专利名称：针对her2的细胞外结构域2和3的抗体的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及HER2的细胞外结构域的氨基酸亚群、靶向这类亚群的抗体、以 及相关的方法和用途，如治疗方法和用途。背景HER2人表皮生长因子受体2 (HER2或erbB-幻是一个跨膜受体酪氨酸激酶家族的表皮 生长因子受体家族(EGFR、HER2、HER3、以及HER4)的一员。这些受体具有在40% -50%之 间的总体序列一致性并且具有相似的结构域。它们都含有一种细胞外配体结合结构域、一 个单一的跨膜结构域、以及细胞内酪氨酸激酶和调节结构域。HER2相关的失调已经发现表皮生长因子受体家族的成员在许多种癌症类型(如上皮细胞的恶性 肿瘤)中促进了肿瘤细胞增殖。已经在许多种人类癌症中研究了 HER2，并且已经发现在许 多肿瘤中被上调了，特别是在乳癌、肺癌、胰腺和结肠直肠癌、以及肾母细胞瘤中，而且在卵 巢癌、膀胱癌、子宫内膜癌、肾癌、头部和颈部癌、胃癌、食管癌、以及前列腺癌中(M6nard et al(2001)Annals of Oncology 12 (Suppl. 1)S15-S19)。癌症癌症是在西方世界中疾病和死亡的最普通的原因之一。通常，对于癌症的大多数 形式，发病率随着年龄而增加。随着人类种群持续活得更长，由于一般健康状态的增进，癌 症可能影响个体数量的增加。虽然在环境因素(饮食、吸烟、紫外线辐射等等)连同遗传 因素(“癌基因”如p53、APC、BRCAl、XP等的种系突变)与癌症的发生风险之间提供一种联 系的知识体有增加，最普通癌症的类型的病因大部分仍然是未知的。从一种细胞生物学观点看没有完全令人满意的癌症的定义，尽管事实上癌症基本 上是一种细胞疾病并且被定义为具有净细胞生长以及抗群体行为的一种转化细胞群体。恶 性转化代表基于不可逆的遗传改变以向一种恶性表型的转变。虽然这还没有正式证明，恶 性转化是被认为是发生在一个细胞中，随后从该细胞发展出的肿瘤开始了( “癌症的克隆 性”教义)。致癌作用是通过它产生癌症的过程并且通常被认为包括最后导致恶性肿瘤生 长的多个事件。这种多级过程包括如果干限速步骤，如突变以及还可能的次生事件的加入， 其导致在癌前期增殖阶段之后癌症的形成。这些分级改变涉及决定细胞分裂、不合群行为、 以及细胞死亡的重要调节通路的错误(突变)的累积。与周围的细胞相比，每一种这些改 变可以提供一种选择性达尔文生长优势，导致在肿瘤细胞群中的净生长。一种恶性肿瘤不 仅必需由这些转化肿瘤细胞它们本身组成，而且周围正常细胞充当为一种支持性基质。这 种募集的癌基质包括结缔组织、血管、以及各种其他的正常细胞例如炎症细胞，它们一致地 起作用从而为这些转化肿瘤细胞提供持续肿瘤生长必需的信号。最常见的癌症的形式出现在体细胞中并且主要是上皮细胞起源的，例如前列腺、 乳房、结肠、泌尿道以及皮肤；随后是从造血系起源的癌症例如白血病和淋巴瘤、从神经外 胚层起源的癌症例如恶性胶质瘤、以及软组织肿瘤例如肉瘤。
乳癌乳癌是全世界癌症的第二最常见的形式，并且到目前为止是女性最频繁发生的癌 症。由Parkin等人提出的来自GL0B0CAM2002数据库的资料揭示在2002年有115万个新 病例并且在相同期间有41万个死亡病例(Parkin DM et al. (2005)CA Cancer J Clin 55， 74-108)。如果在一个早期检测出，则对于生活在一个发达国家中的患者预后是相对好的， 与在一个发展中国家中的57%相比，具有73%的总体五年生存率。该发病率正在缓慢增 加，并且在发达国家中大约每九个女性中有一个在她的一生中被认为患上乳癌。虽然与雌 性类固醇激素相关的生活方式改变(包括暴露于外源性激素)影响发展乳癌的风险，这些 因素仅仅组成了病因学的一小部分，并且预防操作的益处被认为是低的。死亡率的降低是 由于通过乳房X线照相术筛选的早期检测以及现代辅助全身疗法的使用。癌症的治疗以及疗法癌症的治疗包括例如外科手术、放射疗法、化学疗法、靶向治疗、免疫疗法、激素 疗法、以及血管生成抑制剂。