一种体外诱导人间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法

专利名称：一种体外诱导人间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法
技术领域：
本发明属于干细胞诱导分化研究领域，涉及一种诱导干细胞分化的方法，尤其是一种体外诱导人间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法。
背景技术：
糖尿病是一组以血葡萄糖水平增高为特征的代谢性疾病，主要是由于胰岛素分泌相对或绝对不足或胰岛素受体作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱性疾病。糖尿病死亡率仅次于心脑血管和肿瘤，严重威胁人类生命和健康。随着其发病率的逐年上升，糖尿病对人类健康的危害还将进一步加重。世界卫生组织估计，全世界有I. 8亿人患有糖尿病，这一数字很可能到2030年将翻番一倍以上。在糖尿病治疗方面，传统的治疗无外乎促进β细胞胰岛素的分泌、增加外周组织对胰岛素的敏感性及使用外源胰岛素几个方面，然而这些治疗策略显然未能使糖尿病患者得到根治；胰腺移植和胰岛移植又难以克服供体不足和免疫排斥这两大问题，使其临床应用和效果也受到极大影响。因此迫切需求治愈糖尿病的新方法。干细胞以其极强自我更新和多向分化潜能，已成为人们寻找替代患者自身免疫系统破坏的胰岛细胞的最佳种子细胞来源，以干细胞移植为主的再生治疗为糖尿病的根治带来了新的希望。间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs),是目前最有应用优势的种子细胞。间充质干细胞具有非常强的自我增殖能力和分化的多潜能性，国内外的研究表明能根据特定的环境分化为胰岛素分泌细胞，并且间充质干细胞具有其它干细胞所不可比拟的优点，如取材方便、增殖和分化能力强、移植无免疫原性，同时也避免了胚胎干细胞移植所面临的伦理问题。目前对于间充质干细胞向胰岛细胞分化的诱导方案可以归为以下两类多数为集中神经生长因子及活化素的联合应用，如bFGF、EGF等；另一种方法是转染胰岛细胞发育、胰岛素分泌过程中的关键基因，如roX-l、Ngn3等转录因子。但是现有研究诱导分化方案有很大局限性，分化效率不高，应用时效果不理想。血清反应因子(SRF)是一种高度保守且广泛存在于多种生物体内的转录调控因子，它可以与多个基因启动子上CArG box位点特异性结合，进而特异性上调靶基因的转录表达水平。目前发现其主要功能是参与调节细胞内骨架肌动蛋白和其他一些支架蛋白的基因转录过程，进而参与多种哺乳动物生理过程，例如肌原纤维发育及其分化为骨骼肌、平滑肌等过程。最新的研究发现胰岛素基因启动子上含有SRF的结合位点CArG box,并且SRF和PDX-I可以协同促进胰岛素基因的转录，但是利用SRF与生长因子组合共同诱导间充质干细胞向平滑肌细胞分化尚未见报道
发明内容
本发明的目的在于提供一种体外诱导人间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，本方法利用SRF基因修饰与多种生长因子协同诱导间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种体外诱导人间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，包括以下步骤
(I)构建含有SRF基因的重组真核表达质粒；(2)诱导人间充质干细胞向Nestin+细胞分化当步骤(I)中细胞至70_80%融合时，去除原有培养基，加入诱导培养基I培养5 6小时；所述步骤⑵中所述诱导培养基I为含有5mmol/L β -巯基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖培养基，含25mM葡萄糖；(3)诱导Nestin+细胞向胰腺始祖细胞分化在步骤(2)获得细胞中，去除步骤(2)中诱导培养基I，加入诱导培养基II培养7 8天；步骤(3)中所述的诱导培养基II为含有5 20nmol/L bFGF、5 20nmol/L EGF,2% B27、0. 1% β -巯基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖培养基，含25mM葡萄糖；(4)诱导胰腺始祖细胞向胰岛素分泌细胞分化在步骤(3)获得细胞中，去除步骤
