本数目，按下表的比例取出延伸引物混合液和延伸酶混 合物，置于一个离心管中混匀。由于分装过程中，移液器吸头残留等因素可能造成不足以分 装出所需的份数，建议适当放大混合物的配制体积。例如有10份酶切产物时，可按10. 5-11 份样品配制混合物。
[0142]
[0143] 3. 2在PCR扩增区，按每管酶切产物加入2ul混合物进行分装〇
[0144] 3. 3将PCR反应管置于PCR扩增仪中，按下表的程序进行延伸反应。
[0146] 4.纯化
[0147] 在PCR扩增区向每管延伸产物中加入16ul纯化水，6mg树脂，颠倒混匀30分钟。
[0148] 5.点样
[0149] 使用微量移液器，吸取Iul纯化产物，点样至靶片。
[0150] 实施例四：上机检测及结果判读。
[0151] 使用毅新兴业（北京）科技有限公司生产的Clin-TOF型飞行时间质谱仪对点样 后的靶片进行检测和结果判断。
[0152] 另外，分别设置以上位点的野生型对照A1-A3、突变型对照B1-B3。其中，野生型对 照A1-A3、突变型对照B1-B3分别来自市售或实验室保藏的人工质粒。本发明中所用的野生 型对照质粒A1-A3和突变型对照质粒B1-B3,为在商品化质粒pMD18-T Vector (Takara公 司）的基础上，根据《分子克隆》记载的常规方法，用引物和正常人DNA进行PCR后，将PCR 产物插入PMD18-T Vector，即构建野生型质粒A1-A3,再分别定点突变，即构建3个突变型 质粒B1-B3。所述质粒A1-A3和B1-B3可长期保存于-20°C甘油中，用时活化并提取质粒 DNA0
[0153] 如前述表2所示，3条延伸引物及它们在3个基因多态位点上根据各自基因型产生 的延伸产物具有不同的分子量，这些分子量对应各自的质谱峰，若在某分子量处出现质谱 峰，则判断为存在与该分子量对应的物质（延伸引物或产物）：
[0154] 判断标准：
[0155] (1)若野生型和突变型对应的质谱峰均未出现，无论延伸引物对应的质谱峰是否 存在，均判断为实验失败；
[0156] (2)若野生型或突变型对应的质谱峰仅出现一个，则判断为所出现质谱峰对应的 基因型的纯合型；
[0157] (3)若野生型或突变型对应的质谱峰均出现，则判断为杂合型。
[0158] 质谱结果如图1-9所示，以前述表2所示各位点延伸引物及延伸产物的分子量检 查样本C1-C3的质谱结果（图1-9)，确定各SNP位点的基因型，结果如表3所示：
[0159]
[0160] 表 3
[0161] 即在3例患者中，共检测出rsl801131位点CT杂合型3例，rsl801133位点AC杂 合型1例，AA纯和型2例，rsl801394位点AA纯和型3例。
[0162] 对照实施例一
[0163] 1.根据实施例1，使用以下如表4所示引物，对各位点进行测序：
[0164] 根据提供的位点信息查找出SNP位点，在NCBI中找到基因序列，软件Primer Premier 5.0设计引物，进行PCR扩增（见下表）。
[0165]
[0170] 3. PCR 扩增
[0171] 使用上述确定的引物进行PCR扩增，反应体系：
[0172]
[0173] 使用ABI9700PCR仪进行PCR反应，反应程序为：
[0174] 95°C热启动 5min，94°C变性 30s，60°C退火 30s，72°C延伸 40s，共 35cycles，最后 72°C延伸 lOmin。
[0175] 4. PCR产物序列测序
[0176] 用试剂盒（OMEGA D2500-01)回收PCR扩增目的条带，定量后进行测序。测序反应 体系为：2yL Mix(Bigdye3.1、5X sequencing buffer、H20)，2yL 纯化后的 PCR 产物，IyL 引物（5μπι〇1/υ ;使用ABI9700PCR扩增仪进行测序反应。
[0177] 循环条件为：96°C 2min - (95°C IOs - 50°C 5s - 60°C 4min) X30cycles -终止 反应；
[0178] 测序反应后用试剂盒（OMEGA 1320-01)进行纯化后测序。
[0179] 5.结果分析