一种靶向治疗的实例是用治疗性抗体的治疗(抗体疗法)，它可以是一种有吸引 力的途径，因为它靶向肿瘤细胞，与例如选择性雌激素受体调节剂(SERM)以及作为常规全 身性治疗的化学疗法相反。乳癌的治疗自从在七十年代后期它的引进，保乳治疗(结合乳房保留手术以及手术后放射治 疗)已经成为在女性中的第一位的治疗选择，其中肿瘤的根治性切除可以与一种好的美容 结果相结合。乳房切除术在一些患者即具有小乳房、大肿瘤(> km)或多病灶/多中心疾 病的女性中仍然是优选的。腋窝切开主要是用于诊断目的而进行的，并且将至少10个淋巴结去除以给出一 种具有 97%-98%敏感性的好的分期指导(Axelsson CK et al. (1992)Eur J Cancer28A 1415-8 ；Recht A and Houlihan MJ(1995)Cancer 6(9) :1491_1512)。然而，对于原发癌的 治疗中的微创手术的下一步已经引进了具有腋窝淋巴结定位而不是腋窝淋巴结清扫(它 与高的并发症相关)的前哨淋巴结活检技术。这种技术作为认识的结果而被引入，即认识 到从乳房到腋窝的大多数淋巴引流最初通过一个(或少数)淋巴结(前哨淋巴结)，其支持 这个淋巴结可能是腋窝淋巴结状况的一种充分指示的分析(Veronesi U et al. (2003)New Engl J Med 349(6) :546-53)。乳癌作为一种全身性疾病的概念，即在诊断时播散性微转移的存在可以解释在区 域治疗后的治疗失败，为在二十世纪七十年代辅助随机试验铺平了道路，包括内分泌疗法 和化学疗法。辅助的综合化学疗法通常已经是对于激素受体阴性的具有高复发风险的患 者(不管淋巴结状况)的标准疗法。已经证明尤其是在绝经前期患者中对总生存率以及 无复发生存率二者的有益效果(EBCTCG(1998) Lancet 352(9132) :930-4 。对于具有激素 应答疾病(即雌激素受体(ER)和/或孕酮受体(PR)阳性疾病)的患者，辅助的综合化学 疗法已经与内分泌疗法相组合作为序贯化学内分泌疗法而给予。并且，辅助化学治疗通常 引起闭经，引起除细胞毒性之外的二次内分泌效应(Pagani 0 et al. (1998)Eur J Cancer 34(5) :632-40)。内分泌疗法被推荐用于具有激素受体阳性肿瘤的患者(不管年龄、阶段以及绝经状况)。在激素应答绝经前患者中，已经显示出通过手术或照射去除卵巢或通过LHRH激 动剂抑制卵巢是有效的辅助治疗方式(Emens LA and Davidson NA (2003) Cl in Ca Res(l Pt 2) :468S-94Q。在绝经后患者中，卵巢去除没有位置，因为雌激素的原始来源不是从卵 巢合成而是来自在包括乳房的外周组织中的雄留烯二酮向雌酮和雌二醇的转变。它莫西芬是一种具有对ER有拮抗作用的选择性雌激素受体调节剂(SERM)，它促 成了一种在绝经前以及绝经后女性二者中用于晚期乳癌的适当的治疗。在具有ER阳性 (ER+)肿瘤的患者(不考虑淋巴结状况)中在初期手术后给予五年的它莫西芬作为辅助治 疗明显地减少了乳癌的死亡率(EBCTCG(1998)Lancet351(9114) :1451-67)。虽然它莫西芬 具有一种免于心血管疾病的保护效应，由于对在子宫内膜中的ER的激动效应，发展子宫内 膜癌的风险增加了 (EBCTCG(2005)Lancet 365(9472) :1687-717)。芳香酶抑制剂(Als)通过抑制芳香酶而起作用，该酶将雄激素转换成雌激素。 AIs不适合用于绝经前女性的治疗，因为它通过下丘脑和垂体腺体刺激卵巢以增加雄激素 的产生。AIs可以作为辅助治疗单独地或继它莫西芬治疗之后给予绝经后女性，并且已 经显示它们显著降低了死亡率，如果单独给予可能更好(Howell A et al. (1995)Lancet 345(8941) :29-30 ；Ellis MJ and Rigden CE(2006)Curr Med Res 0pin22(12) :2479-87; Coates AS et al. (2007) J Clin Oncol 25(5) :486-92)。