专利名称：人间叶干细胞及其培养方法
技术领域：
本发明涉及一种获自人脐带血和/或人骨髓液(bone marrow aspirate)的成人间叶干细胞(adult human mesenchymal stem cells)及其培养方法。
背景技术：
干细胞具有分化成体内各种细胞的潜力。理论上，干细胞可无限制地分裂增殖，以补充其它种类细胞的数目。当干细胞分裂时，每个新细胞可维持原本干细胞的状态或成为一种具有更特定功能的他种细胞，例如肌肉细胞、红血球细胞或脑细胞。干细胞通常分为全能型(totipotent)、多能型(pluripotent)与有限潜能型(或称复潜能型)(multipotent)。全能型干细胞具有成长为身体中所有不同种类细胞的能力，包括生殖细胞(germ cell)，例如受精卵便是一种全能型干细胞。多能型干细胞能够成长为身体中除了发育胎儿所需的细胞种类以外的任何细胞。有限潜能型干细胞则只能在一种特定器官或一种特定组织中成长为两种或多种不同的细胞种类。
胚胎干细胞(embryonic stem cell)与成人干细胞(adult stem cell)是干细胞的主要来源。胚胎干细胞来自于受精卵发育而成的胚胎。当用于研究目的时，可在征得捐赠者同意后，在诸如体外受精临床医院中进行体外受精以使卵子发育成胚胎，并从中取得胚胎干细胞用于研究。通常可在受精后第4或第5天获得胚胎，此时，胚胎像一个由细胞构成的微小空心球，称为囊胚(blastocyst)。囊胚包含三种结构，分别是滋养叶细胞(trophoblast)，其是一层环绕着囊胚的细胞；囊胚腔(blastocoel)，其是囊胚内部的空腔；以及内细胞群(inner cell mass)，其是一群集中在囊胚一端的约由40-150个细胞组成的细胞群。将这些内细胞群分离出来，并以体外培养方式培养，即可成功获得胚胎干细胞。这些内细胞群一般生长在一层滋养层细胞(feeder cell)上，例如，生长在小鼠胚胎纤维母细胞(mouse embryonic fibroblasts)上，该层滋养层细胞可作为所述内细胞群的附着层并向内细胞群提供营养。所得到的胚胎干细胞是多能型干细胞，可分化为人体中所有种类的细胞。
成人干细胞或体干细胞(adult or somatic stem cell)是一种可在器官或组织的已分化细胞中找到的未分化细胞，属于有限潜能型干细胞。成人干细胞能够自我复制和更新(细胞自新)，并可分化成器官或组织中特定的细胞种类。科学界认为，每种组织中都有一个特定区域能使成人干细胞保持长达数年不活动的状态(即，不分裂)，直到这些细胞因疾病或组织受伤等原因而被活化为止。每种组织中存在的成人干细胞数目极少，已经在包括脑、骨髓、周边血液、血管、骨骼肌、皮肤、脐带、脂肪组织、羊膜与肝脏等组织与器官中找到成人干细胞。通常从骨髓或其他组织中分离出来且可粘附在塑胶培养皿上生长的细胞，可称为有限潜能间质细胞(multipotent mesenchymal stromal cell)，或者，如果其具有干细胞的生理特征，则可称为间质或间叶干细胞(mesenchymalstem cell)(Horwitz等，Cytotherapy 7(5)393-395，2005)。
由于干细胞可作为细胞或组织新生的来源，因此干细胞在各种疾病、身体异常状况以及残障治疗中具有重要作用。使用成人干细胞进行治疗的优点之一是可将患者自身的细胞进行大量培养，增加细胞数目后，再重新植回患者体内，因而可避免由患者自身免疫系统所产生的排斥外来细胞的免疫反应，并且不需要使用免疫抑制药物。
由于胚胎干细胞与生命息息相关，因此使用胚胎干细胞来治疗疾病会产生伦理道德上的争议。相反的，成人干细胞的来源虽然不会引起道德上的争议，但其细胞增殖与分化的能力明显低于胚胎干细胞，并且只能分化成提供所述成人干细胞的组织，虽然目前有证据显示成人干细胞也可分化成数种其他种类细胞的能力。例如，骨髓中用来形成血球的造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSCs)可能分化成脑细胞(例如，神经细胞、少突胶质细胞(oligodendrocytes)与星状细胞(astrocyte))(Hao等，H.Hematother.Stem Cell Res.1223-32，2003；Zhao等，PNAS 1002426-2431，2003；Bonilla等，Eur.J.Neurosci.15575-582，2002)、骨骼肌细胞(Ferrari等，Science 2791528-1530，1998；Gussoni等，Nature 401390-394，1999)、心肌细胞(Jackson等，J.Clin.Invest.1071395-1402，2001)以及肝细胞(Lagasse等，Nat.Med.61229-1234，2000)。骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cells)可能分化为心肌细胞与骨骼肌细胞(Galmiche等，Blood 8266-76，1993；Wakitani等，Muscle Nerve 181417-1426，1995)，而脑干细胞则可能分化为血球细胞与骨骼肌细胞(Bjornson等，Science 283534-547，1999；Galli等，Nat.Neurosci.3986-991.2000)。
