用于骨骼再生的胶原凝胶组合物的制备方法

专利名称：用于骨骼再生的胶原凝胶组合物的制备方法
技术领域：
本发明涉及用于骨骼再生的胶原凝胶组合物的制备方法。更具体地，本发明能够 通过将骨髓衍生有核细胞和胶原基的基质组合物共注射到受试者的骨骼缺陷病变处，赋予 骨传导性(osteoconductivity)、骨发生性(osteogenicity)和成骨细胞分化诱导能力，从 而促进骨发生。进一步地，本发明能够通过用于医药应用的使用基质组合物的过程和质量 控制确保产品的高质量。此外，本发明使得产品能够批量生产，使得产品能够单独使用或如 果需要，与患者的骨髓衍生有核细胞组合使用，且与常规细胞治疗试剂相比，使得产品能够 在短时期内方便且经济地应用于患者。因此，本发明显著实现了产品质量和可靠性的改进，由此可极大提高用户满意度。
背景技术：
本发明是对本申请人提交的名称为“用于骨骼再生的骨发生促进细胞组合物及其 制备方法”的韩国专利申请No. 2006-0091325 (专利注册No. 0834718)的改进。众所周知，骨质疏松是造成骨质量和密度的逐渐丧失并由此伴随着对在骨骼内形 成大量小孔，就类似于在粗糙的浮石或海绵中所见的那样，而导致的骨折的高度敏感性的 医学病状。即，骨质疏松是一种进行性的骨丧失疾病，其与正常骨骼相比，涉及许多小洞或 小孔的形成，骨质量的降低，骨微结构的变薄变弱，从而引起骨骼变脆并即使仅受轻微撞击 也易于折断。因为骨质疏松是默默进行地无疼痛感或症状，人们不能感知到他们患上骨质 疏松直至突然摔倒或被撞击并转而易于骨折。即使轻微摔倒，骨质疏松的人也可能会腕关 节骨折，盆骨骨折和脊椎骨折，并伴随剧烈疼痛。特别地，盆骨骨折和脊椎骨折剧烈疼痛并 需要外科手术，并且患者必须忍受甚至长达数月的卧病在床的痛苦。甚至手术完全康复之 后，由于手术后遗症或者骨质疏松并发症，仍会留下身体缺陷。骨骼不断地经历着分解和置换过程。即，在所有骨骼中不断发生结构重塑。在骨 骼结构重塑期间，破骨细胞破坏和吸收老的骨骼，而成骨细胞形成新骨骼。如果由于骨骼组 织的动态失衡，骨骼吸收超过骨骼再生，这可能导致骨质疏松的发生。已知骨质疏松的发病 率与各种危险因子的组合有关系，例如女性性别，瘦和/或小的身体骨架，年龄的增大，骨 质疏松的家族病史，绝经(包括子宫切除)，月经不调(闭经)，神经衰弱，肾上腺皮质激素 或抗惊厥药物的使用，男性的高雄性素血症(hypoandrogenemia)，锻炼不足，吸烟，酗酒，亚 洲和高加索人(非洲和西班牙裔美洲人风险较低)，早期绝经(45岁之前)，咖啡因和酒精 消费过度，和低钙饮食。亚洲人骨质疏松的发病率高于美洲人。据估计超过28，990，000的美洲人受骨 质疏松的影响(受此影响的80%是女性)。在美国，一千万人已经患有骨质疏松。多于 一千八百万人骨质量低，使他们处于骨质疏松的高风险中。在50岁以上的美洲高加索人中 有1/2的女性和1/8的男性在其一生中将经历与骨质疏松相关的骨折。1/10的50岁以上 的非洲裔美洲人患有骨质疏松；还有额外1/3的人骨密度低，处于发生骨质疏松的风险中。 骨质疏松每年造成了多于一百五十万的骨折，包括300，000髋骨骨折，700，000脊椎骨折，250，000腕关节骨折和300, 000其他部位的骨折。在美国，每年发生12，000, 000例骨折， 其中147，000-250，000例是髋骨骨折，80%是由轻微创伤引起的。到80岁时，约40%的女 性会经历至少一次脊椎骨折。三分之一女性和六分之一男性在80岁之后会经历髋骨骨折。 