专利名称：确定病毒rna分子3’末端序列的方法
技术领域：
本发明提供一种快速、准确地确定病毒RNA分子3’末端序列的方法。
背景技术：
病毒是由核酸和蛋白质构成的非细胞型生物，严格的细胞内寄生，利用宿主的酶系统进行复制。依靠这种机制，病毒可以导致持续性感染的发生，或是导致细胞的转化，形成肿瘤。目前对病毒的研究主要集中在三个方面一方面是为了有效地防治和控制各种病毒性疾病的发生和流行；另一方面是通过对病毒的的认识进一步了解生命物质的基本问题；第三个方面是利用病毒造福人类。但无论哪一个方面，对病毒遗传物质的研究都显得格外重要。一种病毒只有一种特定类型的核酸，即脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。对于DNA病毒，目前多利用聚合酶链式反应实现体外病毒DNA序列的大量扩增，从而可以对病毒DNA基因组进行测序、分析等相关工作，了解病毒的遗传信息。在研究RNA病毒时，同样需要对RNA病毒基因组的序列进行测定。但聚合酶链式反应只能扩增DNA链，不能直接扩增RNA链。因此通常情况下，需要将病毒RNA逆转录为与之相对应的cDNA第一链，再通过聚合酶链式反应克隆逆转录产物，测定cDNA序列来获得相应的病毒RNA的序列。某些RNA 病毒的基因组同真核细胞的信使RNA (mRNA) —样，其分子3’末端具有多聚A尾(polyA)结构，一般为40 200个多聚A核苷酸。由此，可以利用这一特性设计逆转录引物，常用寡聚 T核苷酸Oligo dT引物或是修饰的Oligo dT引物(在Oligo dT的5’末端增加一段核苷酸序列)，通过Oligo dT与病毒RNA3’端的polyA相配对完成逆转录反应。经过聚合酶链式反应扩增、序列测定后可以推测出这些RNA病毒基因组3’端的序列。但是其他RNA病毒基因组3’端是不具有polyA结构的，对于这些病毒RNA序列则无法直接使用Oligo dT引物或是修饰的Oligo dT引物进行逆转录。传统的方法是利用随机引物与病毒RNA分子3’ 端结合进行逆转录反应。由于随机引物只能与病毒RNA分子3’端随机结合并向病毒RNA 分子5’端方向延伸，因此这种方法只能准确定位到病毒RNA分子的5’末端，从而获得病毒 RNA分子的5’末端序列。而病毒RNA分子的3’端由于是与随机引物相结合(不一定能结合到3’末端)，因此无法准确定位，想要获得病毒RNA分子3’端的序列则相对困难。末端转移酶是一种无需模板的DNA聚合酶，催化脱氧核苷酸结合至DNA分子的3’ 羟基端。带有突出、凹陷或平滑末端的单双链DNA分子均可作为末端转移酶的底物。此外末端转移酶还有催化脱氧核苷酸结合至RNA分子3’羟基端的活性。因此利用末端转移酶的这一特性，在病毒RNA分子3’末端加上10 50个寡聚A脱氧核苷酸，将一般的病毒RNA 加工为3’端具有polyA尾的RNA与DNA的杂合分子，再用Oligo dT或修饰的Oligo dT引物进行逆转录反应，则可准确获得该病毒RNA分子3’端的序列。除了信使RNA，RNA 还以核糖体 RNA(rRNA)、转运 RNA(tRNA)、不均一核 RNA(hnRNA) 和小核RNA(snRNA)等形式存在，他们都各自承担着重要的生物学功能。由于少数信使RNA 和其他类型的RNA分子是不具有polyA结构的，对于这些RNA的序列同样无法直接通过利用Oligo dT引物或是修饰的Oligo dT引物进行逆转录的方法来得到。因此，一样可以采用末端转移酶在RNA分子3’末端加上10 50个寡聚A脱氧核苷酸的方法，将一般的RNA 加工为3’端具有PolyA尾的RNA与DNA的杂合分子，然后再用Oligo dT或修饰的Oligo dT引物进行逆转录反应，就可以准确地获得该RNA分子3’端的序列。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术的缺点，提供了一种能够快速、准确的确定病毒RNA分子3’末端序列的方法。解决上述技术问题所采用的技术方案包括下述步骤
I、提取病毒RNA用常规方法提取病毒RNA，检测获得病毒RNA的质量，将病毒RNA的浓度定量至 I μ g/ μ L02、病毒RNA的末端转移反应向离心管中加入病毒RNA、浓度为10mmol/L的脱氧腺苷三磷酸、焦碳酸二乙酯处理水至12. 5 μ L，10mmol/L的脱氧腺苷三磷酸与焦碳酸二乙酯处理水、病毒RNA的体积比为I : 4 : 7. 5，混匀，70°C温育15分钟使病毒RNA变性，获得变性病毒RNA溶液，置于冰上2 10分钟，向含有变性病毒RNA溶液的离心管内加入末端转移酶缓冲液、浓度为20U/ μ L的末端转移酶、浓度为40U/ μ L的RNA酶抑制剂，总体积20 μ L，20U/ μ L的末端转移酶与40υ/μ L的RNA酶抑制剂、末端转移酶缓冲液、病毒变性RNA溶液的体积比为
