专利名称：多肽药物的高效基因工程生产方法
技术领域：
本发明涉及一种用真核或原核细胞表达小肽或低分子量多肽(肽链长度小于50个氨基酸残基)生物活性物质的基因工程生产方法。包括Leptin(瘦素)片段(Leptin 22-56)、Systemin、生长激素释放因子GRF(1-40)、粘连蛋白片段(Fibronectin 1954-1959)、赖氨酸胸腺因子(Lys-Thymic Factor)、干细胞去肉芽肽(Mast Cell Degranalating Peptide)、胸腺肽α1(Thymosin α1)、生长激素释放因子片段(1-29)(GRF 1-29)、血管生成素片段(Angiogenin 108-123)、血管生成素片段(Angiogenin 108-122)、神经肽Y(Neuropeptide Y)、Vasonatrin肽(VNP)、生长激素释放因子GRF(1-44)、神经肽Y片段(Neuropeptide Y 2-36)、促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)、酪氨酸型—促肾上腺皮质激素释放因子(Tyr-CRF)、Thymopoietin II片段(29-41)、纤维蛋白原结合抑制肽、β10胸腺肽(Thymosin β10)、粘附抑制肽(I)、Tritrpticin、Leptin片段(116-130)、RGD肽III、β-胸腺肽片段(16-38)(Thymosin 16-38)、Cecropin A、CD36(93-110)cys、缓激肽增效剂C(Bradykinin Potentiator C)、缓激肽增效剂B(Bradykinin Potentiator B)、胸腺化学激活素(Thymus and Activation Regulated Chemokine)、RGD肽II、BPP 9a、Defensin HNP-I、Backenecin、HIV(gp 120)片段(315-329)、血管紧张肽原酶抑制剂、成纤维细胞生长因子片段(FGF basic 119-126)、Parasin I、肿瘤坏死因子α片段(159-178)、WP9QY、尿胰蛋白酶抑制剂片段(Urinary Trypsin In-hibitor Fragment)、吗啡调节神经肽I、神经肽Y片段(22-36)(Neuropeptide Y22-36)、吗啡调节神经肽II、Neuropeptide FF(NpFF)、α-海葵毒素GI(α-Cono-toxin GI)、Defensin HNP-1、HIV(gp 120)片段(308-331)、细胞间粘附因子片段(1-23)(Intercellular Adhesion Molecular 1-23)、Tachyplesin I、Polyphemusin II衍生肽(Polyphemusin II-Derived Peptide)、内毒素抑制剂(EndotoxinInhibitor)、α-海葵毒素MI(α-Conotoxin MI)、蛙皮抗菌肽I(magainin I)、蛙皮抗菌肽II(Magainin II)、神经肽Y片段(22-36)(Neuropeptide Y 22-36)、肝素结合肽(I)、成纤维细胞生长因子受体结合抑制肽、粘连蛋白吸附促进肽(FibronectinAdhesion Promoting Peptide)、促肾上腺皮质激素片段ACTH(1-24)、CecropinB、促肾上腺皮质激素ACTH(1-17)、CDR-H31C2、血管紧张素转化酶抑制肽(金枪鱼)、C型促尿钠排泄肽(C-Type Natriuretic Peptide 32-53)、Tachyplesin I、凝血酶受体模拟肽、黄体激素释放激素(LHRH)、C—反应蛋白片段(174-185)(C-Reactive Protein 174-185)、血管紧张素III(Angiotensin III)、血管紧张素II(An-giotensin II)、β-白细胞介素前体蛋白片段(110-123)、糖蛋白II b片段300-312(Glycoprotein II b Fragment 300-312)、RGD肽、RGD环肽I、粘连蛋白片段1978-1982(Fibronectin cs-1 Fragment1978-1982)、粘连蛋白片段(1978-1985)(Fi-bronectin cs-1 Fragment 1978-1985)、糖蛋白II b片段(296-306)(Glycoprotein IIb Fragment 296-306)、心房促尿钠排泄因子(1-28)(Atrial Natriuretic Factor1-28)、水蛭肽Hirullin、粘连蛋白片段(196-203)(Fibronectin Fragment 196-203)、海葵毒素α-Conotoxin IMI、HIV(gp 120)片段(315-329)、HIV(gp41)片段、促红细胞生成模拟肽(Erythropoietin Mimetic Peptide Sequence 20)、Laminin片段、β-淀粉样蛋白片段(25-35)、细胞肿瘤抗原P53片段(361-382)、α1-胸腺肽。尤其是人B-型促尿钠排泄肽(BNP)的制备、人α1-胸腺肽的制备、gp120片段315-329的制备、C反应蛋白片段174-185的制备、血管加压素转化酶抑制肽的制备。
目前，用基因工程生产低分子量多肽的常用方法是将单个目标肽段分子的核酸序列与载体蛋白基因连接，首先表达融合蛋白，再用酶解法使目标肽段分子从融合蛋白中释放出来。
其缺点是采用融合蛋白方法表达的目标肽段成份在融合蛋白中仅占10％左右，效率低，生产成本较高。
另一种生产低分子量多肽的常用方法是化学合成法，其缺点是生产过程涉及对功能基因的保护和去保护，而且某些氨基酸合成掺入的效率较低，因此当合成的多肽分子的片段较长时，往往产率较低。此外，化学合成法所用的原材料对环境有害，此微的掺入影响终产品的纯度。
本发明的目的就是为了解决上述问题，提出一种可提高目标多肽的产量且生产成本低的多肽药物的高效基因工程生产方法。
