专利名称：凝胶阻滞色谱柱上聚合制备窄分布低分子量聚合血红蛋白的方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域，涉及一种用凝胶阻滞色谱柱上聚合平均分子量小于200kD且分子量分布较窄聚合血红蛋白的制备方法。
背景技术：
输血是临床医学中一种安全可靠的疗法，尤其在急救医学中的作用是任何其他手段无法完全替代的。随着科学的发展，输血的用途越来越广泛，血液需求也日益增加。但实际应用时还存在着许多难题，如血源短缺，有效储存期短；输血前必须经过严格的血型鉴定和交叉配血试验，烦琐费时；同时输血过程可能发生不良反应和某些传染病的传播，如乙型、丙型肝炎，艾滋病等。随着人们对血液制品安全性要求的不断提高，血液代用品的研究越来越受到重视。尤其是基于血红蛋白的血液代用品不但可以替代血红细胞的携氧功能、储存方便，而且可以去除如AIDS、肝炎病毒等病原微生物。这些都预示着血红蛋白修饰物将有很好的市场需求。用它可以救治车祸等事故中大量失血的病人。尤其是在战争或其他灾难发生时，由于血红蛋白修饰物不存在血液配型问题，其干粉只需与生理盐水混合就可以直接输血，将挽救很多的生命。
血红蛋白由四个亚基(α1α2β1β2)组成，是红细胞中一种负责氧气传递的蛋白。由于其独特的氧结合特性、正常生理代谢途径等原因，以血红蛋白为基础的血液代用品非常符合人体的生理需要。与红细胞不同，由于聚合血红蛋白中没有膜蛋白、可以巴氏消毒，所以解决了输血治疗中存在的相关传染病等问题。同时，聚合血红蛋白可以在室温下长时间保存，突破了人血保存和运输条件要求较严，灾害和战伤抢救输血受到限制。然而，未经修饰聚合的血红蛋白不能作为血液代用品直接使用，这主要是因为(1)未经修饰的血红蛋白会失去2，3-二磷酸甘油酸的调节，使得血红蛋白对氧的结合力升高，不能向组织有效供氧。(2)未经聚合的血红蛋白会使血浆的胶体渗透压升高。(3)未经聚合的血红蛋白四聚体在体内的循环半衰期只有2～4小时，会迅速分解成二聚体和单体从肾脏滤过形成血尿。只进行分子内聚合的四聚体会进入血管的内皮细胞，与其中的NO结合引发血压升高、腹痛等副作用。
1975年Benesch等用5’-磷酸吡哆醛对血红蛋白的2，3-DPG空穴进行修饰，使P50提高至30mmHg以上。但这种修饰后的血红蛋白稳定性较差，可以用双官能团或多官能团的交联剂进行分子内和分子间的交联，生成多聚血红蛋白，以提高稳定性、降低胶体渗透压和携氧能力。目前最广泛使用的交联剂有戊二醛和开链棉子糖。
Northfield公司开发了戊二醛聚合磷酸吡哆醛人血红蛋白PolyHeme(US Patent No.6,552,173)。PolyHeme中四聚体血红蛋白浓度低于1％，有效地避免了肾毒性和四聚体血红蛋白和NO结合而引起副作用。PolyHeme的血红蛋白浓度为14g/dl，渗透压为20-25mmHg，P50为28-30mmHg[15]。这些指标均与全血相近。目前，该产品已进入III期临床试验。1998年，Biopure公司的戊二醛聚合牛血红蛋白HemopureTM经FDA批准进入III期临床试验(US Patent No.5,955,581)。牛血红蛋白的优点在于来源广泛，无需2，3-DPG的修饰就可以达到很大的P50值。