I 1.3 2. 7 8. 3，混匀，37°C温育60分钟，70°C温育10分钟失活末端转移酶，终止反应，即在病毒RNA分子的3’末端连接上至少10 50个寡聚A脱氧核苷酸，得到加尾病毒 RNA溶液。3、加尾病毒RNA的纯化向含有加尾病毒RNA溶液的离心管中加入30 μ L焦碳酸二乙酯处理水。依次加入浓度为3mol/L pH为5. 2的醋酸钠溶液、浓度为5mg/mL的核酸共沉剂、无水乙醇,5mg/mL的核酸共沉剂与3mol/L pH为5. 2的醋酸钠溶液、加尾病毒RNA溶液、焦碳酸二乙酯处理水、 无水乙醇的体积比为I : 1.25 : 5 : 7. 5 : 25，混匀，4°C 12000转/分钟离心35分钟， 用4°C预冷的75%乙醇洗盐，4°C 12000转/分钟离心5分钟，弃去上清，待乙醇挥发干净， 加入20 μ L焦碳酸二乙酯处理水溶解加尾病毒RNA，得到纯化后的加尾病毒RNA溶液。4、加尾病毒RNA的逆转录反应向离心管中加入纯化后的加尾病毒RNA溶液、浓度为Oligo dT引物或修饰的 Oligo dT引物，焦碳酸二乙酯处理水至10 μ L，Oligo dT引物或修饰的Oligo dT引物与纯化后的加尾病毒RNA溶液、焦碳酸二乙酯处理水的体积比为I : 3 6，混匀，将离心管于 70°C温育10分钟对纯化后的加尾病毒RNA溶液进行变性，置于冰上冷却2 10分钟，向含有变性的加尾病毒RNA溶液的离心管内加入一链缓冲液、浓度为O. lmol/L的二硫苏糖醇、 浓度为lOmmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸、浓度为200U/μ L的逆转录酶、浓度为40U/μ L 的RNA酶抑制剂，200U/ μ L的逆转录酶与40U/ μ L的RNA酶抑制剂、0. lmol/L的二硫苏糖醇、lOmmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸、一链缓冲液、变性后的加尾病毒RNA溶液的体积比为 1:1:2:2:4: 10，混匀后50°C温育60分钟，70°C温育15分钟使逆转录酶失活，终止反应，得病毒逆转录产物5、病毒逆转录产物的聚合酶链式反应扩增向离心管中加入病毒逆转录产物、DNA聚合酶缓冲液、浓度为10mmol/L的脱氧腺苷三磷酸、浓度为lOmmol/L的上游引物、浓度为lOmmol/L Oligo dT引物或UAP引物、浓度为5U/ μ L的Taq DNA聚合酶、无菌水，总体积20 μ L，UAP引物与修饰的Oligo dT引物的5’ 末端核苷酸序列一致，DNA聚合酶缓冲液与10mmol/L的上游引物、10mmol/L的Oligo dT引物或UAP引物、5U/μ L的Taq DNA聚合酶、lOmmol/L的脱氧腺苷三磷酸、逆转录产物、无菌水的体积比为 I : O. I O. 3 O. I O. 3 O. 05 O. 25 O. 4 I : O. 5 I. 5 5. 7 7. 9，混匀，按照常规方法进行聚合酶链式反应，得聚合酶链式反应产物。6、测序并分析测序结果将所得聚合酶链式反应产物送往测序公司进行测序。在本发明的加尾病毒RNA的逆转录反应步骤4中，向离心管中加入纯化后的加尾病毒RNA溶液、修饰的Oligo dT引物，焦碳酸乙酯处理水至10 μ L，修饰的Oligo dT引物与纯化后的加尾病毒RNA溶液、焦碳酸二乙酯处理水的最佳体积比为I : 3 6，混匀，将离心管于70°C温育10分钟对纯化后的加尾病毒RNA溶液进行变性,置于冰上冷却2 10分钟， 向含有变性的加尾病毒RNA溶液的离心管内加入一链缓冲液、浓度为O. lmol/L的二硫苏糖醇、浓度为lOmmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸、浓度为200U/ μ L的逆转录酶、浓度为40U/ μ L 的RNA酶抑制剂，200U/ μ L的逆转录酶与40U/ μ L的RNA酶抑制剂、O. lmol/L的二硫苏糖醇、10mmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸、一链缓冲液、变性后的加尾病毒RNA溶液的最佳体积比为I : I : 2 : 2 : 4 : 10，混匀后50°C温育60分钟，70°C温育15分钟使逆转录酶失活，终止反应，得病毒逆转录产物。在本发明的逆转录产物的聚合酶链式反应扩增步骤5中，在逆转录产物的聚合酶链式反应扩增步骤5中，向离心管中加入病毒逆转录产物、DNA聚合酶缓冲液、浓度为 IOmmo I/L的脱氧腺苷三磷酸、浓度为IOmmo I/L的上游引物、浓度为IOmmo I/LUAP引物、浓度为5U/yL Taq DNA聚合酶、无菌水，总体积20 μ L，DNA聚合酶缓冲液与10mmol/L的上游引物、10mmol/L UAP弓丨物、5U/μ L的Taq DNA聚合酶、10mmol/L的脱氧腺苷三磷酸、逆转录产物、无菌水的最佳体积比为I : O. 2 : O. 2 : O. I : O. 5 : I : 7，混匀，按照常规方法进行聚合酶链式反应，得聚合酶链式反应产物。本发明通过末端转移反应加尾后，可利用逆转录反应准确地确定病毒RNA分子的 3’末端序列，方便快捷。由于可以使用Oligo dT或是修饰的Oligo dT引物进行逆转录反应，省去了针对某一特定病毒RNA分子设计及合成特异性引物的过程，使得实验周期大大简化，并且节约了实验成本。同时，本发明也可以应用于其他3’末端不具有PolyA尾结构的RNA分子的3’末端序列的确定。