本发明的技术解决方案一种多肽药物的高效基因工程生产方法，其特征在于它在DNA水平上，将目标肽段的DNA序列串联为多聚体，并用原核或真核细胞表达小肽或低分子量多肽的串联重复多聚体。
本发明通过将目标肽段分子的基因序列重复串联为多聚体，用原核或真核细胞表达，并用酶学或化学方法将目标肽段的多聚体断裂加工为目标肽段单体，该方法能够使表达产物几乎全为目标肽段成分，同时，本发明可以有效表达5-50个氨基酸长度的目标肽段，因此，生产成本较低。
本发明首先用化学合成目标肽段的单体(对多肽而言)或多体(对小肽而言)核苷酸序列，这使我们可以针对表达的宿主(真核或原核细胞)，选择其优先使用的密码子，从而使产物的表达效率进一步提高。
本发明可以在目标肽段的串联重复基因序列的5′端或3′端插入适当的核苷酸序列，使得表达的目标肽段多聚体能够进行亲和层析(如携带抗原序列或组氨酸6聚体)，从而使多肽聚合体在加工断裂前得到高效纯化。
本发明利用同尾酶的特性，可以很方便地使目标肽段单体分子定向克隆为多聚体，且多聚体的聚合度可以随意选择(2，3，4，5…体)。目前已经发现核酸限制性内切酶中存在近百对同尾酶(见附表I)，使得多肽单体分子中间间隔序列的选择设计更加灵活方便。
实例1 人B-型促尿钠排泄肽(BNP)的制备人B-型促尿钠排泄肽(Human b-type Natriuretic Peptide)主要由心肌细胞产生，可使机体的血压下降，临床可用于治疗代偿机能障碍而引起的心率衰竭，并对溶栓药物治疗急性心肌梗塞有辅助疗效，可以增加心指数，提高心输出量，改善血液动力学指标[4，5]。
BNP的氨基酸序列如下Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-
Val-Leu-Arg-Arg-His根据BNP氨基酸组成特点，我们在BNP单体分子间插入色氨酸(Trp)作为多聚体表达产物加工断裂的位点，我们将核酸内切酶Pst I的识别序列
置于BNP核苷酸序列的5′端，将内切酶Nsi I的识别序列
置于BNP核苷酸序列的3′端，Pst I和Nsi I是一对同尾酶，它们产生的粘性末端连接后产生的序列
以及
不能被Pst I和Nsi I识别切割，且两对密码子ATG、CAG是己coli中使用几率较高的密码子(分别编码Met和Gln)。我们采用E.coli表达BNP，因此我们根据E.coli中常用或较常使用的密码子来合成BNP单体及间隔片段的核苷酸序列
其中带下划线的核苷酸序列为插入序列，由小写字母组成的序列分别为Pst I和Nsi I的识别位点，用于BNP基因多聚体的拼接，接入序列中的TGG编码色氨酸(Trp)，是BNP多聚体表达产物加工为BNP单体的断裂位点。我们在Pst I识别序列之前以及Nsi I识别序列之后分别加上了核酸内切酶Nde I和Xho I的识别序列(斜体字母)，目的是为了将串连好的多聚体能方便地装入表达载体，在BNP单体及间隔片段的酶切拼接过程中，Nde I或Xho I的识别序列均被去除，因而间隔片段中并不包含Nde I或xho I序列，该序列仅存于BNP单体或重复串联多聚体的5′端或3′端。一、BNP单体基因的构建我们采用聚合酶链反应(PCR)方法将上述合成的DNA片段作为模板，并扩增为双链。PCR引物的核苷酸序列如下1．CAT ATG CTG CAG TGG TCC CCG AAA2．CTC GAG ATG CAT CCA GTG ACG ACG扩增产物直接连到PCR4-TOPO(TA载体，Invitrogen产品，参见附III第55页)载体中并转导TOPO-10菌，插入序列经测序鉴定，即可得到BNP单体基因质粒TOPO-BNP(1)。(注括号内1代表单体，2代表双体，3代表3体，以此类推)。二、BNP多聚体基因的构建首先将BNP(1)分别用Nsi I/Not I，以及Pst I/Not I酶切，将Nsi I/Not酶切后纯化回收的DNA大片段与Pst I/Not I酶切后纯化回收的DNA小片段连接，连接产物转导至TOPO-10菌中扩增DNA，此时可得到BNP基因的二聚体质粒TOPO-BNP(2)。将TOPO-BNP(2)分别用Nsi I/Not I，以及Pst I/Not I酶切，将Nsi I/Not I酶切后纯化回收的DNA大片段与Pst I/Not I酶切后纯化回收的DNA小片段连接，连接产物转导TOPO-10菌以扩增DNA，即可得到BNP基因的四聚体TOPO-BNP(4)。重复上述方法即可得到BNP基因的八聚体TOPO-BNP(8)。将TOPO-BNP(2)用Nsi I/Not I酶切并回收纯化其DNA大片段，将TOPO-BNP(8)用Pst I/Not I酶切并回收纯化其DNA小片段，把这两个片段连接并转导至TOPO-lO菌中扩增DNA质粒，由此可得到TOPO-BNP(10)。将TOPO-BNP(10)和表达载体PET22b(Novagen产品，参见附III56页)均用Nde I/Xho I双酶切，将TOPO-BNP(10)酶切产生的小片段与PET22b酶切产生的大片段连接并转导至TOPO-10菌以扩增BNP十聚体基因表达质粒PET-BNP(10)(BNP+聚体基因表达质粒构建过程图见第6-7页)。三、BNP+聚体基因的表达及纯化将BNP十聚体基因表达质粒转导至BL21(DE3)表达菌中，挑单菌落培养过夜，将过夜菌按2％接种至LB培养基中，置37℃培养到OD为0.8，加入0.5mM的IPTG，继续培养3小时，离心收集菌体。BNP十聚体基因在通过Xho I酶切位点插入PET22b表达载体时，引入了PET22b表达载体上的6个组氨酸(His)密码子和终止密码子(即BNP十聚体基因和PET22b载体的6个组氨酸及终止密码子均在同一阅读框架内，参见PET22b的基因图谱)，所以表达产物可以用Ni-Sepharose亲和层析纯化，纯化产物的纯度在SDS凝胶电泳上可达90％以上。四、BNP多聚体的裂解、加工及BNP单体纯化1.BNP多聚体的裂解将BNP多聚体用8M的尿素溶液(内含10mM β-巯基乙醇，pH7.8)稀释至浓度为1mg/ml，取2000ml该BNP溶液与6000ml色氨酸裂解试剂，BNPS-Skatole(2-(2′-nitrophenylsulfonyl)-3-methy1-3-bromoindolenine)混合，将该混合液避光置45℃反应15小时。此时BNP多聚体被裂解为BNP单体(断裂位点在Trp的羧基端)。