[0180] 得到PCR产物扩增的PCR产物切胶回收后，上3730测序，得到的序列，先进行 BLAST，确定所扩增序列确实为目的序列后，用SeqMan进行比对，筛查SNP位点（如下表所 示）：
[0181]
【主权项】
1. 一种用于检测叶酸遗传代谢能力相关的SNP的引物组合物，其序列为： 基因多态位点 扩增引物 延伸引物 MTHFR沾|人|677C>T SEQ ID No：1-2 SEQ ID No：7 MTHFR -^W 1298A>C SEQ ID No：3-4 SEQ ID No: 8 ° MTRR 66 A>G SEQ ID No：5-6 SEQ ID No：92. 权利要求1的引物组合物，其中PCR引物序列为核心序列，其在5'端可包括保护 5-15个碱基序列，优选为10bp的tag:ACGTTGGATG。3. 权利要求1的引物组合物，其中延伸引物5'端可增加作为接头的碱基序列，其中优 选为1-15个碱基，更优选1-3个碱基。4. 由权利要求1至3的引物组合物所制备的用于检测叶酸遗传代谢能力相关基因多态 位点的检测产品。5. 权利要求4的检测产品，其中产品为检测试剂盒，包括： (1) 用于PCR的反应试剂，包括：特异性PCR引物，耐高温的DNA聚合酶，dNTPs，PCR反 应缓冲液； (2) 用于PCR产物纯化的试剂； (3) 用于单碱基延伸反应的试剂，包括：延伸引物，耐高温的单碱基延伸酶，ddNTPs，延 伸反应缓冲液。6. 权利要求5的检测产品，其中试剂盒还可包括：阴性质控品，阳性质控品，纯化用树 月旨，点样及质谱检测用靶片，外切酶，干血片DNA提取试剂等试剂。7. 权利要求5的检测产品，其中用于PCR产物纯化的试剂选自碱性磷酸酶，或碱性磷酸 酶和外切酶Exol，或电泳凝胶回收试剂，或PCR产物纯化柱。8. 权利要求7的产品，其中当包括碱性磷酸酶和外切酶Exol的纯化试剂时，所使用的 PCR引物无需包括保护碱基。9. 使用权利要求1-3的引物组合物，或权利要求4-8的产品来检测叶酸遗传代谢能力 相关基因多态位点的方法，包括： (1) 多重PCR:使用特异性的PCR引物，在一个反应体系中，对3处与叶酸遗传代谢能力 相关的基因多态位点所在DNA区域同时进行扩增，得到含3处基因多态位点所在DNA区域 的PCR产物； (2) PCR产物纯化：对步骤（1)得到的PCR产物进行纯化，以减少对后续反应的干扰； (3) 单碱基延伸：使用3条特异性的延伸引物，在一个反应体系中，对步骤⑵得到的 纯化后PCR产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在对应的SNP位点处延伸一个核苷酸，该核 苷酸与SNP位点处的基因型互补配对； (4) 延伸产物纯化：对步骤（3)得到的延伸产物进行纯化，以获得高纯的延伸产物，避 免盐离子等杂质对后续检测的影响； (5) 质谱仪检测：将步骤（4)得到的纯化产物点在含有基质的靶片上，放入质谱仪进行 进行检测； 其中，所述3个与叶酸遗传代谢能力相关的SNP分别是：MTHFR基因rsl801133位点 (C67H)，MTHFR基因rsl801131 位点（A1298C)，和MTRR基因rsl801394 位点（A66G)。10.权利要求4-9所述的试剂盒在检测3个叶酸遗传代谢能力相关的SNP的用途。
【专利摘要】本发明为利用质谱进行叶酸遗传代谢能力检测，公开了一种检测叶酸遗传代谢能力相关基因多态性位点(SNP)的引物系统。基于该引物系统所制备的产品，能实现同时对叶酸遗传代谢能力相关基因多态位点进行检测。使用该产品，通过检测与叶酸遗传代谢能力相关基因多态位点，为指导备孕妇女和孕妇合理服用叶酸提供参考依据。本发明能在一个反应体系内对不同基因上的3处基因多态位点同时进行检测，较测序、实时荧光定量PCR等技术成本更低，操作更简便，准确度和灵敏度提高。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN104946746
【申请号】CN201510288111
【发明人】马庆伟, 张海燕, 钟逾, 李学媛, 林燕, 向华
【申请人】长沙湘资生物科技有限公司
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年5月28日