图I是狂犬病病毒聚合酶链式反应产物序列RV与狂犬病病毒基因组序列基因的计算机软件比对图。图2是流感病毒聚合酶链式反应产物序列NP与流感病毒核蛋白基因序列的计算机软件比对图。
图3是曼氏血吸虫聚合酶链式反应产物序列28SrRNA α与曼氏血吸虫28SrRNA α 亚基的基因序列的计算机软件比对图。实施例I以获得狂犬病病毒(Rabies virus)基因组3’末端序列的方法为例，其步骤如下I、狂犬病病毒RNA的提取狂犬病病毒(ERA株)购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。病毒接种仓鼠肾细胞BHK-21后，33 35°C温箱培养5天。收集感染的细胞培养物，按照说明书用QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒提取狂犬病病毒RNA，QIAamp Viral RNAMini Kit试剂盒为市场上销售的商品，由Qiagen公司销售。狂犬病病毒RNA溶解于40 μ L焦碳酸二乙酯处理水， 取I μ L检测样品浓度，将狂犬病病毒RNA的浓度定量至I μ g/ μ L。2、狂犬病病毒RNA的末端转移反应向离心管中加入7. 5yL狂犬病病毒RNA、lyL浓度为10mmol/L的脱氧腺苷三磷酸、加入焦碳酸二乙酯处理水至12. 5 μ L，10mmol/L的脱氧腺苷三磷酸与焦碳酸二乙酯处理水、狂犬病病毒RNA的体积比为I : 4 7. 5，混匀，70°C温育15分钟使狂犬病病毒RNA 变性，获得变性狂犬病病毒RNA溶液，置于冰上2 10分钟。向含有变性狂犬病病毒RNA 溶液样品的离心管内加入4 μ L末端转移酶缓冲液、I. 5 μ L浓度为20U/ μ L的末端转移酶，
2μ L浓度为40U/ μ L的RNA酶抑制剂，总体积20 μ L，20U/ μ L的末端转移酶与40U/ μ L的 RNA酶抑制剂、末端转移酶缓冲液、病毒变性RNA溶液的体积比为I : 1.3 : 2.7 : 8. 3，末端转移酶缓冲液、末端转移酶、RNA酶抑制剂为市场上销售的商品，由Fermantas公司销售， 混匀，37°C温育60分钟，70°C温育10分钟失活末端转移酶，终止反应，即可在病毒RNA分子的3’末端连接上10 50个寡聚A脱氧核苷酸，得到加尾狂犬病病毒RNA溶液。3、加尾狂犬病病毒RNA的纯化向含有20 μ L加尾狂犬病病毒RNA溶液的离心管中加入30 μ L焦碳酸二乙酯处理水。依次加入5 μ L浓度为3mol/LpH为5. 2的醋酸钠溶液、4 μ L浓度为5mg/mL的核酸共沉剂、100 μ L无水乙醇，5mg/mL的核酸共沉剂与3mol/LpH为5. 2的醋酸钠溶液、加尾狂犬病病毒RNA溶液、焦碳酸二乙酯处理水、无水乙醇的体积比为I : 1.25 : 5 : 7. 5 : 25，核酸共沉剂为市场上销售的商品，由大连宝生物工程有限公司销售，混匀，4°C 12000转/分钟离心35分钟，用4°C预冷的75%乙醇洗盐，于4°C 12000转/分钟离心5分钟，弃去上清，待乙醇挥发干净，加入20 μ L焦碳酸二乙酯处理水溶解加尾狂犬病病毒RNA，得到纯化后的加尾病毒RNA溶液。4、加尾狂犬病病毒RNA的逆转录向离心管中加入3μ L纯化后的 加尾狂犬病病毒RNA溶液、I μ L浓度为IOmmol/ LOligo dT-NUP 引物，Oligo dT-NUP 引物序列为 ctgatctaga ggtaccggat cctttttttt tttttttttt vn由南京金斯瑞生物科技有限公司合成,6 μ L焦碳酸二乙酯处理水至10 μ L, IOmmoI/L的Oligo dT-NUP引物与纯化后的加尾病毒RNA溶液、焦碳酸二乙酯处理水的体积比为I : 3 6，混匀，将离心管于70°C温育10分钟对纯化后的加尾狂犬病病毒RNA溶液进行变性，置于冰上冷却2 10分钟，向含有变性后的加尾狂犬病病毒RNA溶液的离心管内加入4μ L—链缓冲液、2 μ L浓度为O. lmol/L的二硫苏糖醇、2 μ L浓度为IOmmol/ L的脱氧核糖核苷三磷酸、I μ L浓度为200U/ μ L的逆转录酶、I μ L浓度为的40U/ μ L RNA酶抑制剂，200U/μ L的逆转录酶与40U/yL的RNA酶抑制剂、O. lmol/L的二硫苏糖醇、 lOmmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸、一链缓冲液、变性后的加尾病毒RNA溶液的体积比为 1:1:2:2:4: 10，一链缓冲液、二硫苏糖醇、逆转录酶由美国英杰公司销售，脱氧核糖核苷三磷酸由Roche公司销售，RNA酶抑制剂由Fermantas公司销售，混匀后50°C温育 60分钟，于70°C温育15分钟使逆转录酶失活，终止反应，得到加尾狂犬病病毒RNA逆转录产物。5、加尾狂犬病病毒RNA逆转录产物的聚合酶链式反应扩增
