一种分析VDR基因多态性位点Cdx-2的方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明适用于生物【技术领域】，提供了一种分析VDR基因多态性位点Cdx-2的方法及应用，该方法包括以下步骤：设计用于扩增VDR基因Cdx-2多态性位点片段的PCR引物，并通过突变PCR引物近3’端的一个碱基形成特异性PCR引物，所述特异性PCR引物的突变碱基与Cdx-2多态性位点的G等位基因碱基形成能被BseMII内切酶识别的酶切位点；使用上述特异性PCR引物扩增Cdx-2多态性位点的DNA片段得到PCR扩增产物；使用BseMII内切酶对上述扩增产物进行酶切反应得到酶切产物；对所述酶切产物进行电泳、并分析电泳结果。本发明提供的新的分析VDR基因多态性位点Cdx-2的方法，操作简单、且准确性高。
【专利说明】—种分析VDR基因多态性位点Cdx-2的方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，尤其涉及一种分析VDR基因多态性位点Cdx-2的方法及应用。
【背景技术】
[0002]维生素D受体(vitamin D receptor, VDR)是介导活性维生素D— 1，25 (OH) 2D发挥生物效应的生物大分子，位于细胞膜或细胞核中。1，25 (OH)2D激素信号分子在靶细胞与VDR结合形成激素-受体复合物，该复合物作用于靶基因上的特定DNA序列，对结构基因的表达产生调节作用。因此，1，25 (OH) 2D在维持机体钙-磷代谢，调节细胞增殖、分化等方面的重要作用是通过VDR介导实现的。
[0003]VDR基因上存在众多单核苷酸多态性位点(Single NucleotidePolymorphisms, SNPs),它们广泛分布于基因启动子、外显子和内含子等区域。这其中的一些SNPs可能通过各种机制影响VDR基因表达或蛋白质活性水平，从而影响到机体健康状况。
[0004]Rsl 1568820[美国生物信息中心(National Center for BiotechnologyInformation, NCBI)的SNPs编号]是位于VDR基因启动子上的一个SNP，并处于尾型同源盒转录因子_2 (Caudal Type Homeobox Transcription Factor2, CDX-2,为一种小肠特异性同源盒转录因子)与VDR启动子结合的区域，故通常也叫Cdx-2位点。该位点多数情况下的等位基因为G，少数情况下为A。 VDR上Cdx-2位点的A等位基因可促进⑶X_2调节VDR启动子的活性而提高VDR基因转录，促进小肠钙吸收。AA基因型能降低骨质疏松、骨质疏松性骨折、原发性侏儒症的发病风险，而系统分析发现该位点AA基因型与肿瘤风险增加有关。因此，检测Cdx-2位点的基因型，对研究VDR相关的生物医学作用具有重要价值。
[0005]在众多分析SNP的实验技术中，聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction, PCR)后的限制性酶切片段长度多态性(Restriction Fragment LengthPolymorphism, RFLP)分析(PCR-RFLP)通常是最为简单、有效的技术。但在目前知道的全部限制性内切酶中，仅有Bst4CI (或其同切口限制性内切酶HpyCH4II1、Tsp4C1、TaaI)能够识别VDR基因Cdx-2位点所在的核苷酸序列(ACN'GT)，这类内切酶较不常用，且缺乏PCR扩增该目的片段的理想引物。同时，也尚未见到通过引物碱基替换引入其它酶切位点而实现分析的报道。因此，此前的研究者通过测序、探针杂交或高分辨率熔解曲线法(HighResolution Melting, HRM)分析等方法来检测该位点的基因型。
[0006]1.测序法。该技术是分析核苷酸(或碱基)种类及排列顺序的直观方法，需要PCR仪和测序仪等。通过PCR反应扩增含有VDR基因Cdx-2位点的核酸片段，再用测序仪判读该片段中依次排列的全部核苷酸种类，从测序报告中直接判定该DNA片段中Cdx-2位点的等位基因喊基。因测序原理的不同，可有不同的测序设备可选。如Illumina、AB1、LifeTechnology.Roche等等公司均有自己的品牌测序仪。这些测序设备通常含配套检测试剂，如ABI3100/3700系列的核酸序列检测仪，可结合ABI PRISM SNaPShot Multiplex试剂盒使用。测序设备价格相对较贵，大都在100万元以上，配套试剂也较为封闭。这类方法大致分析流程是:特异性引物扩增含SNPs目的片段的PCR反应一PCR产物纯化一纯化产物为模版的再次PCR扩增(如用特殊试剂盒ABI SNaPshot)—纯化PCR产物一测序一软件分析。