由于成人干细胞的数目极少，而且不易用细胞培养的方式来放大其细胞数目，因此希望开发可在体外大量培养成人干细胞的方法，以将其应用在临床治疗上。日本公开专利第2003-052360号以及一篇公开文献(Matsubara等，Biochem.Biohys.Res.Comm.313503-508，2004)中揭示了一种在涂覆有类似基底膜层的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的组织培养皿上培养间叶干细胞的方法，该ECM就是从小鼠内皮细胞(PYS-2)或牛的角膜内皮细胞分离的；其实验结果显示，与培养在没有任何涂层的组织培养皿上的干细胞相比，培养在涂覆有ECM的组织培养皿上的干细胞在经过数次分裂以扩增数目后，仍然保持了分化为多种其他细胞的能力。但是，以这种方法培养出来的干细胞却不利于临床应用，因为其是培养在来自小鼠或牛的ECM上的，接受该类干细胞治疗的患者易于受到外源物质污染或产生异种排斥。因此，目前需要开发出一种可使人间叶干细胞增殖的改进方法，其不会使接受干细胞移植的患者发生外源物质污染和/或异种排斥。
发明内容
本发明提供一种使人间叶干细胞增殖的方法。具体而言，本发明是一种培养获自人脐带血和/或人骨髓液的人间叶干细胞的方法，所述方法是将所述人间叶干细胞培养在一种含有分离自人纤维母细胞的细胞外基质中。
本发明的一个方面在于提供一种使人间叶干细胞增殖的方法，所述方法包括从产后脐带中取得脐带血；用该脐带血制备出单核细胞(mononuclear cells，MNCs)的单细胞悬浮液(a single-cell suspension)；获得间叶干细胞；以及将所述间叶干细胞培养在含有分离自人纤维母细胞的细胞外基质(ECM)中。在所获得的间叶干细胞中，至少76％的干细胞可维持在未分化及有限潜能型细胞状态下至少9代(P9或P3+6，P3+6指细胞先经过3次培养，从第4代(P4)起培养在ECM上，并持续培养6代，总计共9代)。
本发明的另一方面在于提供一种使人间叶干细胞增殖的方法，所述方法包括从人骨髓液中制备出MNCs的单细胞悬浮液；获得间叶干细胞；以及将所述间叶干细胞培养在含有分离自人纤维母细胞的ECM中。在所获得的间叶干细胞中，至少76％的干细胞可维持在未分化及有限潜能型细胞状态下至少8代(P8或P2+6，P2+6指细胞先经过2次培养，从第3代(P3)起培养在ECM上，并持续培养6代，总计共8代)。
本发明另一方面在于提供一种可支持人间叶干细胞生长、使其维持在未分化状态或提高其分化能力的系统，包含一种涂覆有分离自人纤维母细胞的ECM的支持物(substrate)；及一种分离的人间叶干细胞；其中所培养的干细胞具有下列特征a.在所述培养的干细胞中，至少76％的干细胞可维持在未分化状态下至少8代(P8或P2+6)或9代(P9或P3+6)；及b.对至少一种选自由CD29、CD44、CD90/Thy-1、CD105、CD166、stro-1、SH2、SH3、SH4及波形蛋白(vimentin)所组成的细胞标记测试呈阳性反应，及对至少一种选自由CD31、CD34、及CD45所组成的细胞标记测试呈阴性反应。
本发明另一方面在于提供一种分离的、有限潜能性的人间叶干细胞群，其是以本发明的方法培养而成的，并具有如细胞标记等特定的特征。本发明另一方面在于提供一种冷冻保存的分离的、有限潜能型干细胞群，其是以本发明的方法培养而成的，并具有如细胞标记等特定的特征。
本发明的其他方面是提供一种包含人间叶干细胞的组合物，及一种包含人间叶干细胞的药学组合物。本发明还提供一种治疗疾病的方法，其包括对患者给予有效剂量的人间叶干细胞。
应理解，上述的一般性描述以及下述的详细说明，都是为阐述本发明而作出的示例性说明，并非用于限制本发明的范围。
图1显示了根据本发明的较佳实施例中所述的方法培养的BMSC(图1A)和CB-MSC(图1B)的细胞数目测量结果；图2显示了根据本发明的较佳实施例中所述的方法培养的BMSC(图2A)和CB-MSC(图2B)的细胞长度测量结果；图3显示了用流式细胞仪测量根据本发明的较佳实施例中所述的方法培养的BMSC(图2A)和CB-MSC(图2B)的细胞表面标记；图4显示了根据本发明的较佳实施例中所述的方法培养的BMSC分化为软骨(图4A)、硬骨(图4B)及脂肪(图4C)细胞基因的表达量。
具体实施例方式
本发明所揭示的实施例及名词仅用于作为说明，并非用于限制本发明的范围，并且本发明也涵盖了在此未作描述、但本领域熟练技术人员在阅读了本文后能够想到并用于实施的本发明的其他实例。
本文中所使用的名词“干细胞(stem cell)”是指主细胞(master cell)，其是能够不断地复制、增殖以形成器官或组织的具有特定功能的细胞。一个干细胞可进行分裂而产生两个子代干细胞，或是产生一个子代干细胞和一个祖代细胞(progenitor cell)，该祖代细胞随后会增殖成为组织中成熟且发育完全的细胞。文中所使用的名词“干细胞”包括有限潜能型干细胞与多能型干细胞。
文中所用的名词“多能型细胞(pluripotent cell)”是指一种具有完整多分化能力的细胞，即指那些可成长为哺乳动物体内除了用来发育胎儿所需细胞以外的任何细胞种类的细胞。多能型细胞可进行细胞自新，并且可能在组织中保持休眠或静止状态(dormant or quiescent state)。
文中所用的名词“有限潜能型细胞(multipotent cell)”是指一种具有可在指定器官或组织中成长为两种或两种以上不同种类细胞的能力的细胞。
