专利名称：石斛在制备治疗骨疾病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于天然药物技术领域，涉及石斛的药学开发利用，更确切地说，是石斛或其提取物在制备治疗骨疾病药物中的应用。
背景技术：
骨组织是硬结缔组织，主要包括三种细胞(成骨细胞，骨细胞和破骨细胞)以及细胞外基质。这些细胞分泌胶原纤维，非胶原纤维蛋白及调节因子。细胞外基质则是以钙和磷酸盐为主。骨组织的生长，发育，代谢和衰老表现为骨量的增加或减少。通过骨吸收和骨重建使骨骼处于一种动态的平衡。这种动态平衡即是由于正常衰老和创伤导致的有缺陷骨进行更新时所必需的，也是维持成年人骨骼良好的完整性和承重性所必需的。这个过程是通过破骨细胞和成骨细胞来共同完成的。
目前临床上治疗骨质疏松症的药物主要为抑制破骨细胞活性的物质，通过阻滞骨吸收来达到减少骨量丢失的目的的。然而，在需要新骨生成的情况下仅仅抑制骨吸收是不够的，必须通过刺激骨生成来达到增加骨量的目的。
Urist在60年代通过同种异体脱钙骨基质异位诱导成骨的研究发现骨基质中含有一种活性蛋白质，具有使未分化的间充质细胞定向分化为软骨和骨的功能，因此命名为骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic proteins，BMPs)。
骨形态发生蛋白(简称BMP)家族到目前为止已有40多个成员，它们是转化生长因子β(Transforming growth factorβ；简称TGFβ)超家族的成员。BMPs，尤其是研究比较透彻的BMP-2在诱导骨形成和成骨细胞分化过程中起着重要的作用。BMP-2在成骨细胞分化过程中既是自分泌调节因子也是旁分泌调节因子。BMP-2刺激成骨细胞分化的主要机制是首先通过I型和II型BMP受体的磷酸化，进而磷酸化Smad1，磷酸化了的Smad1(MAD homolog 1)与Smad4结合后入核，入核后的Smad1/4复合体与cbfa1(Core binding factor alpha 1)结合，整个复合物与成骨特异性的标志基因上的SBE(Smad binding element，即Smad结合元件)结合，启动下游成骨特异性的标志基因的表达，从而激活成骨细胞。Smad结合元件是在1997年发现的，当时Kim等通过对果蝇的研究第一次报道了Smad1，5可以直接和DNA结合，其结合序列被确定为GCCGnCGC，即SBE元件。在后来的研究中发现，大量的受BMP信号调控的骨发育相关基因，如成骨细胞特异性转录调节因子Runx2、骨钙素(Osteocalcin)等，在其启动子上均具有SBE反应元件。
石斛属(Dendrobium)为兰科第二大属，多年生草本植物。石斛作为一种名贵天然药物在《本草纲目》中就被收录，在《神农本草经》中列为上品，具有益胃生津，滋阴清热、明目利嗓等作用。《中华人民共和国药典》将其定义为益胃生津，滋阴清热。主要用于阴伤津亏，口干烦躁，食少干呕，病后虚热，目暗不明。传统医学认为，石斛具有益胃生津的作用，现代药理研究也证明，石斛对于消化系统疾病有治疗作用。近年来对石斛的药理研究和应用，除集中在对胃肠道的作用研究以外，国内外学者对石斛增强机体免疫力作用，抗肿瘤作用，治疗白内障作用，降血糖作用和抗血小板聚集作用等都有过不同的文献报道。但尚未见单味的天然药物石斛粉、石斛水提取物、石斛多糖成分用于治疗和/或预防骨疾病的文献报道，鉴于此，本发明人通过分子生物学的研究发现单味天然药物石斛、石斛水提取物、石斛多糖成分等等在治疗骨疾病药物中显示出极高的药理活性。
发明内容
本发明的一个目的是提供了石斛在制备治疗和/或预防骨疾病药物中的应用。
本发明进一步提供了石斛在制备治疗和/或预防骨质疏松药物中的应用。
本发明更进一步提供了石斛在制备治疗骨折和骨裂药物中的应用。
本发明更加进一步提供了石斛在制备促进骨中移植物的固定的药物中的应用。促进骨中移植物的固定包括如促进牙科植入物的骨整合。