(2)中诱导培养基II，加入诱导培养基III，同时转染步骤(I)中的SRF基因的重组真核表达质粒，培养7 8天；步骤⑷中所述的诱导培养基III为含有5 20nmol/L Exendin_4、5 20mmol/L尼克酰胺、2% B27和2%胎牛血清的DMEM-高糖培养基，含25mM葡萄糖。而且，步骤(I)中构建含有SRF基因的重组真核表达质粒，真核表达载体为pEGFP、pcDNA3. I 或 pCMV。而且，步骤(2)中所述的人间充质干细胞包括羊水、骨髓、胎盘、脐带血或脂肪组织来源的间充质干细胞。而且，步骤(4)中所述的SRF真核表达质粒为去内毒素的质粒，质粒超螺旋带型清晰，A260/A280 = I. 8 2. O。而且，所述步骤(3)中所述的诱导培养基II为含有10nmol/L bFGFUOnmoI/L EGF、2% B27.0. 1% β-巯基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖培养基，含25mM葡萄糖。而且，所述步骤(4)中所述的诱导液培养基III为含有10nmol/L Exendin-4、10mmol/L尼克酰胺、2% B27和2%胎牛血清的DMEM-高糖培养基，含25mM葡萄糖。本发明的优点和积极效果如下I、本发明首次将SRF用作诱导间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化过程中的修饰基因，并首次将转染SRF和多种生长因子组合共同诱导间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化。2、本发明利用生长因子组合诱导间充质干细胞分化为胰腺始祖细胞(此时细胞高表达rox-i)，同时对细胞进行基因修饰，上调细胞中的SRF表达，并辅以生长因子和活性物质将可能获得分泌胰岛素的细胞，此方法的建立对于研发基于干细胞移植治疗为主的“再生医学”具有重要意义和实用价值。3、本发明所述的Effectene Transfection Reagent转染系统转染效率高，并且安全性好。4、本发明可为间充质干细胞的向胰岛素分泌细胞定向诱导分化和其临床应用提供新的理论和实验依据，并为与之相关的药物开发和筛选提供了新的模型。


图I为本发明利用SRF的上、下游引物对SRF基因进行PCR扩增，将扩增得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，M为分子量marker，I代表扩增PCR产物片段；图2为本发明所构建的SRF质粒进行双酶切验证，M为分子量marker，I为所构建质粒进行双酶切后的电泳图。图3为本发明利用诱导培养基组合三步诱导法诱导人间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的细胞形态图，其中，图3-1代表未诱导组的间充质干细胞的形态；图3-2代表利用诱导培养基I诱导间充质干细胞分化为nestin+细胞的形态变化情况；图3_3代表利用诱导培养基II诱导nestin+细胞分化为胰腺始祖细胞的形态变化情况；图3_4代表利用诱导培养基III诱导胰腺始祖细胞分化为胰岛素分泌细胞的形态变化情况。图4为本发明利用诱导培养基组合三步诱导法诱导人间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化后，利用双硫腙染色检测胰岛素分泌细胞团，其中，图4-1代表未诱导组的间充质干细胞进行双硫腙染色；图4-2代表利用生长因子诱导后双硫腙染色，说明利用诱导培养基组合诱导后出现表达胰岛素的细胞团。图5为本发明利用诱导培养基组合三步诱导法与转录因子SRF共同诱导人间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化后，利用RT-PCR检测分化后细胞表达胰岛素基因mRNA水平，其中A代表诱导培养基组合三步诱导法诱导间充质干细胞分化后，胰岛素基因mRNA水平；B代表诱导培养基组合三步诱导法与转录因子SRF共同诱导人间充质干细胞分化后，胰岛素基因mRNA水平。说明在诱导培养基组合与转录因子SRF共诱导之后胰岛素的mRNA水平较闻。