一种鉴别粳稻BT型细胞质雄性不育恢复基因Rf1a的分子标记方法

专利名称：一种鉴别粳稻BT型细胞质雄性不育恢复基因Rf1a的分子标记方法
技术领域：
本发明涉及一种鉴别粳稻BT型细胞质雄性不育恢复基因/PZVa的分子标记方法，属于生物技术工程领域，专用于含沿Va基因BT型粳稻恢复系种质资源鉴定以及品种选育。背景技术：
近年来，随着人们生活水平的提高，我国城乡居民对稻米消费呈现由籼米向粳米转变的趋势(张峭等，农业展望，2007，I 9-14 ;吴乐等，农业技术经济，2011，5 :87_96)。粳米市场看好，也为粳稻的生产拓展了更为广阔的空间。目前，我国粳稻种植面积在830万hm2左右，其中以常规粳稻品种为主，而具有较大增产潜力的杂交粳稻种植面积只有33万hm2， 所占比例不足4% (邓华风等，杂交水稻，2006，21 (1):1-6)。因此，加强杂交粳稻(特别是三系杂交粳稻)品种的选育，以增加杂交粳稻的竞争优势，实现杂交粳稻的跨越式发展，对保障我国粮食安全，促进农业增效、农民增收具有十分重要的意义。优异亲本的培育是选配三系杂交粳稻优势组合的基础。目前我国杂交粳稻应用的雄性不育细胞质主要是BT型(来自印度春籼品种，Chinsurah Boro II),其次是滇I型 (来自云南高海拔籼稻)(袁隆平等，杂交水稻育种栽培学，1988，83-84 ;李铮友，滇型杂交水稻育种，2000，1-15)。这两种不育细胞质均属于配子体不育类型，具有相似的恢保关系，其育性恢复受I对核基因控制(贺和初，云南农业大学学报，1988，3 (1):54-68)。在育种中， 杂交粳稻的不育系大多是由在生产上推广的开花、异交习性较好的常规粳稻通过回交转育而成，它本身就具有较好的农艺性状；而在恢复系方面，由于粳稻中一般不存在相应的恢复源，其恢复基因是通过人工杂交的方法从籼稻中导入的，在引入恢复基因的同时不可避免的也渗入了籼稻中一些不利的遗传成分(王才林等，中国农业科学，1989，22 (5):8-13)。因此，选育优良粳稻恢复系的关键就在于对恢复基因进行快速、准确的鉴定和选择。早期BT型粳稻恢复基因的鉴定主要依靠测交，并对后代植株的结实情况进行考察，这一方法不仅需要两个生长季节，同时还要对大量单株进行杂交，其过程相当烦琐。后来为简化育种程序，就借助于不育细胞质来选育同质恢，但由于细胞质遗传背景相同必定导致组合杂种优势的降低(李建红等，作物学报，2005，31 (7) :851-857)。而利用与恢复基因紧密连锁或共分离的分子标记则可以克服上述缺点，有效的减少恢复系选育的时间和强度，大大提高育种工作的预见性。为提高BT型细胞质雄性不育恢复基因Rf-I的选择效率，已有研究者利用其连锁的分子标记尝试辅助育种(Akagi et al. , Genome, 1996, 39(6): 1205-1209 ；Ichikawa et al. , Molecular Breeding, 1997, 3(3): 195-202 ；Komori et al. , Euphytica, 2003, 129(2): 241-247 ；Akagi et al. , Theor. AppL Genet. , 2004, 108(8): 1449-1457 ;Tan et al.，Plant breeding, 2004，123(4) : 338-341 ;程宝山等，南京农业大学学报，2011，34 (1):1-7)。这确实在一定程度上提高了选择的可靠性。然而，由于这些标记大都只是与目的基因连锁，因此存在许多缺陷。一方面，这些标记都是通过定位/PZW 基因时获得的，在实际育种群体中往往缺乏多态性，另一方面，由于是连锁标记，不能保证对Rf-I基因的筛选达到100%的准确性。随着现代分子生物学的发展，人们开始对水稻育性恢复的遗传机制有了新的认识。WangeiW. {The Plant cell, 2006，18(3) : 676-687)利用图位克隆的方法解析了 BT型细胞质雄性不育恢复基因Rf-I的育性恢复机理，该基因由两个相关的育性恢复基因 Rfla和/ / 组成，编码定向线粒体的PPR蛋白，其中TPZVa编码的蛋白RFlA以内切方式切驚\B-atp6/orf79 mRNA来阻止0RF79蛋白的产生使育性恢复，而Rflb编码的蛋白RFlB则通过降解mRNA使育性恢复，在RFlA和RFlB同时存在时，RFlA具有优先作用。与可以恢复胞质雄性不育的近等基因系OP/W/P/-2)相比，不能恢复胞质雄性不育的近等基因系(r/-7r/-7)在TPfVa位点上存在I bp和574 bp两处缺失。因此，若在BT型细胞质雄性不育恢复基因克隆的基础上，能进一步设计得到与目标基因共分离的PCR分子标记来快捷、准确地鉴定粳稻BT型细胞质雄性不育恢复基因的不同基因型将有利于优良粳稻恢复系的选育，从而提升三系杂交粳稻育种的技术水平。