[0007]2.探针技术法。主要是使用TaqMan探针，针对含有Cdx-2位点的VDR基因片段设计一对特异性引物，同时，设计两种分别带有不同荧光染料的特异性探针。TaqMan探针是在探针5'-端标记荧光染料，3'-端标记荧光淬灭剂，抑制同一条探针5'-端荧光染料的荧光信号；但当探针断裂或分解后，位于探针两端的荧光基团和猝灭基团分离，前者发出的荧光信号可被检测，从而反映出某反应体系中是否具有能与该探针特异性结合的目的基因片段。这一方法的实现，需在实时荧光定量PCR仪上设定运行特定的温控反应程序。在目的DNA片段变性-退火阶段，完全匹配的探针会特异性地结合到互补的Cdx-2等位基因片段上；扩增目的片段的阶段，特异性结合的探针会被复制延伸DNA模版的聚合酶从5'-端外切下来，发生探针分解、断裂，通过检测该探针所带的特定荧光信号，判断探针所对应的某一基因型。同理，如果另一荧光染料被检测到，说明待测DNA片段是该荧光探针所对应的另一基因型。
[0008]3.高分辨率熔解曲线法(High Resolution Melting，HRM)。该方法依赖于高精度PCR仪(如LightScanner> Roche480II等设备)和饱和染料(如LC Green)。目的基因片段在含特异性引物等PCR反应体系中经过变性-退火-延伸反应后，饱和染料插入到扩增的目的DNA双链中后，发出特定波长的荧光信号；而在熔解反应阶段，双链DNA会解开成为单链并释放出饱和染料，荧光信号出现降低和消失的过程。荧光信号在整个过程中的强弱变化过程被仪器检测记录，生成熔解曲线。由于目的DNA片段不同基因型中的GC含量以及碱基互补性存在差异，该熔解曲线的峰值温度和峰形会有所差异，其分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分，即能分辨Cdx-2的C/G基因型。
[0009]测序、探针杂 交或高分辨率溶解曲线分析等方法均依赖于昂贵的仪器和试剂，以及较高的实验操作技术。
【发明内容】
[0010]本发明的目的在于提供一种分析VDR基因多态性位点Cdx-2的方法及应用，旨在解决由于针对VDR的Cdx-2多态性位点扩增设计引物难度极大、导致无法通过常规的PCR-RFLP的方式，简单、准确地进行VDR基因多态性位点Cdx_2分析的问题。
[0011]本发明是这样实现的，一种分析VDR基因多态性位点Cdx-2的方法，包括以下步骤:
[0012]设计用于扩增VDR基因Cdx-2多态性位点片段的PCR引物，并通过突变PCR引物近3’端的一个碱基形成特异性PCR引物，所述特异性PCR引物的突变碱基与Cdx-2多态性位点的G等位基因碱基形成能被BseMII内切酶识别的酶切位点；
[0013]使用上述特异性PCR弓丨物扩增Cdx-2多态性位点的DNA片段得到PCR扩增产物；
[0014]使用BseMII内切酶对上述扩增产物进行酶切反应得到酶切产物；
[0015]对所述酶切产物进行电泳、并分析电泳结果。
[0016]以及，一种分析VDR基因多态性位点Cdx-2的方法在肥胖流行病学研究领域中的应用。[0017]本发明提供的分析VDR基因多态性位点Cdx-2的方法，通过在用于扩增VDR基因Cdx-2多态性位点片段的PCR引物近3’端人为突变一个碱基，从而使得该突变碱基与Cdx-2多态性位点的G等位基因碱基形成能被BseMII内切酶识别的酶切位点，使得BseMII内切酶能选择性的对扩增产物的酶切位点进行酶切反应，从而达到分析所述VDR基因多态性位点Cdx-2的基因型的目的。该方法不仅操作简单便捷、成本低廉，且准确度高。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1是本发明实施例提供的PCR扩增产物示意图；
[0019]图2是本发明实施例提供的VDR基因Cdx-2位点的RFLP电泳分析结果图；
[0020]图3是本发明实施例提供的VDR基因Cdx-2位点三种基因型的测序结果图。