裂解反应完毕，反应液用等体积的8M尿素溶液稀释，离心去除BNPS-Ska-tole沉淀物，将上清液的pH调节为4.0，并直接上样至SP-Sepharose阳离子柱，用8M尿素+10mM β-巯基乙醇为柱平衡及起始洗脱缓冲液，用8M尿素+100mM β-巯基乙醇+0.5M NaCl为终极洗脱缓冲液，梯度洗脱并收集BNP单体吸收峰。超滤浓缩BNP浓度至5mg/ml左右。
2.BNP单体中二硫链的氧化将经SP-Sepharose阳离子交换色谱初步纯化并浓缩的BNP单体用pH7.550mM的Tris-HCl缓冲液稀释25倍，并加入3mM氧化型谷胱甘肽及2mM还原型谷胱甘肽。将上述溶液在室温放置20小时，此时BNP单体的二个半胱氨酸将被氧化生成一对二硫链。氧化反应完毕，将反应液对1mM的醋酸溶液透析冻干。
3.BNP单体C-末端色氨酸(Trp)的去除及纯化将冻干的BNP单体溶解于100mM的N-ethylmorpholine pH6.0溶液中，使BNP单体的浓度为5mg/ml，加入终浓度为25μg/ml的羧肽酶Y(酶∶底物＝1∶200)，将酶反应液置室温12小时，加入0.1％的三氟醋酸终止反应。该反应物直接用高效液相色谱C18柱分离纯化，起始缓冲液为0.1％的三氟醋酸，终极缓冲液为0.1％的三氟醋酸+80％的乙腈。收集BNP单体的吸收峰，此时所得到的BNP单体的氨基酸序列与天然BNP的序列完全一致。
BNP多聚体基因以及表达质粒的构建
1H NMR(400MHz，CD3COCD3)δ8.15(d，J＝8.4Hz，2H)，7.85(d，J＝8.4Hz，2H)，6.57(brs，1H)，5.75(brs，1H)，0.80-2.00(m，11H)；MS(m/e)286(M+，4)，204(100)；HRMS calcd.for C17H18O4286.1200，found 286.1188.
实施例4反应步骤同实施例2，所不同的是步骤1所用的树脂为Link树脂，碱为4.0当量的碳酸铯，温度为60℃；步骤2有机溶剂为THF，3.0当量2-甲基-2，3-二烯癸酸，6.0当量的三乙胺，钯催化剂为10mol％d的PdCl2/PPh3，反应温度为70℃；Lewis酸为0.2当量的SnCl4产物为
5-正己基-4-(4’-羟基羰基苯)-3-甲基-2(5氢)-呋喃酮yield 84％，purity 85％，solid.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.16(d，J＝8.3Hz，2H)，7.36(d，J＝8.3Hz，2H)，5.27-5.32(m，1H)，1.99(s，3H)，1.63-1.78(m，1H)，1.18-1.33(m，9H)，0.80(t，J＝6.8Hz，3H)；MS(m/e)302(M+，10)，115(100)；HRMS calcd.for C18H22O4302.1512，found 302.1496.
实施例5反应步骤同实施例2，所不同的步骤1所加入的卤化物为邻碘苯甲酸，碱为6.0当量的叔丁醇钠，温度为80℃；步骤2有机溶剂为甲苯，6.0当量的三乙胺，钯催化剂为30mol％d的PdCl2/PPh3，反应温度为60℃；Lewis酸为0.6当量的TiCl4，产物为<p>1.CAT ATG ATC GAT ATG TCC GAC GCT GC2.CTC GAG TTC GAA ACC GTT TTC CGCPCR扩增产物直接连接到PCR2.1-TOPO(TA载体Invitrogen产品，参见附III55页)，插入序列经测序鉴定后，即可得THY单体基因的质粒TOPO-THY(1)(括号内的1代表THY的单体，2代表双体，以此类推)。二、THY多聚体基因的构建将TOPO-THY(1)分别用BstB I/Xba I以及Cla I/Xba I酶切，将BstB I/Xba I酶切回收的大片段与Cla I/Xba I酶切回收的小片段连接，将连接产物转导至TOPO-10菌中扩增DNA，此时可得到THY基因的二聚体质粒TOPO-THY(2)。将TOPO-THY(2)分别用BstB I/Xba I和Cla I/Xba I酶切，将BstBI/Xba I酶切回收的大片段与Cla I/Xba I酶切回收的小片段连接并转导至TOPO-10菌中扩增DNA质粒即可得到THY四聚体基因质粒TOPO-THY(4)。重复上述步骤，即可得到THY八聚体基因质粒TOPO-THY(8)。将TOPO-THY(4)用Bst B I/Xba I酶切并纯化其大片段，将TOPO-THY(8)用Cla I/Xba I酶切并纯化回收其小片段，把这两个基因片段连接后转导至TOPO-10菌并扩增DNA，由此可得到THY的十二聚体基因质粒TOPO-THY(12)。用Nde I/Xho I酶切TOPO-THY(12)并回收纯化DNA小片段(THY的12聚体基因)，并将该基因片段连接到PET29a(Novagen产品，参见附III，见57页)表达载体上，从而完成α1-胸腺肽表达质粒PET-THY(12)的构建。三、α1-胸腺肽十二聚体的表达及纯化将PET-THY(12)基因质粒转导至BL21(DE3)表达菌中。挑单菌落培养过夜，将过夜菌按2％，接种至LB培养基中，置37℃培养到OD为0.8，加入0.5mM，IPTG诱导THY(12)的表达，继续培养3小时离心收集菌体。与PET22b表达载体一样，α1-胸腺肽多聚体基因在通过Nde I/Xho I酶切位点插入到PET29a表达载体时，其表达产物在C末端也带有6个组氨酸(His)，因此可用Ni-Sepharose亲和层析纯化，产物经SDS电泳鉴定，纯度在90％以上。四、α1-胸腺肽多聚体的化学降解以及单体纯化将纯化后的α1-胸腺肽多聚体按1mg/ml的浓度溶于溴化氰溶液中(溴化氰溶液用70％的甲酸配制，浓度为5mg/ml)。将该反应溶液在室温置通风橱中反应24小时，以断裂甲硫氨酸的羧基参与形成的肽键。(本例中，溴化氰裂解
反应完毕，加入8倍体积的10M NaOH以中和溴化氰，将降解产物超滤、脱盐冻干。
