专利名称：一种大豆根特异的高效磷转运蛋白的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，特别涉及一种大豆转运蛋白及应用。
背景技术：
磷是生物生长发育的重要营养元素之一，是蛋白质、核酸、脂类以及各种重要的小分子(如能源供应者ATP)的重要组成成分，是各种代谢(如糖降解)必须的中介物，是生长发育的调节物(如磷酸化)。因此，施加磷肥对提高农产量起着关键作用。但是，磷是一种不可再生的资源，由于长期以来的过度利用，使得磷正在逐步成为一种地球上即将消失 的矿产资源，在不远的将来，磷将制约各国的经济和政治命脉，磷也将成为许多国家的战略物资(Steven Van Kauwenbergh)。然而，为了提高作物的产量，农业上还在不断增加磷的施用量。据报道，我国小麦产区的磷施用量是小麦生长发育所需的两倍(Vitousek，等，2009);另外，人和动物粪中含有大量的磷也被直接释放到环境中。结果导致土壤和水体中磷含量大量增加，引起环境污染。同时，在水体和土壤中的磷大多数是植物不可利用的有机磷。这样，导致了土壤中的有效磷含量低。因此，提高植物对磷的利用率对于减少农业磷的施用量，维护生态安全，提高作物的产量，保障国家磷的战略安全等方面具有重要和关键的意义。大豆是重要的农作物之一，是植物蛋白质、食用油、生物柴油以及异黄酮和卵磷脂等次生代谢产物的重要来源，其产量与土壤磷的供应量和植株对磷的吸收能力直接相关。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种大豆根特异的磷转运蛋白GmPHT06。本发明的另一目的是提供编码上述大豆根特异的磷转运蛋白GmPHT06的基因。本发明的再一目的是提供上述编码大豆根特异的磷转运蛋白GmPHT06的基因在提高植物对磷的利用率以及提高植物在磷胁迫下的抗逆能力中的应用。为了实现本发明目的，本发明的一种大豆根特异的磷转运蛋白GmPHT06，其具有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本发明还提供编码上述蛋白的基因，其具有SEQ ID No. I所示的核苷酸序列。本发明还提供含有编码大豆根特异的磷转运蛋白GmPHT06基因的载体及含有该载体的宿主细胞。本发明还提供含有编码大豆根特异的磷转运蛋白GmPHTOe基因的转化植物细胞及转基因植物。本发明进一步提供编码大豆根特异的磷转运蛋白GmPHT06的基因在提高植物对磷的利用率以及提高植物在磷胁迫下的抗逆能力中的应用。优选地，所述植物为拟南芥、大
Λ7. -rf* ο本发明提供的GmPHTO6 基因(全称为 Glycine max phosphate transporter 06)是从大豆垦农18(由东北农业大学提供)中克隆到的基因，基因的开发阅读框为1602bp，它编码534个氨基酸；大豆根特异的磷转运蛋白GmPHT06具有12个跨膜域(图I)和植物PHTl 特征域 GGDYPLSATIxSE (图 2);用实时定量 PCR(quantitative real-time RT-PCR，qRT-PCR)方法检测到GmPHT06基因主要在大豆根器官中特异表达(图3)，未检测到GmPHT06基因在大豆叶、茎、花和种子等地上器官中的表达(图3)，GmPHT06基因的表达显著受低磷胁迫的诱导(图3) ；GmPHT06蛋白在细胞中定位于细胞膜(图4) ; GmPHT06基因能恢复酵母的磷转运蛋白双突变体PAM2(即APho84/APho89)的表现型，可以在低磷条件下正常生长(图5);动力学分析显示GmPHT06蛋白具有对磷高亲和力的特点(图5)。借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果(I)本发明提供了大豆根特异的磷转运蛋白GmPHT06(氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示)及编码该蛋白的基因(核苷酸序列如SEQ IDNo. I所示)。(2)过表达GmPHT06基因可以提高酵母对磷的利用率。 (3)本发明提供的大豆根特异的磷转运蛋白GmPHT06可用于提高各种植物对磷的利用率，提高植物在磷胁迫下的抗逆能力，从而提高植物的产量。
图I为本发明用TMHMM2. O软件分析的结果显示大豆根特异的磷转运蛋白GmPHT06具有12个跨膜域(上图，详细位置与下图的氨基酸位置对应)以及各个跨膜域的具体位置(下图)。图2为本发明大豆根特异的磷转运蛋白GmPHT06与拟南芥AtPHTl ；4高度同源，PHTl特征域以箭头指示的方框标示。图3为本发明大豆根特异的磷转运蛋白GmPHT06在不同组织中和磷胁迫条件下的表达水平，其中，R -M ；u :单叶；T1 :第一复叶；T2 :第二复叶；Τ3 :第三复叶；Τ4 :第四复叶；NI :茎从下往上的第一节间；S :茎；F :花；S-S1 :开花后7天的荚；S-S2 :开花后14天的荚；S-S3 :开花后21天的荚；S1 :开花后第7天的种子；S2 :开花后第14天的种子；S3 :开花后第21天种子；S4 :成熟种子。短线后的字母标示器官名称，短线前的字母标示发育时期(即相应字母标示器官成熟的时期)。图4为本发明大豆根特异的磷转运蛋白GmPHT06定位于细胞膜上(左图为荧光信号图，中图为明场图，右图为左图和中图的叠加效果图。