图6为本发明利用诱导培养基组合三步诱导法与转录因子SRF共同诱导人间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化后，利用ELISA方法检测培养基中胰岛素的分泌情况，其中A代表诱导培养基组合三步诱导法诱导间充质干细胞分化后，培养基中胰岛素的分泌情况；B代表诱导培养基组合三步诱导法与转录因子SRF共同诱导人间充质干细胞分化后，培养基中胰岛素的分泌情况。说明在诱导培养基组合与转录因子SRF共诱导之后胰岛素分泌显著升高。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。本发明中没有具体指明单位的百分比均为重量百分比。本发明未详细说明的方法均为本领域公知技术或公知实验方法，不具有特殊性。本发明提供一种由多种诱导物组合而成的分3步诱导的新方法，其中SRF基因修饰是间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化中首次采用的方法，该方法能将人间充质干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞，并具有较高的胰岛素分泌量，具体包括以下步骤(I)间充质干细胞的分离、培养间充质干细胞包括羊水、骨髓、胎盘、脐带血、脂肪等组织来源的间充质干细胞。
(2)构建含有SRF基因的重组真核表达质粒，含有SRF基因的真核表达质粒的制备方法是本领域常用的构建真核表达载体的方法。具体的是选择合适的载体，载体可以是pcDNA3. I、pCMV等真核表达载体。根据SRF基因全长序列与所选载体设计酶切位点，利用PCR或人工合成的方法获得SRF基因全长，利用相应的限制性内切酶进行酶切反应，然后用连接酶将酶切后的SRF基因片段和载体连接，进一步通过琼脂糖凝胶电泳、限制性内切酶酶切鉴定、PCR鉴定及测序的方法对获得的质粒进行鉴定，获得SRF真核表达质粒。
(3)诱导人间充质干细胞向Nestin+细胞分化将步骤(I)中细胞种入6孔板中，待生长至70-80%融合时，去除原有DiffiM和10%胎牛血清培养基，加入诱导培养基I 2mL培养5 6小时，诱导培养基I为含有5mmol/Lβ -巯基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖(25mM葡萄糖)培养基。培养基加入量与使用培养板大小有关，如用6孔板，则加2ml，如用24孔板，则加lmL。(4)诱导Nestin+细胞向胰腺始祖细胞分化在步骤(3)获得细胞中，去除步骤(3)中诱导培养基I，加入诱导培养基II 2mL培养 7 8 天，诱导培养基 II 为含有 5 20nmol/L bFGF、5 20nmol/L EGF,2% B27.0. 1%β -巯基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖(25mM葡萄糖)培养基。(5)诱导胰腺始祖细胞向胰岛素分泌细胞分化在步骤⑷获得细胞中，去除步骤⑷中诱导培养基II，加入诱导培养基III 2mL，同时转染步骤(2)中的SRF基因的重组真核表达质粒，培养7 8天，诱导培养基III为含有5 20nmol/LExendin-4、5 20mmol/L尼克酰胺、2% B27和2%胎牛血清的DMEM-高糖(25mM葡萄糖)培养基。(6)分化后细胞的鉴定利用细胞形态观察、RT-PCR、双硫腙染色等方法对分化后的细胞进行鉴定。实施例I一种体外诱导人间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，本实施例采用的是人骨髓间充质干细胞，步骤如下I.人骨髓间充质干细胞的分离、培养从健康志愿者髋骨分离获取人骨髓间充质干细胞，然后收集细胞培养当细胞达到70-80%融合时，用PBS清洗后，用胰酶消化，然后加入含有10%胎牛血清的DMEM低糖培养基(5. 6mM葡萄糖)终止消化，吹打成单细胞悬液，离心后弃上清，再用含有10%胎牛血清的DMEM低糖培养基(5. 6mM葡萄糖)重新悬浮细胞；然后传代培养；2.含有SRF基因的重组真核表达质粒构建(I)小鼠基因组的提取提取小鼠的心脏组织，将组织置于冰块上，同时注意无菌操作。使用PH值为7. 4的PBS，将心脏组织湿润。用眼科剪将心脏组织剪为O. 5cm X O. 5cm的小块，将剪碎的心脏组织放入匀浆器中，在10-20mg心脏组织加入I毫升Trizol，至于冰上研磨5分钟，离心取上清，利用传统方法(氯仿/异丙醇)提取RNA。(2)根据NCBI中Genebank数据库中SRF的全长序列信息和所用pcDNA3. I载体信息设计引物，引物序列如下上游引物I :5’ -CATGGATCCCCATGTTACCGACCCAAGCT-3’