采用巢式聚合酶链式反应扩增狂犬病病毒RNA逆转录产物。向离心管中加入IuL加尾狂犬病病毒RNA逆转录产物，2 μ L ExTaq DNA聚合酶缓冲液、O. 8 μ L浓度为lOmmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸、O. 2 μ L浓度为lOmmol/L的RV-R1引物、O. 2μ L浓度为10mmol/L的UAP引物、O. I μ L浓度为5U/ μ L的ExTaq DNA聚合酶、15. 7 μ L无菌水，混匀，ExTaq DNA聚合酶缓冲液与IOmmoI/L的UAP引物、10mmol/L的RV-R1引物、5U/ μ L的ExTaq DNA聚合酶、10mmol/L脱氧腺苷三磷酸、逆转录产物、无菌水的体积比为 I : O. I : O. I : O. 05 : O. 4 : O. 5 : 7. 9, UAP 引物的序列为 ctgatctaga ggtaccggat cc, RV-R1引物的序列为ggagacttcc cactcaagc, UAP引物和RV-R1引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，混匀后进行35次聚合酶链式反应扩增反应循环，每次循环为94°C 30 秒变性、60°C 30秒退火和72°C I分钟聚合，得到狂犬病病毒第一轮巢式聚合酶链式反应产物；将第一轮巢式聚合酶链式反应产物用无菌水稀释50倍，得到第一轮巢式聚合酶链式反应稀释产物，向离心管中加入I μ L第一轮巢式聚合酶链式反应稀释产物，2 μ LExTaq DNA聚合酶缓冲液、0. 8 μ L浓度为lOmmol/L脱氧核糖核苷三磷酸、0. 2 μ L浓度为IOmmol/ L RV-R2 引物、0. 2 μ L 浓度为 IOmmoI/L UAP 引物、O. I μ L 浓度为 5U/μ LExTaq DNA 聚合酶， 15. 7 μ L无菌水，ExTaq DNA聚合酶缓冲液与IOmmoI/L的UAP引物、10mmol/L的RV-R2引物、5U/y L的ExTaq DNA聚合酶、lOmmol/L的脱氧腺苷三磷酸、第一轮巢式聚合酶链式反应稀释产物、无菌水的体积比为I : O. I : O. I : O. 05 : O. 4 : O. 5 : 7. 9，RV_R2引物的序列为aacccagtaa acgacaccag, RV-R2引物是由南京金斯瑞生物科技有限公司合成,混勻后进行35次聚合酶链式反应扩增反应循环，每次循环为94°C 30秒变性、60°C 30秒退火和 720C 50秒聚合，得狂犬病病毒第二轮巢式聚合酶链式反应产物；ExTaq DNA聚合酶缓冲液、 ExTaq DNA聚合酶为市场上销售的产品，由大连宝生物工程有限公司销售，脱氧核糖核苷三磷酸为市场上销售的产品，由Roche公司销售。6、测序及测序结果分析将狂犬病病毒第二轮巢式聚合酶链式反应产物送往南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序，得到该聚合酶链式反应产物的序列，命名为RV，具体序列见核苷酸序列表RV。将该序列与GenBank中报道的狂犬病病毒基因组序列(GenBank EF206707)用在线分析软件进行比对(http://www. ebi. ac. uk/Tools/msa/clustalw2/),见图 I 在图 I 中， *表示两个序列完全相同的核苷酸，下划线表示所用上游引物RV-R2的序列，其余部分为不相同的核苷酸。由图I可见，两条序列的3’末端完全一致，说明本方法可以准确地测定RNA 分子的3’末端序列。实施例2以定位流感病毒核蛋白(Nucleoprotein, NP)基因3’末端序列的方法为例,其步骤如下I、流感病毒RNA的提取流感病毒(A/Hubei/1190/2010 (H3N2))购自中国典型培养物保藏中心。病毒接种鸡胚后，33 35°C温箱培养鸡胚2 3天。收集鸡胚尿囊液，按照说明书用QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒提取病毒RNA，QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒为市场上销售的商品，由Qiagen公司销售。病毒RNA溶解于40 μ L焦碳酸二乙酯处理水，取I μ L检测样品浓度，将流感病毒RNA的浓度定量至I μ g/ μ L。2、流感病毒RNA的末端转移反应向离心管中加入7. 5 μ g流感病毒RNA、I μ L浓度为lOmmol/L的脱氧腺苷三磷酸、 加入焦碳酸二乙酯处理水至12.5yL，10mmol/L的脱氧腺苷三磷酸与焦碳酸二乙酯处理水、流感病毒RNA的体积比为I : 4 7. 