荧光信号用箭头指示)。洋葱表皮细胞经转化GFP标记的GmPHT06基因后，再经质壁分离后，用激光共聚焦显微镜观察。图5为本发明GmPHT06基因在酵母磷转运蛋白双突变体PAM2(即Apho84/Apho89)中的异源表达的互补结果，其中，左图控载体转化的效果(对照)，中图为转化GmPHT06基因的互补图(纵坐标为培养基的磷浓度，横坐标为菌液的稀释倍数)。彩图中红褐色表示没有活性，黄色表示有活性，黄色越浅，活性越强(在黑白图中，颜色越浅表示活性越强)；右图为转化GmPHT06基因的酵母的动力学生长曲线，显示亲和常数为82. 7μΜ，表明为GmPHT06高亲和磷转运载体。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例I GmPHT06基因的克隆以大豆品种垦农18(KN18)为试验材料，在低磷胁迫(H2PO4, 100 μ Μ)下的液体培养基中培养至真叶张开，取根、莖和叶，利用Trizol试剂盒提取总mRNA(Invitrogen公司)，并利用反转录试剂盒(Takara公司)对总mRNA进行反转录,得到cDNA。液体培养基成份
H3BO350xl0'3mM
MnS04*H20IOxlO'3 mM
ZnSO4WH2O2xl0'3 mM
CuS04*5H201.5χ10'3 mM
Na2Mo04.2H20 0.58xl0'3 mM FeS04.7H200.1 mM
Na2EDTAGH2O0.1 mM
KH2PO4IOmM
KNO32.5 mM
MgS04.7H20IOmM
Ca(N03)2*4H202.5 mM以大豆品种垦农18(KN18)为试验材料，通过RT-PCR(其程序为95°C预变性3min ；94 °C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 2min, 26 循环；72 °C 5min。反应体系0. 3 μ L LA TaqDNA 聚合酶，I μ L 引物 F，I μ L 引物 R，5 μ L IOX 缓冲液，4 μ L dNTP mix, 2 μ L cDNA,36. 7 μ L H2O ;总体系为 50 μ L。其中，引物 F 5-ATGGCTGGAGAATTGGGAGTTT-3 ;引物 R :5’-GGAACAGGAACTGTCCTAGCAG-3’。扩增得到GmPHT06。将其重组到Gateway克隆体系的入门载体pGwC上。并送三博远志生物公司测序，检测GmPHT06的正确性。分析检测正确的GmPHT06基因，基因的开发阅读框为1602bp，它编码534个氨基酸；大豆根特异的磷转运蛋白GmPHT06具有12个跨膜域(图I)和植物PHTl特征域GGDYPLSATIxSE(图 2)。实施例2 GmPHT06基因在酵母中的表达通过Gateway克隆体系将GmPHT06重组到pYES_DEST52载体(购自Invitrogen公司)上，并将重组质粒转化到缺失两个高亲和磷转运基因(PH089和PH084)的酵母突变体 PAM2 ( Δ pho89: : TRPl Δ pho84: :HLS3 ade2 leu2 his3 trpl ura3。Martinez,P. , Zvyagilskaya, R. , Allard, P 和 Persson, B. 1998.Physiological regulationof the derepressible phosphate transporter in Saccharomyces cerevisiae.J. Bacteriol. 180, 2253-2256.)中。在GAL(半乳糖)启动子的作用下，GmPHT06可以互补PH084和PH089的功能，即PAM2可以在低磷(< 50 μ M)条件下正常生长。实施例3 GmPHT06基因在大豆中的表达及其在提高大豆对磷的利用率中的应用选用籽粒饱满且一致的大豆KN18作为测试材料。将其播种于新的蛭石中保湿催芽，于各个生长时期对各器官取样分析；磷胁迫实验是将大豆萌发出土 2-3天后，移入H2PO4A 500μ M的液体培养基中，培养至真叶张开。移至H2PO4的浓度梯度为5μ M的培养基中培养。培养7天后取样，同实施例I中的操作。利用qRT-PCR检测GmPHT06受磷胁迫的调控影响。引物F:5，-TTGGTTGTGACGTGTTTACACC-3，；引物 R : 5，-ACAAAAGTAAGAACCAAAAGCAAAC-3，。PCR 程序ABI St印One进行，用SYBR Green I检测荧光信号。采用15 μ I反应体系，体系配
制如下
SYBR Primix Ex Taq( 2χ ) 7.5 ul
上游引物(10UM)0.3 ul
下游引物(10UM)0.3 ul
ROX Reference Dye ( 50x )0.3 ul
cDNA1.0 ul
ddH,0 (灭菌双蒸水)4.6 ul
