一种狂犬病灭活疫苗的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种狂犬病灭活疫苗的制备方法，其包括以下步骤：对仓鼠肾细胞系进行细胞的复苏、传代与培养的步骤；然后对处理后的仓鼠肾细胞进行毒种繁殖、毒液繁殖的步骤；制备疫苗佐剂，然后按照毒液总量0.025％的比例加入B-丙内酯，在4℃条件下灭活24小时，然后在37℃条件下水解2小时，然后按照水解后细胞毒液与疫苗佐剂9:1的比例进行定量分装，得到狂犬病灭活疫苗。使其具有操作简单、工艺稳定、疫苗病毒含量高、质量易控等优点，可显著提高疫苗产量和质量，并且采用本发明制备方法制得的疫苗安全性好、免疫力高、制造成本低。
【专利说明】一种狂犬病灭活疫苗的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种狂犬病灭活疫苗的制备方法。
【背景技术】
[0002]目前我国生产犬用狂犬病灭活疫苗主要用传统的转瓶培养细胞生产，此方法成本高、毒价低、劳动强度大。同时因各个转瓶都是独立单元，每瓶的细胞质量、病毒滴度均不相同，致使生产出的疫苗质量不稳定、批量差异大。因此，现有技术还有待于更进一步的改进和发展。
【发明内容】
[0003]鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种狂犬病灭活疫苗的制备方法，以提高制作工艺的稳定性与病毒含量。
[0004]本发明的技术方案如下:
[0005]一种狂犬病灭活疫苗的制备方法，其包括以下步骤:
[0006]A、对仓鼠肾细胞系进行细胞的复苏、传代与培养的步骤；
[0007]B、然后在步骤A处理后的仓鼠肾细胞进行毒种繁殖、毒液繁殖的步骤；
[0008]C、制备疫苗佐剂，然后按照毒液总量0.025%的比例加入B-丙内酯，在4°C条件下灭活24小时，然后在37°C条件下水解2小时，然后按照水解后细胞毒液与疫苗佐剂9:1的比例进行定量分装，得到狂犬病灭活疫苗。
[0009]所述的制备方法，其中，所述步骤A具体的包括:
[0010]先用方瓶培养从液氮中复苏的仓鼠肾细胞，待其长成单层后经胰酶消化传代，加入细胞生长液继续培养，形成单层的细胞并继续放大传代培养。
[0011]所述的制备方法，其中，所述步骤A具体的包括:在细胞接种密度为
2-3X103cells/ml，溶氧量为 30% -60%, Ph 值为 7.2-7.4，温度为 36°C _37°C，转数为 50r/min-60r/min，培养基为DMEM:199 = 1: 1，在此条件下对仓鼠肾细胞进行全悬浮培养。
[0012]所述的制备方法，其中，所述步骤B具体的包括:取步骤A中生长良好的单层仓鼠肾细胞，接种含狂犬病 病毒的维持液，继续培养4-6天获得狂犬病毒种。
[0013]所述的制备方法，其中，所述步骤B具体的包括:
[0014]将狂犬病毒种在接种量为1% _2%，溶氧量为30% -60%, Ph值为7.2-7.4，转数为50r/min-60r/min，培养基为DMEM:199 = 1:1，温度为32°C _34°C的条件下继续培养4-6天，当病毒含量达到107 5TCID5(l/ml时得到狂犬病毒液，将狂犬病毒液在_20°C条件下保存。
[0015]所述的制备方法，其中，所述细胞生长液为99% -97%的MEM199液与1% -3%的胎牛血清，且细胞生长液的Ph值为7.2-7.4。
[0016]本发明提供的一种狂犬病灭活疫苗的制备方法，采用复苏、传代、培养、毒种繁殖、毒液繁殖与灭活分装的步骤，使其具有操作简单、工艺稳定、疫苗病毒含量高、质量易控等优点，可显著提高疫苗产量和质量，并且采用本发明制备方法制得的疫苗安全性好、免疫力高、制造成本低。与现有技术相比，本发明的制备方法细胞生长液血清中的浓度可降低至1% -3% ;不仅能提高细胞生长密度，提高病毒滴度，能生产出的病毒液均一稳定，显著提高了疫苗的产量和质量，
【具体实施方式】
[0017]本发明提供了一种狂犬病灭活疫苗的制备方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0018]本发明提供了一种狂犬病灭活疫苗的制备方法，其包括以下步骤:
[0019]步骤101:对仓鼠肾细胞系进行细胞的复苏、传代与培养的步骤；
[0020]步骤102:然后在步骤:101处理后的仓鼠肾细胞进行毒种繁殖、毒液繁殖的步骤；
[0021]步骤103:制备疫苗佐剂，然后按照毒液总量0.025%的比例加入B-丙内酯，在4°C条件下灭活24小时，然后在37°C条件下水解2小时，然后按照水解后细胞毒液与疫苗佐剂9:1的比例进行定量分装，得到狂犬病灭活疫苗。
[0022]更进一步的，所述步骤101具体的包括:
[0023]先用方瓶培养从液氮中复苏的仓鼠肾细胞，待其长成单层后经胰酶消化传代，加入细胞生长液继续培养，形成单层的细胞并继续放大传代培养。 [0024]在本发明的另一较佳实施例中，所述步骤101具体的还包括:在细胞接种密度为
2-3X103cells/ml，溶氧量为 30% -60%, Ph 值为 7.2-7.4，温度为 36°C _37°C，转数为 50r/min-60r/min，培养基为DMEM:199 = 1: 1，在此条件下对仓鼠肾细胞进行全悬浮培养。