HemopureTM中的浓度达13±1g/dl，高铁血红蛋白含量小于15％，P50为34mmHg，胶体渗透压为17mmHg，而粘度只有全血的三分之一。此外，Hemosol公司开发了开环棉籽糖聚合血红蛋白HemolinkTM。棉籽糖经高碘酸氧化得到含有6个醛基的开环棉籽糖(US Patent No.5,770,727)。开环棉籽糖的醛基可以与血红蛋白上的2，3-DPG结合空穴中的氨基进行特异性反应，也可以和Hb表面氨基进行非特异性反应。最终产物中约含40％分子内交联产物聚合血红蛋白(64kD)和60％的分子间交联产物(128kD-600kD)[17-18]。HemolinkTM中蛋白含量为10g/dl，P50为34mmHg，胶体渗透压为24mmHg。
戊二醛是一种同型双功能交联剂，它的两个醛基可以分别和两个相同或不同的氨基生产希夫碱。通常，戊二醛交联可以生成65-85％的聚合血红蛋白。但由于戊二醛的反应活性高、无特异性反应位点，所以其聚合产物分子量分布宽、平均分子量较大。尽管这种聚合血红蛋白分子的分子量分布不会改变它的载氧特性，但会降低血浆的胶体渗透压并增加粘度，进而影响其血液动力学特性。因此，FDA在回复Biopure公司戊二醛聚合牛血红蛋III期临床批文中明确要求降低平均分子量。此外，宽的分子量分布也会给后续的分离过程带来很大麻烦。因此，如何制备窄分布低分子量聚合血红蛋白降低其粘度和流动性就成为了该领域的研究的重点和难点。一种解决方法是用新型交联剂，如聚胺类交联剂等来制备分子量分布较窄的聚合血红蛋白。但是这些交联剂价格昂贵、分子量分布仍然较宽、需要进行大量毒理学评价，因而至今还没有一种产品进入临床研究。中国科学院北京过程研究所苏志国、胡涛创造性地提出了另一种解决方法(中国专利No.01136190.5)。其具体方法是将血红蛋白在pH＝7～9的环境下静态吸附于阴离子交换介质上用200～500倍戊二醛进行交联。最终得到分子量专一(128kD)的血红蛋白。但此方法也存在一些问题如阴离子交换介质的利用率低(0.5-4mg血红蛋白/ml固相)、使用高摩尔比的戊二醛会使血红蛋白过度修饰、使用不含氨基的HEPES缓冲体系价格昂贵等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种凝胶阻滞色谱柱上聚合制备窄分布低分子量聚合血红蛋白的方法，它是一种独有的聚合血红蛋白的制备方法。
本发明的技术方案一种凝胶阻滞色谱柱上聚合制备窄分布低分子量聚合血红蛋白的方法，其步骤包括(1)将天然血红蛋白进行化学修饰或预聚合；(2)将修饰或预聚合的血红蛋白充分脱氧后用泵加入凝胶阻滞色谱柱中平衡，然后分步加入双功能交联剂进行聚合反应，血红蛋白溶液浓度为1～100mg/ml，血红蛋白与双功能交联剂的摩尔比为1∶10～1∶50；(3)用缓冲溶液将步骤1生成的聚合产物洗脱、收集。收集液用甘氨酸或赖氨酸中止反应，戊二醛与甘氨酸(赖氨酸)的摩尔比为2～10∶1，反应时间1～3小时，最后超滤浓缩；(4)采用硼氢化钠对得到的聚合血红蛋白进行还原处理后，再用超滤、层析等方法对该产物进行分离纯化，得到窄分布、平均分子量在200kD以下的聚合血红蛋白。