5，混匀，70°C温育15分钟使流感病毒RNA变性，获得变性流感病毒RNA溶液，立即置于冰上2 10分钟，向含有变性流感病毒RNA溶液的离心管内加入4 μ L末端转移酶缓冲液、I. 5 μ L浓度为20U/ μ L的末端转移酶，2 μ L浓度为40U/ μ L的RNA酶抑制剂，20U/ μ L的末端转移酶与40U/ μ L的RNA酶抑制剂、末端转移酶缓冲液、变性流感病毒RNA的体积比为I : 1.3 : 2. 7 : 8. 3，混匀后37°C温育60分钟，70°C温育10分钟使末端转移酶失活，终止反应，即可在流感病毒RNA分子的3’末端连接上10 50个寡聚A脱氧核苷酸，得到加尾流感病毒RNA溶液。3、加尾流感病毒RNA的纯化向含有20 μ L加尾病毒RNA的离心管中加入30 μ L焦碳酸二乙酯处理水。依次加入5 μ L浓度为3mol/L pH为5. 2的醋酸钠溶液、4 μ L浓度为5mg/mL核酸共沉剂、100 μ L无水乙醇，5mg/mL的核酸共沉剂与3mol/L pH为5. 2的醋酸钠溶液、加尾流感病毒RNA溶液、 焦碳酸二乙酯处理水、无水乙醇的体积比为I : 1.25 : 5 : 7. 5 : 25，混匀，4°C 12000转 /分钟离心35分钟，用4°C预冷的75%乙醇洗盐，于4V 12000转/分钟离心5分钟，弃去上清，待乙醇挥发干净，加入20 μ L焦碳酸二乙酯处理水溶解加尾病毒RNA，，得到纯化后的加尾流感病毒RNA溶液。4、加尾流感病毒RNA的逆转录反应向离心管中加入3 μ L纯化后的加尾流感病毒RNA、I μ L浓度为10mmol/L的Oligo dT-NUP引物、6 μ L焦碳酸二乙酯处理水至10 μ L，IOmmoI/L的Oligo dT-NUP引物与纯化后的加尾流感病毒RNA溶液、焦碳酸二乙酯处理水的体积比为I : 3 6，混匀，将离心管于70°C温育10分钟对纯化后的加尾流感病毒RNA溶液进行变性，置于冰上冷却2 10分钟，向含有变性的加尾流感病毒RNA溶液的离心管内加入4 μ L —链缓冲液、2 μ L浓度为
O.lmol/L的二硫苏糖醇、2 μ L浓度为lOmmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸、I μ L浓度为200U/ μ L的逆转录酶、I μ L浓度为40U/ μ L的RNA酶抑制剂，200U/ μ L的逆转录酶与40U/ μ L的 RNA酶抑制剂、0. lmol/L的二硫苏糖醇、lOmmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸、一链缓冲液、变性后的加尾流感病毒RNA溶液的体积比为I :1:2:2:4: 10，混匀后50°C温育60 分钟，于70°C温育15分钟使逆转录酶失活，终止反应，得到流感病毒RNA逆转录产物。5、流感病毒RNA逆转录产物的聚合酶链式反应扩增向离心管中加入2μ L加尾病毒RNA逆转录产物，2μ LExTaq DNA聚合酶缓冲液、 I μ L浓度为10mmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸、0. 4yL浓度为10mmol/L的Bm-NP_1565R引物、O. 4μ L10mmol/L UAP引物、O. 2μ L浓度为5U/μ LExTaq DNA聚合酶、无菌水 14 μ L, ExTaq DNA 聚合酶缓冲液与 10mmol/L 的 UAP 引物、10mmol/L 的 Bm-NP_1565R 弓丨物、5U/y L的ExTaq DNA聚合酶、lOmmol/L的脱氧腺苷三磷酸、逆转录产物的体积比为 I O. 2 O. 2 O. I O. 5 I 7，Bm-NP-1565R 引物的序列为 atatcgtctc gtattagtag aaacaagggt attttt, Bm-NP_1565R引物是由南京金斯瑞生物科技有限公司合成,混勻后进行35次聚合酶链式反应扩增循环，每次循环为94°C 30秒变性、63°C 30秒退火和72°C 2分钟聚合，得到聚合酶链式反应产物。6、测序并分析测序结果将流感病毒聚合酶链式反应产物送往南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序，得到该聚合酶链式反应产物的序列，命名为NP，具体序列见序列表。将该序列与GenBank中 报道的流感病毒核蛋白(Nucleoprotein, NP)基因序列(GenBank AF255753)用在线分析软件进行比对(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/ clUStalw2/)，见图2，在图2中，*表示两个序列完全相同的核苷酸，下划线表示所用上游引物Bm-NP-1565R的序列，其余部分为不相同的核苷酸。由图2可见，两条序列的3’末端完全一致，说明本方法可以准确地测定RNA分子的3’末端序列。实施例3以获得曼氏血吸虫28S rRNAa亚基3’末端序列的方法为例，其步骤如下I、提取曼氏血吸虫RNA用Tizol试剂一步法提取曼氏血吸虫的RNA,用甲醒变性凝胶电泳检测获得的曼氏血吸虫RNA的质量，Tizol试剂为市场上销售的商品，由大连宝生物工程有限公司销售。 