文中所用的名词“细胞外基质(ECM)”是指一种由分离自人纤维母细胞的细胞外基质及细胞骨架所组成的纤维基质物。在一个较佳实施例中，该人纤维母细胞为人包皮纤维母细胞，但是，也可使用其他类型的纤维母细胞。可参考现有方法来制备ECM，例如揭示于Jordana等Eur.Respir.J.72106，1994、及美国专利第4,816,561号中的方法。一般来说，ECM的制备，是先以一种碱性溶液将纤维母细胞溶解，接着以充分的缓冲溶液冲洗，使得冲洗后仅留下细胞骨架及细胞外基质的蛋白质(例如，胶原蛋白、弹性蛋白、纤丝蛋白(fibrillin)、纤维结合蛋白(fibronectin)及板素(laminin))与多糖(例如，蛋白多糖及氨基多糖(GAGs))。以此方式获得的ECM可作为一种支架(scaffold)，以供本发明干细胞在其上成长和/或增殖。
在本文中，培养细胞的代数是以大写“P”及接续于其后的“阿拉伯数字”来表示。举例来说，“P6”代表细胞总计培养了6代。另外一种贯穿本文的表示方式则是“P(N1)+(N2)”，其中N1代表细胞在被置于ECM上培养的前所经过的培养代数，N2则代表细胞在ECM上培养后所经过的培养代数。举例来说，“P2+4”代表细胞先经过2代的培养后，从第3代开始放置在ECM上培养并继续培养了4代，总计培养代数为6代。
因此，本发明可提供一种成人间叶干细胞的增殖方法，其包含从脐带血和/或人骨髓液制备出MNCs的单细胞悬浮液；获取该间叶干细胞；以及将该间叶干细胞培养在含有分离自人纤维母细胞的ECM中。
“产后脐带(post-partum umbilical cord)”是经由自然分娩或剖腹产手术生产的妇女同意后而取得的。而骨髓液则可在取得适当捐赠者的书面同意后从该捐赠者身体取得或可购自任何商业来源。脐带血一般是以针筒从脐带中抽出。对于单核细胞(MNCs)则可根据揭示于Boyum A.，Scand.J.Clin.Lab.Invest.21 Suppl.97(Paper IV)77-89，1968的方法，利用离心方式取得。所获得的间叶干细胞则培养在事先涂覆有ECM的组织培养皿上。用来进行培养的培养基包含标准基质，例如αMEM(Gibco)，并添加有10％的胎牛血清(FBS)，且还可添加诸如纤维母细胞生长因子(fibroblast growth factors，FGFs)之类的生长因子。通过将间叶干细胞在培养基及ECM上连续培养至少8至9代，可获得所需的间叶干细胞群。
间叶干细胞可根据其上的细胞标记来分辨。目前已知有多种不同的细胞标记，该些已知的细胞标记可参考资料如Stem Cells Scientific Progress andFuture Research Directions.Appendix E.II.Markers Commonly Used ToIdentify Stem Cells and To characterize Differentiated Cell Types.Department of Health and Human Services.June 2001.http://www.nih.gov/news/stemcell/scireport.htm。可利用如免疫化学法(immunochemistry)或流式细胞仪(flow cytometry)等现有方法来检测细胞标记。流式细胞仪可对发光细胞或粒子所发出的散射光与萤光进行快速测量。当个别细胞或粒子通过光束时会产生讯号。分别测量每个细胞或粒子所发出的信号，并将其结果输出，结果即为累积的个别细胞的流式分析特征(cytometriccharacteristics)。用萤光染料标定这些用来辨识细胞标记的抗体，使该抗体可被流式细胞仪检测到。上述方法请参考下列资料Ormerod(ed.)，Flow CytometryA Practical Approach，Oxford Univ.Press，1997。
在本发明一个实施例中，一种人间叶干细胞可表达出至少一种下列细胞标记CD29、CD44、CD90/Thy-1、CD105、CD166、stro-1、SH2、SH3、SH4及波形蛋白(vimentin)。在另一实施例中，人间叶干细胞至少对下列一种细胞标记的检测为阴性CD31、CD34及CD45。
本发明还提供一种间叶干细胞的均质细胞群。文中的用词“均质细胞群(homogeneous population)”是指表达出实质相同的表达型的一群细胞，例如利用细胞标记来判断细胞是否为相同表达型。根据本发明方法分离出来的一群均质细胞群中至少包含约76％实质相同的细胞，或至少包含约83％、84％、88％、89％、90％、91％、93％、95％、96％、97％或98％的实质相同的细胞。具体而言，一群分离自人骨髓液的间叶干细胞(BMSC)，在经过4代(P4或P2+2)培养后包含至少88％实质相同的细胞；在经过6代(P6或P2+4)培养后包含至少84％实质相同的细胞；在经过8代(P8或P2+6)培养后包含至少76％实质相同的细胞。一群分离自人脐带血的间叶干细胞(CB-MSC)，在经过5代(P5或P3+2)培养后包含至少83％实质相同的细胞；在经过7代(P7或P3+4)培养后包含至少93％实质相同的细胞；且在经过9代(P9或P3+6)培养后包含至少76％实质相同的细胞。
在本发明一个实施例中，人间叶干细胞是在一种可支持其生长、维持其未分化状态或提高其分化能力的系统内增殖，该系统包含涂覆有分离自人纤维母细胞的ECM的支持物(substrate)；及分离自人脐带血和/或人骨髓液的人间叶干细胞；其中所培养的这些间叶干细胞具有下列特征在这些培养的干细胞中，至少76％的干细胞可维持在未分化状态下至少8代(P8或P2+6)或9代(P9或P3+6)；及对至少一种选自由CD29、CD44、CD90/Thy-1、CD105、CD166、stto-1、SH2、SH3、SH4及波形蛋白(vimentin)所组成的细胞标记测试呈阳性反应，及对至少一种选自由CD31、CD34、及CD45所组成的细胞标记测试呈阴性反应。