将经溴化氰降解处理的α1-胸腺肽溶于1.8M的羟胺中，使肽段的浓度为0.25mg/ml，将反应液置45℃反应3小时以水解天冬酰胺与甘氨酸间的肽键Asn↓Gly，反应完毕，待反应液的温度降至室温后，加入三氟醋酸至终浓度为0.1％以终止反应。该反应物直接进行高效液相色谱，以0.1％的三氟醋酸为起始缓冲液，以0.1％三氟醋酸+75％的乙腈为终极缓冲液，用C18反相色谱柱纯化α1-胸腺肽，收集α1-胸腺肽单体吸收峰，此时即可得到与天然序列一致的单体α1-胸腺肽。
此外由于α1-胸腺肽的氨基酸组成中没有色氨酸(Trp)，所以该多肽在用串连重复多聚方法生产时，可用Trp作为多聚体加工时的断裂位点，此时只要将上述α1-胸腺肽单体核苷酸序列中的甲硫氨酸(Met)密码子ATG变为Trp的密码子TGG，并在PCR引物序列中作相应调整即可。色氨酸羧基形成的肽键断裂方法参考BNP的制备。附THY二聚体基因结构及对应的氨基酸序列，其中箭头表示了化学断裂的加工位点，其中方框代表了真正的THY的核酸序列或氨基酸序列而不包含其它插入成分。
实例3 gp120片段315～329的制备gp120是HIV-1病毒的外壳蛋白，肽段315～329位于gp120分子的重要功能区一V3环状区(V3loop)，HIV-1病毒感染起始于外壳蛋白gp120与正常细胞的CD4受体结合并使HIV-1病毒与被感染的细胞融合。人工合成的gp120(315～329)片段(以下简称gpfg)可以抑制HIV-1病毒对人T淋巴细胞的感染并抑制合包体的形成。该肽段对防止HIV-1病毒感染或减缓病毒在患者体内传播速度等方面具有潜在的应用价值[9]。
gpfg的氨基酸序列如下Arg-lle-Gln-Arg-Gly-Pro-Gly-Arg-Ala-Phe-Val-Thr-lle-Gly-Lys根据gPfg的氨基酸组成及序列特点，我们选用其羧基端的赖氨酸(Lys)作为多聚体表达产物加工断裂的一个位点，此外在单体分子的氨基端插入谷氨酸作为1H NMR(400MHz，CD3COCD3)δ8.15(d，J＝8.4Hz，2H)，7.85(d，J＝8.4Hz，2H)，6.57(brs，1H)，5.75(brs，1H)，0.80-2.00(m，11H)；MS(m/e)286(M+，4)，204(100)；HRMS calcd.for C17H18O4286.1200，found 286.1188.
实施例4反应步骤同实施例2，所不同的是步骤1所用的树脂为Link树脂，碱为4.0当量的碳酸铯，温度为60℃；步骤2有机溶剂为THF，3.0当量2-甲基-2，3-二烯癸酸，6.0当量的三乙胺，钯催化剂为10mol％d的PdCl2/PPh3，反应温度为70℃；Lewis酸为0.2当量的SnCl4产物为
5-正己基-4-(4’-羟基羰基苯)-3-甲基-2(5氢)-呋喃酮yield 84％，purity 85％，solid.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.16(d，J＝8.3Hz，2H)，7.36(d，J＝8.3Hz，2H)，5.27-5.32(m，1H)，1.99(s，3H)，1.63-1.78(m，1H)，1.18-1.33(m，9H)，0.80(t，J＝6.8Hz，3H)；MS(m/e)302(M+，10)，115(100)；HRMS calcd.for C18H22O4302.1512，found 302.1496.
实施例5反应步骤同实施例2，所不同的步骤1所加入的卤化物为邻碘苯甲酸，碱为6.0当量的叔丁醇钠，温度为80℃；步骤2有机溶剂为甲苯，6.0当量的三乙胺，钯催化剂为30mol％d的PdCl2/PPh3，反应温度为60℃；Lewis酸为0.6当量的TiCl4，产物为5mM的IPTG，继续培养3小时，离心收集菌体。gpfg单体基因在引入PET25b载体中时，与载体上的HSV抗原序列以及6个连续排列的组氨酸序列置于同一阅读框架内，因此gpfg十六聚体表达产物可用HSV抗体亲和层析以及Ni-Sepharose亲和层析纯化，产物的纯度在95％以上。四、gpfg十六聚体的酶切降解及单体纯化将纯化后的gpfg十六聚体按1mg/ml的浓度溶于pH7.5 50mM的磷酸缓冲液中，加入赖氨酸内肽酶和谷氨酸内肽酶，使其浓度分别为10μg/ml和20μg/ml，置37℃反应20小时。加入0.1％的三氟醋酸终止反应。该反应物直接用反相高效液相色谱C18柱纯化，用乙腈梯度洗脱，起始缓冲液为0.1％的三氟醋酸，终极缓冲液为0.1％的三氟醋酸+70％的乙腈。附gpfg二聚体基因结构及对应的氨基酸序列，其中箭头表示了酶切的加工位点，其中方框代表了真正的gpfg的核酸序列或氨基酸序列而不包含其它插入成分。
实例4 C反应蛋白片段174～185的制备C反应蛋白(CRP)主要由肝细胞合成。组织损伤和炎症反应可以触发机体内C反应蛋白的水平急剧升高。CRP可以增强体内的免疫功能，抑制肿瘤转移。CRP肽段174～185(以下简称CRPfg)具有类似完整C反应蛋白的部分功能，它可以抑制肿瘤细胞的生长，激活单核细胞和巨噬细胞对肿瘤细胞的杀伤作用[10，11，12]。
C反应蛋白174～185片段的氨基酸序列如下Ile-Tyr-Leu-Gly-Gly-Pro-Phe-Ser-Pro-Asn-Val-Leu由于CRPfg仅含12个氨基酸，对其单体基因片段操作时效率较低。所以我们先用化学合成方法合成CRPfg的二聚体基因，并在两个单体基因片段间插入Asp-Lys序列，以此二聚体基因作为一个独立单元进行多聚体基因的串连重复，根据CRPfg的氨基酸组成的特点，我们选用天冬氨酸(Asp)和赖氨酸(Lys)作为该肽段C末端和N末端的断裂、加工位点。我们将同尾酶Nhe I(切点为1H NMR(400MHz，CD3COCD3)δ8.15(d，J＝8.4Hz，2H)，7.85(d，J＝8.4Hz，2H)，6.57(brs，1H)，5.75(brs，1H)，0.80-2.00(m，11H)；MS(m/e)286(M+，4)，204(100)；HRMS calcd.for C17H18O4286.1200，found 286.1188.