25-50%髋骨骨折患者甚至在髋骨修复手术之后没有其他人协助就不能走路，并且已知这 种骨折与死亡率相关。在各种用于治疗骨质疏松的开发的治疗方法中，常规确立的骨质疏松疗法，例如 通过使用双磷酸盐或选择性雌激素受体调节剂(SERMs)，首先关注于抑制骨吸收，并且已知 是通过预防骨质量的进一步丧失抑制骨质疏松的发展。此外，通过使用骨移植术或自体成 骨细胞基治疗剂，在由各种因素包括骨质疏松引起的局部骨折中或在要求骨骼再生的目标 病变处实现骨愈合或骨骼再生。但是，常规治疗方法通过抑制破骨细胞活性预防骨吸收拦阻了骨质疏松的进一步 发展，却因此遭遇了与无法实质促进骨再生相关的问题。进一步地，使用上述骨移植技术或 自体成骨细胞基治疗剂不利的是难以实现大面积的生物骨骼再生。尽管为了克服经典骨移植技术遭遇的骨骼再生的不利已经推动了细胞治疗剂的 发展，但难以实现贴壁细胞的系统应用或贴壁细胞通过血液流动的治疗。这是因为不可能 通过血液流动执行细胞注射，因为如果贴壁细胞未附着在适当基底上他们可能会死亡。纵观常规方案的更多细节，为了局部应用使用同种异体骨移植，自体骨移植或自 体成骨细胞基治疗剂的移植的治疗方法已经用于局部病变处发生的骨骼缺陷或骨骼坏死， 或使用骨吸收抑制剂例如双磷酸盐等的治疗方法已经用于在大范围病变处发生的骨骼缺 陷，例如骨质疏松。同种异体骨移植仍遭遇问题，例如传播疾病的可能性，植入材料的供应 不足，非期望免疫反应例如移植排斥的发生，和进入受试者自体组织中的植入物难以完全 再生。同时，自体骨移植解决了或缓解了同种异体骨移植技术所遭遇的这些问题，但是也 有不利，例如难于为骨移植提供骨骼保证足够的供体部位，难于保证供体部位的发病率等。 利用自体成骨细胞的细胞治疗剂是为了解决常规骨骼移植技术的问题和不利而开发的一 种治疗方法，被认为是能够通过从骨髓分离的骨原细胞的大量增殖，使骨原细胞分化成成 骨细胞以及将成骨细胞移植至需要进行骨骼再生的目标部位，实现局部骨骼再生的一种技 术。但是，所有上述常规技术仅可用于局部骨骼再生并简单地用于填充骨骼空的空间，且仍 遭遇难以治疗广泛分布在全身的骨骼缺陷的不利，例如由于骨质疏松的系统骨骼缺陷和由 于骨骼坏死的大面积骨骼缺陷。进一步地，用于治疗骨质疏松的骨吸收抑制剂不具有促进 骨骼再生的能力，并由此在骨质疏松引起的大面积骨骼损伤的治疗上遭遇许多限制。为了克服常规疗法的上述问题和不利，本申请人提交的韩国专利No. 0834718公 开了一种用于骨骼再生的骨发生促进细胞组合物。但是，本申请人的上述常规技术仍遭遇了细胞培养期长的突出问题。更具体地，使用同种异体移植，自体移植或局部自体成骨细胞基治疗剂的移植的 治疗方法已经用于治疗局部骨骼缺陷或坏死。但是，如上文所讨论的，同种异体移植技术遭 遇了问题，例如传播疾病的风险，植入物的供应不足，可能的免疫反应，和进入自体组织中 植入物难以完全再生。同时，自体移植技术解决或减缓了同种异体移植所遭受的这些问题， 但仍存在不利，例如难以保证供体部位，供体部位可能的病理集(pathological episodes) 等。自体成骨细胞基的细胞治疗剂是为了解决这些骨移植技术的问题而开发的一种治疗方法，它被认为是能够通过从骨髓分离的骨原细胞的大量培养，使骨原细胞分化成成骨细胞 并将分化的成骨细胞移植到需要进行骨骼再生的目标病变处，实现局部骨骼再生的一种技 术。但是，自体细胞基的治疗方法有利于患者特异性治疗，但显示出许多短处，例如昂贵，复 杂的过程和大于一个月生产治疗产品的长时期，并因此难以在诊断患者骨骼缺陷或骨折的 现场立即使用产品。为了克服通过常规骨骼移植技术进行骨骼再生的不利，加速了细胞基治疗药物的 发展，但生产这种治疗药物要花大于一个月的长时期。进一步地，自体移植技术具有限制供 体部位的不利，而同种异体移植技术会遭受与可能感染疾病相关的风险。

