作复杂，费用较高。而现有的质谱检测技术，并没有完全公开同时 针对以上多个位点的检测技术，同时这些技术仍然停留在肿瘤检测的相关方面。因此目前 需要一种不同于以往的质谱检测技术，能在同一体系中针对同一个体的多个SNP进行检 测，通过该技术的检测信息，为指导备孕妇女和孕妇合理服用叶酸提供参考依据，从而填补 我国在指导叶酸服用人群进行合理摄入叶酸的领域空白。
【发明内容】
[0026] 本发明基础在于，发明人通过与中国疾病预防控制中心妇幼保健中心联合组织的 检测结果（参见表1)，明确发现不同人群对于叶酸服用需要量存在差异。鉴于人体摄入过 多叶酸存在的副作用，结合现有研宄中的缺陷以及技术误导，通过优化筛选SNP检测位点 和相关检测产品，最终提供了一种联合多重PCR技术、单碱基延伸技术和质谱检测技术，检 测叶酸相关基因多态位点（SNP)的检测方案。其中：在多重PCR中同时扩增3个来自不同 基因、且含SNP的DNA片段；在单碱基延伸过程中，对多重PCR的纯化产物进行多重单碱基 延伸，延伸引物在3个SNP处分别延伸一个核苷酸，使得所延伸的核苷酸类型，分别与SNP 处的基因型相关；单碱基延伸产生由延伸引物和延伸产物组成的待检混合物，以质谱对待 检混合物进行检测，通过质谱峰确定待检混合物中各物质分子量，并与预先计算的各延伸 引物和延伸产物的理论分子量进行比对，从而确定待检混合物是否包含特定的物质，进而 确定各SNP处的基因型。其中，本发明针对MTHFR、MTRR基因中多个SNP位点，结合现有技 术的内容，进行优化筛选，从中确定3个位点作为检测的靶点，即：MTHFR基因 rsl801131位 点（A1298C)，MTHFR 基因 rsl801133 位点（C677T),和 MTRR 基因 rsl801394 位点（A66G)。
[0027] 因此，本发明第一个目的是提供一种用于检测叶酸遗传代谢能力相关的SNP的引 物组合物，其序列如表2所示。
[0028] 表 2
[0030] 其中，所述3个SNP位点分别是：MTHFR基因 rsl801133位点（C677T)，MTHFR基因 rsl801131 位点（A1298C)，MTRR 基因 rsl801394 位点（A66G)。
[0031] 其中，各位点对应的延伸引物及延伸产物分子量如表3所示。
[0032] 表 3
[0033]
[0034] 在一个实施方案中，上述PCR引物序列为核心序列，其在5'端可包括保护碱基序 列，优选5-15个碱基。在一个具体实施方案中，保护碱基序列选自在5'端加入IObp的 tag(ACGTTGGATG)，保护碱基的序列使得PCR引物（即核心引物）的分子量增大，可以避免 反应剩余的PCR引物一并进入质谱检测过程中，以避免干扰检测效果。另外，在一个具体实 施方案中，延伸引物的5'端也可以适量增加碱基序列（如上述保护碱基序列）。增加碱基 序列的目的是当两个基因多态位点对应的延伸引物及产物的分子量接近时，通过给其中一 个延伸引物或两个延伸引物都增加碱基，改变引物及其产物的分子量，与其他延伸引物及 产物的分子量之间拉大差距，提高检测效果。而且，增加后的引物及产物分子量，一定不超 出检测窗口。
[0035] 例如，PCR 引物 SEQ ID NO: 1 为 5' -ACGTTGGATGGTGCATGCCTTCACAAAGCG-3'。在另 一个具体实施方案中，延伸引物的5'端也可以增加作为接头的碱基序列。
[0036] 本发明第二个目的是提供了由上述引物组合物所制备的检测产品。其中，该产品 选自检测试剂盒、检测试剂、检测芯片等。
[0037] 在一个实施方案中，该产品为检测试剂盒，包括：
[0038] (1)用于PCR的反应试剂，包括：特异性PCR引物，耐高温的DNA聚合酶，dNTPs，PCR 反应缓冲液；
[0039] (2)用于PCR产物纯化的试剂；
[0040] (3)用于单碱基延伸反应的试剂，包括：延伸引物，耐高温的单碱基延伸酶， ddNTPs，延伸反应缓冲液。
[0041] 在一个具体实施方案中，该试剂盒还可包括：阴性质控品，阳性质控品，纯化用树 月旨，点样及质谱检测用靶片，外切酶，人基因组DNA提取试剂等试剂。