上述步骤(1)中所用的血红蛋白来源于人血红蛋白、牛血红蛋白、猪血红蛋白或其它哺乳动物血红蛋白。
上述步骤(1)中加入适量修饰剂、分子内交联剂或其他双功能交联剂进行预交联。例如用分子内交联剂，如1～4倍摩尔比的NFPLP、DBBF或其他双功能交联剂如3～8倍摩尔比戊二醛进行预交联。
上述步骤(2)中加入的双功能交联剂为戊二醛、乙二醛、乙醇醛等。
上述步骤(2)中色谱柱填料为凝胶阻滞色谱介质，缓冲液pH值为5.0～9.0。
上述步骤(2)中脱氧方法，包括减压真空抽气脱氧与惰性气体鼓泡式脱氧。
上述步骤(2)所述的反应时间为3～20小时。
上述步骤(2)所述的反应温度为0～30℃。
上述步骤(2)中血红蛋白与同型双功能试剂摩尔比为1∶10～50。
本发明的工作原理为我们提出了自己的原创思想——在色谱柱上创造一个动态的不对称环境，以达到均一聚合。即在原有反应装置上加装一个根据分子尺寸进行分离的凝胶阻滞色谱柱。而当聚合度增大的时候，分子尺寸必然增大。因此，凝胶阻滞色谱柱可以对血红蛋白四聚体和聚合度不同的聚合血红蛋白进行分离。当混合液在反应体系中循环时，四聚体和聚合度较低的聚合血红蛋白会因为保留时间较长，而在色谱柱中富集。如果在色谱柱以外的部分Hb浓度较低且溶液中含有戊二醛，则聚合反应主要在色谱柱中进行。聚合度较高的聚合血红蛋白在色谱柱中的时间短，抑止了其进一步的聚合，使得聚合反应趋于均一化。我们在此思想基础上确立了独有的制备方法。该方法具有收率高(＞60％)、使用低摩尔比的戊二醛不会使血红蛋白过度修饰、离子交换介质的利用率高(1～100mg/ml血红蛋白/ml固相)、使用价格便宜的PBS缓冲体系等优点。不但如此，由于缓冲溶液的pH值以及离子强度对凝胶阻滞色谱的分离过程无明显影响，所以该方法适用于较大的pH(5.0～9.0)和离子强度范围。进而影响氨基的反应活性以及聚合反应的反应时间。
本发明选用的血红蛋白可为人血红蛋白，是从人红细胞中纯化出来的。红细胞破膜后血红蛋白丢失了效应剂2，3-二磷酸甘油酸。这使得比人血红蛋白对氧的结合力明显上升，必须经过2，3-DPG位点进行化学修饰。另外，本发明也可适用于其它来源的血红蛋白，如牛血红蛋白、猪血红蛋白。使用本发明所述方法以牛血红蛋白和猪血红蛋白为原料，与戊二醛反应后，所得结果与人血红蛋白的制备结果相似。
本发明使用的血红蛋白是根据标准的已知技术来提取和制备的。首先收集并裂解人红细胞。通过超速离心、过滤等方法除去细胞碎片和细胞基质。最后，用DEAE纤维素离子交换选择吸附的方法除去杂蛋白，获得纯化的人血红蛋白。纯化血红蛋白要经过PLP修饰，在低温下保存。血红蛋白在天然状态下可分为脱氧血红蛋白和氧合血红蛋白。脱氧血红蛋白在构象上处于紧张态(T态)，而氧合血红蛋白在构象上处于松弛态(R态)。由于T态被视为血红蛋白在红细胞中天然存在的构象，因而脱氧血红蛋白的氧结合性能更能满足人的需要，本发明也利用脱氧血红蛋白制备聚合血红蛋白。血红蛋白脱氧形成脱氧血红蛋白是在与戊二醛反应之前进行的。本发明采用充入氮气的方法来完成血红蛋白的脱氧过程，色谱柱的填料和缓冲液抽去空气，聚合反应在氮气保护下进行。
本发明在柱上聚合之前可以使用分子内交联剂，如1～4倍摩尔比的NFPLP、DBBF或其他双功能交联剂，如3～8倍摩尔比戊二醛进行预交联。
