专利名称：调控马铃薯低温糖化的蛋白和基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及ー个调控马铃薯低温糖化的关键基因SbSnRKl a I及其应用。该基因在调节低温贮藏的马铃薯块茎低温糖化程度方面具有显著的功能，可以在马铃薯贮藏后炸片加工方面进行应用。
背景技术：
马铃薯油炸加工对块茎品质的要求非常严格，除外观品质外，更主要的是要求块茎高淀粉含量和低还原糖含量低于O. 25%(鲜重)并耐低温贮藏。原因在于，在油炸过程中，块茎内的还原糖与氮化合物的α-氨基酸进行“ Mai I lard Reaction”致使薯片或薯条表面顔色加深，从而严重影响加工品质(屈冬玉等，2001)。为了延长加工周期以及抑制常温贮藏导致的块茎品质下降等现象，在马铃薯加工业中常将块茎长期贮藏在低温下。然而，低温加速块茎内淀粉裂解转化还原糖(葡萄糖和果糖)，这种“低温诱导的块茎糖化”现象是大多数品种不适合加工的主要原因。因此，马铃薯块茎低温糖化的研究既有解释低温糖化代谢过程中的分子机理作用，又有对马铃薯低温贮藏后加工的经济应用价值。马铃薯块茎低温糖化主要是由于低温改变了块茎内淀粉-糖代谢的平衡，导致蔗糖在块茎中累积，蔗糖又进ー步转化为葡萄糖和果糖所致(Isherwood，1973)。研究表明，在此代谢途径中转化酶(Irwertase)是直接导致还原糖积累的关键酶。早在Uppal和Verma (1990)的研究中发现，低温贮藏期间转化酶活性与还原糖含量呈极显著相关(r=0.821)。后续大量的研究同样表明，低温贮藏块茎中转化酶活性与还原糖含量显著相关(Richardson et al. 1990; Cheng et al. 2004; McKenzie et al. 2005)。SnRKl (sucrose non-fermenting-l-re lated protein kinase 植物鹿糖非发酵-I相关蛋白激酶)作为植物蛋白激酶家族中ー个重要家族，其与酵母中SNFl (sucrosenon-fermenting-1, SNFl)和哺乳动物中的 AMPK(AMP_activated protein kinase, AMPK)同源并具有与它们相似和自身独特的功能，在植物体内普遍存在三个亚家族。SnRKl在植物体内的研究今年来发展非常迅速，SnRK在植物的碳水化合物代谢和多种环境胁迫，ABA途径，抗病抗逆，甚至产量和品质都是关键性的调节酶(Halford andHey 2009; Hey et al. 2010; Coello et al. 2011; Halford et al. 2011)。在马铃薯 中已经克隆到α，β亚组分别为StubSNFl和Gal83，马铃薯SnRKl与块茎的萌发(Halfordet al. 2003)，淀粉积累，葡萄糖的含量下(McKibbin et al. 2006)密切相关并影响着糖代谢途径中多种酶例如ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的表达(Tiessen et al. 2003)。而关于SnRKl的互作蛋白也在逐渐深入研究中(Beczner et al. 2010; Shen et al. 2011)。但是在低温糖化代谢过程中的影响却未见相关文献的报导，因此转化酶，转化酶抑制子与SnRKl各亚基蛋白之间的互作调控关系对低温糖化的影响具有很好的生物学和经济意义。
发明内容
本发明的SbSnRKl a I基因是以抗低温糖化的野生种品系5 berthaultii的优质全长cDNA酵母双杂交文库为基础，以转化酶为铒蛋白杂交此文库筛选获得的潜在互作蛋白候选基因之一。后续实验证明SnRKl蛋白激酶a和0亚组(SbSnRKl a 1，StSnRKl^ I)和转化酶，转化酶抑制子之间存在一对一的特异选择性互作关系，同时SbSnRKl a I对低温糖化起到了极显著的调节作用。该互作关系以及SbSnRKl a I对低温糖化的影响在国内外尚均未有相关文献的报导。