可根据分化成不同细胞种类的能力来检测培养过程中增殖的干细胞。例如，可测试培养中的细胞分化成脂肪细胞(adipocyte)和/或造骨细胞(osteoblast)的能力。脂肪细胞是一种负责合成与储存脂肪的结缔组织细胞(connective tissue cell)，造骨细胞及软骨细胞(chondrocytes)则是负责骨骼生成的主要细胞，并被认为是源自于骨骼组织(skeletal tissues)中的骨质祖代细胞(osteoprogenitor cell)。一般来说，间叶干细胞的分化可根据揭示于Matsubara等，Biochem.Biophys.Res.Comm.313503-508，2004中的方法，来进行诱发与检测。
具体而言，可通过将间叶干细胞培养在可诱发脂肪细胞分化的培养基中来监测脂肪细胞的分化情况，该可诱发脂肪细胞分化的培养基中包含添加有10％胎牛血清的DMEM-LG、1μM的地塞米松(dexamethasone)、10μM的胰岛素、0.5mM的甲异丁基黄嘌呤(methylisobutylxanthine)及200μM的消炎痛(indomethacin)。利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法来测定脂肪细胞转录因子PPARγ2(peroxisome proliferator activated receptor gamma 2)的表达量，以检测脂肪细胞分化情形。
可通过将间叶干细胞培养在可诱发骨细胞分化的培养基中来监测硬骨细胞的分化情况，该可诱发骨细胞分化的培养基中包含添加有10％胎牛血清的DMEM-LG、10mM的磷酸甘油酯(Sigma)、50μM的抗坏血酸-2-磷酸盐及0.1μM的地塞米松。利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法来测定包括(但不限于)骨桥蛋白(osteopontin，OP)、骨钙蛋白(osteocalcin，OC)、骨黏连蛋白(osteonectin，ON)等造骨标记的表达，来监测硬骨细胞的分化过程。
可通过将间叶干细胞培养在可诱发软骨细胞分化的培养基中来监测软骨细胞的分化情况，该可诱发软骨细胞分化的培养基中包含添加有1％胎牛血清的DMEM-LG、10ng/ml TGF-β1(R&D)、50nM的抗坏血酸-2-磷酸盐及6.25μg/ml的胰岛素(Sigma)。利用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法来测定诸如第X型及第II型胶原蛋白的表达，来监测软骨细胞的分化过程。
本发明还提供一种含有本发明间叶干细胞的组合物。本发明还提供一种含有本发明间叶干细胞的药学组合物。本发明的间叶干细胞或其配方可通过包括非经肠胃道的注射(如，皮下或肌肉内注射)或静脉滴注等任何传统方法对患者用药。上述治疗方式可以是单次用药，或是在一定期间内进行数次用药。所述药学组合物可包含一种或多种的药学上可接受的载体(carrier)。这些载体必须是“药学可接受的”，且与间叶干细胞间具有至少某种程度上的相容性，且不会对接受该药剂的使用者造成伤害。载体通常是经过高温杀菌且不含致热原(pyrogen)的水或是生理盐水。
可冷冻保存本发明的间叶干细胞，其是将细胞冷冻保存于溶液中，如保存于最终浓度不超过10％的二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶液中。也可将细胞冷冻保存于含有二甲基亚砜和/或葡萄聚糖(dextran)的溶液中。其他冷冻保存细胞的方法也是本领域熟练技术人员所熟知。
本发明提供一种治疗患者的方法，此方法包括对患者使用有效治疗剂量的本发明间叶干细胞。所述的“有效治疗剂量(therapeutically effectiveamount)”是指能有效降低疾病症状的间叶干细胞剂量，或是能有效维持或增加患者体内从该间叶干细胞所衍生出的细胞数目的剂量。
所述的患者是定义为任何需要接受间叶干细胞的治疗的人。本发明的间叶干细胞可用来治疗因受伤而需要更换或再生组织的任何种类的外伤伤口。这类的外伤状况包括中枢神经系统伤害(CNS)，如脑部、脊髓、中枢神经周围组织至周边神经系统(PNS)或是身体任何部位的伤害。这类外伤可能是由意外事故或是由正常或不正常的医疗程序所造成，例如手术或血管扩张术所产生的外伤。这类外伤可能与血管破裂或血管阻塞有关，例如中风或静脉炎。在一些特殊较佳实施例中，将这些细胞用于自体组织或异体组织置换或再生的治疗或程序中，包括用于角膜上皮缺损治疗(corneal epithelial defect)、软骨修复、颜面磨皮术(facial dermabrasion)、口鼻黏膜(mucosal membrane)、鼓膜、肠道内衬组织(intestinal lining)、神经结构(如视网膜、基底膜中的听觉神经、嗅觉上皮中的嗅觉神经)、皮肤的烧伤或创伤修复，或是用来重建其他受创或患病的器官或组织，且这些细胞的用途并不仅限于此。此外损伤也可能由特殊情况或疾病所造成，包括心肌梗塞、癫痫、多发性硬化症、中风、低血压、心跳停止、再灌注损伤、发炎反应、因老化所造成认知能力退化、放射线伤害、脑性麻痹、神经退化性疾病、阿兹海默症(Alzheimer’s disease)、帕金森氏症(Parkinson’s diease)、脑脊髓病变(Leigh’s disease)、爱滋病痴呆综合症、丧失记忆、肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、缺血性肾脏病、脑部或脊髓损伤、心肺绕道手术、青光眼、视网膜再灌注损伤、视网膜外伤、先天性代谢疾病、肾上腺脑白质退化症、纤维囊肿、肝糖储积症、甲状腺功能低下症、镰刀型血球贫血症、皮尔森氏症(Pearson syndrome)、庞氏症(Pompe’s disease)、苯酮尿症(PKU)、紫质症、枫糖尿症、高胱胺酸尿症、黏聚糖疾病(mucoplysaccharide nosis)、慢性肉芽肿以及酪胺酸血症、癌症、肿瘤或其他病理或恶性赘瘤等症状。
