miR-216在制备促进成骨分化的药物中的用图
【技术领域】
[0001] 本领域涉及再生医学领域，具体而言涉及miRNA在制备促进成骨分化的药物中的 用途。
【背景技术】
[0002] 人间充质干细胞（hMSCs)具有自我更新和多谱系分化潜能，在适当条件下能够分 化为骨、软骨、脂肪和肌组织（Prockop，DJ，1997 ;Phinney，DG，2007 ;PUtenger，MF 等人， 1999和Fink，T等人，2011)。研究者首先从骨髓中分离出MSC (BMSCs),并证明了其多系分 化的能力。BMSCs向成骨细胞分化是机体普遍存在的生理过程。在生理条件下，骨组织呈 现成骨细胞的骨形成和破骨细胞的骨吸收的动态平衡。一旦各种原因导致这种动态平衡破 坏，如成骨分化能力降低时，就会引起骨质疏松、锁骨颅骨发育不全、股骨头坏死、关节退行 性变、脊柱侧弯等骨相关疾病。因此，揭示间充质干细胞成骨的调控机制具有极其重要的临 床应用价值。
[0003] 由于受来源的限制以及取样困难，BMSC的研究和应用发展较慢。后来的研究发现， 除骨髓外，MSC还广泛存在于脂肪、皮肤、滑液、脱落的牙齿、羊水和胎盘等多种组织器官中 (Prockop，DJ，1997)。研究证明，与骨髓来源的MSC相似，人脂肪组织来源的MSC (hAMSCs) 具有跨系甚至跨胚层的多向分化潜能，在体内外可分化成多种细胞类型，如成骨细胞、软骨 细胞、脂肪细胞、肌细胞、内皮细胞、神经胶质细胞等。此外与BMSC相比，hAMSC s具有原料充 足，取材方便，体外分离扩增方法简单易行等优点，因此备受研究者青睐。目前MMSCs已经 成为研究MSC自我更新和分化的最佳细胞模型和最有发展潜力的组织工程种子细胞。
[0004] MicroRNAs UiRNAs)是一类高度保守的非编码小RNA分子，能够在转录或转录 后水平调控靶基因表达（Ambros，V，2004 ;Bartel，DP，2004)。最近，越来越多的证据表明 miRNAs能够调控细胞分化和命运决定（Ivey, KN and D Srivastava，2010)。目前，miR-125、 miR-133、miR-135、miR-138、miR-181、miR-206、miR-9、miR-27、miR_196a、miR-214、 miR-764-5p、miR-2861、miR-3960、miR-642a-3p、miR-141/200a 和 miR-17-5p ~92/ miR-106a等许多miRNAs已经被证实参与成骨分化的调控。miR-214转基因小鼠表现出明 显的成骨能力降低（Wang，X，2013)。这些研究结果提示，HiiRNA s在MSC的成骨分化调控中 可能扮演了非常重要的角色。
【发明内容】
[0005] 根据一些【具体实施方式】，本发明提供miR-216在制备促进成骨分化的药物中的用 途。
[0006] 在一些【具体实施方式】中，miR-216促进人脂肪组织来源的间充质干细胞向成骨分 化。
[0007] 在一些【具体实施方式】中，miR-216的序列如SEQ ID No. 1所示。SEQ ID No. 1为 UAAUCUCAGCUGGCAACUGUGA，其登录号为 miRbase Accession number MIMAT0000273。
[0008] 在一些【具体实施方式】中，通过转染试剂提供miR-216 ;转染试剂优选为脂质体。在 一些【具体实施方式】中，转染试剂是Lipofectamine2000。
[0009] 在一些【具体实施方式】中，miR-216的转染浓度为100nmol/L。
【附图说明】
[0010] 图I :hAMSCs经成骨诱导培养基诱导后3天的ALP染色。
[0011] 图2 :hAMSCs经成骨诱导培养基诱导后12天的茜素红染色。
[0012] 图3A :转染NC对照后，hAMSCs的ALP染色。
[0013] 图 3B :转染 miR-216a 后，hAMSCs 的 ALP 染色。
[0014] 图4A :转染NC对照后，hAMSCs的茜素红染色。
[0015] 图4B :转染miR-216a后，hAMSCs的茜素红染色。
[0016] 图5 :成骨诱导后碱性磷酸酶的活性。hAMSCs :未经转染的hAMSCs ;NC :转染有NC 对照的、经过成骨诱导的hAMSCs ;miR-216a :转染有miR-216a的、经过成骨诱导的hAMSCs。
【具体实施方式】