鉴于此，本发明的目的在于提供一种调控马铃薯低温糖化的a 7基因和蛋白及其应用。为了实现上述目的，本发明第一个方面提供了一种SbSnRKl a I蛋白，它的氨基酸序列为序列表SEQ ID NO:2所示。本发明的第二个方面提供了编码该SbSnRKl a I蛋白的多核苷酸序列；其中优选的多核苷酸为SEQ ID NO: I。本发明的第三个方面提供了包含上述多核苷酸序列的表达载体；其中优选的表达载体是pMD18-T载体或pBIC载体。本发明的第四个方面提供了包含上述表达载体的细胞；其中优选的细胞是大肠杆菌DH5a或农杆菌LBA4404。本发明通过试验研究发现，在不适宜低温贮藏后炸片加工的马铃薯品系中超量表达SbSnRKl a I基因，可显著提高该转基因植株的抗低温糖化的能力，降低低温贮藏后的炸片色泽程度，使其4°C贮藏一个月后仍能基本达到商业加工的标准。经基因改良后的马铃薯品系，更加耐低温贮藏，延长了从采后到炸片加工的低温可贮藏时间。特别适用于马铃薯的油炸加工，从而有利于加工品种的改良，新加工品种的创建，商业化生产成本的降低以及原材料利用率的提闻。因此，本发明的第五个方面提供了上述的氨基酸序列SEQ ID N0:2或多核苷酸序列SEQ ID NO: I在马铃薯抗低温糖化中的应用。与现有技术相比，本发明利用克隆的a 7基因在马铃薯中超量表达，超量mk SbSnRKl a I基因后可极显著提高马铃薯低温贮藏过程中的抗低温糖化的能力。本发明通过在马铃薯体内超量表达该基因可以提高植物的抗低温糖化能力，在马铃薯体内干涉该基因的表达可以使植物对低温糖化更敏感。
图I -.SbSnRKl a I基因超量表达载体构建流程图。图2 pBIC载体结构图。图3 ,SbSnRKl a I转基因株系薯块低温4°C贮藏30天炸片色泽指数。图4 ,SbSnRKl a I转基因株系薯块低温4°C贮藏30天还原糖含量检测。图5 ,SbSnRKl a I转基因株系薯块低温4°C贮藏30天转化酶活性检测。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明做出更详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。 本发明克隆的基因被命名为5^免欣7 σ 2，可以通过农杆菌介导的遗传转化方法或其他转基因方法把基因转入植物中，通过筛选鉴定获得的转基因植株或株系均属于本发明的保护范围。本发明通过在马铃薯体内超量表达该基因可以提高植物的抗低温糖化能力，在马铃薯体内干涉该基因的表达可以使植物对低温糖化更敏感，其在抗逆方面的应用均属于本发明保护的范围。I本发明SbSnRKl a I基因的克隆与序列分析
本发明中的基因是通过对构建的马铃薯抗低温糖化野生种品系
S.berthaultii全长cDNA酵母双杂交文库以转化酶为铒蛋白分别进行杂交实验所获得的，发现该基因与转化酶存在蛋白质-蛋白质互作关系。文库酵母双杂以及鉴定筛选结果证明，SbSnRKl 〃 2基因的RD区与转化酶在酵母体内能实现蛋白质_蛋白质互作并呈现很高的阳性。设计扩增SbSnRKl σ 2基因全长cDNA序列引物
正向引物为5’ -ATGGACGGAACAGCAGTGCAAGGCA-3’
反向引物为5’ -AAGTACTCGAAGCTGAGCAAGAAAA-3，