发明内容
技术问题本发明针对粳稻BT型细胞质雄性不育恢复系选育过程中恢复基因鉴定较为烦琐的技术难题，根据恢复系和不育系(同核异质保持系)在/ / 位点存在的574 bp的碱基差异，设计、合成与目的基因共分离的功能标记，并通过简单的检测方法，快速鉴定含 Rfla基因的粳稻恢复系种质资源，同时还能进一步应用于分子标记辅助育种。技术方案
I、一种鉴定粳稻BT型细胞质雄性不育恢复基因/PZVa的分子标记方法，其特征在于 用Rfla恢复基因特异性引物InDel-TP/Va 正向引物 InDel-TPfVa-F 序列为 5’-CTGATGATCGAGGAGGAGGTA-3’
反向引物 InDel-TPfVa-R 序列为 5’- TAACGCGTCTTCCATCCTACT-3’
利用上述引物快速区分粳稻BT型细胞质雄性不育恢复基因TP/Va不同基因型的PCR分子标记方法为
(I)水稻植株基因组DNA的提取(SDS法)，参照Del laporta S L, et al.，Plant Mol B iol Rep, 1983， I (I): 19221。(2)将所述的两条分子标记引物InDel-TPfVa-F和InDel-TPfVa-R加入PCR反应体系，并对水稻种质资源或育种群体植株的DNA进行扩增；20 μ L PCR反应体系包括
10ng/yL 的 DNA 2. O μ L,4 pmol/ μ L 的引物 2. O μ L，其中引物 InDel-/ /7a-F 和 InDel-TPfVa-R 各 I. O μ L，10XPCR 含有 25 mmol/L MgCl2 的 Buffer 2. O μ L,2. 5 mmol/ L 的 dNTP O. 4 μ L，5 U/ μ L 的 7 O. 5 μ L 和 ddH20 13. I μ L ；
PCR反应程序包括95 °C预变性5 min ;然后95°C变性30 s、55°C复性30 s、72°C延伸
Imin，循环35次；然后72°C延伸7 min, 10°C冷却10 min后，将扩增产物加上样缓冲液终止反应。(3)反应产物在质量比浓度为I. 0%的琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色并于凝胶成像系统下观察，记载。如果有1145 bp的特征条带即为含TPZVa恢复基因的纯合体；如果有571 bp的特征条带即为不含恢复基因的纯合体；如果同时存在1，145 bp和571 bp的两条特征条带，则为/P/Va恢复基因的杂合体。有益效果本发明提供的一种鉴别粳稻BT型细胞质雄性不育恢复基因/PZVa的分子标记方法，具有以下优点
(O本发明提供的分子标记与现有的粳稻BT型细胞质雄性不育恢复基因的分子标记相比，它是根据基因的插入/缺失位点设计的采用PCR扩增的功能性标记，其基因型能直接反映植株的表型，不仅不存在由于遗传交换而造成的错误鉴定，而且在操作上高效、快捷。；
(2)本发明提供的分子标记方法能实现对粳稻BT型细胞质雄性不育恢复基因资源的快速鉴定，能从大量粳稻中准确筛选出含恢复基因/ / 的品种，这些具有育性恢复能力的粳稻品种在育种中可以作为优异亲本来选育新的恢复系，有效的拓宽现有恢复系遗传基础，增强杂交粳稻的组合优势。(3)本发明提供的分子标记方法能有效用于粳稻BT型细胞质雄性不育恢复系的辅助育种。早期恢复系成型后，还必须对其恢复基因进行测交鉴定，这一方法不仅需要两个生长季节，同时还要对大量单株进行杂交，其过程相当烦琐。虽然后来为简化育种程序，借助不育细胞质来选育同质恢，但由于细胞质遗传背景相同必定导致组合杂种优势的降低。 而利用与恢复基因共分离的分子标记则可以克服上述缺点，在苗期就可进行基因型筛选， 有效降低恢复系选育的时间和强度，大大提高育种工作的预见性。四