本发明采用柱上聚合法制备聚合血红蛋白，为了使血红蛋白四聚体进行较为均一的聚合，我们将在原有反应装置上加装一个可以对血红蛋白四聚体进行富集的色谱柱，这根色谱柱可以对血红蛋白四聚体和聚合度不同的聚合血红蛋白进行分离。当混合液在反应体系中循环时，四聚体和聚合度较低的聚合血红蛋白会因为保留时间较长，而在色谱柱中富集。如果在色谱柱以外的部分Hb浓度较低且溶液中含有戊二醛，则聚合反应主要在色谱柱中进行。聚合度较高的聚合血红蛋白在色谱柱中的时间短，抑止了其进一步的聚合，使得聚合反应趋于均一化。在制备过程中，吸附的血红蛋白在固相上的密度以及与参与反应的戊二醛的摩尔比、反应温度、反应时间、缓冲液的性质及其pH值，对于制备的聚合血红蛋白的纯度及其产率有很大的影响。
本发明采用0～30℃作为反应温度，填料采用的是凝胶阻滞色谱介质，所使用缓冲液的pH值在5～9之间。反应时间随pH值减小而增大，所以反应一般为3～20小时。时间再延长，聚合血红蛋白的产率不再增加。血红蛋白与色谱填料的比例以及与戊二醛的摩尔比，对于制备的聚合血红蛋自分子量的均性至关重要。本发明在1～100mg血红蛋白/ml填料和戊二醛与血红蛋白摩尔比为10～50∶1的范围内优化反应物的配比。实验结果表明在20～60mg血红蛋白/ml填料和1 5～30∶1(戊二醛与血红蛋白的摩尔比)的配比下，聚台血红蛋白基本上是两个分子聚合的血红蛋白，而且产率较高。而高于这一配比，聚合血红蛋白的产率有所增加，但是有较多聚血红蛋白生成。因此，本发明采用这一配比制备聚合产物。
图1为本发明所涉一种凝胶阻滞色谱柱上聚合制备窄分布低分子量聚合血红蛋白的方法的装置图。
其中1、储液器，2、泵，3、色谱柱。
图2为本发明所涉一种凝胶阻滞色谱柱上聚合制备窄分布低分子量聚合血红蛋白的方法的聚合血红蛋白样品的SEC-HPLC结果曲线图。
具体实施例方式以下将通过具体实施方式
的形式再对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅局限于以下的具体实施方式
，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1取5g浓度为75mg/ml的PLP修饰后的人血红蛋白溶液(pH＝7.4)在20℃通氮2小时，使血红蛋白处于脱氧状态。装填Φ1.6×30cm Superdex S-300凝胶阻滞交换柱，用脱氧后的10mM PBS(pH＝7.4)缓冲液平衡(装置图见图1)。将血红蛋白溶液泵入色谱柱中循环，并使储液器中溶液最终体积为40ml。1小时后，分10次每隔0.5小时，向储液器中加入7.7ml戊二醛。继续反应2小时。最后用10mM PBS缓冲液(pH7.4)洗脱。收集物超滤浓缩后，用硼氢化钠还原。超滤浓缩。收集物用TSK 3000sw凝胶过滤柱，流动相为1/15M PBS+0.1M NaCl(pH7.2)，流速为0.50ml/min，洗脱物在280nm紫外光下检测。可检测到3个洗脱峰(色谱图见图2)。根据洗脱时间，可确定前两个洗脱峰的分子量均小于200kD。第三个为未反应的血红蛋白。
权利要求
