利用质谱进行叶酸遗传代谢能力检测的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种用于确定叶酸遗传代谢能力相关基因多态性 位点（SNP)的检测方法及产品，具体而言是利用多重PCR技术、单碱基延伸技术和质谱技 术，叶酸遗传代谢能力的3个基因多态位点进行检测的方法及相应的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 叶酸是B族维生素的一种，参与DNA、RNA、蛋白质等其他重要化合物的合成，在机 体代谢过程中发挥重要的作用，常用于孕期营养补充，从而预防神经管缺陷等疾病。
[0003] 我国患出生缺陷排在前5位的包括：先天性心脏病，神经管畸形，唇腭裂，唐氏综 合症，多指（趾）。根据2003年的统计结果，我国先天性心脏病的发病人数达到11-16万 人。根据2004年的统计结果，我国神经管畸形的发病发生率为9. 44/万。此外，根据2003 年的统计结果，唐氏综合症的发病率位18000人，
[0004] 神经管畸形是指由于胚胎在母体内发育至第3-4周时，神经管未能闭合所造成的 先天缺陷，可导致脊柱裂，脑膨出和无脑畸形。
[0005] 先天性心脏病是器官形成期心血管系统发育导致的一种疾病。研宄表明，HCY可 影响胚胎早期心血管发育，补充叶酸能够明显缓解同型半胱氨酸对心血管的发育毒性，降 低CHD的发病风险。
[0006] 有研宄认为，由于叶酸代谢相关基因的缺陷致叶酸的代谢障碍引起的甲基化导 致染色体不分离，可能是发生唐氏综合征的危险因素。
[0007] 叶酸缺乏引起HCY，从而引起唇腭裂，包括唇裂（俗称：兔唇）和腭裂（俗称：狼 咽）。这种疾病与参与叶酸代谢的基因有很大关系，如果一个婴儿的哥哥或姐姐也有这种先 天缺陷，那这个婴儿便比其他婴儿多30至40倍的可能出现这种缺陷。
[0008] 高同型半胱氨酸血症与妊高征关系密切，可导致血管内皮细胞损伤，并可能是妊 高征的发病因素之一。Hcy的轻中度升高可导致内皮细胞的抗凝功能下降，可以使内皮细 胞合成减少，影响前列环素（PGI2)的合成，而PGI2有抑制血小板的粘附和聚集，增强血 管扩张的作用。
[0009] 孕妇体内叶酸缺乏是造成早产或流产的重要原因之一。叶酸缺乏引起的流产或早 产，采用其它任何补救措施都难以避免。
[0010] 大量的科学研宄表明，叶酸摄入绝对或相对的缺乏，是引起高同型半胱氨酸血症 的直接原因。引起叶酸缺乏的主要原因，遗传因素：机体叶酸利用能力的先天性不足，引起 叶酸缺乏；摄入不足：膳食中叶酸不足或烹调加工损失；需要量增加：孕妇、乳母都处于特 殊的生理状态，叶酸需要量增加，造成相对不足；其它不良因素：酗酒、服用某些药物（如抗 惊厥类药物）等均可导致叶酸的缺乏。
[0011] 亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR)是叶酸代谢的关键酶，催化5, 10-亚甲基四氢叶 酸还原为5-甲基四氢叶酸。人类MTHFR基因位于染色体1ρ36. 3,其中有多个与MTHFR活性 相关的 SNP 位点，例如 G1965A、A1515C、C894T、以及 677C 和 1298A 等。
[0012] MTHFR第1298位碱基A>C突变（rsl801131)，导致谷氨酰胺被丙氨酸取代，产生产 生了三种基因型：野生型（A/A)，杂合突变型（A/C)和纯合突变型（C/C)，引起MTHFR活性 下降，高半胱氨酸转化为蛋氨酸的能力下降，导致血浆中半胱氨酸（Hcy)升高。其中野生 型，杂合突变型和纯合突变型三种基因型在中国人群中分布所占比例为66. 8%，29. 3%和 3. 9%〇
[0013] MTHFR第677位碱基OT突变（rsl801133)，导致编码MTHFR蛋白叶酸结合区域 222位的丙氨酸被缬氨酸取代，产生了三种基因型：野生型（C/C)，杂合突变型（C/T)和纯合 突变型（T/T)，导致MTHFR酶活性降低，同型半胱氨酸在体内积累。其中野生型，杂合突变型 和纯合突变型三种基因型在中国人群中分布所占比例为33%，44%和23%。
[0014] 甲硫氨酸合成酶还原酶（MTRR)能够通过还原型甲基化作用重新生成具有功能活 性的甲硫氨酸合酶，是叶酸代谢的关键酶之一。主要突变型有十余种，其中A2756G在西 方人群中较为常见，另外还有122M(A66G)、S175L、其它一些片段插入缺失和点突变，其中 A66G是最主要和研宄最多的突变。