图I检测粳稻BT型细胞质雄性不育恢复基因Rfla的标记设计策略 (阴影部分表示不含恢复基因Rfla水稻存在的I bp和574 bp两处碱基缺失；黑框部分表示引物所在位置)
图2 InDel-TPZia对不同地区来源的常规籼稻品种、恢复系以及保持系的分子检测 (M :DNA分子量标准，100-2，000 bp ;1_11 :常规籼稻品种南京11、南充一枝蜡、中早39、 黄华占、滇瑞408、贵州麻谷、Tetep、Basmati 370、IR24、密阳23、Dular ; 12-19 :籼稻恢复系镇恢084、93-11、蜀恢527、辐恢838、广恢998、航I号、华恢451、中恢8006 ；20~24 :川香 29B、II -32B、武香 2B、冈 46B、中莲 1B)
图3 InDel-TPZia对不同地区来源的常规粳稻品种的分子检测 (M =DNA分子量标准，100-2，000 bp ；1~24 :南粳44、南粳46、宝农34、嘉33、嘉48、圣稻 13号、圣稻14号、豫粳6号、郑稻18号、津稻263、津川I号、盐丰47、辽粳9号、吉粳88、长白9号、龙粳21号、松粳9号、伊粳12号、新稻32号、楚粳32号、合系41号、关东194、越光、爱知106)
图4 InDel-TPZia对不同地区来源的粳稻恢复系、不育系以及杂交粳稻品种的分子检
测
(M :DNA分子量标准，100-2, 000 bp ;1_14 :粳稻BT型细胞质雄性不育恢复系宁恢8号、 C-25、C-53、R9511、湘晴、R161、申恢 254、R192、皖恢 9 号、HP121、LR27、C418、轮回 422、R187 ； 15-20 :粳稻BT型细胞质雄性不育系95122A、徐稻3号A、武运粳7号A、863A、泰粳985A、连粳6号A ；21-24 :杂交粳稻组合9优418、常优I号、86优8号、95优161)
图5 InDel- Rfla对863A/宁恢8号F2群体不同单株的分子检测 (M =DNA 分子量标准，100-2，000 bp ；1 :宁恢 8 号；2 863A ；3 863A/ 宁恢 8 号 F1 杂种个体；4-24 :部分F2分离单株)
五具体实施方式
为充分公开本发明一种鉴别粳稻BT型细胞质雄性不育恢复基因/PZVa的分子标记方法，以下结合方法验证和实施实例加以说明。其具体实施步骤如下
(一)试验材料
常规籼稻品种南京11 (江苏)、南充一枝腊(四川)、中早39 (浙江)、黄华占(广东)、滇瑞408 (云南)、贵州麻谷(贵州)、Tetep (越南)、Basmati370 (泰国)、IR24 (菲律宾)、密阳 23 (韩国)、Dular (印度)。籼稻恢复系镇恢084 (江苏)、93-11 (江苏)、蜀恢527 (四川)、辐恢838 (四川)、 广恢998 (广东)、航I号(福建)、华恢451 (湖南)、中恢8006 (浙江)。籼稻保持系川香29B (四川，野败型细胞质雄性不育保持系)、II -32B (浙江，印水型细胞质雄性不育保持系)、武香2B (湖北，马协型细胞质雄性不育保持系)、R 46B (四川， 冈型细胞质雄性不育保持系)、中莲IB (江苏，红莲型细胞质雄性不育保持系)。常规粳稻品种南粳44 (江苏)、南粳46 (江苏)、宝农34 (上海)、嘉33 (浙江)、嘉 48 (浙江)、圣稻13号(山东)、圣稻14号(山东)、豫粳6号(河南)、郑稻18号(河南)、津稻 263 (天津)、津川I号(天津)、盐丰47 (辽宁)、辽粳9号(辽宁)、吉粳88 (吉林)、长白9号 (吉林)、龙粳21号(黑龙江)、松粳9号(黑龙江)、伊粳12号(新疆)、新稻32号(新疆)、楚粳 32号(云南)、合系41号(云南)、关东194 (日本)、越光(日本)、爱知106 (日本)。粳稻恢复系宁恢8号(江苏)、CR_25 (江苏)、C_53 (江苏)、R9511 (江苏)、湘晴(浙江)、R161 (上海)、申恢254 (上海)、R192 (上海)、皖恢9号(安徽)、HP121 (安徽)、LR27 (天津)、C418 (辽宁)、轮回422 (湖南)、R187 (湖北)。BT型粳稻不育系95122A、徐稻3号A、武运粳7号A、863A、泰粳985A、连粳6号A， 以上不育系均由江苏育成品种(品系)转育而成。BT型杂交粳稻组合9优418(9201A/C418，江苏)、常优I号(武运粳7号A/R254， 江苏)、86优8号(863A/宁恢8号，江苏)、95优161 (95122A/晚161，江苏)