下游引物1 :5’ -GGTCTCGAGGTTCACCACCTGTAGCTCGG-3’PCR反应体系
基因组模板Ιμ
正向引物Ιμ
反向引物Ιμ dNTP4μL
IOxbuffer5 μι
EasyTaq 聚合酶Ιμ
总体积5(^L利用EasyTaq 聚合酶在 94°C 5min, (94°C lmin,53°C 30s，72°C 3min) 35 个循环，72°C IOmin的反应条件下进行PCR扩增，将扩增获得的PCR产物于I %的TBE琼脂糖凝胶中电泳(如图I)，利用琼脂糖凝胶DNA快速纯化回收试剂盒纯化回收获得SRF基因片段。(3)将SRF基因和pcDNA3. I质粒用BamHI和XhoI双酶切后，经T4DNA连接酶(Promega)连接，取连接产物10 μ I加入到感受态细胞(常规CaCl2法制备Ε. coliDH5 α感受态细胞)中，轻敲管壁使内容物混匀，冰浴30min，42°C水浴热击90s，迅速转置冰浴2min，加入500 μ ILB培养基振荡培养，将300 μ I转化产物涂布于含有氨苄青霉素的LB培养基平板上，置于37°C培养箱培养过夜。培养12h后挑取单克隆，分别接种于3ml含氨苄青霉素的液体培养基，37°C振荡培养过夜。利用质粒小提试剂盒(Solarbio)提取质粒，用BamHI和XhoI双酶切验证(如图2)，琼脂糖凝胶电泳检测有I. 6kb左右的SRF目的片段，进一步将含有pcDNA3. I-SRF质粒的DH5a菌液送至上海生工生物技术有限公司进行测序鉴定，测序结果在Genebank数据库中进行比对，证明阅读框完全正确，pcDNA3. I-SRF质粒中含有SRF全长基因。(4)质粒DNA的大量提取，将pcDNA3. I-SRF质粒转化大肠杆菌DH5 α，取菌液30 μ 1，接种到3ml含氨苄青霉素的LB培养基中，在37°C水浴摇床上震荡培养过夜，利用去内毒素质粒大提试剂盒(Solarbio)操作步骤纯化提取pcDNA3. I-SRF质粒备用。提取后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳观察，质粒超螺旋带型清晰。同时利用核酸蛋白测定仪(美国Bio-Rad公司)对核酸进行定量分析，A260/A280 = I. 8 2. O为最佳。3.诱导人骨髓间充质干细胞向胰腺始祖细胞分化待分离获得长期培养的间充质干细胞生长至70 80%，加入诱导培养基I (5mmol/L β -巯基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖(25mM葡萄糖)培养基)，放入37V,5% CO2恒温培养箱培养5 6小时，将间充质干细胞诱导为Nestin+细胞；吸去旧培养基，加入诱导培养基II (I Onmo I/L bFGF U Onmo I/L EGF,2% B27.0. 1% β-巯基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖(25mM葡萄糖)培养基)，放入37°C、5% CO2恒温培养箱培养，48h首次半量换液，之后每3天全量换液一次，培养7天。4.在胰腺始祖细胞中转染SRF真核表达质粒，诱导其向胰岛素分泌细胞分化按照Effectene Transfection Reagent转染系统将SRF基因转染入胰腺始祖细胞，具体操作步骤如下在24孔板中预先加入O. 5mL含血清但不含抗生素的DMEM低糖培养基，置于37°C、5% CO2培养箱中孵育。细胞在转染前汇合度达到60-70%，将培养基吸去，加入PBS漂洗一次后，加入O. 25%胰酶消化细胞，离心收获细胞，并用不含Ca2+和Mg2+的PBS漂洗细胞，离心去上清，加入重悬缓冲液R重悬细胞，使其终浓度为I. O X IO7个细胞/mL。将重悬的细胞转移至I. 5mL无菌微量离心管中，按I μ g/每孔分别将不含SRF基因的pcDNA3. I质粒和含有SRF的pcDNA3. 1-SRF表达质粒加入到细胞悬液中，轻轻混匀。打开Neon 仪器开关，在Neon 管中加入3mL电解缓冲液，然后将它插入Neon 移液器吸头架中，用Neon 移液器夹取一个Neon 吸头，确保移液器与吸头无缝隙。