专利名称：一种含有mrp-2基因3′utr和报告基因的重组质粒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学领域，更具体地说，涉及一种含有MRP-2基因的3' UTR和报告基因的重组质粒及其生产方法和应用。
背景技术：
肿瘤多药耐药(multidrug resistance, MDR)是指肿瘤细胞对多种药物产生抗药性的同时，对其他结构不同、靶位不同、作用方式不同的抗肿瘤药物均产生的交叉耐药性。多药耐药是最重要、最常见的肿瘤耐药现象，成为肿瘤治疗中最大的障碍之一。多药耐药相关蛋白MRP-2是三磷酸腺苷(ATP)结合盒运载体基因家族成员之一，也称ABCC2 (ATP-binding cassette, subfamily C, member 2)，又名管状多特异性有机阴离子转运蛋白(cMOAT)，是近几年新发现的一个与肿瘤多药耐药相关的基因。MRP-2转运的抗癌药物包括甲氨蝶呤、多柔比星、表柔比星、米托蒽醌、长春碱、顺钼、依托泊苷和一些两性阴离子药物及内源性的化合物如葡萄糖醛酸盐和硫酸盐等。近几年，MRP-2介导的MDR是研究多药耐药机制的热点之一。随着人类基因组计划的完成和模式生物基因组计划的进行，人们对于占人类基因组95%以上的非编码序列的研究日益加强。研究发现，它们中很多是具有生物学功能和意义的片段，在这些研究之中，对于大小约21-23个碱基的单链小分子RNA的microRNA的研究则是最为热点之一。在近几年肿瘤的研究中，关于microRNA对于肿瘤的功能与调控的研究一直是肿瘤治疗领域的热点之一，取得了很大的突破与进展。目前研究表明，microRNA 主要是通过结合到靶标基因的3' UTR区域，进而抑制靶标基因的转录，因此基因的3' UTR的抑制程度能够指示该基因受到microRNA抑制的水平。然而，现阶段对于多药耐药与 microRNA的相关研究报道并不多见，对MRP-2蛋白与microRNA的研究更是鲜有报导，目前没有一种简便、快捷的方法用来筛选能够抑制多药耐药蛋白的microRNA。
发明内容
本发明的目的是，提供一种含有MRP-2基因3' UTR和报告基因的重组质粒。本发明的第二个目的是，提供上述重组质粒的制备方法。本发明的第三个目的是，提供上述重组质粒在筛选抑制MRP-2基因3 ‘ UTR活性的microRNA中的应用。为了实现上述第一个目的，本发明提供的技术方案为一种含有MRP-2基因3' UTR和报告基因的重组质粒，所述报告基因为萤火虫荧光素酶基因pGL3。为了实现上述第二个目的，本发明提供的技术方案为一种含有MRP-2基因3' UTR和报告基因的重组质粒的制备方法，包括以下步骤
(1)用pGL3-pr0m0ter质粒转化常规制备的DH5 α感受态细胞，进行扩增，碱裂解法制备pGL3-pr0m0ter质粒，电泳检测质粒的纯度和含量，用NcoI和HindIII对质粒进行双酶切，试剂盒凝胶回收大片段的酶切产物；
(2)MRP-2基因的3'UTR序列的克隆、酶切及纯化，所用的引物为引物 1: 5' - CCCAAGCTTTGGGTTAGAAAAGGAC -3'；
引物 2: 5' - CATGCCATGGTTCAGGACAGTGGTTGT -3'；
以基因组DNA为模板，利用常规PCR反应进行扩增，用试剂盒凝胶回收PCR产物，将回收的PCR产物用NcoI和HindIII双酶切；
(3)将上述获得的pGL3-pr0m0ter载体和MRP-2基因3'UTR片段进行连接反应；
(4)筛选重组子，将上述连接产物直接转化感受态大肠杆菌，经过含有氨苄青霉素的LB 培养基中选择培养，从转化子的平板上随即挑取菌落，扩增培养后用碱裂解法少量提取质粒备用，经过酶切、PCR、测序鉴定。为了实现上述第三个目的，本发明提供的技术方案为一种含有MRP-2基因3' UTR和报告基因的重组质粒在筛选抑制MRP-2基因3 ‘ UTR活性的microRNA中的应用。作为一个优选方案，用PGL3-MRP-2-3 ‘ UTR-promoter质粒联合海肾荧光素酶PRL-SV40质粒共转染耐药型肿瘤细胞系，通过同时检测两种荧光素酶活性来反应 microRNA对MRP-2基因3 ‘ UTR活性的抑制作用。作为又一个优选方案，所述耐药型肿瘤细胞系为结肠癌细胞系HCT116/L-0HP。本发明的优点在于，通过同时检测萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性来反应microRNA对于MRP-2基因3 ‘ UTR区的抑制活性，即其对于MRP-2的抑制活性，从而建立靶向筛选逆转肿瘤多药耐药的microRNA的方法。该方法在筛选逆转肿瘤多药耐药的 microRNA、研究逆转肿瘤多药耐药与microRNA之间的作用机理以及研究肿瘤细胞多药耐药microRNA水平的机制等方面有极佳的应用前景。