发明内容
因此，鉴于以上讨论的常规骨骼移植技术相关的问题进行本发明，本发明的第一 目的是提供用于骨骼再生的胶原凝胶组合物的制备方法，该方法包括从动物组织收集骨髓 并从骨髓分离有核细胞；并将有核细胞与由I型胶原和磷灰石组成的生物基质混合。本发明的第二目的是通过使用胶原基的基质混合物，提高骨传导性和对骨原细胞 或血管细胞的细胞亲和力。本发明的第三目的是提供一种能够通过分离骨髓衍生的有核细胞并将有核细胞 和基质混合物共移植至需要进行骨骼再生的目标部位促进骨骼再生的骨发生促进组合物。本发明的第四目的是提供能够同时赋予骨骼填充物和骨骼再生细胞的可注射组 合物，及其生产方法。为了这个目的，将含有能够进行产业规模大量生产的胶原的骨骼基质 混合物与患者的骨髓衍生有核细胞混合，然后混合物准备用于需要在短时间内进行骨骼再 生的患者。本发明的第五目的是通过将根据本发明制备的骨发生促进组合物注射至需要进 行局部骨骼形成的目标病变处，实现基质组合物和有核细胞均勻递送至需要进行骨骼形成 的目标部位，而不考虑骨骼缺陷病变的形状和形态。因此，有可能治疗多种骨折相关的疾 病。本发明的第六目的是提供用于骨骼再生的胶原凝胶组合物的制备方法，其适合于 通过显著改进产品的质量和可靠性提高用户满意度。根据本发明，以上和其他目标可通过提供一种用于骨骼再生的胶原凝胶组合物的 制备方法而实现，该方法包括从动物组织收集骨髓并从骨髓分离有核细胞；并将有核细胞 与由I型胶原和磷灰石组成的生物基质混合。如上文所述，本发明提供了用于骨骼再生的胶原凝胶组合物的制备方法，该方法 包括从动物组织收集骨髓并从骨髓分离有核细胞；并将有核细胞与由I型胶原和磷灰石组 成的生物基质混合。进一步地，本发明通过使用胶原基的基质混合物，提高骨传导性和对骨原细胞或 血管细胞的细胞亲和力。进一步地，本发明提供了一种能够通过分离骨髓衍生的有核细胞并将有核细胞和 基质混合物共移植至需要进行骨骼再生的目标部位促进骨骼再生的骨发生促进组合物。此外，本发明提供了能够同时赋予骨骼填充物和骨骼再生细胞的可注射组合物， 及其生产方法。为了这个目的，将含有能够进行大量生产的胶原的骨骼基质混合物与患者的骨髓衍生有核细胞混合，然后混合物(rendered)准备用于需要在短时间内进行骨骼再 生的患者。进一步地，本发明通过将根据发明制备的骨发生促进组合物注射至需要进行局部 骨骼形成的目标病变处，实现基质组合物和有核细胞均勻递送至需要进行骨骼形成的目标 部位，而不考虑骨骼缺陷病变的形状和形态。因此，有可能治疗多种骨折相关的疾病。最后，本发明显著有益于通过显著改进产品的质量和可靠性提高用户满意度。


图1为描述本发明所用的用于骨骼再生的胶原凝胶组合物的制备方法的工艺流 程图；图2为肩胛皮下注射Iml根据本发明的用于骨骼再生的胶原凝胶组合物的裸鼠的 照片；图3为肩胛皮下注射Iml根据本发明的用于骨骼再生的胶原凝胶组合物之后9周 的裸鼠的放射自显影照片；图4为显示肩胛皮下注射Iml根据本发明的用于骨骼再生的胶原凝胶组合物之后 9周的裸鼠的组织染色结果的照片；图5为在兔子前臂诱导长IOmm的骨折之后，注射根据本发明的用于骨骼再生的胶 原凝胶组合物之后3周和9周的放射自显影照片；以及图6为在兔子前臂诱导长15mm的骨折之后，注射本发明所述的用于骨骼再生的胶 原凝胶组合物之后的3周和9周的放射自显影照片。