将Neon 吸头浸入细胞-质粒混合物中，吸取IO uL混合物。然后将移液器垂直插入位于Neon 移液器吸头架上的Neon 管中。在显示屏上设置电转参数为电压990V，脉冲时间40ms，点击次数I次，然后按下START键。当触摸屏显示Complete，说明电转完成。将移液器取下，并吸头中的样品转移至预先加入诱导培养基III (10nmol/L Exendin-4、10mmol/L尼克酰胺、2%B27和2%胎牛血清的DMEM-高糖(25mM葡萄糖)培养基)孵育的孔板中。轻轻晃动培养板，确保细胞分布均匀。将培养板置于37°C、5% CO2培养箱中继续培养48小时，进行半量换液，之后每3天全量换液一次，诱导其向胰岛素分泌细胞分化。5.检测分化后细胞的形态学变化在诱导分化过程中，顺序利用诱导培养液I、诱导培养液II、诱导培养液III同时进行SRF基因修饰诱导细胞分化，经历Nestin+细胞、胰腺始祖细胞、胰岛素分泌细胞三个阶段，利用倒置相差显微镜进行形态学观察，结果如图3所示，细胞在形态学上发生明显变化，变圆并形成细胞簇。6.利用双硫腙染色方法鉴定胰岛素分泌细胞首先配置双硫腙染色剂，50mg双硫腙(DTZ)加入5mL DMSO溶解作为储备液，用PBS稀释终浓度为0. lmg/mL，抽滤除菌，配制为染色液。对于诱导分化的细胞和未诱导分化的细胞，用PBS漂洗2次，加入染色液，37°C温育15min后镜检。结果如图4所示，诱导分化后细胞着色较深，呈棕红色。实施例2一种体外诱导人间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，本实施例使用的是pCMV-Tag2B作为载体，具体方法如下I.人骨髓间充质干细胞的分离、培养，同实施例I。2.构建pCMV-SRF真核表达质粒(I)以实施例I中构建好的pcDNA3. I-SRF质粒为模版，以pCMV_Tag2B作为载体，采用PCR的方法从pcDNA3. I-SRF质粒中扩增SRF基因片段，根据SRF的全长序列信息和所用pCMV载体信息设计引物，引物序列如下上游引物2 :5 ’ -ATCGGGATCCATGTTACCGACCCAAGCT-3 ’下游引物2 :5 ’ -GGTCTCGAGGTTCACCACCTGTAGCTCGG-3 ’进行PCR扩增，将扩增得到的PCR产物利用琼脂糖凝胶电泳检测后，利用凝胶纯化方法纯化回收获得SRF基因片段。(2)将SRF基因和pCMV_Tag2B质粒用BamHI和XhoI双酶切后，经T4DNA连接酶(Promega)连接，取连接产物转化大肠杆菌DH5 α (转化方法同实施例I)，将300 μ I转化产物涂布于含有氨苄青霉素的LB培养基平板上，置于37°C培养箱培养过夜。培养12h后挑取单克隆，分别接种于3ml含氨苄青霉素的液体培养基，37°C振荡培养过夜。利用质粒小提试剂盒(Solarbio)提取质粒,用BamHI和XhoI双酶切验证,琼脂糖凝胶电泳检测有I. 6kb左右的SRF目的片段，进一步将含有pCMV-SRF质粒的DH5 α菌液送至上海生工生物技术有限公司进行测序鉴定，测序结果在Genebank数据库中进行比对，证明阅读框完全正确，pCMV-SRF质粒中含有SRF全长基因(3)pCMV-SRF质粒的大量提取方法，同实施例I。3.诱导人骨髓间充质干细胞向胰腺始祖细胞分化，同实施例I。4.在胰腺始祖细胞中转染SRF真核表达质粒，诱导其向胰岛素分泌细胞分化转染质粒为pCMV-SRF质粒，其他同实施例I。5.利用双硫腙染色方法鉴定胰岛素分泌细胞，同实施例I。6.利用RT-PCR的方法检测胰岛素分泌细胞特异性基因insulin的mRNA表达情况。诱导分化后，利用Trizol法提取培养细胞的总RNA，提取的总RNA用核酸定量仪检测并定量。以mRNA为模板，采用Oligo (dT)为引物，利用M-MLV逆转录酶逆转录为cDNA。设计insulin的引物，由Invitrogen生物技术公司合成。引物序列如下正向引物3 :5 ’ -CAGCCGCAGCCTTTGTGAA-3 ’反向引物3 :5 ’ -TCCACAATGCCACGCTTCTG-3 ’利用反转录得到的cDNA为模板在95 V 5min, 32个循环扩增(95 V 30s、55. I0C 45s, 72 °C 60s)，72。。延伸IOmin的条件下进行PCR扩增。结果如图5所示(A)代