将病毒RNA的浓度定量至I μ g/ μ L。2、曼氏血吸虫RNA的末端转移反应向离心管中依次加入7. 5yg曼氏血吸虫RNA、lyL浓度为lOmmol/L脱氧腺苷三磷酸，焦碳酸二乙酯处理水至12. 5μ L，10mmol/L的脱氧腺苷三磷酸与焦碳酸二乙酯处理水、曼氏血吸虫RNA的体积比为I : 4 7. 5，混匀，70°C温育15分钟使曼式血吸虫RNA变性，获得变性曼氏血吸虫RNA溶液，置于冰上2 10分钟，向含有变性曼氏血吸虫RNA溶液的离心管内加入4 μ L末端转移酶缓冲液、I. 5 μ L浓度为20U/ μ L的末端转移酶、2 μ L浓度为40U/ μ L的RNA酶抑制剂，20U/ μ L的末端转移酶与40U/ μ L的RNA酶抑制剂、末端转移酶缓冲液、变性曼氏血吸虫RNA溶液的体积比为I : 1.3 : 2. 7 : 8. 3，混匀后37°C温育60 分钟，70°C温育10分钟失活末端转移酶，终止反应，即在曼氏血吸虫RNA分子的3’末端连接上10 50个寡聚A脱氧核苷酸，得到加尾曼氏血吸虫RNA溶液。3、曼氏血吸虫加尾RNA的纯化向含有20 μ L加尾曼氏血吸虫RNA溶液的离心管中加入30 μ L焦碳酸二乙酯处理水。依次加入5 μ L浓度为3mol/L pH 5. 2醋酸钠溶液、4 μ L浓度为5mg/mL的核酸共沉剂、 1001^的无水乙醇，511^/1^的核酸共沉剂与311101/1 pH 5. 2的醋酸钠溶液、加尾曼氏血吸虫RNA溶液、焦碳酸二乙酯处理水、无水乙醇的体积比为I : 1.25 : 5 : 7. 5 : 25，混匀， 40C 12000转/分钟离心35分钟，用4°C预冷的75%乙醇洗盐，于4°C 12000转/分钟离心 5分钟，弃去上清，待乙醇挥发干净，加入20 μ L焦碳酸二乙酯处理水溶解加尾曼氏血吸虫 RNA,得到纯化后的加尾曼氏血吸虫RNA溶液。
4、曼氏血吸虫加尾RNA的逆转录反应向离心管中加入3μ L纯化后的加尾曼氏血吸虫RNA、1 μ L浓度为10mmol/L的 Oligo dT-NUP引物，6 μ L焦碳酸二乙酯处理水至10 μ L, IOmmoI/L的Oligo dT-NUP引物与纯化后的加尾曼氏血吸虫RNA溶液、焦碳酸二乙酯处理水的体积比为I : 3 6，混匀，将离心管于70°C温育10分钟对纯化后的加尾曼氏血吸虫RNA进行变性，置于冰上冷却2 10分钟，向含有变性的加尾曼氏血吸虫RNA溶液的离心管内加入4μ L—链缓冲液、2 μ L浓度为O. lmol/L的二硫苏糖醇、2 μ L浓度为lOmmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸、I μ L浓度为 200U/ μ L的逆转录酶、I μ L浓度为40U/ μ L的RNA酶抑制剂，200U/ μ L的逆转录酶与40U/ μ L的RNA酶抑制剂、O. lmol/L的二硫苏糖醇、10mmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸、一链缓冲液、变性后的加尾曼氏血吸虫RNA溶液的体积比为I :1:2:2:4: 10，混匀后50°C 温育60分钟，于70°C温育15分钟使逆转录酶失活，终止反应，得曼氏血吸虫RNA逆转录产物。5、曼氏血吸虫RNA逆转录产物的聚合酶链式反应扩增采用巢式聚合酶链式反应扩增曼氏血吸虫RNA逆转录产物。向离心管中加入3μ L 曼氏血吸虫RNA逆转录产物，2 μ L EasyTaq DNA聚合酶缓冲液、2 μ L浓度为10mmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸、O. 6 μ L浓度为10mmol/L的28S a F1引物aagcagaact ggcgctgtgg gatg、0. 6 μ L 浓度为 10mmol/L 的 UAP 引物、O. 5 μ L 浓度为 5U/ μ L 的 EasyTaq DNA 聚合酶、11. 3 μ L无菌水，混勻，EasyTaq DNA聚合酶缓冲液与10mmol/L的UAP引物、10mmol/L 的28Sa F1弓丨物、5U/μ L的EasyTaq DNA聚合酶、lOmmol/L的脱氧腺苷三磷酸、曼氏血吸虫 RNA逆转录产物体积比为I : 0.3 : 0.3 : 0.25 : I 1.5 5. 7，28S a F1引物的序列为 aagcagaact ggcgctgtgg gat, 28S a F1引物是由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，混勻后进行35次聚合酶链式反应扩增循环，每次循环为94°C 30秒变性、58°C 30秒退火和72°C 50 秒聚合，得到曼氏血吸虫第一轮巢式聚合酶链式反应产物；将曼氏血吸虫第一轮巢式聚合酶链式反应产物用无菌水稀释50倍，得到曼氏血吸虫第一轮巢式聚合酶链式反应稀释产物，向离心管中加入3μ L曼氏血吸虫第一轮巢式聚合酶链式反应稀释产物，2μ LEasyTaq DNA聚合酶缓冲液、2 μ L浓度为lOmmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸、0. 