BT型细胞质雄性不育恢复基因F2分离群体86优8号(863A/宁恢8号)经自交获得的200个F2单株。以上材料均为公知公用材料，江苏省农业种质资源中期库可免费提供。具体参考文献为林世成等，中国水稻品种及其系谱，上海上海科学技术出版社，1991 :318 ;李欣等，水稻半矮杆基因的染色体定位研究，扬州大学学报(农业与生命科学版)，2002， 23 (1):40-44 ;毛永根等，常规早籼中早39在江山市的表现及高产栽培技术，现代农业科技，2010，20 75-77 ;周少川等，优质稻核心种质黄华占及其衍生系统理想模式研究，中国水稻科学，2009，29 (3) =153-159 ;万建民等，中国水稻遗传育种与品种系谱，北京中国农业出版社，2009，272 ;吴俊生等，广亲和品种零贵40的评价与利用价值，中国种业，2000，
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(二)分子标记开发
(O 粳稻BT型细胞质雄性不育恢复基因Rfla变异位点的核苷酸序列分析根据Wangce77，2006, 18(3) : 676-687)等的研究结果，利用粳稻恢复
基因位点Rfla的基因组信息，设计引物对该位点序列进行PCR扩增并直接测序，获得/PZVa 位点的基因组序列。通过序列分析证实，已测序的粳稻BT型细胞质雄性不育恢复系和不育系(同核异质保持系)在/ / 位点都存在的574 bp的碱基差异。(2)引物设计
利用Rfla基因的核苷酸序列在水稻基因组网站(Gene Bank, www. ncbi. nlm. nih. gov/)下载其位于水稻第10染色体长臂所在PAC克隆(Pl-derived artificial chromosome, PAC)的核酸序列(0SJNBa0017E08, AC068923),并对相关序列进行分析；然后， 利用 Primer Premier 5. 0(http://www. premierbiosoft. com)在 574bp 喊基插入缺失区域的附近，设计相应的插入/缺失标记，并将合成的标记引物命名为InDel-TP/Va。其正向引物序列为 5’ -CTGATGATCGAGGAGGAGGTA-3’，反向引物序列为 5’ - TAACGCGTCTTCCATCCTACT-3’， 退火温度为55°C (图I)。(三)分子标记验证
(I)水稻植株基因组DNA的提取
水稻植株基因组DNA的提取参照SDS法(Dellaporta S L, et al. , Plant Mol B iol Rep, 1983，I (I): 19221.)。具体步骤为取水稻苗期叶片，在_20°C预冷的研钵中用液氮研磨并装入I. 5 mL离心管；加入600 uL提取液(20%SDS，IM Tris-HCl, 0. 5M EDTA, 5M NaCl，65°C预热)，摇勻，65°C温浴30 min，中间振荡Γ4次；加入1/4体积5M KAC,摇匀后置冰上30 min ;加入氯仿-异戊醇(24:1) 300 400 uL，在摇床上充分振荡，120 rpm, 30 min ； 8，000^10, OOOrpm离心15分钟，液面分层，下层颜色较深，上层微带黄绿色，取上清(400 uL 左右)至另一离心管；加入等体积氯仿-异戍醇(24:1),摇床上充分振荡，8(T90 rpm, 30 min ;8，000 rpm离心15分钟，转移上清(400 uL左右)至新的离心管；加入2倍体积-20°C 预冷的无水乙醇,轻轻摇勻直到有絮状物产生,12，000 rpm离心6min ;弃无水乙醇,加入 4°C70%乙醇，放置10 min，弃上清，超净工作台上风干Ih ;加入100 200 uL TE，_20°C保存。( 2 )分子标记的扩增和电泳检测
利用粳稻BT型细胞质雄性不育恢复基因InDel-TP/Va标记，其引物序列为