然而，这种疗法是相对新的并且 长期副作用还没有完全认识(Buzdar A et al. (2006) Lancet 0ncol7(8) :633-43)，但最重 要的是心血管并发症以及骨质疏松症。新近研制的完全阻滞ER的纯抗雌激素如氟维司群，目前仅仅用于晚期乳癌而不 在该辅助方案中(Rutqvist LE(2004)Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 18(1) 81-95)。虽然一些研究表明一些ER阴性(ER-)，即ERa阴性(ERa-)肿瘤对它莫西芬治 疗有应答，辅助内分泌疗法在激素受体阴性乳癌中没有位置(EBCTCG(1998)Lancet 351 1451-1467)。在所有乳癌的约20%并且在低分化乳癌中高达70%过量表达Her2基因(Berger MS 等人(1988) Cancer Res 48(5) :1238-43 ；Borg Aet al. (1990) Cancer Res50(14) 4332-7)。主要通过免疫组织化学(IHC)可以常规地评估HER2状况，并且在具有中度表达 的病例中可以通过荧光原位杂交(FISH)分析确定基因扩增状况。HER2过量表达或基因扩 增通常与一种预后不良相关。此外，已经呈现了支持HER2过量表达与对内分泌治疗的抗性 之间的关系的实验资料(Shou J et al. (2004) J Natl Cancer Inst 96(12) =926-35) 然 而，临床资料并不一致(Borg Aet al. (1994) Cancer Lett 81(2) 137-44，De Placido S et al. (2003)Clin Ca Res 9(3) 1039-46，RydenL et al. (2005) J Clin Oncol 23(21) 4695-704)。乳癌是一种真正的异质性疾病，并且尽管对其性质的了解在增加，可用的治疗选 项仍然不是十分满意的。发明的披露本披露的一个方面的一个目的是提供来自HER2细胞外结构域的氨基酸残基的亚 群。本披露其他方面的目的是提供能够与这些亚群相互作用的亲和配体以及包括这些亲和配体的组合物。本披露的某些其他方面的进一步的目的是提供利用这些亚群作为靶标(例 如用于治疗目的)的用途和方法。本发明由所附权利要求定义的。因此，作为本披露的第一方面，提供了一种能够选择性地与一种亚群相互作用的 亲和配体，该亚群是来自HER2的细胞外结构域2和3的37个或更少的连续的氨基酸残基 (SEQ ID NO 7)，所述亚群包括氨基酸序列LQVF (SEQ ID NO 8)和/或ESFD⑶(SEQ ID NO: 9)。在本披露的情况下，“HER2的细胞外结构域2和3”是指由SEQ ID NO 7的氨基酸 残基组成的HER2序列的部分。此外，在本披露的情况下，“来自HER2的细胞外结构域2和3的连续的氨基酸残基” 是指SEQ ID NO :7的氨基酸序列的一个连续的部分。此外，在本披露的情况下，“与一种氨基酸残基的亚群选择性地相互作用，，是指与 包含在该亚群中的氨基酸残基选择性地相互作用。例如，能够与一种氨基酸残基的亚群选 择性地相互作用的一种亲和配体可以能够与由该亚群的氨基酸残基组成的一个片段选择 性地相互作用，这个片段可以在溶液中游离存在或被固定例如结合至一种珠粒上。还有，这 种片段可以结合至报告基因基序上用于相互作用的检测。作为另一个实例，“能够与一种氨 基酸残基的亚群选择性地相互作用的亲和配体”可以是指该亚群被包括在一个长的多肽中 的情况，它是在该亲和配体与该亚群的氨基酸残基相互作用并且不与周围的氨基酸残基相 互作用的前提下建立的。在本披露的情况下，“特异的”或“选择性的”相互作用(例如一种亲和配体与其靶 标或抗原的“特异的”或“选择性的”相互作用)表示该相互作用是这样使得在特异的与非 特异的相互作用之间或在选择性的与非选择性的相互作用之间的区别变得有意义。在两种 蛋白质之间的相互作用有时是通过解离常数测量的。解离常数描述了在两个分子之间的结 合强度(或亲和性)。