用于治疗中的间叶干细胞也可含有有效剂量的核酸载体(nucleic acidvector)或生物载体，以指挥患者体内指定基因的表达。传统重组核酸载体的构建与表达方法均为本领域熟练技术人员所熟悉，且该些方法包括那些记载于由Sambrook等人所编着的“Molecular CloningA Laboratory Manual，Vols1-3(2d ed.1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press”中的相关技术。上述核酸载体可包含在生物载体内，例如病毒与细菌，尤以包含在非致病性或减活微生物中为佳，其包括减活后的病毒、细菌、寄生虫以及类病毒粒子。
可利用体外基因治疗方法(ex vivo gene therapy protocol)将上述核酸载体或生物载体导入细胞中，该方法包括从患者身体中切除细胞或组织、将核酸载体或生物载体导入切出的细胞或组织中、以及将切出的细胞重新植回患者体内(请参考Culver等，Hum.Gene Ther.1399-410，1990；Kasid等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87473-477，1990)。可利用如磷酸钙媒介转染法(calcium phosphate-mediated transfection)来将核酸载体或生物载体导入切出的细胞或组织中。也可使用其他方法将核酸载体导入宿主细胞中，例如电穿孔法(electroporation)(Neumann等，EMBO J.1841-845，1982)。
本发明的细胞也可配合其他药剂共同使用，例如其他种类的细胞、生长因子与抗生素。其他药剂的种类可由本领域熟练技术人员决定。
应理解，在实施例或其它内容中所显示的成分用量、反应条件等数字或是本申请说明书内容所使用的数字均为大约数值。因此，除非文中特别注明，本说明书的上述数字参数均为近似值，其可根据所需获得的本发明的结果而加以变化。并且，这些参数并非用来限定与本发明权利要求均等的原理，而是应用正常操作技术下所得到的较佳数据。
虽然上述用来指出本发明的最大范围的数据范围及参数均为近似值，但上述特定较佳实施例中所记述的数据值已尽可能地精准。然而各个测量实验均有其标准偏差，因此任何数据值必然有部分误差。
应理解，如果没有特别于上下文中清楚记述的其他意义，则说明书内容及后附权利要求中所使用的如“一(“a”或“an”)”与“该(the)”等特定用语均包含其复数形态。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅做示范之用。
在本申请书中所提到的所有参考文献均全体纳入参考，以揭示并叙述该文献所记载的相关方法和/或材料。此外，文中所讨论的文献仅揭示本发明申请日前的现有技术。并且没有任何文献显示本发明内容曾被现有技术所揭示。本发明内容所得到的实际数据会因个别的实施条件而与本发明揭示于说明书内容中的数据有所不同。
各种实施本发明的方法技术和/或实验程序(统称“方法”)包含任何可达成相同目的的现有方法，但不能限定为本说明书的特定的方法示例。此外，虽已在说明书的特定内容中叙述部分方法，但是这些方法是用于示范本发明，并非用来限定本发明的内容。
以下通过数个较佳实施例来说明本发明，并非用于限定本发明。
实施例以下将通过实施例来阐述本发明，以帮助本领域熟练技术人员实施本发明。应理解，所揭示的实施例仅用于阐述本发明，本发明的范围并不局限于所揭示的这些实例。
实施例1在涂覆有细胞外基质的组织培养皿上培养间叶干细胞1.1间叶干细胞的分离与培养1.1.1自人骨髓液中分离及培养人间叶干细胞(BMSC)将人骨髓液(获自Cambrex Inc.Lot No.0313557)置于37℃的水浴下解冻，并将解冻后的溶液转移到离心管中。于10至15分钟的期间内，一滴滴地加入50毫升的培养基至该离心管中。以200×g的速度离心15分钟，使细胞沉淀，并再次重新悬浮在15毫升的培养基中。重复上述离心步骤一次，计算所获得的间叶干细胞(BMSC)数目并将其培养在添加了20％胎牛血清的α-MEM基质中(购自Gibco，Cat.No.12571-063)，将细胞置于37℃、5％CO2及饱和湿度的环境中培养7到10天。用培养基冲洗数次，将未粘附于培养皿的细胞去除。然后，用0.25％胰蛋白酶-1mM EDTA(Gibco)溶液于37℃下进行酵素处理约5分钟，以收取细胞，并以50个细胞/平方厘米的密度将细胞重新培养在180平方厘米的组织培养瓶(Falcon)中。经过8天，再次以胰蛋白酶/EDTA溶液收取第2代的细胞，以1×106个细胞/毫升的密度将细胞重新悬浮在10％DMSO/90％FBS中，并储存在1毫升的小管中，置于液态氮中保存，直到要用时再解冻。