6 μ L浓度为lOmmol/L 的 28S a F2 引物、0. 6 μ L 浓度为 IOmmoI/L 的 UAP 引物，0. 5 μ L 浓度为 5U/ μ L 的 EasyTaqDNA 聚合酶、11. 3 μ L无菌水，EasyTaqDNA聚合酶缓冲液与10mmol/L的UAP引物、10mmol/L的 28S a F2弓丨物、5U/y L的EasyTaq DNA聚合酶、lOmmol/L的脱氧腺苷三磷酸、曼氏血吸虫第一轮巢式聚合酶链式反应稀释产物、的体积比为I : 0. 3 : 0. 3 : 0. 25 : I : 1.5 : 5. 7， 28S a F2引物的序列为agacakcagg acggtggcca tgg,28S a F2引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，混匀后进行35次聚合酶链式反应扩增循环，每次循环为94°C 30秒变性、 580C 30秒退火和72°C 50秒聚合，得曼氏血吸虫第二轮巢式聚合酶链式反应产物；EasyTaq DNA聚合酶缓冲液、EasyTaq DNA聚合酶为市场上销售的产品，由北京全式金生物技术有限公司销售。6、测序并分析测序结果将曼氏血吸虫第二轮巢式聚合酶链式反应产物送往南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序，得到该聚合酶链式反应产物的序列，命名为28SrRNAa，具体序列见序列表。在GenBank中报道的曼氏血吸虫28SrRNA的部分基因序列(GenBank X13836)长度为 568bp,根据前人研究结果(van Keulen H, Mertz PM, LoVerde PT, Shi H, Rekosh DM, 1991. Characterization of a 54-nucleotide gap region in the 28S rRNA gene of Schistosoma mansoni. Mol Biochem Parasitol. 45 (2) :205-214.), 28S rRNA α 亚基的 3， 末端序列在第138位碱基处。用该部分序列与本实施例中获得的28SrRNAa序列用在线分析软件进行比对(http://www. ebi. ac. uk/Tools/msa/clustalw2/),见图 3，在图 3 中，* 表示两个序列完全相同的核苷酸，下划线表示所用引物28S a F2的序列，其余部分为不相同的核苷酸。由图3可见，两条序列的3’末端完全一致，说明本方法可以准确地测定RNA分子的3’末端序列。实施例4 在以上的实施例I 3的加尾病毒RNA的逆转录反应步骤4中，所用修饰的Oligo dT引物用等质量的Oligo dT引物替换，该步骤中的其它步骤与相应的实施例相同。在逆转录产物的聚合酶链式反应扩增步骤5中，所用修饰的Oligo dT引物用等质量的Oligo dT 引物替换，该步骤中的其它步骤与相应的实施例相同。其它步骤与相应的实施例相同。
权利要求
1.一种确定病毒RNA分子3’末端序列的方法，包括下述步骤 (1)提取病毒RNA 用常规方法提取病毒RNA，检测获得病毒RNA的质量，将病毒RNA的浓度定量至I μ g/μ L ； (2)病毒RNA的末端转移反应 向离心管中加入病毒RNA、浓度为lOmmol/L的脱氧腺苷三磷酸、焦碳酸二乙酯处理水至12.5yL，10mmol/L的脱氧腺苷三磷酸与焦碳酸二乙酯处理水、病毒RNA的体积比为I : 4 : 7. 5，混匀，70°C温育15分钟使病毒RNA变性，获得变性病毒RNA溶液，置于冰上2 10分钟，向含有变性病毒RNA溶液的离心管内加入末端转移酶缓冲液、浓度为20U/ μ L的末端转移酶、浓度为40U/ μ L的RNA酶抑制剂，总体积20 μ L，20U/ μ L的末端转移酶与40υ/μ L的RNA酶抑制剂、末端转移酶缓冲液、病毒变性RNA溶液的体积比为I 1.3 2. 7 8. 3，混匀，37°C温育60分钟，70°C温育10分钟失活末端转移酶，终止反应，即在病毒RNA分子的3’末端连接上至少10 50个寡聚A脱氧核苷酸，得到加尾病毒RNA溶液； (3)加尾病毒RNA的纯化 向含有加尾病毒RNA溶液的离心管中加入30 μ L焦碳酸二乙酯处理水。依次加入浓度为3mol/L pH为5. 2的醋酸钠溶液、浓度为5mg/mL的核酸共沉剂、无水乙醇,5mg/mL的核酸共沉剂与3mol/L pH为5. 2的醋酸钠溶液、加尾病毒RNA溶液、焦碳酸二乙酯处理水、无水乙醇的体积比为I : 1.25 : 5 : 7. 