【具体实施方式】
[0021]为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0022]本发明实施例提供了一种分析VDR基因多态性位点Cdx-2的方法，包括以下步骤:
[0023]SO1.设计用 于扩增VDR基因Cdx_2多态性位点片段的PCR引物，并通过突变PCR弓丨物近3’端的一个碱基形成特异性PCR引物，所述特异性PCR引物的突变碱基与Cdx-2多态性位点的G等位基因碱基形成能被BseMII内切酶识别的酶切位点；
[0024]S02.使用上述特异性PCR弓丨物扩增Cdx_2多态性位点的DNA片段得到PCR扩增产物；
[0025]S03.使用BseMII内切酶对上述扩增产物进行酶切反应得到酶切产物；
[0026]S04.对所述酶切产物进行电泳、并分析电泳结果。
[0027]具体地，上述步骤SOl中，发明人通过NCBI网站下载得到VDR基因序列(GeneID:7421,NCBI Reference Sequence:NG_008731.1)，并从 SNP 数据库查得 rsl 1568820 序列如下，对应 SED ID NO:3, SED ID NO:4，具体为 rsll568820[Homo sapiens]:
[0028]ATATTCCTGAGTAAACTAGGTCACA [A/G] TAAAAACTTATTTCTTATTATGG GT，其中上述序列中的[A/G]分别代表Cdx-2多态性位点的两种不同基因型A或G。
[0029]发明人利用Primer Premier和NEBcutter等生物学软件的限制性内切酶位点搜索功能，截取该SNP两侧约400bp共800bp的碱基长度，寻找酶切位点，仅找到Bst4CI (HpyCH4II1、Tsp4C1、TaaI)这种识别ACN'GT序列的内切酶可用于鉴定Cdx_2位点基因型。但在VDR的Cdx-2位点两侧距离最近的上游312bp处和下游51bp处还各有一个Bst4CI识别位点，为方便以下进行描述，分别将Cdx-2位点上下游的这2处Bst4CI识别位点表示为Bst4C1-312、和Bst4CI+51。因此，理论上可以在Bst4CI_312—Cdx_2位点之间设计上游引物，Cdx-2—Bst4CI+51之间设计下游引物，从而扩增出只含一个Bst4CI内切酶识别的Cdx-2位点。但对Cdx-2—Bst4CI+51之间的核苷酸序列分析发现:由于该狭窄区域的GC含量很低，仅为21.5%，要想在这个50bp的区域设计出理想的引物十分困难，并随之会增加实验条件摸索的难度与成本。因此，Bst4CI内切酶鉴定VDR Cdx-2基因型的路线无法实现。
[0030]此外，发明人还尝试通过截取VDR Cdx-2位点两侧约50bp共IOObp的碱基长度，利用SiteFind在线软件搜索该位点附近可经引物近3'-端突变1_2个碱基而形成鉴别该位点的限制性内切酶，仍无合适结果。
[0031]经过发明人对Cdx-2多态性位点序列反复研究发现，设计用于扩增VDR基因Cdx-2多态性位点片段的PCR引物时，Cdx-2多态性位点附近的序列可以通过PCR引物近3'端突变I个碱基形成特异性PCR引物，具体地，PCR引物近3'端的一个碱基A突变为碱基T，突变后的特异性PCR引物的突变碱基与Cdx-2多态性位点的G等位基因碱基构成能被SiteFind在线软件的候选内切酶库中并不含有、本领域技术人员不会想到的BseMIl(BspCNI)内切酶识别的酶切位点，所述BseMII (BspCNI)内切酶识别序列为5-CTCAG (N) 1(|丨_3或
3-GAGTC(N)8 ? -5。向SiteFind软件的内切酶库添加BseMII后，发现在Cdx-2多态性位点附近突变I个碱基后，扩增产物将含有能被能BseMII内切酶识别的酶切位点。
[0032]作为优选实施例，为在VDR Cdx-2多态性位点附近构建BseMII识别序列来鉴定Cdx-2基因型，所述特异性PCR引物的序列如SED ID NO: 1、SED ID N0:2所示，其上游引物用Cdx-2F表示，下游引物用Cdx-2B表示，所述Cdx-2F、Cdx-2B的序列为:
[0033]Cdx-2F:TTATATATATTCCTGAGTAAACTAGGTCTCA ；
[0034]Cdx-2B: GCGTGGAGTTAGAAAGACAGAAG?
