专利名称：一种处理石油行业高盐含油废液的嗜盐菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株本源嗜盐菌株及其应用，特别涉及该菌株在不同类型高盐含油废液处理中的应用。
背景技术：
目前，石油在国民经济发展中具有举足轻重的作用。随着社会和区域经济的迅速发展，国家对石油能源的需求不断増加，使得油田被大面积勘探和开发，由石油开发造成的污染问题日益凸显、污染日趋严重。在石油勘探和开发过程中，钻井作业、井下作业、采油、联合站等环节产生不同类 型的含油废液，由于原油特性、地质条件的不同，废液性质差异较大，但也有共同特性，如呈碱性、含油量高、COD浓度高、矿化度高等。高盐含油废液如不经适宜处理或直接排放将会对环境造成严重污染，过高的PH值、高浓度的可溶性盐及石油类物质等会影响土壤的结构，导致土壤板结，使土壤无法返耕，危害植物的正常生长；有害的石油类物质可能会进入食物链，对环境中的生物及人类的身体健康和生命安全造成威胁。高盐采油废液的处理主要有物理、化学、生物方法，但物理和化学方法具有处理不彻底，费用较高、容易造成二次污染等而难以在实际中推广，微生物处理法由于具有节约能源、投资少、运行费用低、对环境无污染等优点而日益受到各国环保人士的关注和重视，成为国内外生态环境领域研究的热点和重点。近年来，国内外都相继开展利用微生物法处理环境中的石油污染物，主要是从污染环境中筛选高效降解微生物或优势微生物，然后将其投放到待处理的样品或环境中，使其去除石油污染物，然而微生物对石油污染物的降解易受pH、盐度等影响，高盐度会降低微生物的活性和代谢，从而抑制微生物对石油污染物的降解，为了加快石油污染物的降解速率，往往需要采取措施強化微生物在不利环境中的适应性。油田含油废液通常具有含盐量高、矿化度高等特点，给普通微生物的处理带来一定的难度。因此，探索和开发适用于不同盐环境下的功能微生物，对于解决油田高盐环境中的污染物问题有着重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供ー种从钻井废弃泥浆中分离出的嗜盐芽孢杆菌，该菌株能很好处理石油行业高盐含油废液中的石油，而且对于碱性高盐钻井废弃泥浆中的石油处理效果也较好，为石油行业高盐含油废液的处理提供一种高效、低成本、环境友好方法。本发明采用的技术方案是用于石油行业高盐含油废液处理的嗜盐菌是芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp. spizizenii Y-B,该菌已于 2010 年 9 月 28 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 4194。在扫描电镜下观察，该菌株形态为杆状，产芽孢，固体培养菌体为乳白色、表面光滑、不透明粘湿、边缘整齐。上述嗜盐芽抱杆菌Bacillus subtilis subsp. spizizenii Y-B CGMCC No. 4194的培养方法无菌条件下，以钻井废弃泥浆为菌源，在温度为25 30°C条件下，嗜盐菌培养基中培养2 3天，分离出嗜盐菌株。在温度25 30°C条件下，将上述菌株在高盐含油基础培养基中富集培养3 5天，然后移取菌液于固体LB培养基上，在温度为30°C的培养箱里培养24小时后，得到以原油为卩隹一碳源的嗜盐芽抱杆菌Bacillus subtilis subsp. spizizenii Y-B CGMCCNo.4194。所述嗜盐菌培养基各组分质量百分比为酸水解酪素0.5%，酵母膏1.0%，细菌蛋白胨 O. 5%，柠檬酸三钠 O. 3%，KCl O. 3%，MgS047H20 I. 8%, CaCl2O. 02%, NaCl 5%,FeS047H20 O. 0001 %，其余为蒸馏水。含油基础培养基各组分质量百分比为=NH4NO3O. 3%, KH2PO4O. 05%, K2HPO4O. 05%,MgSO4O. 02%, NaCl 5%, CuSO4O. 001%, MnSO4O. 001%, FeS047H20 O. 001%, CaCl2O. 001%, 石油0.2%，其余为蒸馏水。固体LB培养基各组分质量百分比牛肉膏5%，蛋白胨1%，NaCl 1%，琼脂2%，其余为蒸馏水。