特异性引物及双色探针，序列分别为
猪瘟病毒
上游引物CSFV-F :5，-AGCTCCCTGGGTGGTCTAAGT-3，(SEQ ID NO. 1)；
CSFV-R (10μΜ) PRRSV-F (10μΜ) PRRSV-R (10μΜ) CSFV-P (10μΜ) PRRSV-P (10μΜ) dNTPS (IOmM) (MH2O Total下游引物CSFV-R :5，-CCCTCGTCCACATAGCATCT-3，(SEQ ID NO. 2)； 荧光探针
CSFV-P :5’ -FAM-AGTTCGACGTGAGCAGAAGCCCACC-TAMRA-3’ (SEQ ID NO. 3)；
猪蓝耳病病毒
上游引物PRRSV-F :5，-GGACACCAAGGGCAGACTCT-3，(SEQ ID NO. 4)； 下游引物PRRSV-R :5，-CACCTCCAACCTCAATTTTACC-3，(SEQ ID NO. 5)； 荧光探针
PRRSV-P 5' -VIC-CTGGCGGTCACCCGTCATCATAGAG-TAMRA-3' (SEQ ID NO. 6)。猪瘟病毒的荧光探针报告基团为FAM，猪蓝耳病病毒的荧光探针报告基团为VIC， 淬灭基团为TAMRA。所述检测试剂盒的一个优选方案是，10X双色荧光定量PCR buffer中含有以下成分500mM Tris-HCl (ρΗ8· 0)、50mM MgCl2,250mM KCl 以及 15%(v/v)的 DMS0。所述检测试剂盒的一个优选方案是，双色荧光定量PCR MIX的组成如下 10X双色荧光定量PCR buffer 2. 5μ1
CSFV-F (10μΜ) μ
μ μ μ 0. 5μ1 0. 5μ1 μ 11. 5μ1 20. 0μ 1。所述检测试剂盒的一个优选方案是，病毒提取液A每1000ml中含有异硫氰酸胍 480g, 0. IM Tris-HCl CpH 6. 4) 500ml, 0. 2M EDTA (ρΗ8· 0) 120ml，余量为水。所述检测试剂盒的一个优选方案是，病毒提取液B的组成为异丙醇。本发明方法能够同时检测出待测标本中猪瘟病毒和猪蓝耳病毒两种病原体，并能够实时精确检测并对病毒进行定量，应用极为方便。由于该方法引入了特异性扩增引物和荧光探针，使得检测的灵敏度和特异性得到很大程度的增强，从而避免了其他检测方法特异性不高容易漏诊和误诊的问题，基于上述优点，该试剂盒适合在各级动物卫生监督所、动物疫病预防控制中心动物医院和各种动物疾病研究机构等大规模筛查的推广应用。根据本方法原理制得的试剂盒，可方便地同时检测出猪瘟病毒和猪蓝耳病毒，准确率高，具有广泛的应用前景。
CSFV-R (10μΜ) PRRSV-F (10μΜ) PRRSV-R (10μΜ) CSFV-P (10μΜ) PRRSV-P (10μΜ) dNTPS(IOmM) dd H2O Total
图1为双色荧光PCR体系中CSFV检测的敏感性实验，从左到右依次为1X108、 IX 107、1X 106、1X 105、1X 104、1X 103、1X IO2 拷贝 / μ 1 的标准品的扩增结果。图2为双色荧光PCR体系中PRRSV检测的敏感性实验，从左到右依次为1 X 108、 IX 107、1X 106、1X 105、1X 104、1X 103、1X IO2 拷贝 / μ 1 的标准品的扩增结果。
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图3为双色方法PCR体系中CSFV的特异性实验图，CSFV为阳性、PRRSV、SIV、VSV、 FMDV、JEV及阴性质控品均为阴性。图4为双色荧光PCR方法中PRRSV的特异性实验，PRRSV为阳性、CSFV, SIV、VSV, FMDV、JEV及阴性质控品均为阴性。
具体实施例方式实施例1
1、特异性引物及探针的设计
根据从Genbank上检索到的猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV)和猪蓝 ^^ (Reproductive and Respiratory Syndrome Virus) WtlSlj^^lJ, i^ifffiT^llJ 猪瘟病毒和猪蓝耳病毒的引物和探针，其序列如下 猪瘟病毒
上游引物CSFV-F :5，- AGCTCCCTGGGTGGTCTAAGT-3，(SEQ ID NO. 1)； 下游引物CSFV-R :5，- CCCTCGTCCACATAGCATCT-3，(SEQ ID NO. 2)； 荧光探针
CSFV-P 5' -FAM- AGTTCGACGTGAGCAGAAGCCCACC-TAMRA-3，(SEQ ID N0. 3)，扩增片段 93 bp ；
猪蓝耳病病毒