5 : 25，混匀，4°C 12000转/分钟离心35分钟，用4°C预冷的75%乙醇洗盐，40C 12000转/分钟离心5分钟，弃去上清，待乙醇挥发干净，加入·20 μ L焦碳酸二乙酯处理水溶解加尾病毒RNA，得到纯化后的加尾病毒RNA溶液； (4)加尾病毒RNA的逆转录反应 向离心管中加入纯化后的加尾病毒RNA溶液、浓度为Oligo dT引物或修饰的OligodT引物，焦碳酸二乙酯处理水至10μ L，Oligo dT引物或修饰的Oligo dT引物与纯化后的加尾病毒RNA溶液、焦碳酸二乙酯处理水的体积比为I : 3 6，混匀，将离心管于70°C温育10分钟对纯化后的加尾病毒RNA溶液进行变性，置于冰上冷却2 10分钟，向含有变性的加尾病毒RNA溶液的离心管内加入一链缓冲液、浓度为O. lmol/L的二硫苏糖醇、浓度为lOmmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸、浓度为200U/μ L的逆转录酶、浓度为40U/μ L的RNA酶抑制剂，200U/ μ L的逆转录酶与40U/ μ L的RNA酶抑制剂、0. lmol/L的二硫苏糖醇、lOmmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸、一链缓冲液、变性后的加尾病毒RNA溶液的体积比为1:1:2:2:4: 10，混匀后50°C温育60分钟，70°C温育15分钟使逆转录酶失活，终止反应，得病毒逆转录产物； (5)病毒逆转录产物的聚合酶链式反应扩增 向离心管中加入病毒逆转录产物、DNA聚合酶缓冲液、浓度为lOmmol/L的脱氧腺苷三磷酸、浓度为I Ommo I /L的上游引物、浓度为I Ommo I /L OI i go dT引物或UAP引物、浓度为5U/μ L的Taq DNA聚合酶、无菌水，总体积20 μ L，UAP引物与修饰的Oligo dT引物的5’末端核苷酸序列一致，DNA聚合酶缓冲液与10mmol/L的上游引物、10mmol/L的Oligo dT引物或UAP引物、5U/y L的Taq DNA聚合酶、lOmmol/L的脱氧腺苷三磷酸、逆转录产物、无菌水的体积比为 I : O. I O. 3 O. I O. 3 O. 05 O. 25 O. 4 I : O. 5 I. 5 5. 7 .7. 9，混匀，按照常规方法进行聚合酶链式反应，得聚合酶链式反应产物。
2.根据权利要求I所述的确定病毒RNA分子3’末端序列的方法，其特征在于在加尾病毒RNA的逆转录反应步骤(4)中，向离心管中加入纯化后的加尾病毒RNA溶液、修饰的Oligo dT引物，焦碳酸二乙酯处理水至10 μ L，修饰的Oligo dT引物与纯化后的加尾病毒RNA溶液、焦碳酸二乙酯处理水的体积比为I : 3 6，混匀，将离心管于70°C温育10分钟对纯化后的加尾病毒RNA溶液进行变性，置于冰上冷却2 10分钟，向含有变性的加尾病毒RNA溶液的离心管内加入一链缓冲液、浓度为O. lmol/L的二硫苏糖醇、浓度为lOmmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸、浓度为200U/μ L的逆转录酶、浓度为40U/μ L的 RNA酶抑制剂，200U/y L的逆转录酶与40U/y L的RNA酶抑制剂、O. lmol/L的二硫苏糖醇、lOmmol/L的脱氧核糖核苷三磷酸、一链缓冲液、变性后的加尾病毒RNA溶液的体积比为 1:1:2:2:4: 10，混匀后50°C温育60分钟，70°C温育15分钟使逆转录酶失活，终止反应，得病毒逆转录产物。
3.根据权利要求I或2所述的确定病毒RNA分子3’末端序列的方法，其特征在于在逆转录产物的聚合酶链式反应扩增步骤(5)中，向离心管中加入病毒逆转录产物、DNA聚合酶缓冲液、浓度为lOmmol/L的脱氧腺苷三磷酸、浓度为lOmmol/L的上游引物、浓度为IOmmol/ L UAP引物、浓度为5U/ μ L Taq DNA聚合酶、无菌水，总体积20 μ L，DNA聚合酶缓冲液与 10mmol/L的上游引物、10mmol/L UAP引物、5U/ μ L的Taq DNA聚合酶、10mmol/L的脱氧腺苷三磷酸、逆转录产物、无菌水体积比为I : O. 2 : O. 2 : O. I : O. 5 : I : 7，混匀，按照常规方法进行聚合酶链式反应，得聚合酶链式反应产物。
全文摘要
一种确定病毒RNA分子3’末端序列的方法，包括提取病毒RNA、加尾病毒RNA的纯化、加尾病毒RNA的逆转录反应、病毒逆转录产物的聚合酶链式反应扩增步骤。病毒RNA的末端转移反应本发明通过末端转移反应加尾后，可利用逆转录反应准确地确定病毒RNA分子的3’末端序列，方便快捷。由于可以使用Oligo dT或是修饰的Oligo dT引物进行逆转录反应，省去了针对某一特定病毒RNA分子设计及合成特异性引物的过程，使得实验周期大大简化，并且节约了实验成本。同时，本发明也可以应用于其他3’末端不具有PolyA尾结构的RNA分子的3’末端序列的确定。
文档编号C12Q1/68GK102618531SQ20121007665
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月21日 优先权日2012年3月21日
发明者孙书洪, 孙燕, 李治, 王立飞 申请人:陕西师范大学