本发明所述的石斛可以制成用于人的药物制剂，也可以制备成各种动物应用的兽药。
本发明同时公开了以单味天然药物石斛或其提取成分制成的制剂，以及在该单味药或其提取成分的基础上添加其它药物和/或载体组成的制剂在制备防治骨病药物中的应用。石斛或其提取成分可以通过激活BMP信号传导途径来刺激成骨细胞，特异性地促进新骨形成。表明该药及其有效成分可用于需要补充新骨生成的各种场合。石斛或其提取成分可以全身或局部用药，预防和治疗骨质疏松症；治疗骨质疏松性骨折及其他各类骨折，显著提高骨折和骨裂的修复率。并且可以用于改善各种矫形装置和牙科植入物的外科手术效果，它们不仅可以刺激骨骼生长以及移植物的固化，并且可以相对减少移植物或人工牙齿在植入位置生长所需的时间。
本发明的所述的天然药物石斛包括石斛粉(石斛原生粉)、石斛水提取物、石斛多糖等。2005年版药典介绍石斛的炮制方法为干品除去残根，洗净，切段，干燥即得石斛。
石斛水提取物一般按常规方法取石斛细粉，加入适量的水，浸泡2小时，然后水煮约1个小时。冷却至室温后，将提取液离心，提取后的残渣再用水煮，冷却后离心，合并两次上清液，浓缩，得石斛水提取物。
石斛多糖成分的提取将石斛粉末加石油醚回流提取，然后以80％乙醇回流提取，再加蒸馏水回流提取，醇沉，静置过夜，得石斛多糖。
本发明的另一个目的是提供了一种药物组合物，按常规制剂工艺可以将本发明所述的石斛粉或其水提取物或石斛多糖和一种或多种药学上可接受的组分和/或载体结合组成组合物。
本发明所述可接受的组分包括如雌激素、二膦酸盐、降钙素和活性VitD代谢物等。
本发明所述组合物包括口服制剂，如片剂、颗粒剂、分散颗粒、胶囊、缓释片、缓释微丸等；非胃肠道给药制剂液体剂型如溶剂、悬浮液、注射剂、输液剂、粉剂制剂等；局部给药制剂凝胶剂、软膏剂、乳膏剂、糊剂、贴剂等；其它药学上可接受的制剂。
具体的说，固体载体可以是至少一种物质，例如填充剂(如甘露醇、乳糖、聚乙二醇)，粘合剂(淀粉、微晶纤维素)，崩解剂(如羧甲基纤维素、低取代的羟丙基纤维素)，润滑剂(如滑石粉、硬脂酸镁)，湿润剂(如丙二醇、乙醇)，抗氧剂(如焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠)，防腐剂(苯甲醇)，稳定剂(EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、乙醇胺、碳酸氢钠)等。惰性固体载体包括磷酸镁、硬脂酸镁、滑粉糖、乳糖、果胶、聚山梨酯80、糊精、淀粉、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、甘露醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、卡波姆940、羟丙基-β-环糊精、吐温-80、丙二醇、氮酮等。
本发明的组合物在相当宽的剂量范围内是有效的。例如每天服用的剂量可在每公斤体重大约100mg-200mg干生药或相当于100mg-200mg干生药提取物的范围内。在成人的治疗中，剂量最好是在150mg干生药/公斤体重或相当于150mg干生药提取物/公斤体重。实际服用的剂量应该由医生根据有关的情况来决定，这些情况包括被治疗者的身体状态，选者的给药途径、年龄、体重、患者对药物的个体反应，患者症状的严重程度等等，因此上述剂量范围并不是以任何方式限制本发明的范围。
下面通过动物实验及临床疗效实验进一步阐述本发明的积极效果一、石斛刺激骨生成的分子生物学机理是激活骨形态发生蛋白信号通路为了证实天然药物石斛刺激新骨生成的机理，本发明人构建了一种带有SBE检测序列的荧光素酶报导基因克隆细胞株。可以通过检测培养细胞中荧光素酶表达强度的变化，确定加入培养基中的待筛选物质是否具有激活骨形态发生蛋白信号通路的作用。也就是说，凡是可以激活骨形态发生蛋白的信号通路的待筛选物质，均具有提高成骨细胞活性和刺激新骨生成的作用。