上游引物PRRSV-F :5，- GGACACCAAGGGCAGACTCT-3，(SEQ ID N0. 4)； 下游引物PRRSV-R :5，- CACCTCCAACCTCAATTTTACC-3，(SEQ ID N0. 5)； 荧光探针
PRRSV-P 5' -VIC- CTGGCGGTCACCCGTCATCATAGAG-TAMRA-3，(SEQ ID N0. 6)，扩增片段 77 bp。用于检测猪瘟病毒的荧光探针报告基团为FAM，用于检测猪蓝耳病病毒的荧光探针报告基团为VIC，淬灭基团为TAMRA。2、标本采集和预处理
本方法及试剂盒适用标本类型包括猪的组织、血清、分泌排泄物等。组织标本无菌条件下取组织约100 200mg左右，置入1. 5ml洁净EP管中，保存待检。血清用一次性无菌注射器抽取受检猪静脉血3-5ml，留取血清，保存待检。分泌排泄物无菌条件下采集，保存待检。采集的标本应该尽快送检，或者保存于-20°C。3、阳性质控品的制备
分别以猪瘟病毒(CSFV)和猪蓝耳病病毒(PRRSV)RNA标准品为模板，进行PCR扩增，步骤如下
反转录体系
Oligo dT Primer (50 μ Μ) 1 μ 1、dNTP Mixture (10 mM ) 1 μ 1 以及总 RNA 2 μ g, 65°C 5min，激冷，然后加入 5XPrimeScript Buffer 4 μ 1(TAKARA 公司)、RNase Inhibitor (40 U/ μ 1) 0· 5 μ 1、PrimeScript RTase (200 U/ μ 1) 1 μ 1 和 RNase free H2O 4. 5 μ 1 反转录条件
30°C IOmin,然后42°C，30min,进行逆转录和成cDNA。
PCR 体系
10XPCR Buffer 5 μ 1、TaKaRa Taq (5 U/ μ 1) 1 μ 1、dNTP Mixture (各 2· 5 mM) 4μ1、上述 CSFV 和 PRRSV 上下游引物(ΙΟμΜ)各 0. 5μ 1、上述 cDNAO. 5μ 1 和 RNase free Η2039· 25 μ 1， PCR条件
按照94°C 3分钟预变性，94°C 30秒，60°C 30秒，72°C 45秒，共35个循环，72°C延伸 10分钟。反应后取5μ 1 PCR扩增产物用2%的琼脂糖凝胶进行检测，将切胶纯化的PCR产物与pMD-18T载体连接，重组质粒pMD-18T-CSFV或pMD_18T_PRRSV涂布于培养皿上，转化感受态DH5 α细胞，挑取阳性菌落抽提质粒，取品5 μ 1稀释测其A260nm和A280nm吸光度值，计算其浓度并换算成绝对拷贝数，稀释成1. 0 X IO7拷贝/ μ 1，作为双色荧光定量PCR的阳性质控品。4、病毒RNA的提取
1)固体组织取0. 5g左右组织用玻璃勻浆器勻浆或剪刀剪碎，加入1. 5ml生理盐水继续研磨，待勻浆后转至1. 5ml的EP管中，IOOOOrpm离心anin，取上清100 μ 1于1. 5ml的 EP管中，加入200 μ 1 RNA提取液A充分震荡，静置;3min ；
2)血清或病毒液取100 μ 1血清加入200 μ 1 RNA提取液A充分震荡，静置;3min，然后加入200 μ 1 RNA提取液B，用力震荡15s，4°C 13，OOOrpm离心5min ；
3)弃上清，加入Iml 75%乙醇，充分混勻，13，OOOrpm离心5min，小心吸去大部分残留液体；
4)将提取管敞口在室温空气中干燥lOmin，使液体挥发干净，用20μ1 DEPC水溶解沉淀即为待检测的病毒RNA。5、双色荧光定量PCR扩增
每个测试反应体系配制如下，双色PCR MIX 20 μ 1、反转录酶系 μ1、Τεκι酶系 μ ，瞬时离心，然后加入待检测的RNA3P1 ；同样按照上述体系设置阳性和阴性对照，加入阳性质控品或阴性质控品3 μ 1进行扩增。将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，设置各检测的名称和荧光基团种类 (检测CSFV的报告基团选择FAM，检测CSFV的报告基团选择VIC，淬灭基团选择TAMRA)，设定循环条件:ABI PRISM 7700,ABI PRISM5700、ABI GeneAmp 7000、ABI PRISM7300/7500、 MJ Opticon等仪器循环条件为93°C—2分钟，后93°C 30秒一55°C 45秒，40个循环。 LightCycler等使用毛细管的仪器循环条件为93°C—2分钟，后93°C 5秒一58°C 45秒， 共40个循环。6、结果分析和判定