实施例4反应步骤同实施例2，所不同的是步骤1所用的树脂为Link树脂，碱为4.0当量的碳酸铯，温度为60℃；步骤2有机溶剂为THF，3.0当量2-甲基-2，3-二烯癸酸，6.0当量的三乙胺，钯催化剂为10mol％d的PdCl2/PPh3，反应温度为70℃；Lewis酸为0.2当量的SnCl4产物为
5-正己基-4-(4’-羟基羰基苯)-3-甲基-2(5氢)-呋喃酮yield 84％，purity 85％，solid.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.16(d，J＝8.3Hz，2H)，7.36(d，J＝8.3Hz，2H)，5.27-5.32(m，1H)，1.99(s，3H)，1.63-1.78(m，1H)，1.18-1.33(m，9H)，0.80(t，J＝6.8Hz，3H)；MS(m/e)302(M+，10)，115(100)；HRMS calcd.for C18H22O4302.1512，found 302.1496.
实施例5反应步骤同实施例2，所不同的步骤1所加入的卤化物为邻碘苯甲酸，碱为6.0当量的叔丁醇钠，温度为80℃；步骤2有机溶剂为甲苯，6.0当量的三乙胺，钯催化剂为30mol％d的PdCl2/PPh3，反应温度为60℃；Lewis酸为0.6当量的TiCl4，产物为<p>将PET-CRPfg(16)基因质粒转导至BL 21(DE3)表达菌中，挑单菌落过夜培养，将过夜菌按2％的接种量接种至LB培养基中，置37℃培养至OD为0.8，加入0.5mM IPTG诱导CRPfg(16)的基因表达。继续培养3小时，离心收集菌体，表达产物用Ni-Sepharose进行分离纯化。四、CRPfg多聚体的断裂加工和单体肽段分离纯化将纯化后的CRPfg十六聚体按1mg/ml的浓度溶于0.1M pH8.0的Tris-HCl缓冲液中，加入天冬氨酸内肽酶使其终浓度为10μg/ml，置37℃反应20小时，再加入终浓度为5μg/ml的胰蛋白酶，置37℃反应15小时，反应完毕，加入0.1％的三氟醋酸终止反应。用反相高效液相色谱分离纯化CRPfg单体肽段(方法同例3)。
下图为CRPfg四聚体基因结构及对应的氨基酸序列，箭头表示了酶切加工位点，其中方框带阴影的部分代表了真正的CRPfg的核酸序列或氨基酸序列而不包含其它插入成分
实例5 血管加压素转化酶抑制肽的制备血管加压素转化酶对调节机体血压具有重要作用。它可使血管紧张素I转化为活性较强的血管紧张素II，并抑制缓激肽的功能。血管加压素转化酶抑制肽是血管加压素转化酶的非竞争性抑制剂，临床上用于治疗高血压[13，14]。
血管加压素转化酶抑制肽(以下简称ACEIP)的氨基酸组成如下Pro-Ala-Asn-lle-Lys-Trp-Gly-Asp由于ACEIP分子仅有8个氨基酸残基，因此我们选用化学方法合成ACEIP的二聚体基因，以此二聚体基因片段作为一个独立单元，进行多聚体基因的重复串连。根据ACEIP肽段的氨基酸组成及序列特点，即ACEIP的羧基端为Asp(天冬氨酸)，氨基端为Pro(脯氨酸)，我们选用
作为串连重复多聚体基因表达产物的断裂加工位点。此外我们分别将Cla I(切点为
)和Nar I
的识别序列置于ACEIP二聚体基因单元的5′端和3′端，选用同尾酶Cla I和Nar I作为二聚体基因单元间的连接位点，主要是因为二者酶切产生的粘性末端在连接后产生的序列能够编码Gly-Asp，而该氨基酸序列恰好与ACEIP羧基端的两个氨基酸相同。由于该多肽的二聚体基因单元及插入序列的总长度仅为54碱基，所以我们用化学合成该多肽二聚体基因的两条互补链(包括间隔序列)，并在该基因片段的5′端和3′端分别设置Nde I和Xho I的粘性末端。
ACEIP二聚体基因及间隔片段的序列如下TATGATCGATCCGGCTAACATCAAATGGGGTGACCCGGCAAACATCAAATGGGGCGCCCACTAGCTAGGCCGATTGTAGTTTACCCCACT GGGCCGTTTGTAGTTTACCCCGCGGGAGCT带下划线的核苷酸序列分别为同尾酶Cla I和Nar I的识别位点，用于A-CEIP多聚体基因的拼接。一、ACEIP二聚体基因的构建将化学合成的ACEIP二聚体基因的两条核苷酸链分别进行5′端磷酸化，然后将两种核苷酸混合、变性、退火，形成带有Nde I和Xho I粘性末端的ACEIP二聚体基因的双链核酸片段，将此片段连接到经Nde I和Xho I酶切处理过的PET20b载体上(Novagen公司产品，见附III 57页)，并转导JM109菌以扩增A-CEIP二聚体基因质粒PET-ACEIP(2)。