具体实施例方式下文中，参照附图更具体地描述用于实现上述目标和效果的本发明的优选实施方式。本发明所应用的用于骨骼再生的胶原凝胶组合物的制备方法如图1至6所示。结合下文中本发明的描述，考虑到如果描述本发明相关的已知功能或结构会使本 发明的主题不清楚，那么省略对它的具体描述。考虑本发明的功能建立下文所述的术语，而且它们可根据制造者的意图或相关技 术领域中的常规实践而变化。因此，应根据本发明的说明书的上下文来定义本文所用的术语。如图1所示，首先从动物组织中收集骨髓，然后从其分离有核细胞(分离有核细胞 的步骤)。之后，将分离得到的有核细胞与由I型胶原和磷灰石组成的生物基质混合，从而 制备用于骨骼再生的胶原凝胶组合物。磷灰石，即普通磷酸钙矿物质，是磷的主要来源并广泛分布在许多火成岩和变态 岩石中。这种化合物也可以人工合成。磷灰石可用作磷酸盐肥料，乳剂，牙膏，人工骨骼和 他们的原材料。当磷灰石与用于上述应用的胶原混合时，它们会发生化学反应，其可避免长 期的细胞培养。优选地，制备得到的凝胶组合物置于注射器中并在其中混合，注射器与连接体或类似部件相连。有核细胞分离步骤获得的细胞含有自体有核细胞。分离得到的自体有核细胞可通过从动物骨髓中收集2_5mm大小的骨髓，之后清洗 以分离所需的有核细胞而获得。进一步地，生物基质采用没有末端肽的I型胶原和磷灰石。每0. 106ml的1 X IO6至4X IO6具有骨发生能力的有核细胞的悬浮液中加入 0. 24ml的I型胶原和26. 93mg的磷灰石。下文中，将说明如上构成的根据本发明的用于骨骼再生的胶原凝胶组合物的制备。实施例现在将参照以下实施例更具体地描述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不 应解释为限制本发明的范围和实质。实施例1 骨骼再牛组合物对棵鼠的应用从小鼠组织中收集骨髓，然后分离出有核细胞以制备细胞悬浮液。制备I型胶原 和磷灰石作为生物基质的成分。将细胞悬浮液，I型胶原和磷灰石混合制备Iml用于骨骼再生的胶原凝胶组合物。在BALB/c小鼠(n = 13，体重约23g，不分雌雄)的肩胛皮下注射Iml用于骨骼再 生的胶原凝胶组合物。在注射骨骼再生的胶原凝胶组合物之后的3、6和9周，进行放射自显影照相和肉 眼检查，然后进行组织染色。图2显示了肩胛皮下注射Iml用于骨骼再生的胶原凝胶组合物的裸鼠照片。可以 观察到骨骼再生胶原凝胶组合物通常被如期地注射到目标部位。图3是肩胛皮下注射Iml用于骨骼再生的胶原凝胶组合物之后9周的裸鼠的放射 自显影照片。如图3所示，通过从外面引入到骨骼再生胶原凝胶组合物中的细胞启动了血 管形成。图4显示了肩胛皮下注射Iml用于骨骼再生的胶原凝胶组合物之后9周的裸鼠的 组织染色结果。如图4所示，通过从外面引入到骨骼再生胶原凝胶组合物中的细胞启动了 血管形成和胶原形成。^MM 2 骨骼再牛組合4勿X拆秀导T长IOmm骨折的云M勿It型的应用从兔子组织中收集骨髓，然后分离出有核细胞以制备细胞悬浮液。制备I型胶原 和磷灰石作为生物基质的成分。将细胞悬浮液，I型胶原和磷灰石混合制备0. 2ml用于骨骼再生的胶原凝胶组合 物。对于这个实验，为了移植含有骨髓衍生有核细胞的胶原凝胶组合物，新西兰白兔 (n = 7，体重约2. ^g，不分雌雄)被指定为自体移植对照组(n = 3)和实验组(n = 4)。根据亨利方法，纵向切开兔子前臂以显露出桡骨骨干。然后用锯在兔子桡骨骨干 形成长IOmm的骨骼缺陷并彻底去除骨骼缺陷诱导的病变处的骨膜。对于对照组，先从髂骨收集松质骨骼并在骨缺陷病变处进行骨骼移植，之后缝合 皮肤和皮下组织。