反应结束后，调整阈值使阴性质控品Ct值在40以上，FAM荧光Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线的为CSFV阳性，VIC荧光Ct值小于35个循环且呈S型扩增曲线的为PRRSV 阳性，，二者均为阳性，则为PRRSV和CSFV共阳型。7、灵敏度实验
上述阳性质控品(IO7拷贝/ μ 1 )，依次稀释为1.0Χ ΙΟ6、1.0Χ ΙΟ5、1.0Χ IO4、1.0Χ 103、 1.0Χ IO2U-OXIOiU. OX 10°拷贝/μ 1，进行灵敏度实验。
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双色荧光定量PCR体系中CSFV检测的敏感性实验见图1，双色荧光定量PCR体系中PRRSV检测的敏感性实见图2。图1为双色荧光PCR体系中CSFV检测的敏感性实验，从左到右依次为 IX 108、1X 107、1X 106、1X 105、1X 104、1X 103、1X IO2 拷贝 /μ 1 的标准品的扩增结果。图2为双色荧光PCR体系中PRRSV检测的敏感性实验，从左到右依次为IX 108、 IX 107、1X 106、1X 105、1X 104、1X 103、1X IO2 拷贝 / μ 1 的标准品的扩增结果。结果证实本试剂盒检测灵敏度为1. OX IO2 μ Γ1，该双色荧光定量PCR的方法敏感度为普通PCR的200倍，精确性优于普通PCR方法。8、特异性实验
根据上述的双色荧光定量PCR检测方法，用猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、二者双阳性以及其它病毒如猪流感(SIV)、猪水疱型口炎病毒(VSV)、口蹄疫病毒(FMDV)、猪乙型脑炎病毒 (JEV)、阴性对照进行验证实验并对产物进行测序验证，结果证实，本发明方法及试剂盒特异性好，未出现假阳性，吻合度为100%，实验结果见图3和图4。图3为双色方法PCR体系中CSFV的特异性实验图，由图可以看出，CSFV为阳性、PRRSV、SIV、VSV、FMDV、JEV及阴性质控品均为阴性。图4为双色荧光PCR方法中PRRSV的特异性实验，由图可以看出，PRRSV为阳性、 CSFV, SIV、VSV、FMDV, JEV及阴性质控品均为阴性。
权利要求
1.一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的双色荧光定量PCR联合检测方法，包括如下步骤(1)提取待测样品中的病毒RNA；(2)以得到的总RNA为模板，使用猪瘟病毒的上游引物CSFV-F :5，-AGCTCCCTGGGTGGTCTAAGT-3，(SEQ ID NO. 1)；下游引物CSFV-R :5，-CCCTCGTCCACATAGCATCT-3，(SEQ ID NO. 2)；荧光探针CSFV-P :5，-AGTTCGACGTGAGCAGAAGCCCACC-3，(SEQ ID NO. 3)禾口猪蓝耳病病毒的上游引物PRRSV-F :5，-GGACACCAAGGGCAGACTCT-3，(SEQ ID NO. 4)；下游引物PRRSV-R :5，-CACCTCCAACCTCAATTTTACC-3，(SEQ ID NO. 5)；荧光探针PRRSV-P :5，-CTGGCGGTCACCCGTCATCATAGAG-3，(SEQ ID NO. 6)进行一步双色荧光定量PCR，其中，猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的荧光探针报告基团不相同；(3)结果分析反应结束后，根据待测样品的荧光Ct值判断待测样品是否为CSFV、 PRRSV阳性。
2.根据权利要求1所述的一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的双色荧光定量PCR联合检测方法，其特征在于荧光定量PCR反应的反应体系总体积为25μ 1，组成如下双色荧光定量 PCR MIX 20μ1、反转录酶系 μ 、Taq酶系 μ 以及提取的猪瘟和猪蓝耳病病毒RNA或者阳性质控品或者阴性质控品3μ1 ；其中双色荧光定量PCR MIX中含有IOX双色荧光定量PCR buffer、dNTPS。
3.根据权利要求2所述的一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的双色荧光定量PCR联合检测方法，其特征在于10X双色荧光定量PCR buffer中含有以下成分500m M Tris-HCl (pH8. 0)、50mM MgCl2,250mM KCl 以及 15%(v/v)的 DMSO。