共计15 ulqRT-PCR 参数如下两步法95°C10S，热启动；95°C 5S，60°C lmin,40 个循环。从检查结果来看，GmPHT06在根中特异表达(图3左。图中横坐标器官 缩写为 短横线前的字母U表示单叶期大豆，F表示开花期大豆，S表示荚，seed表示种子；短横线后的字母表示相应的器官，R，根；A，地上部；H，下胚轴；C，子叶；E，上胚轴；U，单叶；T1 T4，第一至第四复叶，F，花；S，荚；，不同时期的荚；NI，第一节间)，并受低磷的强调控。磷浓度为5 μ M时基因的表达量超过对照500 μ M的5倍(图3右)。但在有磷的条件下，GmPHT06的表达与磷的供给浓度成正相关。洋葱表皮瞬时表达分析表明，GmPHT07蛋白在细胞中定位于细胞膜(图4，左图为YFP荧光信号图，中间为白光图，右图为前二者的重叠图)；GmPHT07基因能恢复酵母的磷转运蛋白双突变体PAM2(即APho84/APho89)的表现型，可以在磷胁迫的条件下正常生长(图5，左和中间图)；动力学分析显示GmPHT07蛋白具有对磷高亲和力的特点，Km值为82. 7 μ M，稀释100倍的菌液在10 μ M低浓度磷条件下可以正常生长(图5，右图)。实施例4GmPHT06基因在拟南芥中的表达及其在提高拟南芥对磷的利用率中的应用将GmPHT06基因构建在由35S启动子驱动的双元载体pLeela(pLeela载体来自德国马普 Drs. George Coupland 实验室，已公开在文献 I. Liu, Y. X.，Koornneef, M.，and Soppe, ff. J. (2007)The Absence of Histone H2B Monoubiquitination in theArabidopsis hubI (rdo4)Mutant Reveals a Role for Chromatin Remodeling in SeedDormancy. The Plant Cell. 19 :433-444 ；2. Hanano, S. , Stracke, R. , Jakoby, M. , Merkle,T. , Domagalska, M. A. , Weisshaar, B. , and Davis, S. J. (2008)Asystematic surveyin Arabidopsis thaliana of transcription factors that modulate circadianparameters. BMC genomics. 9 :182)上,过表达到拟南芥中检测该基因的功能，已获得转基因植株。并用测定了 3棵独立转基因植株在低磷(浓度为10 μ M)胁迫的条件下植物体内总磷含量的变化。取生长14天的幼苗，用超纯水清洗干净，放入60°C烘箱中过夜烘干，将称量后的样品(100 300mg)直接放入消化罐中，加入7ml 68%的HNO3和2ml 30%的H2O2 (优级纯)，用 Microwave laboratory system (Milestone, Italy)在 18CTC,lKPa 条件下消化15min。冷却后,将消化液转入25ml用超纯水洗净并烘干的容量瓶中，用超纯水定容至 25ml ο 用 Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometer (ICP-0ES,Perkin Elmer, USA),以磷的标准溶液做标准曲线测定磷含量,每个样品重复测量3次。从测定结果来看，转基因拟南芥比野生型的总磷含量提高了 4.2%。由此可见，基因GmPHT06过表达于植物中，增强了转基因植物在低磷胁迫条件下吸收磷的能力，进而有效地提高了植物抗低磷胁迫的能力。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.大豆根特异的磷转运蛋白GmPHT06，其特征在于，其具有 1)由SEQID No. 2所示的氨基酸序列；或 2)SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等功能的氨基酸序列。
2.编码权利要求I所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，其具有SEQID No. I所示的核苷酸序列。
4.含有权利要求2或3所述基因的载体。
5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。
6.含有权利要求2或3所述基因的转化植物细胞。
7.权利要求2或3所述的基因在提高植物对磷的利用率以及提高植物在磷胁迫下的抗逆能力中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的植物为拟南芥。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的植物为大豆。
全文摘要
本发明属于基因工程领域，涉及一种大豆根特异的磷转运蛋白GmPHT06，其具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，以及编码该蛋白的基因，其具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本发明提供的大豆根特异的磷转运蛋白GmPHT06可用于提高各种植物对磷的利用率，提高植物在磷胁迫下的抗逆能力，从而提高植物的产量。
文档编号C12N15/63GK102702336SQ201210078440
公开日2012年10月3日 申请日期2012年3月22日 优先权日2012年3月22日
发明者傅永福, 张晓玫, 范成明 申请人:中国农业科学院作物科学研究所