图1为MRP-2基因3' UTR序列的克隆，其中Marker为DL2000，1和2为MRP-2 基因 3' UTR 片段(261bp)。图 2 为 pGL3-MRP-2-3 ‘ UTR-promoter 重组质粒的 Nhe I 和 Bgl II 双酶切检测， 其中 Markerl 为 DL10000, Marker2 为 DL2000，1 和 2 为 pGL3-MRP_2_3‘ UTR-promoter/ HindIII + NcoI (5010bp+261bp)。图 3 为运用 pGL3-MRP-2-3 ‘ UTR-promoter 质粒在 HCT116/L-0HP 细胞中筛选对于MRP-2基因3 ‘ UTR活性有影响的microRNA，以空白pGL3-promoter质粒荧光活性为 Control，l 为空白、2 为 hsa_miR-148a、3 为 hsa_miR-222、4 为 hsa_miR-297、5 为 hsa_miR-630、6 为 hsa-miR-1915。图 4 为检验 pGL3-MRP-2-3' UTR-promoter 质粒在 HCTl 16/L-0HP 细胞中筛选出的对于MRP-2基因有抑制作用的microRNA，1为hsa_miR-148a、2为hsa_miR-222、3为 hsa-miR-297>4 % hsa-miR-630>5 % hsgi_miR_1915。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的含有MRP-2基因3' UTR和报告基因的重组质粒的构建和应用的具体实施方式
做详细说明。
实施例1、构建含有MRP-2基因3' UTR和报告基因的重组质粒一、试验材料
1、菌株、质粒
(1)菌株大肠杆菌E.C0liDH5a，耐药性型大肠癌细胞株HCT116/L-0HP由华东理工大学药理实验室诱导，对于奥沙利钼的IC5tl为167μ g/ml，耐药倍数为9. 7 ；
(2)质粒pGL3-promoter和pRL_SV40为本实验室保存。2、生化试剂
(1)ExTaq酶，限制性内切酶 Hindlll，NcoI 和 DNA Ligation Kit 购自 TaKaRa 公司。 DL2000 marker 和 λ DNA/Hind III marker 购自上海 MajorBio 公司。PRMI 1640 培养液 (Hyclone)； Lipofect Transfection Reagent (TIANGEN, Beijing)；
(2)双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自KenReal公司。质粒回收试剂盒和DNA片段回收试剂盒购自Tiangen公司；
(3)小牛血清购自民海生物公司。BSA，NaCl，NaF,Tris, EDTA, Trytone，Yeast Extract, PMSF, PAGE, SDS, Tween-20，G250，硼酸，甘氨酸，亮肽，蛋白显影液等试剂购自上海MajorBio 公司。MRP-2，β-actin抗体购买于cell signal公司。3、主要试剂的配制
100mg/mL 牛血清白蛋白(BSA):称取 BSA 0. Ig 溶于 ImL 0. 15 M NaCl, - 20° C 保存。 制作蛋白标准曲线时，用0. 15M NaCl进行100倍稀释成lmg/mL，一 20° C保存。蛋白电泳缓冲液(5X):称取Tris 15. lg，甘氨酸94g，SDS 5g溶于IL超纯水，室温保存。蛋白转移缓冲液(5X )称取Tris 29g，甘氨酸14. 5g，SDS 1. 85g溶于IL超纯水， 室温保存。临用前稀释为IX，每升加入甲醇200 mL。1.5 M Tris ‘ HCl CpH 8. 8)称取 Tris 45. 43g 溶于 200mL，浓盐酸调 pH 至 8. 8， 超纯水定容至250 mL，4° C保存。0. 5 M Tris · HCl (pH 6. 8)称取 Tris 15. 14g 溶于 200mL，浓盐酸调 pH 至 6. 8， 超纯水定容至250 mL，4° C保存。30%丙烯酰胺称取丙烯酰胺29g，甲叉双丙烯酰胺Ig溶于100 mL，滤纸过滤于棕色瓶中4° C保存。TBS缓冲液(5X )称取Tris 24. 2g，NaCl 80g溶于IL超纯水，室温保存。TBST 缓冲液(含 0. 1% Tween-20 的 TBS 缓冲液):量取 Tween-20 ImL 溶于 IL TBS, 即可使用，最好现用现配。封闭液(含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液)称取脱脂奶粉5g溶于IOOmL TBST，溶