4.根据权利要求2所述的一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的双色荧光定量PCR联合检测方法，其特征在于所述双色荧光定量PCR MIX的组成为10X双色荧光定量PCR buffer 2. 5μ1CSFV-F (10μΜ) μ μ μ μ 0. 5μ1 0. 5μ1 μ 11. 5μ1 20. 0μ 1。
5.根据权利要求1所述的一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的双色荧光定量PCR联合检测方法，其特征在于双色荧光定量PCR反应条件为93°C 2分钟，然后93°C 30秒，55 58 °C 45秒，采集荧光信号，40个循环。
6.一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的双色荧光定量PCR联合检测试剂盒，包括如下成分病毒核酸提取液A、病毒核酸提取液B、反转录酶系、Taq酶系、双色荧光定量PCRMIX、阳性质控品、阴性质控品，其特征在于，所述双色荧光定量PCRMIX中含有IOX双色荧光定量 PCR buffer、dNTPS、及猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的特异性引物及双色探针，序列分别为猪瘟病_CSFV-F :5，-AGCTCCCTGGGTGGTCTAAGT-3‘ (SEQ ID NO. 1) CSFV-R :5’ -CCCTCGTCCACATAGCATCT-3’ (SEQ ID NO. 2)；上游引物下游引物荧光探针CSFV-P :5’ -FAM-AGTTCGACGTGAGCAGAAGCCCACC-TAMRA-3’ (SEQ ID NO. 3)；猪蓝耳病病毒上游引物PRRSV-F :5，-GGACACCAAGGGCAGACTCT-3，(SEQ ID NO. 4)； 下游引物PRRSV-R :5，-CACCTCCAACCTCAATTTTACC-3，(SEQ ID NO. 5)； 荧光探针PRRSV-P :5’ -VIC-CTGGCGGTCACCCGTCATCATAGAG-TAMRA-3' (SEQ ID NO. 6)； 猪瘟病毒的荧光探针报告基团为FAM，猪蓝耳病病毒的荧光探针报告基团为VIC，淬灭基团为TAMRA。
7.根据权利要求6所述的一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的双色荧光定量PCR联合检测试剂盒，其特征在于10X双色荧光定量PCR buffer中含有以下成分500mM Tris-HCl (pH8.0)、50mM MgCl2,250mM KCl 以及 15%(v/v)的 DMSO。
8.根据权利要求6所述的一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的双色荧光定量PCR联合检测试剂盒，其特征在于所述双色荧光定量PCRMIX的组成如下IOX双色荧光定量PCR buffer 2. 5μ1CSFV-F (ΙΟμΜ) CSFV-R (ΙΟμΜ) PRRSV-F (ΙΟμΜ) PRRSV-R (ΙΟμΜ) CSFV-P (ΙΟμΜ) PRRSV-P (ΙΟμΜ) dNTPS(IOmM) dd H2O Total
9.根据权利要求6所述的- μ μ μ μ 0. 5μ1 0. 5μ1 μ 11. 5μ1 20. 0μ 1。 -种猪瘟病毒和猪蓝耳病病f；的双色荧光定量PCR联合检测试剂盒，其特征在于所述病毒提取液A每1000ml中含有异硫氰酸胍480g，0. IM Tris-HCl CpH 6. 4) 500ml, 0. 2M EDTA (ρΗ8· 0) 120ml，余量为水。
10.根据权利要求6所述的一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的双色荧光定量PCR联合检测试剂盒，其特征在于所述病毒提取液B的组成为异丙醇。
全文摘要
本发明公开了一种猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒的双色荧光定量PCR联合检测方法，该方法可以实现在同一个待测样本中同时检测猪瘟病毒和猪蓝耳病毒的存在，并能对两种病毒的负载水平进行定量。本发明还提供了一种用于猪瘟病毒和猪蓝耳病病毒双色荧光定量PCR联合检测的试剂盒。本发明的检测方法及试剂盒操作简便快速，特异性高，检测效果敏感、可靠，最低检测浓度为1×102拷贝/μl。
文档编号C12Q1/68GK102212623SQ20111014687
公开日2011年10月12日 申请日期2011年6月2日 优先权日2011年6月2日
发明者吕殿红, 周秀蓉, 温晓慧, 温肖会, 罗胜军, 袁洁, 贾春玲, 钱钢锐, 魏文康, 黄忠 申请人:广东省农业科学院兽医研究所