专利名称：：一种Sublancin抗菌肽的生产方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
,具体地,涉及ー种Sublancin抗菌肽的生产方法。
背景技术：
：Sublancin抗菌肽是由枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)产生ー种具有抗菌活性的内源性多肽。由核糖体合成，通过前导序列进行转录后修饰和转运。其物理性质为无色结晶或白色结晶性粉末，易溶于水。Sublancin含有_■硫键，因此稳定性好。Sublancin抗菌肽对革兰氏阳性菌具有较强抑制和杀灭作用，可应用于食品保鲜、抗感染以及抑制环境消毒。目前，国内外尚未有可实现エ业化生产的Sublancin抗菌肽生产方法。关于Sublancin抗菌肽制备方法的报道也比较少。Paik等1998年(SunH.Paik,AnuChaKicherla,andJ.NormanHansen.1998.IdentificationandCharacterizationoftheStructuralandTransporterGenesfor,andtheChemicalandBiologicalPropertiesof,Sublancin168,aNovelLantibioticProducedbyBacillussubtilis168.THEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMISTRY.273:23134-23142.)报道了一种在实验室制备Sublancin抗菌肽的方法。菌株为B.subtilis168，发酵规模为1し每IL培养基含蔗糖20g，柠檬酸11.lg,Na2SO44g，(NH4)2HPO44.2g，酵母提取物5g，KCl0.762g，MgCl2*6H200.418g,MnCl24H200.0543g,FeCl36H200.049g,ZnCl20.0208g，用NH4OH调pH6.86.9。发酵条件为37°C通风培养16h后，200rpm摇床37°C培养28h。纯化方法为用磷酸调发酵培养液PH2.5;离心除去细胞；过25ml体积疏水层析柱；冻干；用0.I%的三氟こ酸溶解后离心去掉沉淀；经过2次HPLC反相C-18分析柱的分离纯化后，经冻干，于_20°C保存。该方法发酵规模小，产量低而且不稳定。纯化过程采用了高精密仪器高效液相色谱(HPLC)，对化学试剂以及操作人员的要求都比较高，这就导致采用此方法精制Sublancin抗菌肽成本高，产量低的特点。因此，上述方法不适用于大规模生产，不能满足エ业化生产的需要。
发明内容本发明的目的在于提供一种高纯度Sublancin抗菌肽的发酵生产和纯化的方法，以克服现有技术中没有エ业化生产高纯度Sublancin抗菌肽的不足。本发明通过大量研究，对ー系列エ艺数据进行探索，通过技术革新，优化了发酵配方和エ艺，扩大发酵規模，提高了Sublancin抗菌肽的产量，降低了生产成本，摸索出ー套可以大规模生产Sublancin抗菌肽的发酵方法；并进行了纯化过程的设计、组合，解决了纯化对高精密仪器的依赖和产量低的问题，使Sublancin抗菌肽的纯化满足规模化生产的要求，通过一系列层析技术实现Sublancin抗菌肽的大量纯化,最终实现高纯度Sublancin抗菌肽的エ业化制备。Sublancin抗菌肽纯物质的纯化制备流程见图I。本发明提供了ー种Sublancin抗菌肽的制备方法，所述生产方法包括(I)枯草芽孢杆菌接种培养基进行发酵，过滤发酵液；(2)将步骤(I)得到的发酵液离心，通过阳离子交换层析、疏水层析、尺寸排阻层析、阴离子交换层析，最后超滤浓缩、干燥，即得Ssublancin抗菌肽。其中，步骤(I)中所使用的菌株为B.subtilisCVCC20076，发酵液通过陶瓷膜过滤，所述陶瓷膜孔径为20nm。步骤⑴中所述的培养基组成为每IL发酵培养基含玉米粉10_50g，豆柏10-50g,蛋白胨5_20g，葡萄糖(或蔗糖)2-20g,酵母粉0-10g，硫酸铵0-10g，硝酸铵0_10g，硫酸镁0-1.5g，硫酸锰0-1.5g，磷酸盐0-10g。加氢氧化钠调节PH7.0-8.0，发酵规模为10-20m3。此外，步骤(I)中枯草芽孢杆菌的接种量为lX106_107CFU/mL，发酵温度为30-37°C，发酵时间为24-32h，通气量600-1000m3/h，转速120_200r/min，pH6-7。