正向引物(InDel-WfVa-F)序列为 5’ -CTGATGATCGAGGAGGAGGTA-3’
反向引物(InDel-WfVa-R)序列为 5’- TAACGCGTCTTCCATCCTACT-3’
对不同水稻品种(品系或组合)微Rfla基因型分离群体进行PCR扩增和电泳检测。(3)20 UL PCR反应体系包括10 ng/μ L 的 DNA 2. O n LA pmol/ μ L 的引物
2.O μ L，其中引物 InDel-WfVa-F 和 InDel-WfVa-R 各 I. O μ L, 10XPCR Buffer (包括 25 mmol/L 的 MgCl2>2. O μ L，2. 5 mmol/L 的 dNTP 0. 4 μ L，5 U/ μ L 的 0. 5 μ L 和 ddH20 13. I μ L ；
PCR反应程序包括PCR反应程序包括95 °C预变性5 min ;然后95°C变性30s、55°C复性30s、72°C延伸lmin，循环35次；然后72°C延伸7min, 10°C冷却IOmin后，将扩增产物加上样缓冲液终止反应。(4)反应产物在质量比浓度为I. 0%的琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色并于凝胶成像系统下观察，记载。如果有1145 bp的特征条带即为含TPZVa恢复基因的纯合体；如果有571 bp的特征条带即为不含恢复基因的纯合体；如果同时存在1145 bp和571 bp的两条特征条带，则为/P/Va恢复基因的杂合体。(5)结果分析
I) InDel- Rfla标记对常规籼稻品种、籼稻恢复系以及保持系位点的基因型
检测
利用分子标记InDel-TP/Va对来自不同地区的24份籼稻材料进行PCR扩增和电泳检测。结果表明11个常规籼稻品种南京11号、南充一枝蜡、中早39、黄华占、滇瑞408、贵州麻谷、Tet印、Basmati 370、IR24、密阳23、Dular，8个籼稻恢复系镇恢084、93_11、蜀恢527、 辐恢838、广恢998、航I号、华恢451、中恢8006以及5个籼稻雄性不育保持系川香29B、
II-32B、武香2B、冈46B、中莲IB均能稳定扩增出I条长度约I, 145 bp的条带(图2)。这表明以上材料在Rfla位点不存在574 bp的缺失，其基因型为/Pf/a/P/Va，它们对粳稻BT型细胞质雄性不育系都具有恢复作用。2) InDel- Rfla标记对常规粳稻品种Rfla位点的基因型检测
利用分子标记InDel-TP/Va对来自不同地区的24份粳稻品种进行PCR扩增和电泳检测。结果显示22个常规粳稻品种南粳44、南粳46、宝农34、嘉33、嘉48、圣稻13号、圣稻 14号、豫粳6号、郑稻18号、津稻263、津川I号、盐丰47、辽粳9号、吉粳88、长白9号、龙粳21号、松粳9号、新稻32号、楚粳32号、合系41号、关东194及越光均能稳定扩增出I 条长度约571 bp的条带，这些品种在位点存在574 bp的缺失，其基因型为r/Var/Va， 因此这些材料对BT型细胞质雄性不育系具有保持不育的作用；而其它2个水稻品种爱知 106和伊粳12号，由于能扩增出TP/Va/P/Va基因型特有的1，145 bp的条带，它们对BT型细胞质雄性不育系具有恢复作用，这些具有育性恢复能力的粳稻品种在育种中可以作为优异亲本来进一步选育新的恢复系(图3)。因此，通过InDel-TP/Va标记的PCR扩增能准确鉴定 BT型粳稻恢复系种质资源。3)InDel- 标记对粳稻恢复系、不育系以及杂交粳稻品种位点的基因型检测
利用分子标记InDel-TPfVa对来自不同地区的14份粳稻BT型细胞质雄性不育恢复系、 6份雄性不育系以及4份杂交粳稻品种进行PCR扩增和电泳检测。结果表明，恢复系宁恢8 号、C-25、C-53、R9511、湘晴、R161、申恢 254、R192、皖恢 9 号、HP121、LR27、C418、轮回 422 和 R187能扩增I条长度约I, 145 bp的条带；不育系95122A、徐稻3号A、武运粳7号A、863A、 泰粳985A和连粳6号A能扩增出I条长度约571 bp的条带；而杂交粳稻品种9优418、常优I号、86优8号及95优161则能同时扩增出长度约1，145 bp和571 bp的两条带(图4)。 因此，在Rfla位点，粳稻恢复系的基因型为/P/Va/P/Va，不育系的基因型为r/Var/Va，而杂交粳稻组合的基因型为RHarfla。4)InDel- 标记对863A/宁恢8号F2分离群体不同单株沿Va位点的基因型检测