解后4° C保存。G250考马斯亮蓝溶液(测蛋白含量专用)称取G250 lOOmg，溶于50mL 95%乙醇， 量取IOOmL磷酸，超纯水定容至1L，滤纸过滤，4° C保存。1 M Tris · HCl CpH 7. 5)称取 Tris 30. 29g 溶于 200mL 超纯水，浓盐酸调 pH 至 8. 8，超纯水定容至250 mL，4° C保存。1 M DTT 称取 DTT 3. 085g 溶于 20mL 0. OlM 乙酸钠溶液，-20° C 保存。20mg/mL PMSF 称取 PMSF 0. 2g 溶于 IOmL 异丙醇，-20° C 保存。
细胞总蛋白提取液称取NaCl 0. 73g，NaF 0. 524g，EDTA 0. 931g，SDS 0. 25g，去氧胆酸钠 2. 5g，量取 Triton-100 2. 5mL, 1 M Tris · HCl (pH 7.5) 2. 5mL，超纯水定容至 250mL，4° C 保存。用时每毫升提取液中加 1 μ L DTT(lM)、5yL PMSF (20mg/mL)、10 μ L 亮肽(2. 5mg/mL)即可。SDS-聚丙烯酰胺分离胶(5mL)
权利要求
1.一种含有MRP-2基因3' UTR和报告基因的重组质粒，其特征在于，所述报告基因为萤火虫荧光素酶基因。
2.权利要求1所述的一种含有MRP-2基因3'UTR和报告基因的重组质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)用pGL3-pr0m0ter质粒转化常规制备的DH5α感受态细胞，进行扩增，碱裂解法制备pGL3-pr0m0ter质粒，电泳检测质粒的纯度和含量，用NcoI和HindIII对质粒进行双酶切，试剂盒凝胶回收大片段的酶切产物；(2)MRP-2基因的3'UTR序列的克隆、酶切及纯化，所用的引物为引物 1: 5' - CCCAAGCTTTGGGTTAGAAAAGGAC -3'；引物 2: 5' - CATGCCATGGTTCAGGACAGTGGTTGT -3'；以基因组DNA为模板，利用常规PCR反应进行扩增，用试剂盒凝胶回收PCR产物，将回收的PCR产物用NcoI和HindIII双酶切；(3)将上述获得的pGL3-pr0m0ter载体和MRP-2基因3'UTR片段进行连接反应；(4)筛选重组子，将上述连接产物直接转化感受态大肠杆菌，经过含有氨苄青霉素的LB 培养基中选择培养，从转化子的平板上随即挑取菌落，扩增培养后用碱裂解法少量提取质粒备用，经过酶切、PCR、测序鉴定。
3.权利要求1所述的一种含有MRP-2基因3'UTR和报告基因的重组质粒在筛选抑制MRP-2基因3 ‘ UTR活性的microRNA中的应用。
4.根据权利要求3所述的一种含有MRP-2基因3'UTR和报告基因的重组质粒在筛选抑制MRP-2基因3 ‘ UTR活性的microRNA中的应用，其特征在于，用pGL3_MRP-2_3 ‘ UTR-promoter质粒联合海肾荧光素酶pRL_SV40质粒共转染耐药型肿瘤细胞系，通过同时检测两种荧光素酶活性来反应microRNA对MRP-2基因3 ‘ UTR活性的抑制作用。
5.根据权利要求3所述的一种含有MRP-2基因3'UTR和报告基因的重组质粒在筛选抑制MRP-2基因3 ‘ UTR活性的microRNA中的应用，其特征在于，所述耐药型肿瘤细胞系为结肠癌细胞系HCT116/L-0HP。
全文摘要
本发明公开了一种含有MRP-2基因3′UTR和报告基因的重组质粒及其应用，将构建的MRP-2基因3′UTR报告基因载体与pRL-SV40载体及所需筛选的microRNA共转染到耐药型的结肠癌细胞系中，通过同时检测萤火虫和海肾荧光素酶的活性来反应microRNA对于MRP-2基因3′UTR区的抑制活性，从而建立靶向筛选逆转肿瘤多药耐药的microRNA的方法。该方法在筛选逆转肿瘤多药耐药的microRNA、研究逆转肿瘤多药耐药与microRNA之间的作用机理以及研究肿瘤细胞多药耐药microRNA水平的机制方面有极佳的应用前景。
文档编号C12N15/66GK102492712SQ201110437408
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月23日 优先权日2011年12月23日
发明者刘建文, 徐可, 梁欣, 江林, 沈克, 程卓安 申请人:华东理工大学