表诱导培养基组合三步诱导法诱导间充质干细胞分化后，胰岛素基因mRNA水平；(B)代表诱导培养基组合三步诱导法与转录因子SRF共同诱导人间充质干细胞分化后，胰岛素基因mRNA水平。结果说明在诱导培养基组合与转录因子SRF共诱导之后胰岛素的mRNA水平较高。实施例3一种体外诱导人间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，本实施例采用的是人脐血间充质干细胞，具体步骤如下I.人脐血间充质干细胞的分离、培养，同实施例I。取抗凝脐血和等体积的PBS混匀，利用Ficoll分离液分离单个核细胞层，PBS清洗，细胞计数，以2X IO7细胞密度接种，置于37°C、体积分数为5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。于贴壁2小时后更换新鲜培养液，待细胞达80%融合时以O. 25%胰酶和O. 02%EDTAl I混合笑话，进行传代培养。2.含有SRF基因的重组真核表达质粒构建，同实施例I。3.诱导人脐血间充质干细胞向胰腺始祖细胞分化，同实施例I。4.在胰腺始祖细胞中转染SRF真核表达质粒，诱导其向胰岛素分泌细胞分化转染质粒为pcDNA-SRF质粒，同实施例I。5.利用RT-PCR的方法检测胰岛素分泌细胞特异性基因insulin的mRNA表达情况，同实施例I。6.利用胰岛素(INS)酶联免疫分析(ELISA)实验检测培养基中胰岛素分泌量诱导分化完成之后，吸取诱导培养基，PBS轻洗3遍，换用无血清H-DMEM培养基培养12h。收集培养基上清，-80°C保存备测。
利用胰岛素酶联免疫分析试剂盒(R&D)检测步骤如下 (I)标准品的稀释和加样在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100 μ L，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50 μ L，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100 μ L分别加到第三孔、第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50 μ L，混匀；然后在第三、第四孔中先各取50 μ L弃掉,再各取50 μ L分别加到第五、第六孔中，再分别加入50 μ L标准品稀释液，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50 μ L分别加入到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加入标准品稀释液50yL，混匀；混匀后从第七第八空中各取50 μ L分别加到第九、第十空中，加标准品稀释液50 μ L混匀；混匀后各取50yL弃掉。(稀释后没孔加样量都为50μ 1，浓度分别为12mU/L，8mU/L，4mU/L，2，mU/L,ImU/L),其余步骤与下面相同,绘制标准曲线。(2)加样分别设空白孔(空白孔不加样品和酶标试剂，其余步骤相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔先加样品稀释液40 μ L，然后再加待测样品10 μ L。加样将样品加于酶标板孔底部，混匀。(3)温育用封板膜封板后置于37°C,30min。(4)配液将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。(5)洗涤小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，加满洗涤液，静置30s后弃去，重复5次。(6)加酶每孔加入酶标试剂50 μ L，空白孔除外。(7)温育同 3。(8)洗涤同 5。(9)显色每孔先加入显色剂Α50 μ L，再加入显色剂B 50 μ L，轻轻混匀，37°C避光显色15min。(10)终止每孔加终止液50 μ L，终止反应(此时蓝色立转黄色)。(11)测定以空白孔调零，450nm波长依序测定各孔吸光度。(12)计算根据标准曲线计算出每孔样品的胰岛素含量。结果如图6所示，利用本发明方法所诱导分化的细胞能够产生胰岛素，并且，与只利用三种诱导培养基诱导细胞分化组相比，同时对细胞进行SRF基因修饰后的分化细胞产生胰岛素量显著升高，从5. 64±1. 04mU/L上升至12. 98±1. 86mU/L。