具体方式如下，将带有SBE(Smad1 binding element)序列与骨钙素(Osteocalcin)启动子的DNA片段克隆到pGL3-basic报告基因表达载体上，用这个报告基因表达载体稳定转染了一个鼠的成纤维细胞系OCT-1，构建了一个高效检测BMP信号通路的模型。
向含有所构建的克隆细胞株的培养基中加入石斛水提取液或石斛多糖溶液(相当于0.15克生药/kg体重)，培养24-48小时后将细胞消化，测量荧光素酶的活性。发现荧光素酶的表达有显著地提高，说明石斛的有效成份可以促进成骨细胞的活性，进而达到促进新骨形成的效果。表1为加入天然药物石斛水提取液后后荧光素酶活性与对照组荧光素酶活性的比较。表2加入天然药物石斛多糖后荧光素酶活性与对照组荧光素酶活性的比较。
表1 加入石斛水提取液后荧光素酶活性的比较
表2 加入石斛多糖后荧光素酶活性的比较荧光素酶活性的检测方法荧光素酶分析使用Promega公司生产的LuciferaseReporter Assay System，具体方法为使用细胞裂解液收集待测细胞蛋白，离心除去细胞碎片，将上清液与试剂盒提供的荧光素酶反应底物混合进行反应，并同时于化学发光检测仪(TR717 Microplate Luminometer，TROPIX Co.)中读取数据。
如上表1结果显示，加入天然药物石斛水提取液后，实验组与阴性对照组相比荧光素酶活性大约升高了2.6倍。这说明了天然药物石斛水提取液可以显著地促进成骨细胞的活性，也就是说可以促进新骨的生成。
如上表2结果显示，加入多糖溶液后，实验组与阴性对照组相比荧光素酶活性大约升高了4倍。这也就说明了天然药物石斛的多糖组分是天然药物石斛中可以促进成骨细胞的活性的主要成分。
二、石斛的药效学动物实验及结果1、小鼠颅骨部位的头皮下局部用药取体重为20-25克的昆明小鼠，分别在头骨枕部的皮下注射相当于0.1g干生药/公斤体重石斛多糖溶液，隔日一次，共6次，对照组用等量的生理盐水。停药一周后，采用选择剂量为50mA，50kV，0.05s的X光拍片，结果如图1药物注射小鼠的颅骨骨密度较对照鼠的颅骨骨密度有明显增加。
停药二周后将小鼠处死，取顶骨浸泡于14％的EDTA中置37℃温箱5天脱钙，然后分别选用70％乙醇30min；80％乙醇30min；85％乙醇30min；90％乙醇30min；95％乙醇30min；100％乙醇20min，10min脱水，石蜡包埋后切片，HE染色，在400倍光镜下观察。从颅骨的脱钙骨组织切片中，可以看到成骨细胞增生活跃的实验结果。
2、石斛制备骨缺损复合物填充试验如下制备兔同种异体颗粒骨直径为0.5-1.0mm，60钴消毒后备用。
制备骨缺损填充复合物按每150mg同种异体颗粒骨加入200mg的石斛多糖溶液和0.1ml纤维蛋白胶混合液，使复合物具有一定的黏度和强度，再以直径为4mm，长为1.5cm的圆柱状塑形器塑形，置于无菌环境下备用。
对兔实施3％戊巴比妥(30/mg/kg)耳缘静脉麻醉，麻醉生效后，平卧固定在手术台上。双前肢除毛备皮，消毒手术区，铺单。取前臂挠背偏内侧切口约4cm至挠骨骨干，剥离骨膜，以线锯截取挠骨中上1/3处长约1.5cm的挠骨，造成骨缺损，用骨锉锉平骨折断端，冲洗创面，彻底清除骨碎片后，依次分组植入下列不同的混合物，检查创面无明显出血后，逐层缝合，术毕。
表3石斛制备骨缺损复合物填充试验中各组动物植入混合物的对比实验结果术后常规饲养，2周后在X光下观察显示，用药物组在骨缺损部位的显影较对照组增强，显示有刺激新骨生长的迹象。实验尚在进一步的观察中。
三、石斛或其提取物制成的组合物临床疗效观察鉴于石斛为天然药物常用药，我们曾试用于两例知情自愿受试者，其治疗效果显著。两例年龄分别为50和82岁的女性患者，患有骨质疏松症合并骨折。按药典规定的常规剂量口服含石斛水提取液制成的制剂，六周后骨折均已初步愈合。显示口服石斛可以促进骨质疏松症合并的骨折愈合。