通过PCR方法，从抗低温糖化的马铃薯野生种品系5 berthaultii的块茎cDNA中扩增出SbSnRKl α I全长cDNA序列。扩增方法为先用试剂盒(购自上海生エ公司，中国)抽提马铃薯块茎总RNA，具体过程參见说明书，然后用反转录试剂盒(购自Τ0Υ0Β0公司，日本)将mRNA反转录为总cDNA，具体过程參见说明书，再以此为模板用以上正反向引物用LA酶(购自Takara公司，日本)扩增SbSnRKl α I基因的全长，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测为单一条带后，用胶回收试剂盒(购自上海生エ公司，中国，具体过程參见说明书)回收目标条带，克隆至PMD18-T载体(购自Takara公司，日本)，取5yL连接产物进行热击转化大肠杆菌DH5ci感受态(參照J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)，涂布于新配置的含有氨节青霉素/异丙基_β -D-硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3- Π引哚基-B-D-半乳糖甘(Amp/IPTG/X-gal)的LB固体平板上，37で培养过夜，挑选白斑若干，于含Amp 50 mg/L的液体LB培养基中，于37 0C 200 r/min振荡培养过夜至浑浊，用引物PCR检测菌液是否为阳性，送三个阳性克隆至华大基因生物技术公司完成测序工作。测序结果显示，所克隆的SbSnRKl σ 7的cDNA全长为1545bp (见序列表中SEQ IDNO: I所示),编码514个氨基酸(SEQ ID N0:2所示)。用GenBank的Blastn分析显示，与已知的马铃薯StubSNFl(U83797. 4)的cds区域序列相似性有99 %，有17个碱基的不同。该蛋白质与马铃薯StubSNFl蛋白(NP_001233965. I)的氨基酸相似性同样高达99 %，在分別在第286、334、438和462位有4个氨基酸的区別。预测该蛋白质分子量为58. 881KD，等电点为8. 61,用SignalP预测没有找到序列前导序列或特殊区室革巴蛋白信号，Expasy蛋白结构预测的结果显示无明显跨膜区。 2 SbSnRKl a I基因的载体构建
在扩增的SbSnRKl a I基因的引物两侧分别加上及和feci酶切位点，随后以已构建的pMD18-T载体为模板进行PCR扩增，并将扩增产物克隆重新至pMD18-T载体，具体步骤见本发明的SbSnRKl a I基因的克隆与序列分析部分。随后以BernHl和feci双酶切带有目的基因全长的PMD18-T载体，同时以及丽TI和5^1双酶切以块茎优势表达的启动子CIPP替换了 35S启动子的PBI121载体pBIC，各自的酶切产物经I %琼脂糖凝胶电泳后用胶回收试剂盒(购自上海生工公司，中国)回收目标条带，并将目的基因片段与pBIC载体大片段以0.8:1的比例混合，加入T4DNA连接酶(购自Takara公司)1U，I X反应缓冲液，无菌水补充至10 ii L体系，16°C链接10小时，取5 ii L连接产物进行热击转化大肠杆菌DH5 a感受态，涂布于新配置的卡那(Km) 50 mg/L抗性平皿上筛选阳性克隆并酶切检测。pBIC的载体图以及超量表达载体构建流程见图I和图2。对获得的重组质粒利用电转化仪在1800V的电压下转化农杆菌LBA4404，用含利福平(Rif) 100mg/L，卡那(Km)50 mg/L的YEB固体抗性平皿筛选转化阳性斑，挑取若干个阳性斑于含利福平(Rif)100mg/L，卡那(Km)50 mg/L的YEB液体培养基中28°C，150r/min培养4小时，取I y L做模板进行重组质粒的PCR阳性检测，确认为阳性的菌株保存用于后续的遗传转化。3遗传转化
将生长7-9周、直径0.5 cm左右的试管薯切成1-2 mm厚的薄片，在含有相应质粒的农杆菌菌液中浸泡10 min。浸染结束后取出薯片，用无菌滤纸吸干表面菌液。转入灌有共培养培养基 A1(MS 基本培养基+3% 蔗糖+1 mg/L IAA+0. 2 mg/L GA3+0. 5 mg/L BA+2 mg/L ZT)的培养皿中，于24°C暗培养2 d。暗培养后，薯片再转到灌有再生培养基A2 (Al+ 75 mg/LKam+400 mg/L Cef)的培养皿中，置于光照强度2000 lux,光周期16 h/d,温度24°C的条件下培养直到抗性芽再生。待抗性芽长出达0.5-1 cm时，将其切下转入生根培养基A3(MS基本培养基+3%蔗糖+50 mg/L Kam+200 mg/L Cef，pH 5. 8)，转化成功的小芽因为有Kam抗性，能在A3上生根。4 SbSnRKl a I基因的功能鉴定