[0017] 以下提供了本发明实施方式中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是， 这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下组织、细胞、试剂和仪器的类型、型号、 品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。
[0018] 实施例1 :成人脂肪源间充质干细胞的分离和鉴定
[0019] 1.成人脂肪组织取自吸脂手术患者（中国医学科学院整形医院)，与自愿捐献者签 订知情同意书，捐献者均为25-35岁的健康女性。
[0020] 2.从脂肪组织中分离hAMSCs的方法简述如下：
[0021] 吸脂术采集出来的脂肪组织用D-Hanks洗去血细胞和麻醉药，0. 2g/100mlII型胶 原酶(购自：美国Life Technologies公司）消化Ih,之后用D-Hanks洗漆2遍以除去胶原 酶。
[0022] 离心收集细胞，细胞以2X106/ml的密度接种于含58% (v/v)DMEM/F12+40% (v/ v)MCDB-201、2% (v/v)胎牛血清、10ng/ml EGF、10ng/ml PDGF、1X 胰岛素-转铁蛋白-亚 硒酸（ITS)UX亚油酸-牛血清白蛋白、50μΜ beta-巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、100μ g/ ml青霉素和lOOU/ml硫酸链霉素的干细胞培养液，37°C、5%C02、95%湿度的培养箱培养。
[0023] 两天后换液，弃去未贴壁的细胞，以后每3天半量换液。
[0024] 当细胞达70%~80%汇合时，0· 25g/100ml胰酶（Gibco)常规消化，细胞按照1 :3 进行传代。
[0025] 3. hAMSCs 的表型：
[0026] 收集第三代细胞，PBS洗3次；
[0027] 加 0. 1%皂素室温破膜1小时，PBA洗3次(若检测细胞内抗原，则进行本步骤；若 检测细胞表面抗原，则直接进行下一步）；
[0028] 加一抗（CD29、CD44、CD105、CD31、CD34、CD106、HLA-DR、FLK-I 单抗，购自：BD 公 司），4°C孵育30分钟；
[0029] 加 PBS洗3次，加 FITC标记二抗(兔抗鼠，购自中杉金桥生物技术有限公司），4°C 孵育30分钟；
[0030] 加 PBS洗3次，4%多聚甲醛固定，300ul PBS重悬；
[0031] 上流式细胞仪（品牌、型号）检测细胞。经鉴定，细胞呈现典型的AMSC表型：
[0032] CD29+、CD44+、CD105+、FLK-Γ ;
[0033] CD31' CD34' CD106' HLA-、DR'
[0034] 实施例2 :miRNAs的转染
[0035] 1.试剂：
[0036] (1)转染试剂为 Lipofectamine2000 (Invitrogen);
[0037] (2)待转染的 HiiRNAs :
[0038] miR-216 粉末为美国 Life Technologies 公司合成；
[0039] 采用公知技术合成与miR-216长度相似的无关序列（SEQ ID No. 2 : UUCUUCGAACGUGUCACGUTT)作为 NC 对照。
[0040] 2.待转染的HIiRNAs储备液配置：
[0041] 将装有待转染的HiiRNAs的管低速离心5min，按照Lipofectamine2000 (Invitrogen)说明书加入Opti-MEM溶解miRNA s，震荡并瞬时离心配成20 μ M的储备液。
[0042] 3.细胞准备：
[0043] 取第3代对数生长期、70%_80%汇合的hAMSCs进行转染。
[0044] 4.转染过程：
[0045] 用Opti-MEM分别稀释待转染的HiiRNAs和Lipofectamine2000,轻轻混匀后室温放 置 5min ;
[0046] 将Lipofectamine2000稀释液缓慢逐滴加入待转染的miRNAs稀释液中，轻轻混匀 获得miRNA s和Lipofectamine2000混合液，室温孵育20min ;
[0047] 从培养箱取出待转染细胞，吸出培养液，用DPBS液(杜氏磷酸缓冲液)洗3遍，吸净 洗液后每孔加入I. 5ml Opti-MEM ;
[0048] 将孵育好的miRNAs-Lipofectamine2000混合液缓慢逐滴入培养皿中.转染量： HiiRNAs