二、ACEIP多聚体基因的构建将ACEIP(2)分别用Cla I/Bpu1102 I和Nar I/Bpu1102 I酶切，将Cla I/Bpu1102 I酶切、纯化回收的DNA小片段与Nar I/Bpu1102 I酶切、纯化回收的DNA大片段连接，并转导至JM109菌中扩增DNA质粒，由此可得到ACEIP四聚体基因片段PET-ACEIP(4)，将PET-ACEIP(4)DNA质粒分别用Cla I/Bpu1102 I和Nar I/Bpu1102 I酶切，并将Cla I/Bpu1102 I酶切回收的DNA小片段与Nar I/Bpu1102 I酶切回收的DNA大片段连接并转导至JM109菌中扩增DNA，即可得到ACEIP的8聚体基因质粒PET-ACEIP(8)，重复上述步骤可得到PET-ACEIP(16)和PET-ACEIP(32)。三、ACEIP32聚体基因的表达纯化将PET-ACEIP(32)基因质粒转导至BL 21(DE3)表达菌中，挑单菌落培养过夜，将过夜菌按2％的接种量接种至LB培养基中，置37℃培养到OD为0.8，加入0.5mM的IPTG，继续培养3小时，离心收集菌体，表达产物用Ni-Sepharose亲和层析纯化，其纯度达90％。四、ACEIP32聚体的化学降解及单体纯化将纯化后的ACEIP32聚体按1mg/ml溶于70％的甲酸中置37℃保温反应48小时，加入3倍体积的水，混匀冷冻干燥。将冻干物溶于0.1％的三氟醋酸，用HPLC反相色谱分离纯化ACEIP单体肽段。(注ACEIP32聚体多肽中直接与羧基端6个组氨酸(poly His.tag)相连的单体分子在用甲酸水解时，其羧基端的6个组氨酸残基不能被去除，该ACEIP片段因为与6个组氨酸残基相连，故可用Ni-Sepharose吸附去除，或直接用C18反相HPLC柱将该肽段与正常的ACEIP分子分开。)附ACEIP四聚体基因结构及对应的氨基酸序列，其中箭头表示了酶切加工位点，方框代表了真正的CRPfg的核酸序列或氨基酸序列而不包含其它插入成分。
实例6 其它30类生物活性肽的制备方法附表I说明以30种生物活性肽为例，简要说明了利用核酸内切酶中的同尾酶的特性(即一对同尾酶可以识别、酶切不同的核苷酸序列，但产生相同的粘性末端，且当这两种粘性末端连接后，其核苷酸序列不再能被这对同尾酶中的任何一个酶识别和酶切)，构建目标肽段的重复串连基因的方法。附表I的各子表“a”中列出了各生物活性肽的氨基酸序列及间隔序列、核酸序列及间隔序列、同尾酶识别序列，肽段多聚体间隔区的氨基酸序列，肽段多聚体间隔区的核酸序列，以及肽段多聚体的断裂加工方法。与这30种生物活性肽相比，一些多肽的氨基酸组成或序列具有类似的特点，它们可以用完全相同的方法进行多肽基因的串连重复以及多聚体表达产物的断裂、加工。我们将这些活性肽列入了与各子表“a”相对应的“b”表中(子表“b”中的活性肽可以用与之对应的子表“a”中的方法制备)。由附表I可以看出，同一肽段可以选用不同的同尾酶串连多肽基因，也可以选择不同的断裂、加工方法。
附表I中的简写说明Trp↓ 表示用BNPs-Skatole试剂断裂由色氨酸的羧基形成的肽键Met↓ 表示用溴化氰断裂由甲硫氨酸的羧基形成的肽键1H NMR(400MHz，CD3COCD3)δ8.15(d，J＝8.4Hz，2H)，7.85(d，J＝8.4Hz，2H)，6.57(brs，1H)，5.75(brs，1H)，0.80-2.00(m，11H)；MS(m/e)286(M+，4)，204(100)；HRMS calcd.for C17H18O4286.1200，found 286.1188.
实施例4反应步骤同实施例2，所不同的是步骤1所用的树脂为Link树脂，碱为4.0当量的碳酸铯，温度为60℃；步骤2有机溶剂为THF，3.0当量2-甲基-2，3-二烯癸酸，6.0当量的三乙胺，钯催化剂为10mol％d的PdCl2/PPh3，反应温度为70℃；Lewis酸为0.2当量的SnCl4产物为
5-正己基-4-(4’-羟基羰基苯)-3-甲基-2(5氢)-呋喃酮yield 84％，purity 85％，solid.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.16(d，J＝8.3Hz，2H)，7.36(d，J＝8.3Hz，2H)，5.27-5.32(m，1H)，1.99(s，3H)，1.63-1.78(m，1H)，1.18-1.33(m，9H)，0.80(t，J＝6.8Hz，3H)；MS(m/e)302(M+，10)，115(100)；HRMS calcd.for C18H22O4302.1512，found 302.1496.
实施例5反应步骤同实施例2，所不同的步骤1所加入的卤化物为邻碘苯甲酸，碱为6.0当量的叔丁醇钠，温度为80℃；步骤2有机溶剂为甲苯，6.0当量的三乙胺，钯催化剂为30mol％d的PdCl2/PPh3，反应温度为60℃；Lewis酸为0.6当量的TiCl4，产物为1H NMR(400MHz，CD3COCD3)δ8.15(d，J＝8.4Hz，2H)，7.85(d，J＝8.4Hz，2H)，6.57(brs，1H)，5.75(brs，1H)，0.80-2.00(m，11H)；MS(m/e)286(M+，4)，204(100)；HRMS calcd.for C17H18O4286.1200，found 286.1188.