本发明的另ー个目的是提供ー种利用该菌株处理石油行业井下作业废液、污染海水和废弃泥浆三种不同高盐含油废液的方法。本发明所提供的处理石油行业井下作业产生废液、被污染海水和钻井废弃泥浆三种不同高盐含油废液的方法是利用嗜盐芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp. spizizeniiY-B CGMCC No. 4194对不同含油废液中的石油进行降解处理，该菌株可以将含油废液中的石油降解为ニ氧化碳和水。在不同含油废液中加入嗜盐芽孢杆菌Bacillus subtilissubsp. spizizenii Y-BCGMCC No. 4194,嗜盐芽抱杆菌 Bacillus subtilis subsp.spizizenii Y-BCGMCC No. 4194的体积百分比为2 10%，其余为含油废液；温度保持在25 30°C，振荡处理时间为5 7天。处理过程中不需投加培养基和其它化学处理剂。试验证明在温度25 30°C下，含油废液中的石油浓度在190 2200mg/L之间，该菌对废液中石油的降解率在70%以上，对石油浓度不高于200mg/L的含油废液的降解效果更好，高达95%以上，而且对石油行业不同类型含油废液具有良好的适应性及处理效果。本发明的嗜盐芽抱杆菌Bacillus subtilis subsp. spizizenii Y-BCGMCCNo. 4194是ー株具有极高活性，对石油行业不同含油废液中的石油降解能力较好的菌株，其培养方法简单，生长速度快，对环境适应能力强，可用于石油行业高盐含油废液的处理，具有良好的エ业化应用前景。本发明的有益效果本发明所述的嗜盐芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp.spizizenii Y-B CGMCC No. 4194目前已对石油行业不同类型含油废液进行了处理试验，对废液中石油降解率达70%以上，对低浓度废液中的石油降解效果更好，高达95%以上。采用生物法处理，其最終产物为ニ氧化碳和水，对环境友好且处理成本低，将在石油行业高盐含油废液处理中应用广泛。
图 I 是嗜盐芽抱杆菌 Bacillus subtilis subsp. spizizenii Y-B CGMCCNo. 4194的测序序列图。
具体实施例方式下属实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有百分比浓度均为质量百分比，所有培养基中的溶剂均为蒸馏水。实施例I、嗜盐芽抱杆菌 Bacillus subtilis subsp. spizizenii Y-BCGMCCNo. 4194的筛选、培养和对不同含油废液的处理效果嗜盐芽抱杆菌Bacillus subtilis subsp. spizizenii Y-B CGMCC No. 4194 的筛
选与培养称取IOg油田钻井废弃泥浆，放入盛有90ml无菌生理盐水的三角瓶中，在温度为25 30°C下，恒温振动18-24小时，用无菌枪头吸取5ml菌悬液加入盛有45ml嗜盐菌培养基中，嗜盐菌培养基各组分质量百分比为酸水解酪素0.5%，酵母膏1.0%，细菌蛋白胨 O.5%，柠檬酸三钠 O. 3%，KCl O. 3%，MgS047H20 I. 8%, CaCl2O. 02%, NaCl 5%，FeSOJH2O溶液O. 0001%，其余为蒸馏水。在温度为25 30°C下培养2-3天，即可得嗜盐菌株。取5ml上述菌液在45ml高盐含油基础培养液中进行培养，高盐含油基础培养液各组分质量百分比为NH4NO3O. 3%, KH2PO4O. 05%, K2HPO4 O. 05%, MgSO4O. 02%, NaCl 5%,CuSO4O. 001%, MnSO4O. 001%, FeSOJH2O O. 001%, CaCl2O. 001%，石油 O. 2%，其余为蒸馏水。在温度为25 30°C下培养3 5天，然后用无菌枪头吸取Iml上述菌液加入盛有9ml无菌水试管中充分混匀，以此推制成10' IO-2, IO-3,10_4，10_5，10_6不同稀释液。