四、本发明的石斛及其提取物与现有的用于治疗骨疾病的中西药物相比具有下述特点1、以往治疗骨质疏松症的药物多为抑制破骨细胞活性的药物，而本发明发现的天然药物及其有效成分能有效刺激成骨细胞活性，因此本发明可应用在需要有新骨生成的各种治疗场合。
2、本发明为单味天然药物或其提取物，药物作用机理明确，疗效确切，毒副作用小，临床用药安全有效。
图1为用药组与对照组小鼠骨密度比较图；图2为用药组与对照组小鼠骨细胞的增生情况比较，1为石斛水提取物注射小鼠，2为石斛多糖注射小鼠，3为对照组小鼠。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步的说明，实施例仅为解释性的，决不意味着它以任何方式限制本发明的范围。
实施例1石斛水提取物的制备取200g石斛粉末，用2500ml水煮，约1个小时。冷却至室温后，将提取液离心，提取后的残渣再用水煮，冷却后离心，合并两次上清液，制得石斛水提取物，浓缩。水提取物烘干备用。
实施例2石斛多糖的提取取石斛粉末220克，加石油醚1000ml，回流提取1小时，过滤，滤渣挥干溶媒。以80％乙醇1000ml回流提取1小时，过滤，滤渣置圆底烧瓶中，加蒸馏水3000ml，回流提取1小时，乘热过滤，减压浓缩至300ml，加入0.1％活性炭脱色，过滤，加入95％乙醇使溶液含醇80％，静置过夜，过滤。多糖烘干备用。
实施例3取石斛水提取物50.0g，药用淀粉30.0g，糊精30.0g，50％乙醇适量，将上述原料充分搅拌混合制成颗粒，在60～70℃干燥2～4小时，制成100片，每片含石斛水提取物0.5g。
实施例4取石斛水提取物25g，加微晶纤维素20g，乳糖55g，以10％PVP乙醇制粒，干燥，填充于胶囊，得胶囊剂，每粒胶囊石斛水提取物为250mg。
实施例5取石斛多糖5g，加适量纯化水溶解，取明胶1.0g，加水适量充分溶胀，60℃加热熔解(I)；取聚乙烯醇0.5g、聚乙烯吡咯烷酮1.0g、羧甲基纤维素钠0.5g加水适量，加热至60℃是熔解(II)；取甘油、丙二醇、白陶土混合均匀加热至60℃，加入I、II两相混合均匀，涂布于无纺布上，干燥得巴布剂，每片巴布剂含石斛多糖为0.5g。
实施例6取石斛多糖5g，加适量水溶解，加入羟丙基-β-环糊精3％，吐温-80 2％，丙二醇25％、乙醇25％、氮酮5％得凝胶剂，每ml凝胶含石斛多糖为1mg。
权利要求
1.石斛在制备治疗和/或预防骨疾病药物中的应用。
2.石斛在制备治疗和/或预防治疗骨质疏松药物中的应用。
3.石斛在制备治疗骨折和骨裂药物中的应用。
4.石斛在制备促进骨中移植物固定的药物中的应用。
5.如权利要求1-4所述的应用，其特征在于，所述的石斛包括石斛原生粉、石斛水提取物、石斛多糖。
6.如权利要求1-4所述的应用，其中，所述的药物可以是人药或兽药。
7.一种药物组合物，其特征在于，含治疗有效量的石斛原生粉或其水提取物或石斛多糖与一种或多种药学上可接受的组分和/或载体的组合。
8.如权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述的组合物包括口服制剂，非胃肠道给药制剂，局部给药制剂，及其它药学上可接受的制剂。
全文摘要
本发明涉及石斛在制备治疗和/或预防骨疾病药物中的应用。石斛或其有效提取成分可以通过激活骨形态发生蛋白信号传导途径来刺激成骨细胞，特异性地促进新骨形成。实验表明石斛及其有效成分可用于需要补充新骨生成的各种临床场合。石斛或其有效成分可以全身或局部用药，预防和治疗骨质疏松症，治疗骨质疏松性骨折及其他各类骨折，显著提高骨折和骨裂的修复率。石斛及其有效成分不仅可以刺激骨骼生长和促进移植物的固化，并且可以相对减少移植物或人工牙齿在植入位置生长所需的时间。
文档编号A61P19/00GK1919310SQ20051013600
公开日2007年2月28日 申请日期2005年12月28日 优先权日2005年12月28日
发明者朱天慧 申请人:南开大学, 天津瑞芯科技有限公司