实施例4反应步骤同实施例2，所不同的是步骤1所用的树脂为Link树脂，碱为4.0当量的碳酸铯，温度为60℃；步骤2有机溶剂为THF，3.0当量2-甲基-2，3-二烯癸酸，6.0当量的三乙胺，钯催化剂为10mol％d的PdCl2/PPh3，反应温度为70℃；Lewis酸为0.2当量的SnCl4产物为
5-正己基-4-(4’-羟基羰基苯)-3-甲基-2(5氢)-呋喃酮yield 84％，purity 85％，solid.1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.16(d，J＝8.3Hz，2H)，7.36(d，J＝8.3Hz，2H)，5.27-5.32(m，1H)，1.99(s，3H)，1.63-1.78(m，1H)，1.18-1.33(m，9H)，0.80(t，J＝6.8Hz，3H)；MS(m/e)302(M+，10)，115(100)；HRMS calcd.for C18H22O4302.1512，found 302.1496.
实施例5反应步骤同实施例2，所不同的步骤1所加入的卤化物为邻碘苯甲酸，碱为6.0当量的叔丁醇钠，温度为80℃；步骤2有机溶剂为甲苯，6.0当量的三乙胺，钯催化剂为30mol％d的PdCl2/PPh3，反应温度为60℃；Lewis酸为0.6当量的TiCl4，产物为<p>表2a
表2b
表3a
表3b(1)
表3b(2)
表4a
表4b
<p>表5a
表5b
表6a
表7a
表8a
表9a
表9b
表10a
表10b
表11a
表11b
表12a
表12b
<p>表13a
表13b
表14a
表14b
<p>表15a
表15b
表16a
表16b
表17a
表17b
<p>表18a
表18b(1)
表18b(2)
表19a
表20a
表21a
表21b
表22a
表23a
表23b
<p>表24a
表24b
表25a
表26a
表27a
表27b
表28a
表29a
表30a
附表II核酸内切酶中的部分同尾酶
续附表II
附III本文所用及的克隆载体及表达载体基因图谱
附III
附III
附III续载体基因图谱
参考文献1.Current Protocols in Protein Science Chapter 11，Published by John Wiley & SonsInc.
2.Zhu，L.G.，Qin，L.et al.J Am Chem Soc 1994，Vol.116，52183.Ziyong Sun，Song Zhou，et al.Research on Protein Specific Cleavage ReagentsProgress in Biochemistry and Biophysics 1995，Vol.22312-3174.Jarkko Magga，Olli Vuolteenaho，et al.B-type natriuretic peptidea myocyte-specific marker for characterizing load-induced alterations in cardiac geneexpression Ann Med 1998，Vol.30，Suppl 139-455.Roger M.Mills，Thierry H.Lejemtel，et al.Sustained Hemodynamic Effects of anInfusion of Nesiritide(Human b-Type Natriuretic Peptide)in Heart FailureJournal of the American College of Cardiology 1999，Vol.34，No.1155-1626.Enrico Garaci，Francesca Pica，et al.Antitumor Effect of Thymosinα1/Interleukin-2 or Thymosin α1/Interferon α，β Following Cyclophosphamide inMice Injected with Highly Metastatic Friend Erythroleukemia Cells J Immunother1993，Vol.13，No.17-177.Katherine M.Malinda，Gurmel S.Sidhu，et al.Thymosin α1 Stimulates EndothelialCell Migration，Angiogenesis，and Wound Healing the Journal of Immunology 1998，1601001-10068.Kenneth E.Sherman，Maria Sjogren，et al.Combination Therapy with Thymosinα1 and Interferon for the Treatment of Chronic Hepatitis C InfectionArandomized，Placebo-Controlled Double-Blind Trial Hepatology l998，Vol.27，No.41128-11359.Pramod N.Nehete，Ralph B.Arlinghaus，et al.Inhibition of HumanImmunodeficiency Virus Type 1 Infection and Syncytium Formation in HumanCells by V3 Loop Synthetic Peptides from gp120 Journal of Virology Nov.1993，6841-684610.Barbara P.Barna，Mary Jane Thomassen，et al.Combination therapy with asynthetic peptide of C-reactive protein and interleukin 2augmented survival anderadication of pulmonary metastases Cancer Immunol Immunother 1994，3838-4211.Barbara P.Barna，Deborah A Eppstein，et al.Therapeutic effects of a syntheticpeptide of C-reactive protein in pre-clinical tumor models Cancer ImmunolImmunother 1993 36171-176