[0015] MTRR基因第66位碱基A>G突变（rsl801394)，在氨基酸链残基22处蛋氨酸被异亮 氨酸替代，可引起MTRR酶的活性降低，易导致同型半胱氨酸血症、神经管缺陷等疾病。上述 基因位点变异，会显著影响机体的叶酸利用能力，进而引起孕妇发病风险和婴儿出生缺陷。 其中野生型（A/A)，杂合突变型（A/G)和纯合突变型（G/G)三种基因型在中国人群中分布所 占比例为58%，36%和6%。
[0016] 机体叶酸利用能力的先天性不足，引起叶酸缺乏时，需要对补充适当的叶酸，以维 持机体机内正常的生物代谢。我国推荐孕期补充量为400微克/天，可以将显著降低患儿 的出生缺陷，如能够降低NTDs(41% -85% )，但是还有15% -59%却效果不明显，通过增加 合适剂量的叶酸可以进一步降低NTDs。个性化补充叶酸，即让补充叶酸更具有针对性。专 家建议：根据自己的遗传体质，在正确的时间补充合适剂量的叶酸。
[0017] 对MTHFR基因、MTRR基因及其相关位点的检测，可以直接发现被检测者叶酸代谢 方面的遗传缺陷（即叶酸的利用能力），从而根据风险高低（相关代谢酶的活性程度）。如 由发明人和中国疾病预防控制中心妇幼保健中心联合组织的孕期叶酸利用能力检测所提 供的增补参考量：
[0018] 表1 :孕期叶酸利用能力检测所提供的增补参考量表
[0020] 以上补充剂量指合成叶酸补充剂或强化剂的摄入量，不包括食物；对所有成年人 包括孕妇和乳母，合成叶酸制剂的可耐受的最高摄入量（UL)设定为1000微克/天。因此 800微克/天的叶酸制剂是安全的。
[0021] 对叶酸的增补剂量并非越多越好。大量研宄发现，过量补充叶酸会导致以下不良 后果：导致体内锌缺乏。锌是多种酶的活化剂，因此，孕母过量补充会导致胎儿生长缓慢，出 生体重过低。
[0022] 利用现代基因分型技术（荧光PCR，Sanger测序等）检测孕妇的叶酸代谢相关基 因，根据基因分型结果对受检者叶酸利用能力进行分级，进而针对性的调整叶酸补充剂量。 目前常用的检测技术中，测序需对多个位点逐一进行检测，操作复杂，费用较高。芯片法虽 可检测多个位点，但操作过程繁琐，检测费用高。
[0023] 中国实用新型专利ZL 201420084983和发明专利ZL201410067910、名称"单管联 合测定乙醛脱氢酶2基因与亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变位点的试剂盒及检测方法"公 开一种利用多重PCR技术检测亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变位点的方法，该方法能够准 确测定MTHFR的C677T突变位点，从而有利于预测个体对叶酸的代谢能力，指导孕产妇和儿 童补充适合剂量的叶酸补充剂等。但该技术只能检测单一突变位点，且仍然存在传统PCR 扩增检测技术的缺陷。
[0024] 在应用检测MTHFR基因和/或MTRR基因的突变位点的新技术来中，质谱技术显示 出其准确、高效的优势。其中，张孝平等（胰腺癌细胞DPYD、MTHFR基因单核苷酸多态性分 析，《山东医药》2011年第45期；胃癌细胞DPYD、MTHFR基因单核苷酸多态性的检测，《江苏 医药》2011年第17期）和陈宝安等（应用质谱技术检测结肠癌DPYD、MTHFR基因单核苷酸 多态性，《癌变?畸变?突变》第24卷第2期）公开了利用MALDI-T0F质谱技术检测MTHFR 基因的三个 SNPs 位点 G1965A(rs2274976)、A1515C(rsl801131)及 C894T(rsl801133)，结 果发现该位点突变可能导致MTHFR活性改变，影响氟尿嘧啶类药物的体内代谢，且与氟尿 嘧啶类药物的疗效及毒副反应相关。然而，以上技术均是联合检测DPYD基因（二氢嘧啶脱 氢酶基因）和MTHFR基因的突变，通过预测临床预测氟嘧啶类药物的疗效及毒副反应，使肿 瘤患者在选用最佳药物方案、剂量及最大限度地降低药物毒副反应方面受益。因此，研宄人 员根据上述技术的教导，易于想到通过质谱技术检测MTHFR的上述三个位点来确定肿瘤患 者的最佳用药方案，而难以想到对该三个位点进行调整改变，以及难以想到用于指导叶酸 服用人群进行合理摄入叶酸的用途。
[0025] 综合所述，目前存在的技术问题是：缺乏一次能同时检测多个叶酸相关的基因多 态位点的方法和产品，常见的检测技术，如测序、实时荧光定量PCR等，均需对位点逐一进 行检测，当位点较多时操