1.一种凝胶阻滞色谱柱上聚合制备窄分布低分子量聚合血红蛋白的方法，其特征在于它包括以下步骤(1)将天然血红蛋白进行化学修饰或预聚合。(2)将修饰或预聚合的血红蛋白充分脱氧后用泵加入凝胶阻滞色谱柱中平衡，然后分步加入双功能交联剂进行聚合反应，血红蛋白溶液浓度为1～100mg/ml，血红蛋白与双功能交联剂的摩尔比为1∶10～1∶50。(3)用缓冲溶液将步骤1生成的聚合产物洗脱、收集。收集液用甘氨酸或赖氨酸中止反应，戊二醛与甘氨酸(赖氨酸)的摩尔比为2～10∶1，反应时间1～3小时。最后超滤浓缩。(4)采用硼氢化钠对得到的聚合血红蛋白进行还原处理后，再用超滤、层析等方法对该产物进行分离纯化，得到窄分布、平均分子量在200kD以下的聚合血红蛋白。
2.根据权利要求1所述的凝胶阻滞色谱柱上聚合制备窄分布低分子量聚合血红蛋白的方法，其特征在于步骤(1)中所用的血红蛋白来源于人血红蛋白、牛血红蛋白、猪血红蛋白或其它哺乳动物血红蛋白。
3.根据权利要求1所述的凝胶阻滞色谱柱上聚合制备窄分布低分子量聚合血红蛋白的方法，其特征在于步骤(1)中加入适量修饰剂、分子内交联剂或其他双功能交联剂进行预交联。例如用分子内交联剂，如1～4倍摩尔比的NFPLP、DBBF或其他双功能交联剂如3～8倍摩尔比戊二醛进行预交联。
4.根据权利要求1所述的凝胶阻滞色谱柱上聚合制备窄分布低分子量聚合血红蛋白的方法，其特征在于步骤(2)中加入的双功能交联剂为戊二醛、乙二醛、乙醇醛等。
5.根据权利要求1所述的凝胶阻滞色谱柱上聚合制备窄分布低分子量聚合血红蛋白的方法，其特征在于步骤(2)中色谱柱填料为凝胶阻滞色谱介质，缓冲液pH值为5.0～9.0。
6.根据权利要求1所述的凝胶阻滞色谱柱上聚合制备窄分布低分子量聚合血红蛋白的方法，其特征在于步骤(2)中脱氧方法，包括减压真空抽气脱氧与惰性气体鼓泡式脱氧。
7.根据权利要求1所述的凝胶阻滞色谱柱上聚合制备窄分布低分子量聚合血红蛋白的方法，其特征在于步骤(2)所述的反应时间为3～20小时。
8.根据权利要求1所述的凝胶阻滞色谱柱上聚合制备窄分布低分子量聚合血红蛋白的方法，其特征在于步骤(2)所述的反应温度为0～30℃。
9.根据权利要求1所述的凝胶阻滞色谱柱上聚合制备窄分布低分子量聚合血红蛋白的方法，其特征在于步骤(2)中血红蛋白与同型双功能试剂摩尔比为1∶10～50。
全文摘要
一种凝胶阻滞色谱柱上聚合制备窄分布低分子量聚合血红蛋白的方法，它将天然血红蛋白用泵加入凝胶阻滞色谱中平衡，然后分布加入双功能交联剂进行聚合反应，反应温度为0～30℃，pH值为5.0～9.0反应时间3～10小时；血红蛋白溶液浓度为1～100mg/ml，血红蛋白与双功能交联剂的摩尔比为1∶10～1∶50。用氨基的缓冲溶液将生成的聚合产物洗脱、收集。收集液用甘氨酸或赖氨酸中止反应，戊二醛与甘氨酸(赖氨酸)的摩尔比为2～3∶1。超滤浓缩。采用硼氢化钠对得到的聚合血红蛋白进行还原处理后，再用超滤、层析等方法对该产物进行分离纯化，得到窄分布、平均分子量在200kD以下的聚合血红蛋白。
文档编号A61P7/00GK1990038SQ20051013602
公开日2007年7月4日 申请日期2005年12月28日 优先权日2005年12月28日
发明者杨成民, 王翔, 黄磊, 李燊, 张鸿辉, 梁伟光, 李洪英, 许丽丽, 王劲峰, 由英才 申请人:天津协和生物科技发展有限公司