其中步骤⑵所述的离心条件为10000-15000g离心20-40min。本发明通过尝试不同的离子浓度和pH值，摸索出适合层析的洗涤、洗脱液。本发明提供的Sublancin抗菌肽的制备方法，其中阳离子交换层析步骤是用缓冲液A平衡离子交换层析柱，将发酵液上离子交换层析柱，上样量与阳离子交换层析柱填料的体积比为201，上样流速为50mL/min，之后用缓冲液A冲洗层析柱至紫外吸收达到基线水平，再用缓冲液A和缓冲液B按3I的体积比进行等度洗脱，收集洗脱液；所述缓冲液A为20mMNaAc溶液，pH4.0;所述缓冲液B为含20mMNaAc和IMNaCl的溶液，pH4.O。该步骤利用Sublancin抗菌肽与其它杂蛋白与层析柱填充物所带电荷相互作用的原理，将Sublancin抗菌肽与其它杂蛋白分离。由于Sublancin抗菌肽的等电点与其它杂蛋白的等电点不同，在适当的盐浓度和PH条件下与层析柱填充物(阳离子交换剂)结合的強度不同，从而将目的肽与杂蛋白分离。该步骤可除去发酵液中大多数原料蛋白以及菌体蛋白等杂蛋白，得到的Sublancin抗菌肽纯度可达70%以上。本发明的方法中，步骤2)所述的疏水层析步骤是用缓冲液A’平衡疏水层析柱，将离子交換层析收集到的洗脱液与2MNaCl进行等体积混合上样疏水层析柱，上样量与疏水层析柱填料的体积比为2.5I上样流速为30mL/min，用缓冲液A’洗涤色谱柱，直至紫外吸收至基线水平，再用缓冲液B’进行线性梯度洗脱，收集洗脱液；所述缓冲液A’为含20mMNaAc和IMNaCl的溶液，pH4.0，所述缓冲液B，为20mMNaAc,pH4.O。其中，步骤2)所述的尺寸排阻层析将疏水层析步骤收集的洗脱液上样，毎次进样体积为柱体积的5%，流速为2mL/min，收集抗菌肽洗脱峰。其中，步骤2)的尺寸排阻层析步骤是用SEC缓冲液清洗并充满尺寸排阻层析柱，待基线水平后，再上样。所述SEC缓冲液是20mMNa2HPO4和150mMNaCl的混合溶液。该步骤可以按照样品中各组分分子大小进行分离。在流经层析柱的过程中，大分子蛋白受填料的阻碍小，优先通过层析柱，小分子蛋白受填料的阻碍大通过层析柱的时间长。经过尺寸排阻层析可进ー步除去比Sublancin分子量大的杂质蛋白。此时的Sublancin抗菌肽纯度可达高到99%以上。将尺寸排阻层析步骤收集的洗脱液上阴离子交换层析柱，流速2ml/min，收集流出的液体。阴离子交换层析主要作用是能除去从发酵液中带来的残余DNA和内毒等杂质物质，确保Sublancin抗菌肽终产物的安全性。本发明还提供了上述生产方法制备得到的Sublancin抗菌肽产品。最后将得到的Sublancin抗菌肽溶液超滤浓缩、干燥后即得Sublancin抗菌肽纯物质。根据本发明提供的生产方法所得到的高纯度Sublancin抗菌肽，其纯度>99%，分子量为3876.48Da，具有优异的抗菌效果。本发明的有益效果(I)本发明以玉米和大豆加工品等粮食产品为主要原料，代替了实验室中化学试剂级别的原料，降低了生产成本；(2)本发明将发酵规模提高到了エ业化生产级别，实现了Sublancin抗菌肽的エ业化生产。(3)本发明提高了Sublancin抗菌肽的生产效率,发酵液中Sublancin抗菌肽的含量可达80-100ug/mL。(4)本发明采用エ业化中式层析柱，为实现Sublancin抗菌肽的大規模纯化铺平了道路，而且易于推广应用。(5)本发明精制的Sublancin抗菌肽纯度达到99%以上，可用于医药、食品添加剂以及环境消毒剂等产品的生产。本发明的方法能够实现大規模发酵，产量高，成本低，产物纯度高，而且实现了稳定化生产。纯化过程对操作人员要求低，エ艺简单易于推广应用、可实现规模化生产。图I为本发明的Sublancin抗菌肽的纯化制备方法流程图。图2为本发明制备的Sublancin抗菌肽纯物质HPLC色谱图。图3为本发明制备的Sublancin抗菌肽纯物质分子量质谱测定图。图4为Sublancin抗菌肽质谱片段HPLC色谱图。图5为Sublancin抗菌肽片段I、片段3质谱图。图6为Sublancin抗菌肽片段2质谱图。图7为Sublancin抗菌肽片段2的ニ级质谱图。图8为发酵液中Sublancin抗菌肽的含量检测色谱图。具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例I发酵规模10m3。