权利要求
1.一种体外诱导人间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，其特征在于包括以下步骤 (1)构建含有SRF基因的重组真核表达质粒； (2)诱导人间充质干细胞向Nestin+细胞分化当步骤(I)中细胞至70-80%融合时，去除原有培养基，加入诱导培养基I培养5 6小时； 所述步骤⑵中所述诱导培养基I为含有5mmol/L β -巯基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖培养基，含25mM葡萄糖； (3)诱导Nestin+细胞向胰腺始祖细胞分化在步骤(2)获得细胞中，去除步骤(2)中诱导培养基I，加入诱导培养基II培养7 8天； 步骤(3)中所述的诱导培养基II为含有5 20nmol/L bFGF、5 20nmol/L EGF,2%B27、0. 1% β-巯基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖培养基，含25mM葡萄糖； (4)诱导胰腺始祖细胞向胰岛素分泌细胞分化在步骤(3)获得细胞中，去除步骤(2)中诱导培养基II，加入诱导培养基III，同时转染步骤(I)中的SRF基因的重组真核表达质粒，培养7 8天； 步骤⑷中所述的诱导培养基III为含有5 20nmol/L Exendin_4、5 20mmol/L尼克酰胺、2% B27和2%胎牛血清的DMEM-高糖培养基，含25mM葡萄糖。
2.根据权利要求I所述的体外诱导人间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，其特征在于所述步骤(I)中构建含有SRF基因的重组真核表达质粒，真核表达载体为pEGFP、pcDNA3. I 或 pCMV。
3.根据权利要求I所述的体外诱导人间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，其特征在于步骤(2)中所述的人间充质干细胞包括羊水、骨髓、胎盘、脐带血或脂肪组织来源的间充质干细胞。
4.根据权利要求I所述的体外诱导人间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，其特征在于步骤(4)中所述的SRF真核表达质粒为去内毒素的质粒，质粒超螺旋带型清晰，A260/A280 = I. 8 2. O。
5.根据权利要求I所述的体外诱导人间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，其特征在于所述步骤⑶中所述的诱导培养基II为含有10nmol/L bFGF、10nmol/L EGF,2%B27、0. 1% β-巯基乙醇和2%胎牛血清的DMEM-高糖培养基，含25mM葡萄糖。
6.根据权利要求I所述的体外诱导人间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，其特征在于所述步骤⑷中所述的诱导液培养基III为含有10nmol/L Exendin-4、10mmol/L尼克酰胺、2% B27和2%胎牛血清的DMEM-高糖培养基，含25mM葡萄糖。
全文摘要
本发明涉及生物医学领域，具体地说是涉及一种体外诱导间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的方法，技术方案构建SRF基因的重组真核表达质粒，真核表达载体包括是pEGFP、pcDNA或pCMV；将人间充质干细胞首先预诱导为nestin+细胞，进一步诱导为胰腺始祖细胞，然后将含有SRF基因的真核表达载体转染到上述细胞中，最后诱导为胰岛素分泌细胞。本发明可为糖尿病的细胞治疗提供新的种子细胞来源，为间充质干细胞的定向诱导分化为胰岛素分泌细胞和其临床应用提供新的理论和实验依据，并为与之相关的药物开发和筛选提供了新的模型。
文档编号C12N5/10GK102618500SQ20121007625
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月21日 优先权日2012年3月21日
发明者俞如发, 张同存, 王楠 申请人:天津科技大学