1.1.2从人脐带血中分离及培养人间叶干细胞(CB-MSC)新鲜的脐带是取自产后妇女的胎盘，用针筒抽出脐带血并用2,000rpm的速度离心20分钟。取出少量离心后的上层的浆溶液检验爱滋病毒(HIV)及B型肝炎病毒(HBV)等病源的感染情况，以确定细胞自身无病源污染。将该上层浆溶液倒掉，小心地取出中层部分并转移至另一离心管内，混入相同体积的添加有2mM的EDTA的磷酸盐缓冲液(D-PBS/2mM EDTA)。用Ficoll(购自Amersham Biosciences，Cat.No.17-1440-02)密度梯度在2,000rpm的速度下离心40分钟，然后用D-PBS/2mMEDTA溶液清洗1次，再次用1,000rpm的速度离心5分钟。重复上述的清洗动作数次，或进一步用溶解缓冲液(包含150mM的氯化氨及10mM的碳酸氢钠)处理，直到看不到红血球为止。将所获得的间叶干细胞(CB-MSC)重新悬浮在α-MEM基质中并与冷冻基质(其包括5％DMSO、30％FBS及65％的α-MEM基质)混合，储存在-80℃的液态氮中，直到要用时再解冻。
1.2制备涂覆有细胞外基质的培养皿1.2.1涂覆有Stematrix的培养皿在37℃下，用10μg/ml的C-型丝裂霉素(mitomycin C)来处理人包皮纤维母细胞(可购自台湾动物研究所，Lot No.881122-02-F(HSF)或购自American TypeCell culture，ATCCNo.SCRC-1041TM的细胞株HFF-1(HFF))约3小时，然后用6×105个细胞/毫升的密度将细胞培养在直径3厘米、事先已涂覆有1％明胶的培养皿上。制备ECM时，先用PBS清洗细胞两次，然后用0.05N的氢氧化钠溶液将细胞溶解约1-2分钟，并再次用PBS冲洗3次。所制备而成的人包皮纤维母细胞的细胞外基质在此称为“Stematrix”，并可立即用来培养细胞或是可保存在4℃的PBS中，长达6个月。
1.2.2涂覆有人胎盘ECM的培养皿将人胎盘的ECM(可购自BD Pharmingen，cat.No.354237)于4℃下溶解，并用冰冷的α-MEM基质加以稀释直到其最终浓度为25μg/ml为止。在培养皿上涂覆上该已稀释好的人胎盘的ECM，每个直径3厘米的培养皿的用量约为1毫升。让有涂层的培养皿在室温下静置2小时，然后以α-MEM清洗两次，即可使用。
1.2.3涂覆有MatrigelTM的培养皿将MatrigelTM(可购自BD Pharmingen，cat.No.354234)于4℃下溶解，并以冰冷的α-MEM基质加以稀释直到其最终浓度为25μg/ml为止。在培养皿上涂覆上该已稀释好的MatrigelTM，每一直径3厘米的培养皿的用量约为1毫升。让有涂层的培养皿在室温下静置2小时，然后以α-MEM清洗两次，即可使用。
1.2.4涂覆有小鼠ECM的培养皿根据Robertson所揭示的方法(Robertson E.J.(1987)Embryo-derived stemcell line.Chapter 4 in“Teratocarcinoma and Embryonic Stem CellsAPractical approach”，IRL Press，Oxford，Washington DC，p77-78)，从13天大、129sv×129sv株的小鼠胚胎中分离出小鼠纤维母细胞。在37℃下，先以10μg/ml的C-型丝裂霉素(mitomycin C)来处理该纤维母细胞约2.5小时，然后以7×105个细胞/毫升的密度将细胞培养在直径3厘米、事先已涂覆有1％明胶的培养皿上。制备ECM时，先以PBS清洗细胞两次，然后以0.05N的氢氧化钠溶液将细胞溶解约1-2分钟，并再次以PBS冲洗3次。所制备而成的小鼠胚胎纤维母细胞的细胞外基质在此称为“mECM”，并可立即用来培养细胞或是可保存在4℃的PBS中，长达6个月。
1.2.5涂覆有牛角膜内皮细胞ECM的培养皿根据Matsubara等人及Gospodarowicz等人所揭示的方法(Matsubara等，Biochem.Biohys.Res.Comm.313503-508，2004 and Gospodarowicz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(7)4494-4098，1980)，将牛角膜内皮细胞(bovinecorneal endothelial cells，购自台湾动物研究所，Lot No.60044)在37℃下以2×104个细胞/毫升的密度培养在含有培养液A(DMEM-Ham’s F12(1∶1)、10％胎牛血清及抗生素(100u/ml青霉素G及100μg/ml链霉素))、直径6厘米的培养皿上。待细胞长满后，将培养液换成培养液B(培养液A再添加5％右旋糖苷(200,000道尔顿，购自Wako，Japan))并继续培养7天。制备ECM时，先以PBS清洗细胞两次，然后以0.5％Triton X-100(在PBS中)溶液于室温处理细胞约30分钟，并再次以PBS冲洗3次。所制备而成的牛角膜内皮细胞的细胞外基质在此称为“bECM”，并可立即用来培养细胞或是可保存在4℃的PBS中，长达2个月。