[0035]其中Cdx_2F近3’端第三个碱基T为突变碱基，上述引物Cdx_2F、Cdx_2B经引物评价软件分析，此对引物的Tm值为58°C,具评分结果较好，以Primer Premier5.0评测结果为例，其Rating值达到了 84。所述引物Cdx_2F、Cdx_2B适宜的Tm值(55_65°C为宜)、良好的引物评分，适合所述Cdx-2多态性位点DNA片段的扩增；且若PCR产物能被BseMII酶切，即可获得水平凝胶电泳能够分辨的适宜的酶切片段长度:282bp和42bp。
[0036]上述步骤S02中，使用上述特异性PCR引物扩增Cdx-2多态性位点的DNA片段，可以得到含有BseMII内切酶识别位点的PCR扩增产物；由于特异性PCR上游引物近3’端、与Cdx-2多态性位点相距两个碱基的位置含有人为替代的碱基T，从而使得当Cdx-2多态性位点基因型为G时，PCR扩增产物中含有能被BseMII内切酶识别的位点5’ -CTCAG(N) 1(|_3’，因此PCR扩增产物能被BseMII内切酶酶切，分别得到不同长度的酶切片段；而当Cdx_2多态性位点基因型为A时，此时，与BseMII内切酶识别位点对应的PCR扩增产物序列为5’ -CTCAA(N) 1(|-3’，因此，其仍然不能被BseMII内切酶酶切，酶切后的PCR产物的长度仍然保持不变。作为具体实施例，当特异性PCR引物的序列为:
[0037]Cdx-2F:TTATATATATTCCTGAGTAAACTAGGTCTCA ；
[0038]Cdx-2B:GCGTGGAGTTAGAAAGACAGAAG 时，所述 PCR 扩增产物如图1 所示，其中，Cdx-2多态性位点A基因型的PCR扩增产物序列如SED ID NO: 5所示，Cdx_2多态性位点G基因型的PCR扩增产物序列如SED ID N0:6所示。当Cdx_2多态性位点基因型为G时，经酶切后将得到长度为282bp和42bp的酶切片段；而当Cdx-2多态性位点基因型为A时，此时，与BseMII内切酶识别位点对应的PCR扩增产物序列为5-CTCAA (N) 1(|_3’，因此，其仍然不能被BseMII内切酶酶切，酶切后的PCR产物的长度仍然保持不变，为324bp。
[0039] 上述用于扩增Cdx-2多态性位点的DNA片段可以直接从生物样品中提取得到，当然，也可以通过其他获得该DNA片段的途径获取得到。[0040]作为优选实施例，所述步骤S02中，所述使用特异性PCR引物扩增Cdx-2多态性位点的DNA片段的PCR扩增体系为:
[0041]
[0042]
【权利要求】
1.一种分析VDR基因多态性位点Cdx-2的方法，包括以下步骤: 设计用于扩增VDR基因Cdx-2多态性位点片段的PCR引物，并通过突变PCR引物近3’端的一个碱基形成特异性PCR引物，所述特异性PCR引物的突变碱基与Cdx-2多态性位点的G等位基因碱基形成能被BseMII内切酶识别的酶切位点； 使用上述特异性PCR引物扩增Cdx-2多态性位点的DNA片段得到PCR扩增产物； 使用BseMII内切酶对上述扩增产物进行酶切反应得到酶切产物； 对所述酶切产物进行电泳、并分析电泳结果。
2.如权利要求1所述的分析VDR基因多态性位点Cdx-2的方法，其特征在于，所述特异性PCR引物的上游引物用Cdx-2F表示，下游引物用Cdx-2B表示，所述Cdx-2F、Cdx_2B的序列分别如SED ID NO: 1、SED ID N0:2所示，具体为:
Cdx-2F:TTATATATATTCCTGAGTAAACTAGGTCTCA ；
Cdx-2B:GCGTGGAGTTAGAAAGACAGAAG, 其中Cdx-2F近3’端第三个碱基T为突变碱基。
3.如权利要求1所述的分析VDR基因多态性位点Cdx-2的方法，其特征在于，所述使用特异性PCR引物扩增Cdx-2多态性位点的DNA片段得到PCR扩增产物的步骤中，PCR扩增体系为:
4.如权利要求1~3任一所述的分析VDR基因多态性位点Cdx-2的方法，其特征在于，所述使用特异性PCR引物扩增Cdx-2多态性位点的DNA片段得到PCR扩增产物的步骤中，PCR扩增体系为:
5.如权利要求1~3任一所述的分析VDR基因多态性位点Cdx-2的方法，其特征在于，在所述使用BseMII内切酶对上述扩增产物进行酶切反应的步骤中，所述酶切反应的反应体系如下:
6.如权利要求1~3任一所述的分析VDR基因多态性位点Cdx-2的方法，其特征在于，在所述使用BseMII内切酶对上述扩增产物进行酶切反应的步骤中，所述酶切反应的反应体系如下:
7.如权利要求1~3任一所述的分析VDR基因多态性位点Cdx-2的方法，其特征在于，所述电泳的条件为使用2%的琼脂糖凝胶、以TBE为电泳缓冲液，在120V稳压条件下，电泳40min.
8.如权利要求1~7任一所述的分析VDR基因多态性位点Cdx-2的方法在肥胖流行病学研究领域中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103952486SQ201410168692
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月23日 优先权日:2014年4月23日
【发明者】周继昌, 朱玉梅, 刘小立, 杨应周, 杨慧, 郭平, 徐健, 车晓玲 申请人:深圳市慢性病防治中心