IL发酵培养液含玉米粉20g，豆柏20g，蛋白胨5g，葡萄糖5g，硫酸铵5g，硫酸镁0.8g。用氢氧化钠调pH7.5。培养液经温度121°C，罐压0.08Mpa,维持时间30min灭菌。枯草芽孢杆菌B.subtilisCVCC20076，购自中国エ业微生物菌种保藏管理中心。菌种接种量为lX106CFU/mL。发酵培养温度34°C，通气量600m3/h，搅拌速度120r/min,pH7.0。发酵培养时间32h。陶瓷膜过滤的膜孔径20nm,得到Sublacin抗菌肽的发酵液。实施例2发酵规模20m3。IL发酵培养液含玉米粉50g，豆柏50g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，硫酸铵5g，酵母粉5g，磷酸氢ニ钾5g。用氢氧化钠调pH8.0。培养液经温度121°C，罐压0.15Mpa，维持时间30分钟灭菌。枯草芽孢杆菌B.subtilisCVCC20076菌种接种量为lX107CFU/mL。发酵培养温度30°C，通气量1000m3/h，搅拌速度160r/min，pH:6.5。发酵培养时间24h。陶瓷膜过滤的膜孔径10nm，得到Sublacin抗菌肽的发酵液。实施例3发酵规模10m3。IL发酵培养液含玉米粉10g，豆柏10g，蛋白胨5g，蔗糖2g，硫酸铵5g。用氢氧化钠调pH7.O。培养液经温度121°C，罐压0.lOMpa，维持时间30分钟灭菌。枯草芽孢杆菌B.subtilisCVCC20076菌种接种量为lX106CFU/mL。发酵培养温度37°C，通气量720m3/h，搅拌速度200r/min，pH:6.O。发酵培养时间28h。陶瓷膜过滤的膜孔径30nm,得到Sublacin抗菌肽的发酵液。实施例4Sublancin抗菌肽的纯化方法经过发酵后发酵液中含有抗菌肽经过陶瓷膜过滤后，经过12000g离心30min收集上清液备用。经预处理后的发酵液经过一系列固相萃取技术最终得到Sublancin抗菌肽的纯物质，エ艺如下I、离子交换层析在室温条件下，离子交換柱填料体积为1し用7L的离子交换缓冲液A(20mM醋酸钠NaAc，pH4.0)平衡离子交换层析柱，流速为50ml/min。取实施例3制得的发酵液进行层析柱上样，上样量约为20L，流速为50ml/min。上样后，用离子交换缓冲液A冲洗层析柱，直到紫外吸收接近基线水平。用缓冲液A:缓冲液B(20mMNaAc+lMNaCl，pH4.0)=3:I的比例进行等度洗脱，洗脱峰即含有抗菌肽，收集含有sublancin抗菌肽的洗脱液。收集完毕后，用5L缓冲液B冲洗层析柱，并用3L0.IMNaOH清洗，最后用20%こ醇保存层析柱。该步骤得到抗菌肽的纯度约为70%。2、疏水层析在室温条件下,疏水层析填料为0.2し先将离子交换层析收集到的sublancin抗菌肽粗产品与2MNaCl进行等体积混合备用。用缓冲液A(20mMNaAc+IMNaCl,pH4.0)平衡疏水层析柱，流速为30ml/min。层析柱平衡好后，保持流速，将离子交換所收集的样品全部上样，上样量与层析柱填料比在2.5I。上样后，用缓冲液A洗涤色谱柱，直至紫外吸收至基线。使用缓冲液B(20mMNaAc，pH4.0)进行线性梯度洗脱，30min内缓冲液B从0到100%。内当缓冲液B所占比例至80%-90%时，Sublancin抗菌肽被洗脱下来,收集洗脱液。洗脱完毕后，使用0.6L0.IMNaOH清洗层析柱，并用20%的こ醇保存层析柱。该步骤得到抗菌肽的纯度约为95%。3、尺寸排阻层析在室温条件下，尺寸排阻层析填料为0.4し含Sublancin抗菌肽的发酵液经过离子交換、疏水层析后，还需要经过尺寸排阻层析才能获得高纯度的目的物质。先用SEC缓冲液(20mMNa2HPO4+150mMNaCl)清洗并充满纯化系统，接上尺寸排阻层析柱(SuperdexG50填料)平衡系统，流速为2ml/min。待基线水平后进样，将疏水层析步骤得到的洗脱液上尺寸排阻层析柱，毎次进样体积为15ml，抗菌肽在70min左右出峰，收集抗菌肽洗脱峰。最后，用20%的こ醇保存层析柱。该步骤得到抗菌肽的纯度大于95%。4、阴离子交换层析该步骤的目的是去除残余宿主DNA。在室温条件下，阴离子交換填料为1ml。先用20mlPBS(20mMNa2HP04+150mMNaCl)平衡阴离子交换层析柱。