1.3在涂覆有ECM的培养皿上培养人间叶干细胞将根据实施例1.1所揭示的方法分离并培养的人间叶干细胞(包括BMSC及CB-MSC两种细胞)，以低密度(50个细胞/毫升)方式培养在根据实施例1.2所制备出来的培养皿上。每隔2到3天更换一次培养基，在37℃、5％CO2及饱和湿度中培养7天。经过一周后，以0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液将细胞收取下来。计算过细胞数目后，即可将该些细胞用于分析试验中(包括测量细胞长度和/或细胞表面标记)或是以上述相同的培养条件再次培养细胞。无论是BMSC或是CB-MSC，均可连续培养至少8代或9代。
实施例2实施例1.3的间叶干细胞的分析2.1实施例1.3的BMSC或CB-MSC的增殖试验图1显示根据实施例1.3所揭示方法培养而成的BMSC(图1A)或是CB-MSC(图1B)的细胞数目。与对照组(也即，培养在无涂覆ECM的正常培养皿上)及培养在其他细胞基质上的细胞相比，结果显示培养在Stematrix上的细胞，其细胞数目明显较多，表示本发明方法确实可提高间叶干细胞增殖的能力。具体而言，对培养在Stematrix上的间叶干细胞来说，第9代(P2+7)BMSC的细胞数目约为对照组细胞数目的30至95倍(图1A)；第10代(P3+7)CB-MSC的细胞数目则约为对照组细胞数目的1,400至1,800倍(图1B)；另外，第9代(P2+7)BMSC的细胞数目约为bECM组细胞数目的3至10倍(图1A)，显示出本发明的方法对于间叶干细胞的生长繁殖略优于上述日本公开专利第2003-052360号及Matsubara等人(Matsubara等，Biochem.Biohys.Res.Comm.313503-508，2004)所揭示方法中在牛角膜内皮细胞的细胞外基质上培养干细胞的效果。
2.2实施例1.3的BMSC或CB-MSC的未分化试验图2证实根据本发明方法培养出来的BMSC或是CB-MSC细胞，即使到了第9或第10代，大部分细胞仍保持在可快速自我更新的细胞(rapidly self-renewingcells，RS cells)的状态，此种细胞的特征为细胞形态较小，并具有较佳的分化能力(Sekiya等，Stem Cells，20530-541，2002)。以倒立式显微镜(Nikon，EclipseTS100)在放大100倍的情况下，用肉眼观察并测量细胞在长轴方向上的细胞长度，并用电脑进行后续数据分析。分别在所撷选的影像中为每一培养条件随机挑选出30个细胞进行分析。具体而言，培养在Stematrix上的细胞，无论是第9代(P2+7)的BMSC(图2A)或是第10代(P3+7)的CB-MSC细胞(图2B)，其细胞长度约为对照组细胞(也即，培养在无涂覆ECM的正常培养皿上的细胞)的细胞长度的43％至55％(p＜0.001，t测试)；此结果显示维持在人包皮纤维母细胞的细胞外基质环境中的间叶干细胞，可保持小型细胞(即为RS cells)状态至少直到第9或10代。更详细地说，培养在对照组、Stematrix(HFF)、Stematrix(HSF)、bECM、mECM、MatrigelTM及胎盘ECM上的BMSC的细胞长度分别为163.9±51.7μm、71.0±26.7μm、90.5±29.7μm、118.4±39.7μm、131.7±46.6μm、170.3±84.0μm及153.3±58.5μm(参见图2A中的插入表格)。培养在控制基质、Stematrix(HFF)、Stematrix(HSF)、mECM、MatrigelTM及胎盘ECM上的CB-MSC的细胞长度分别为142.1±47.9μm、76.7±20.7μm、71.0±14.1μm、79.3±16.8μm、120.4±55.5μm及114.7±68.8μm(参见图2B中的插入表格)。此外，也可发现分离自人包皮纤维母细胞的ECM比其他来源的ECM，例如胎盘或小鼠胚胎等，更能保持间叶细胞处于未分化的状态，详见实施例2.3。
2.3实施例1.3的BMSC或CB-MSC的免疫分析试验利用流式细胞仪或免疫化学染色法来分析根据实施例1.3所述方法而获得的人间叶干细胞的细胞表面标记。简而言之，用胰蛋白酶将细胞收取下来的后，经PBS清洗后，用藻红素(phycoerytherin，PE)-共轭的干细胞抗体CD29或CD90/Thy-1染色，将其在冰上培养约30分钟；在某些情况下，即是与干细胞抗体CD31或CD105一同在冰上培养约30分钟；清洗后，用FITC-共轭的山羊抗-小鼠IgG抗体染色并在冰上培养约30分钟。在FACScan流式细胞仪上用CellQuest软件(Becton Dickinson)进行分析。详情参见以下网址http://www.bdbiosciences.com/pharmingen/protocols/Lysed_Whole_Blood_Method.shtml。
图3显示用流式细胞仪分别分析根据实施例1.3所述方法获得的第8代或第9代的BMSC(图A)或是CB-MSC(图B)的细胞表面标记。与培养在一般培养皿上的细胞(对照组)、及培养在来自胎盘的ECM与mECM上的细胞相比，可看出有显著比例的培养在Stematrix上的细胞，可表达CD29、CD90/Thy-1及CD105。
表1表示不同代的BMSC或是CB-MSC的细胞表面标记的量化数据。随着细胞代数增加，例如，高达第8代(或P2+6)或第9代(或P3+6)，培养在MatrigelTM、分离自胎盘的ECM及mECM上的染色细胞数目也从约90％降低至30-40％；在mECM的情况中，该染色细胞数目更低至10％以下。但是，可发现培养在Stematrix上的染色细胞数目一直维持在80-90％的范围内。
表1