12.Mary Jane Thomassen，David P.Meeker，et al.Activation of Human Monocytesand Alveolar Macrophages by a Synthetic Peptide of C-Reactive Protein Journal oflmmunotherapy 1993，Vol.13，No.11-613.Yasuhiro Kohama，Shigeru Matsumoto，et al.Isolation of Angiotensin-ConvertingEnzyme Inhibitor from Tuna Muscle Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 1988，Vol.155，No.1332-33714.Yasuhiro Kohama，Hiroaki Oka，et al.Induction of Angiotensin-ConvertingEnzyme Inhibitory Activity by Acid-Limited Proteolysis of Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogenase Biochemical and Biophysical Research Communications1989，Vol.161，No.2456-460
权利要求
1.一种多肽药物的高效基因工程生产方法，其特征在于它在DNA水平上，将目标肽段的DNA序列串联为多聚体，并用原核或真核细胞表达小肽或低分子量多肽的串联重复多聚体。
2.按权利要求1所述的多肽药物的高效基因工程生产方法，其特征在于在基因水平上，利用DNA限制性内切酶中的同尾酶具有识别水解不同核苷酸序列，但产生相同的粘性末端，且当二者的粘性末端相连后，该片段不能再被同尾酶识别切割的特点，在表达小肽或低分子量多肽的核酸的5′端及3′端分别加上同尾酶的识别序列，通过用同尾酶水解、连接反应等步骤的重复，构建目标肽段基因的串联重复多聚体。
3.按权利要求1所述的多肽药物的高效基因工程生产方法，其特征在于它根据小肽或低分子量多肽的氨基酸序列或组成特点，在构建目标肽段基因的串联重复多聚体时，利用同尾酶本身的识别序列，或在同尾酶识别序列的5′端或3′端加入适当的核苷酸序列，从而使串联重复的各单个目标多肽基因间存在特定的间隔序列，这些间隔核苷酸序列在翻译为氨基酸后，成为目标肽段多聚体的断裂、加工位点。
4.按权利要求1或2或3所述的多肽药物的高效基因工程生产方法，其特征在于用上述方法，将两种或两种以上不同的目标多肽基因串联或串联重复，从而使表达产物中存在几种不同的目标多肽。
5.按权利要求1所述的多肽药物的高效基因工程生产方法，其特征在于用化学或酶学方法[1]将上述表达的目标肽段多聚体断裂、切割加工为目标肽段的单体分子。化学裂解方法通常包括用溴化氰裂解甲硫氨酸的羧基形成的肽键，用甲酸水解断裂天冬氨酸的羧基与脯氨酸的亚氨基形成的肽键
，用羟胺水解断裂天冬酰胺的羧基与甘氨酸的氨基形成的肽键
，用BNPS-Skatole(2-(2′-nitrophenylsulfonyl)-3 methyl-3 bromindolenine)裂解色氨酸的羧基形成的肽键。此外也可用一些金属或非金属配合物催化断裂目标多肽单体间隔序列中的特定肽键[2，3]。蛋白酶水解方法通常包括用胰蛋白酶水解精氨酸或赖氨酸的羧基形成的肽键，用赖氨酸内肽酶水解赖氨酸的羧基形成的肽键，用谷氨酸内肽酶水解谷氨酸的羧基形成的肽键，用天冬氨酸内肽酶水解天冬氨酸的氨基形成的肽键。此外还可用序列识别酶，如内激酶(Endokinase)、凝血酶、凝血因子Xa等催化目标多肽与间隔序列间的特定肽键水解。在完成串联重复多聚体的裂解后，还可用羧肽酶(A、B、P、Y)或氨肽酶对裂解生成的多肽单体分子进行加工，以去除间隔区的氨基酸残基。
6.按权利要求1或2或3所述的多肽药物的高效基因工程生产方法，其特征在于(1)若目标肽段不含甲硫氨酸(Met)或仅其羧基端为Met，则可选用met作为间隔序列成份，并用溴化氰裂解目标肽段多聚体。(2)若目标肽段不含有色氨酸(Trp)或仅其羧基端为Trp，则可选用Trp作为间隔序列成份，并用BNPS-Ska-tole化学裂解目标肽段的多聚体。(3)若目标肽段不含有赖氨酸(Lys)或仅其羧基端为Lys，则可选用Lys作为间隔序列成份，并用赖氨酸内肽酶降解目标肽段的多聚体。(4)若目标肽段不含有谷氨酸(Glu)或仅其羧基末端为Glu，则可选用Glu作为间隔序列成份，并用谷氨酸内肽酶降解目标肽段的多聚体。(5)若目标肽段不含有天冬氨酸(Asp)或仅其N-端氨基酸为Asp，则可选用Asp作为间隔序列成份，并用天冬氨酸内肽酶降解目标肽段多聚体。(6)若目标多肽中不含有精氨酸和赖氨酸，或仅多肽的羧基端是精氨酸或赖氨酸，则可选用赖氨酸或精氨酸作为间隔序列成份，并用胰蛋白酶(Trypsin)降解目标肽段多聚体。(7)若目标肽段中不含有Asp-pro肽键，则可选用Asp-pro作为间隔序列成份，并且用甲酸裂解目标肽段的多聚体。(当目标肽段的羧基端为天冬氨酸或N-端为脯氨酸时，选用Asp-pro为断裂位点可减少羧肽酶的加工处理)。(8)若目标肽段中不含有Asn-Gly肽键，则可选用Asn-Gly作为间隔序列成份，并且用羟受裂解目标肽段的多聚体(当目标肽段的羧基端为天冬酰受或N端为甘氨酸时，选用Asn-Gly为断裂位点，可减少羧肽酶的加工处理)。(9)若目标肽段中不含有Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser序列，则可选用该序列作为间隔序列成份，并且用凝血酶裂解目标肽段的多聚体(当目标肽段的羧基端序列为Leu-Val-Pro-Arg，或其氨基端序列为Gly-Ser时，选用序列Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser作为间隔序列成份可减少羧肽酶的加工处理。(10)若目标肽段中不含有Ile-Glu-Gly-Arg序列，或该序列仅存在于目标肽段的羧基端，则可选用凝血因子Xa酶解目标肽段的多聚体。(11)若目标太段中不含有Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列，或该序列仅存在于肽段的羧基端，则选用该序列作为插入序列成份，并用内激酶裂解目标肽段的多聚体。(12)以上的各酶解或化学裂解方法可组合使用，即采用两种或两种以上的裂解方法将目标肽段多聚体裂解为单体。(13)若用以上方法裂解得到的多聚体与天然序列有差别，可以选用适当的羧肽酶或氨肽酶加工肽链的羧基端或氨基端(详见实例6)。
全文摘要
本发明用真核或原核细胞表达低分子量多肽活性物质。在核酸水平上,利用DNA限制性内切酶中的同尾酶具有识别水解不同DNA序列,但产生相同的粘性末端,且当二者的粘性末端连接后,该位点不再能被同尾酶识别的特性,将编码目标肽段的DNA分子串联重复,构成多聚体,并根据目标肽段的氨基酸组成及序列特点,在各DNA单体分子间插入适当的核苷酸序列,这些特定的核苷酸序列在翻译为氨基酸后,成为使串联重复目标肽段的多聚体断裂为单体的加工位点。
文档编号C12N15/11GK1273248SQ9912061
公开日2000年11月15日 申请日期1999年12月13日 优先权日1999年11月24日
发明者孙自勇, 刘建宁 申请人:刘建宁