SbSnRKl a I基因在马铃薯抗低温糖化方面的功能，申请人将13个超量基因转基因株系(PS株系)和对照植株栽培种鄂马铃薯3号(Ep3)同时于2011下半年种植于华中蔬菜分中心基地同一个大棚中，每个株系种植24盆，植株长势良好，薯块成熟度高，转基因株系在田间农业形状上与对照并无显著差异。取各转基因株系单薯重>50g无病斑无机械损伤的块茎分别在常温20°C和低温4°C下贮藏30天，进行油炸薯片和还原糖，转化酶酶活等测定，每个时间点取3个生物学重复。对不同温度不同贮藏时间下各超量表达株系与对照之间的的炸片色泽指数做比较，直观的结果发现，，对照和转基因株系之间20°C贮藏30天炸片色泽均无明显差别。但是4°C贮藏下，各转基因株系的炸片色泽均明显低于对照株系Ep3，其中PS3，PS8，PS15表现尤 为明显(图3)。此结果表明超量表达a 7对低温糖化均起到了非常明显的抑制作用，使得原本不适用于低温贮藏后炸片加工的栽培种Ep3获得了贮藏I个月后仍能达炸片色泽指数较低的能力。
还原糖的含量測定结果显示转基因株系与対照的差异更为显著，与对照相比，低温贮藏下超量株系的各株系大多比对照明显低(图4)，其中PS3表现最为明显，4°C 30天贮藏时还原糖含量下降程度超过90%，即低温下转基因株系中还原糖的积累速率非常慢，这也是炸片色泽很低的主要直接原因。同样转化酶酶活水平也显示出来同样的趋势，4°C贮藏 过程中在超量株系中转化酶的酶活极显著低于对照(图5)。实验检测结果证明，转％免欣7ひ7基因的马铃薯在抗低温糖化方面效果极其显著，是ー个在马铃薯抗低温糖化应用上非常有潜力的功能基因。
权利要求
1.StSnRKl α蛋白，它的氣基酸序列为序列表SEQ ID NO:2所不。
2.编码StSnRKla蛋白的多核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的多核苷酸序列，其特征在于该序列为SEQID NO: I。
4.包含权利要求2或3所述多核苷酸序列的表达载体。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于它是PMD18-T载体或pBIC载体。
6.包含权利要求4或5所述表达载体的细胞。
7.根据权利要求6所述的细胞，其特征在于它是大肠杆菌DH5a或农杆菌LBA4404。
8.权利要求I所述的氨基酸序列SEQID N0:2在马铃薯抗低温糖化中的应用。
9.权利要求2或3所述的多核苷酸序列SEQID NO: I在马铃薯抗低温糖化中的应用。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域，涉及一个调控马铃薯低温糖化的关键基因StSnRK1α及其应用。克隆到与马铃薯低温糖化显著相关的基因StSnRK1α，该基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所示，氨基酸序列如序列表SEQIDNO2所示。生物学功能验证和转基因株系表型证明，本发明的StSnRK1α基因在马铃薯抗低温糖化中有显著功效，为马铃薯抗低温糖化的机理研究以及现有品种的改良提供了新的有效途径。
文档编号C12N1/21GK102634497SQ201210077910
公开日2012年8月15日 申请日期2012年3月22日 优先权日2012年3月22日
发明者刘勋, 宋波涛, 林原, 柳俊, 谢从华 申请人:华中农业大学