-未测定2.4实施例1.3的BMSC或CB-MSC的分化试验大致根据Shih等人所揭示的方法(Shih等Stem Cells 23(7)1012-1020，2005)来诱发BMSC的体外分化。并根据Matsubara等人所揭示的方法(Matsubara等，Biochem.Biophys.Res.Comm.313503-508，2004)，以RT-PCR来分析软骨细胞(第X型及第II型胶原蛋白)、硬骨细胞(OP及OC)及脂肪细胞(PPARγ2)的基因表达量。
图4表示以RT-PCR法测出的第4代(P2+2)及第8代(P2+6)BMSC的软骨(图A)、硬骨(图B)及脂肪(图C)基因的表达量。结果显示培养在涂覆有Stematrix的培养皿上的BMSC的基因表达量不是比对照组(即，培养在不含ECM环境中的细胞)高，就是与对照组至少一样高。在此试验中，以β-肌动蛋白作为RT-PCR分析法中的内部对照组。结果显示，根据本发明较佳实施例培养出来的间叶干细胞，在经过至少8代的培养后，或是在ECM上至少6代的培养后，仍然保有有限潜能性(multipotent)，也即，可分化成多种或特定细胞的能力。
说明书中所引用的参考资料均清楚记载，并在此处将其全文纳入作为参考。本说明书内的较佳实施例仅用于说明本发明的较佳实施例，而非用于限制本发明范围。本领域熟练技术人员应理解，本发明还涵盖多种其他较佳实施例，且说明书与实施例用于示范，其实际精神与范围当由所附权利要求所界定。
权利要求
1.一种人间叶干细胞的增殖方法，其特征在于，所述方法包含将所述人间叶干细胞培养在含有分离自人纤维母细胞的细胞外基质的环境中。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人间叶干细胞分离自人脐带血或人骨髓液。
3.一种人间叶干细胞的增殖方法，其特征在于，包含从产后脐带取得脐带血；从所述脐带血中制备出单核细胞的单细胞悬浮液；获得人间叶干细胞；以及将所述人间叶干细胞培养在含有分离自人纤维母细胞的细胞外基质的环境中。
4.一种人间叶干细胞的增殖方法，其特征在于，包含取得人骨髓液；从所述人骨髓液中制备单核细胞的单细胞悬浮液；获得人间叶干细胞；以及将所述人间叶干细胞培养在含有分离自人纤维母细胞的细胞外基质的环境中。
5.如权利要求1、3或4中任一项所述的方法，其特征在于，至少76％的人间叶干细胞在经过至少8代的培养后仍保持在实质未分化的状态。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述未分化的间叶干细胞的特征为a.对至少一种选自由CD29、CD44、CD90/Thy-1、CD105、CD166、stro-1、SH2、SH3、SH4和波形蛋白组成的群组中的细胞标记的测试呈阳性反应；b.对至少一种选自由CD31、CD34及CD45组成的群组中的细胞标记的测试呈阴性反应。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述未分化的间叶干细胞为有限潜能型。
8.如权利要求1、3或4中任一项所述的方法，其特征在于，所述人纤维母细胞是初代分离细胞或是不老化细胞株。
9.如权利要求1、3或4中任一项所述的方法，其特征在于，还包含添加纤维母细胞生长因子至培养基中的步骤。
10.如权利要求1、3或4中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞外基质是以如下步骤制备培养纤维母细胞、用碱性溶液将所培养的纤维母细胞溶解、及用大量缓冲液冲洗溶解后剩余的细胞外基质部分。
11.一种分离的、均质的有限潜能型人间叶干细胞群，其特征在于，所述细胞群是用如权利要求1、3或4中任一项所述的方法制备而成的。
12.一种冷冻保存的人间叶干细胞，其特征在于，是用如权利要求11所述的细胞制备而成的。
13.一种用于支持人间叶干细胞的生长、维持其未分化状态或提高其分化能力的系统，其特征在于，包含涂覆有分离自人纤维母细胞的ECM的支持物；及分离的人间叶干细胞；其中所培养的所述干细胞具有下列特征a.在所述培养的干细胞中，至少76％的干细胞在经过至少8或9代的培养后仍维持在未分化状态；及b.对至少一种选自由CD29、CD44、CD90/Thy-1、CD105、CD166、stro-1、SH2、SH3、SH4及波形蛋白所组成的细胞标记测试呈阳性反应，及对至少一种选自由CD31、CD34、及CD45所组成的细胞标记测试呈阴性反应。
14.如权利要求13所述的系统，其特征在于，所述人间叶干细胞分离自人脐带血或人骨髓液。
15.如权利要求13所述的系统，其特征在于，所述人纤维母细胞为初代分离细胞或是不老化细胞株。
16.如权利要求13所述的系统，其特征在于，还包含添加一种纤维母细胞生长因子至培养基的步骤。
17.如权利要求13所述的系统，其特征在于，所述细胞外基质以如下步骤制备培养纤维母细胞、用碱性溶液将所培养的纤维母细胞溶解、及用大量缓冲液冲洗溶解后剩余的细胞外基质部分。
18.如权利要求13所述的系统，其特征在于，这些未分化的间叶干细胞为有限潜能型。
19.一种药学组合物，其特征在于，包含如权利要求11或12所述的人间叶干细胞。
全文摘要
本发明揭示一种获自人脐带血和/或人骨髓液的人间叶干细胞的增殖方法，其包含将这些人间叶干细胞培养在含有分离自人纤维母细胞的细胞外基质的环境中。
文档编号A61K35/12GK1986781SQ20051013615
公开日2007年6月27日 申请日期2005年12月20日 优先权日2005年12月20日
发明者林佩如, 吴贞仪, 林会娣, 陈婉昕 申请人:财团法人工业技术研究院