分别从10_2，IO-3, IO-4三管稀释液中各吸取IOOul于固体LB培养平板上，固体LB培养基各组分质量百分比牛肉膏5%，蛋白胨l%，NaCl I%，琼脂2%，其余为蒸馏水，在温度为30°C培养箱中培养24h，出现乳白色菌体，用接种环从平板上挑选出此菌体，在固体LB培养基上划线纯化2-3次,得到所需的以原油为卩隹一碳源的嗜盐芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp.spizizenii Y-B CGMCC No. 4194。上述培养基均在121、O. IMpa下灭菌30分钟。嗜盐芽抱杆菌Bacillus subtilis subsp. spizizenii Y-B CGMCC No. 4194 对石油的降解能力试验过程用嗜盐菌培养基(酸水解酪素0.5%，酵母膏1.0%，细菌蛋白胨 O. 5 %，柠檬酸三钠 O. 3 %，KCl 0.3%, MgS047H20 I. 8 %，CaCl2O. 02 %，NaCl 5%,FeS047H20 溶液 O. 0001 %,其余为蒸懼水)将菌株 Bacillus subtilis subsp. spizizeniiY-B CGMCC No. 4194培养到对数期，按照培养基体积8%的量转接到高盐含油基础培养基(NH4NO3O. 3 %, KH2PO4O. 05 %, K2HPO4O. 05 %, MgSO4O. 02 %, NaCl 5 %, CuSO4O. 001 %,MnSO4O. 001%，FeSOJH2O O. 001 %，CaCl2O. 001 %，原油 O. 2%，其余为蒸馏水)中，在温度25 30°C、转速150rpm摇床上培养7天。将上述液体在酸性条件下用CCl4试剂萃取，用红外测油仪测定石油浓度，并以不含菌液的高盐含油基础培养基为对照。计算石油降解率，以确定对石油的降解能力。降解率(％) = (A-B)/AX 100 (A——降解前高盐含油基础培养基中的石油浓度，B——降解后高盐含油基础培养基中的石油浓度)。试验结果表明，2000mg/L 的石油溶液经过嗜盐芽抱杆菌 Bacillus subtilis subsp. spizizenii Y-BCGMCC No. 4194的降解作用，降解率达60%以上。嗜盐芽抱杆菌Bacillus subtilis subsp. spizizenii Y-B CGMCC No. 4194 对不同类型含油废液中石油的降解能力在井下作业产生的废液和被污染的海水中分别加入体积百分比8%的嗜盐芽孢杆菌 Bacillus subtilis subsp. spizizenii Y-B CGMCC No. 4194,于温度 25 3CTC、转速150rpm摇床上培养7天，测试处理前后溶液中含油量变化。井下作业产生的废液和被污染的海水中石油浓度在190 2200mg/L之间，试验过程中未投加其它化学处理剂。试验表明该嗜盐菌对井下作业废液和污染海水的降解效果降解率在70%以上；对石油浓度不高于200mg/L的含油废液的降解效果更好，高达95%左右。嗜盐芽抱杆菌Bacillus subtilis subsp. spizizenii Y-B CGMCC No. 4194 降解条件优化(I)pH 值对嗜盐芽抱杆菌 Bacillus subtilis subsp. spizizenii Y-BCGMCCNo. 4194降解石油能力的影响分别在pH值为4、6、7、8、9、10、11的高盐含油基础培养基中，按照培养基体积8%的量加入嗜盐芽抱杆菌 Bacillus subtilis subsp. spizizenii Y-B CGMCC No. 4194,于25 30°C，150rpm恒温振荡培养7天后测定测试处理前后溶液中含油量变化。试验表明，嗜盐芽抱杆菌 Bacillus subtilis subsp. spizizenii Y-B CGMCC No. 4194 在 pH = 9 时对石油降解效果最好。(2)不同形态氮源和磷源对嗜盐芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp. spizizeniiY-B CGMCC No. 4194降解石油能力的影响分别在含有(NH4)2SO4, (NH2)2CO, KNO3> NH4NO3的高盐含油基础培养基中，按照培养基体积8%的量加入嗜盐芽抱杆菌Bacillus subtilis subsp. spizizenii Y-B CGMCCNo. 