对于实验组，将含有骨髓衍生有核细胞的细胞组合物注射至骨缺陷病变处的空白 空间。在实验的3、6和9周进行放射自显影照相之后，根据骨折上游部分，骨折下游部分 和骨缺陷区域的骨愈合程度进行评分。相应分值的总和用于评估骨折愈合的程度。图5显示了在兔子前臂诱导长IOmm的骨折之后，注射用于骨骼再生的胶原凝胶组 合物之后3周和9周的放射自显影照片。两组动物在骨骼形成上显示出相似的结果。^MM 3 骨骼再牛会目合物对i秀导了长15_骨折的云M勿I草型的应用从兔子组织中收集骨髓，然后分离出有核细胞以制备细胞悬浮液。制备I型胶原 和磷灰石作为生物基质的成分。将细胞悬浮液，I型胶原和磷灰石混合制备0. 2ml用于骨骼再生的胶原凝胶组合 物。对于这个实验，为了移植含有骨髓衍生有核细胞的胶原凝胶组合物，新西兰白兔 (n = 18，体重约2. ^g，不分雌雄)被指定为两组，每组含9只兔子对照组和实验组。根据亨利方法，纵向切开兔子前臂以显露出桡骨骨干。然后用锯在兔子桡骨骨干 形成长15mm的骨骼缺陷并彻底去除骨骼缺陷诱导的病变处的骨膜。对于对照组，在动物中形成骨骼缺陷病变并用0. 8%盐水溶液清洗，之后缝合皮肤 和皮下组织。对于实验组，将含有骨髓衍生有核细胞的细胞组合物注射至骨缺陷病变处的空白 空间。在实验的3、6和9周进行放射自显影照相之后，根据骨折上游部分，骨折下游部分 和骨缺陷区域的骨愈合程度进行评分。相应分值的总和用于评估骨折愈合的程度。图6显示了在兔子前臂诱导长15mm的骨折之后，注射用于骨骼再生的胶原凝胶组 合物之后3周和9周的放射自显影照片。证实了相对于对照组，实验组显示出显著骨骼形 成。尽管为了说明的目的，公开了本发明的优选实施方式，但本领域技术人员将领会 到各种修改，添加以及替换均是可能的，不会偏离所附权利要求中公开的本发明的范围和 实质。
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权利要求
1.一种用于骨骼再生的胶原凝胶组合物的制备方法，该方法包括 从动物组织收集骨髓并从所述骨髓分离有核细胞；以及将所述有核细胞与由I型胶原和磷灰石组成的生物基质混合。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述有核细胞是自体有核细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，分离的所述自体有核细胞是通过从动物骨髓中 收集2-5mm大小的骨髓，并清洗骨髓以分离有核细胞而获得的。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述生物基质包括去除末端肽的I型胶原和磷灰石。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，每0.106ml的1 X IO6至4X IO6具有骨发生能力 的有核细胞的悬浮液中加入0. 24ml的I型胶原和26. 93mg的磷灰石。
全文摘要
本文公开了用于骨骼再生的胶原凝胶组合物的制备方法，该方法包括从动物组织收集骨髓并从所述骨髓分离有核细胞；以及将该有核细胞和由I型胶原和磷灰石组成的生物基质混合。
文档编号C07K14/78GK102089008SQ200880130301
公开日2011年6月8日 申请日期2008年7月23日 优先权日2008年7月11日
发明者吕世根, 张在德, 朴炫信, 柳志喆, 金勋, 金善爱, 金壮勋, 金成洙, 金泰亨 申请人:世元世龙技术株式会社