[0042] 在另一个具体实施方案中，用于PCR产物纯化的试剂：碱性磷酸酶，或碱性磷酸酶 和外切酶ΕχοΙ，或电泳凝胶回收试剂，或PCR产物纯化柱。其中当包括碱性磷酸酶和外切酶 ExoI的纯化试剂时，所使用的PCR引物无需包括保护碱基。
[0043] 本发明第三个目的是使用上述引物组合物、产品或试剂盒来检测叶酸遗传代谢能 力相关的基因多态位点的方法，包括如下步骤：
[0044] (1)多重PCR :使用特异性的PCR引物，在一个反应体系中，对3处与叶酸遗传代谢 能力相关的基因多态位点所在DNA区域同时进行扩增，得到含3处基因多态位点所在DNA 区域的PCR产物；
[0045] (2) PCR产物纯化：对步骤（1)得到的PCR产物进行纯化，以减少对后续反应的干 扰；
[0046] (3)单碱基延伸：使用3条特异性的延伸引物，在一个反应体系中，对步骤（2)得 到的纯化后PCR产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在对应的SNP位点处延伸一个核苷酸， 该核苷酸与SNP位点处的基因型互补配对；
[0047] (4)延伸产物纯化：对步骤（3)得到的延伸产物进行纯化，以获得高纯的延伸产 物，避免盐离子等杂质对后续检测的影响；
[0048] (5)质谱仪检测：将步骤（4)得到的纯化产物点在含有基质的靶片上，放入质谱仪 进行进行检测；
[0049] 其中，所述3个与叶酸遗传代谢能力相关的SNP分别是：MTHFR基因 rsl801131位 点（A1298C)，MTHFR 基因 rsl801133 位点（C677T)，和 MTRR 基因 rsl801394 位点（A66G)。
[0050] 在一个实施方案中，步骤2的纯化过程可以选自碱性磷酸酶消化、碱性磷酸酶和 外切酶ExoI消化、切胶纯化、PCR纯化柱过柱等。在一个具体实施方案中，当使用碱性磷酸 酶消化、或碱性磷酸酶和外切酶ExoI消化进行纯化后，进行高温酶失活处理。
[0051] 本发明第四个目的是提供前述试剂盒在检测3个叶酸遗传代谢能力相关的SNP的 用途。
[0052] 有益效果
[0053] 本发明优点和效果如下：
[0054] 1、敏感：本发明综合了多重PCR、单碱基延伸、质谱检测等技术为一体，既可通过 PCR技术放大检测模板，又可通过质谱技术检测微量样本，综合了两种技术的优点，远远优 于单独使用PCR检测多态性SNP，因此它的检测灵敏度很高。
[0055] 2、特异：单碱基延伸又称为"微测序"，使用特异性探针对DNA分子进行识别，具有 测序技术的高准确性，特异性好、假阳性低等特点；特别的，不同于测序技术延伸数百个碱 基，该技术仅延伸单个碱基，出错概率更低；
[0056] 3、简便安全：操作简单、安全、自动化程度高、防污染；
[0057] 4.快速：速度快、高通量，可在5-6小时内完成数百个样本的检测。
[0058] 5、本发明可对多个已知患者进行检测，分别得到具有不同SNP位点的检测结果， 其中患者可以是单个SNP位点发生突变，也可以是多个SNP位点发生突变。这表示患者可 以携带一个或多个SNP突变，从而为选择合适剂量提供参考信息。
[0059] 6、本发明克服了以往技术一次检测SNP位点过少的缺陷，成本低廉。
[0060] 原理与定义
[0061] 本发明提供了一种联合多重PCR、单碱基延伸和质谱检测等技术，检测与叶酸遗传 代谢能力相关基因多态位点（SNP)的检测方案。其原理在于：
[0062] 在多重PCR步骤中，通过设计并使用合适的引物从而能同时扩增多达3个SNP位 点所在DNA片段。
[0063] 在单碱基延伸步骤中，对上一步多重PCR的产物依次进行纯化和多重单碱基延 伸。其中，延伸引物共3条，分别与3个SNP位点对应，并在对应的SNP位点处延伸一个核 苷酸，该核苷酸与SNP位点处的基因型互补配对（如某SNP位点处是A基因型，将在对应的 延伸引物上延伸T核苷酸）。在单碱基延伸步骤中，采用ddNTP代替dNTP，因此，在延伸一 个碱基后，延伸引物将终止延伸。
[0064] 在质谱检测过程中，单碱基延伸产物在脱盐纯化后，点至含基质的靶片，并在真空 环境中被激光激发，通过飞行管至检测器。不同物质通过飞行管的时间与它们的分子量呈 负相关，即分子量越大，飞行速度越慢，到达检测器的时间越晚。
[0065] 术语"检测产品"，指用于检