将尺寸排阻层析收集到的样品上样，流速为2ml/min(即将所有样品流穿，样品中残余宿主DNA吸附在层析柱上，而抗菌肽不吸附)。收集流出的液体即得不含參与宿主DNA、纯度大于99%的抗菌肽。用缓冲液(20mMTris+lMNaCl,pH8.0)清洗层析柱并用20%的こ醇保存。将阴离子交换层析步骤获得的抗菌肽按常规方法超滤浓缩、干燥，冻干密封保存。实施例5Sublancin抗菌肽的HPLC分析检测方法将实施例4得到的Sublancin抗菌肽用HPLC分析。所用仪器有Agilent1260Infinityニ元液相色谱系统(购自Agilent公司);AgilentZORBAX300StableBond(300SB)C8HPLC色谱柱(购自Agilent公司);流动相A:0.I%的三氟こ酸水溶液；流动相B:80%的こ腈水溶液；柱温25°C，检测波长280nm;最大压力200bar，流速lml/min,分析梯度见表I:表IHPLC分析梯度流动相梯度权利要求1.一种制备Sublancin抗菌肽的方法,其特征在于包括如下步骤1)枯草芽孢杆菌接种培养基进行发酵，过滤发酵液；2)将步骤I)所得发酵液先后进行离心、阳离子交换层析、疏水层析、尺寸排阻层析、阴离子交换层析，最后超滤浓缩、干燥，即得Sublancin抗菌肽。2.如权利要求I所述的抗菌肽制备方法，其特征在于步骤I)中发酵液通过陶瓷膜过滤，所述陶瓷膜孔径为20nm。3.如权利要求I或2所述的抗菌肽制备方法，其特征在于步骤I)中所述的培养基组成为每IL发酵培养基含玉米粉10-50g，豆柏10-50g，蛋白胨5-20g，葡萄糖(或蔗糖)2_20g，酵母粉O-lOg，硫酸铵O-lOg，硝酸铵O-lOg，硫酸镁0-1.5g，硫酸锰0-1.5g，磷酸盐0_10g，pH7.0_8·Oο4.如权利要求I或2所述的抗菌肽制备方法，其特征在于步骤I)中枯草芽孢杆菌的接种量为IX106_107CFU/mL，发酵温度为30_37°C，发酵时间为24_32h，通气量600-1000m3/h，转速120-200r/min,pH6.0-7.O。5.如权利要求I或2所述的抗菌肽制备方法，其特征在于步骤2)所述的离心条件为10000-15000g离心20-40min。6.如权利要求I或2所述的抗菌肽制备方法，其特征在于，所述的阳离子交换层析是用缓冲液A平衡离子交换层析柱，将发酵液上样，上样量与阳离子交换层析柱填料的体积比为201，上样流速为50ml/min，之后用缓冲液A冲洗层析柱至紫外吸收达到基线水平，再用缓冲液A和缓冲液B按3I的体积比进行等度洗脱，收集洗脱液，所述缓冲液A为20mMNaAc溶液，pH4.0，所述缓冲液B为含20mMNaAc和IMNaCl的溶液，pH4.O。7.如权利要求I或2所述的抗菌肽制备方法，其特征在于，步骤2)所述的疏水层析步骤是用缓冲液A’平衡疏水层析柱，将离子交换层析收集到的洗脱液与2MNaCl进行等体积混合上样层析柱，上样量与疏水层析柱填料的体积比为2.51，上样流速为30ml/min，用缓冲液A’洗涤色谱柱，直至紫外吸收至基线水平，再用缓冲液B’进行线性梯度洗脱，收集洗脱液；所述缓冲液A’为含20mMNaAc和IMNaCl的溶液，pH4.0，所述缓冲液B’为20mMNaAc,pH4.O。8.如权利要求I或2所述的抗菌肽制备方法，其特征在于，步骤2)所述的尺寸排阻层析是将疏水层析步骤收集的洗脱液上样，每次进样体积为柱体积的5%，流速为2ml/min，收集抗菌肽洗脱峰。9.如权利要求I或2所述的高纯度抗菌肽生产方法，其特征在于，将尺寸排阻层析步骤收集的洗脱液上阴离子交换层析柱，流速2ml/min，收集流出的液体。10.如权利要求I9任意一项所述的生产方法得到的抗菌肽产品。全文摘要本发明提供了一种Sublancin抗菌肽的制备方法，包括如下步骤(1)枯草芽孢杆菌接种培养基进行发酵，过滤发酵液；(2)将步骤(1)的发酵液先后进行离心、阳离子交换层析、疏水层析、尺寸排阻层析、阴离子交换层析，最后超滤浓缩、干燥，得Sublancin抗菌肽。本发明的方法成本低、生产效率提高、产物纯度高，制得的Sublancin抗菌肽的纯度可达99％以上，工艺简单易于推广应用、可实现规模化生产。文档编号C12R1/125GK102851339SQ20121007636公开日2013年1月2日申请日期2012年3月21日优先权日2012年3月21日发明者郭文江,祝发明申请人:中农颖泰林州生物科园有限公司