4194，于25 30°C，150rpm恒温振荡培养7天后测定测试处理前后溶液中含油量变化。试验表明，嗜盐芽抱杆菌 Bacillus subtilis subsp. spizizenii Y-B CGMCC No. 4194的最佳利用N源是(NH2)2CO15分别在含有KH2P04、K2HP043H20、KH2PO4 与 K2HP043H20 体积比 I : I 的高盐含油基础培养基中，按照培养基体积8%的量加入嗜盐芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp.spizizenii Y-B CGMCC No. 4194，于25 30°C，150rpm恒温振荡培养7天后测定测试处理前后溶液中含油量变化。试验表明，嗜盐芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp. spizizeniiY-B CGMCC No. 4194 的最佳利用 P 源为 K2HP043H20。实施例2 :嗜盐芽孢杆菌株Y-B CGMCC No. 4194在优化后的降解条件下对钻井废弃泥浆的降解能力钻井废弃泥衆pH位于9左右，根据嗜盐芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp.spizizeniiY-B CGMCC No. 4194优化后的降解条件，在石油浓度为600mg/L左右的钻井废弃泥衆加入体积百分比8%的嗜盐芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp. spizizenii Y-BCGMCC No·4194，然后再加入(NH2)2C0氮源和K2HP043H20磷源，保持N : P为I : I 3 : 1，温度为25 30°C条件下振荡处理7天后测试处理前后溶液中含油量变化，试验过程中未投加其它化学处理剂。试验表明在降解条件优化后，其嗜盐芽孢杆菌株Bacillus subtilissubsp. spizizenii Y-B CGMCC No. 4194对废弃泥浆的降解能力提高了 23%，由51. 21%提高到70% 80%。
权利要求
1.一种嗜盐芽孢杆菌Y-B,其特征在于其学名为Bacillus subtilis subsp.spizizenii,其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNo.4194。
2.如权利要求I所述的嗜盐芽抱杆菌Y-B(Bacillus subtilis subsp. spizizenii)处理含油废液的方法，其特征在于在含油废液中加入嗜盐芽孢杆菌Y-B(Bacillus subtilissubsp. spizizenii),嗜盐芽抱杆菌Y_B (Bacillus subtilis subsp. spizizenii)的体积百分比为2 10%，其余为含油废液；温度保持在25 30°C，振荡处理时间为5 7天。
3.如权利要求2所述的嗜盐芽孢杆菌Y-B处理含油废液的方法，其特征在于所述的含油废液是井下作业产生的废液、被污染的海水、钻井废弃泥浆。
全文摘要
本发明公开了一株从钻井废弃泥浆中富集、筛选、培养出的嗜盐菌Y-B，其目的是高效降解石油行业高盐含油废液中的石油。菌株Y-B呈乳白色，革兰氏阳性菌，细胞杆状，产芽孢，经鉴定为嗜盐芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.spizizenii)，具有极高的活性，其培养方法简单，容易获取，成本低，生长迅速，适宜于偏碱性、高盐环境，对高盐含油废液中的石油去除效果较好，将在石油行业高盐含油废液及溢油突发事故的处理中有着广阔的应用前景。
文档编号C12R1/125GK102676424SQ201210078420
公开日2012年9月19日 申请日期2012年3月22日 优先权日2012年3月22日
发明者刘光全, 刘玉龙, 宋佳宇, 岳勇, 邓皓, 陈梅梅 申请人:中国石油天然气集团公司, 中国石油集团安全环保技术研究院, 北京中油爱索环境工程技术有限公司