[0025]更进一步的，所述步骤102具体的包括:取步骤101中生长良好的单层仓鼠肾细胞，接种含狂犬病病毒的维持液，继续培养4-6天获得狂犬病毒种。并且将狂犬病毒种在接种量为I % -2 %,溶氧量为30 % -60%, Ph值为7.2-7.4，转数为50r/min-60r/min,培养基为DMEM:199 = 1:1，温度为32°C _34°C的条件下继续培养4_6天，当病毒含量达到107_5TCID5ciAil时得到狂犬病毒液，将狂犬病毒液在_20°C条件下保存。
[0026]在步骤101中的所述细胞生长液为99% -97%的MEM199液与1% _3%的胎牛血清，且细胞生长液的Ph值为7.2-7.4。
[0027]为了更进一步描述本发明，以下列举更详尽的实施例进行说明。
[0028](I)筛选适宜细胞系:将狂犬病毒株接种于仓鼠肾传代细胞上，不断培养传代，控制培养条件，Ph值7.2-7.4、温度32°C _34°C，使病毒适应细胞，检测病毒增殖滴度，当所需病毒含量每毫克达到>107_5TCID5tZml，筛选出适宜细胞；
[0029](2)制苗用细胞的传代与培养:长成单层的细胞经胰酶消化传代，加入细胞生长液于37°C条件下继续培养，形成良好单层的细胞并继续放大传代培养，培养条件为:DMEM:
199= 1:1, Ph值为7.2-7.4，温度为36°C _37°C，培养时间为48小时-72小时；
[0030](3)仓鼠肾细胞的生物反应器全悬浮培养:将长成单层的仓鼠肾细胞经胰酶细胞分散液消化为单个细胞，接种于生物反应器中，细胞接种密度为2-3X103cellS/ml，溶氧量为 30% -60%，Ph 值为 7.2-7.4，温度为 36°C _37°C，转数为 50r/min_60r/min，培养基为DMEM: 199 =1:1。[0031](4)细胞毒种的繁殖:将生长良好的单层仓鼠肾细胞，接种含狂犬病病毒的维持液，继续培养4-6天获得狂犬病毒种；
[0032]细胞毒种的鉴定:细胞毒种鉴定完全符合狂犬病病毒CVS-1l株毒种标准，细胞毒种每毫升病毒含量>107_ 5TCID50/mL.[0033](5)细胞毒液的繁殖:将狂犬病毒种在接种量为1% _2%，溶氧量为30% -60%,Ph 值为 7.2-7.4，转数为 50r/min-60r/min，培养基为 DMEM: 199 = 1:1，温度为 32°C -34°C的条件下继续培养4-6天，当病毒含量达到107 5TCID5(l/ml时得到狂犬病毒液，将狂犬病毒液在-20°C条件下保存。
[0034](6)病毒的灭活、配苗与分装:制备疫苗佐剂，然后按照毒液总量0.025%的比例加入B-丙内酯，在4°C条件下灭活24小时，然后在37°C条件下水解2小时，然后按照水解后细胞毒液与疫苗佐剂9:1的比例进行定量分装，得到狂犬病灭活疫苗。
[0035]安全检测
[0036]用体重11克-13克的小白鼠8只，各腹腔注射疫苗0.5ml，观察7日，全部健活，无不良反应。并与市面上的狂犬疫苗进行比较，其结果如表1所示。
[0037]表1
[0038]
【权利要求】
1.一种狂犬病灭活疫苗的制备方法，其包括以下步骤: A、对仓鼠肾细胞系进行细胞的复苏、传代与培养的步骤； B、然后在步骤A处理后的仓鼠肾细胞进行毒种繁殖、毒液繁殖的步骤； C、制备疫苗佐剂，然后按照毒液总量0.025%的比例加入B-丙内酯，在4°C条件下灭活24小时，然后在37°C条件下水解2小时，然后按照水解后细胞毒液与疫苗佐剂9:1的比例进行定量分装，得到狂犬病灭活疫苗。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A具体的包括: 先用方瓶培养从液氮中复苏的仓鼠肾细胞，待其长成单层后经胰酶消化传代，加入细胞生长液继续培养，形成单层的细胞并继续放大传代培养。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A具体的包括:在细胞接种密度为 2-3X103cells/ml，溶氧量为 30% -60%, Ph 值为 7.2-7.4，温度为 36°C -37。。，转数为50r/min-60r/min，培养基为DMEM:199 = 1: 1，在此条件下对仓鼠肾细胞进行全悬浮培养。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B具体的包括:取步骤A中生长良好的单层仓鼠肾细胞 ，接种含狂犬病病毒的维持液，继续培养4-6天获得狂犬病毒种。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B具体的包括: 将狂犬病毒种在接种量为I % -2%，溶氧量为30% -60%, Ph值为7.2-7.4，转数为50r/min-60r/min，培养基为DMEM:199 = 1:1，温度为32°C _34°C的条件下继续培养4-6天，当病毒含量达到107 5TCID5(l/ml时得到狂犬病毒液，将狂犬病毒液在_20°C条件下保存。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述细胞生长液为99% -97 %的MEM199液与1% -3%的胎牛血清，且细胞生长液的Ph值为7.2-7.4。
【文档编号】C12R1/93GK103948919SQ201410168670
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年4月23日 优先权日:2014年4月23日
【发明者】吴金, 张中洋, 高玉龙, 任培森, 李晓莉, 杨金梅, 孙岩 申请人:吉林和元生物工程有限公司