为进一步验证InDel-TPfVa对不同基因型的检测效果，在分蘖盛期对863A/宁恢8号F2分离群体的200个单株DNA进行PCR扩增，其电泳产物呈现3种类型的条带，即恢复系宁恢 8 号 UmaRfla，1145 bp)、粳稻不育系 863A (了/7<^/7<3，57讣口)以及杂种 F1 (.Rflarfla, 1145 bp和571 bp)的带型(图5)。经统计，在F2群体中共检测到TP/Va/P/Va基因型单株 41个，Rflarfla基因型单株111个，rflarfla基因型单株48个，三种基因型符合1:2:1 (X 2=2. 91，O. 25 <P<0. 50)。因此，通过InDel-TPfVa标记的PCR扩增能准确区分沿Va位点的不同基因型，达到辅助育种的目的。
权利要求
1.一种鉴定粳稻BT型细胞质雄性不育恢复基因TPZVa的分子标记方法，其特征在于 用Rfla恢复基因特异性引物InDel-TP/Va正向引物 InDel-TPfVa-F 序列为 5’-CTGATGATCGAGGAGGAGGTA-3’反向引物 InDel-TPfVa-R 序列为 5’- TAACGCGTCTTCCATCCTACT-3’扩增水稻植株的基因组DNA，如果有1，145 bp的特征条带即为含TPZVa恢复基因的纯合体；如果有571 bp的特征条带即为不含TPZVa恢复基因的纯合体；如果同时存在1，145 bp 和571 bp的两条特征条带，则为恢复基因的杂合体。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于水稻植株基因组DNA的提取；将权利要求I所述的两条分子标记引物InDel-TPfVa-F和InDel-TPfVa-R加入PCR反应体系，并对水稻种质资源或育种群体植株的DNA进行扩增；20 μ L PCR反应体系包括 10 ng/yL 的 DNA 2. O μ L,4 pmol/ μ L 的引物 2. O μ L，其中引物 InDel-/ /7a-F 和 InDel-TPfVa-R 各 I. O μ L, 10XPCR 含有 25 mmol/L MgCl2 的 Buffer 2. O μ L,2. 5 mmol/ L 的 dNTP O. 4 μ L，5 U/ μ L 的 7 O. 5 μ L 和 ddH20 13. I μ L ；PCR反应程序包括95 °C预变性5 min ;然后95°C变性30 s、55°C复性30 s、72°C延伸 I min，循环35次；然后72°C延伸7 min, 10°C冷却10 min后，将扩增产物加上样缓冲液终止反应；反应产物在质量比浓度为I. 0%的琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭染色并于凝胶成像系统下观察，记载。
全文摘要
本发明涉及一种粳稻BT型细胞质雄性不育恢复基因Rf1a的分子标记方法，属于生物工程技术领域。设计合成一对正、反引物，对不同水稻植株DNA进行扩增，如果有1,145bp的特征条带即为含Rf1a恢复基因的纯合体；如果有571bp的特征条带即为不含Rf1a恢复基因的纯合体；如果同时存在1,145bp和571bp的两条特征条带，则为Rf1a恢复基因的杂合体。本发明不仅能快速、准确地鉴定水稻种质资源或其育种群体中是否含有粳稻BT型细胞质雄性不育恢复基因Rf1a，同时能进一步区分Rf1a基因的纯合体和杂合体，预测后代基因型，大大提高对BT型粳稻恢复系的选择效率，加速育种进程。
文档编号C12Q1/68GK102605074SQ20121007854
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月23日 优先权日2012年3月23日
发明者于新, 周丽慧, 姚姝, 张亚东, 朱镇, 王才林, 赵凌, 赵庆勇, 陈涛, 骆名瑞 申请人:江苏省农业科学院