典型地在一种抗体与其抗原之间的解离常数是从10_7到10_"M。然 而，高的特异性并不是必需要求高的亲和性。对于其对应物具有低亲和性的分子(在摩尔 范围内)已经显示出与具有很高亲和性的分子一样的特异性。在本披露的情况下，一种特 异性或选择性的相互作用是指在给定条件下在一种自然产生的或处理过的生物学流体的 组织样品或液体样品中其他蛋白质存在下，为了确定一种特异性蛋白、靶标蛋白或其一种 片段的存在和/或量的一种特定的方法可使用的程度。换言之，特异性或选择性是用于相 关蛋白之间区分的能力。在本说明书中特异性的与选择性的有时是可互换使用的。例如， 一种抗体的特异性或选择性可以如以下实例部分4中而确定，其中分别使用了一种蛋白 阵列装置、一种悬浮珠粒阵列、以及一种多路竞争测定(multiplexed competition assay) 来进行分析。特异性与选择性测定还被描述于Nilsson P et al. (2005)Proteomics 5 4327-4337。本发明的第一方面是基于但不限于诸位发明人已经发现亲和配体结合至由 HER2的细胞外结构域2和3之内的氨基酸序列组成的多肽，特别是包括序列LQVF(SEQ ID NO 8)和/或ESFD⑶(SEQ ID NO 9)的多肽，这些多肽对人类乳癌细胞的生长具有抑制作用。已经发现一个具有沈个氨基酸残基的多肽片段(SEQ ID NO 16)，以及更短的片段如一个具有21个氨基酸残基的片段(SEQ ID NO :19)、一个具有12个氨基酸残基的片段 (SEQ ID NO 20)、两个具有9个氨基酸残基的片段(SEQ ID NO 15和18)、以及两个具有8 个氨基酸残基的片段(SEQ ID N0:11和17)与展示出一种生长抑制作用的抗体相互作用 (参见图6)。因此，在该第一方面的实施方案中，该亚群可以由30个或更少的氨基酸残基如沈 个或更少的氨基酸残基组成。此外，该亚群可以例如由21个或更少的氨基酸残基，如16个 或更少的氨基酸残基，如12个或更少的氨基酸残基，如9个或更少的氨基酸残基，如8个或 更少的氨基酸残基组成。在一些情况下该亲和配体与该亚群之间一种充分的相互作用可能要求不同长度 的氨基酸序列。因此，在该第一方面的实施方案中，该亚群可以由6个或更多个氨基酸残 基，如由8个或更多个氨基酸残基，如由10个或更多个氨基酸残基组成。如以下实例中所示，一种出产具有生长抑制作用的抗体的免疫法是通过使用一种 抗原(SEQ ID NO 1)来进行的，其中在C末端的最后四个氨基酸残基是LQVF。因此，在该第 一方面的实施方案中，如果该亚群包括该序列LQVF，它可能在LQVF的C端侧上具有2个或 更少的氨基酸残基，如在LQVF的C端侧没有氨基酸残基。即，在一些实施方案中，该亚群的 C端可能由以下组成...LQVFET (在LQVF的C端侧上有两个氨基酸残基)、...LQVFE (在 LQVF的C端侧上有一个氨基酸残基)、...LQVF (在LQVF的C端侧上没有氨基酸残基)。已经发现许多个片段(SEQ ID NO 11以及15-20)与展示了生长抑制作用的抗体 (即msAb-C，见实例部分幻相互作用。因此，在该第一方面的实施方案中，所述亚群可以选 自下组，其组成为=SEQ ID NO 11以及15-20。在该第一方面的进一步的实施方案中，该亚群可以包括该序列LQVF。在这类实施 方案中，该亚群可以选自下组，其组成为SEQ ID N0:11和20。SEQ ID N0:16和20分别包 括 I^QVF。在该第一方面的其他的实施方案中，该亚群可以包括该序列ESFD⑶。在这类实施 方案中，该亚群可以选自下组，其组成为SEQ ID NO :11以及15-19。SEQ ID N0:11以及 15-19的每一个包括ESFDGD。在该第一方面的实施方案中，该亚群可以包括该序列PESFD⑶(SEQ ID NO=IO)或 LPESFDGD(SEQ ID NO :11)。此外，在该第一方面的实施方案中，该亚群可以包括该序列ESFD⑶P，如 PESFD⑶P，如 LPESFDGDP。在该第一方面的实施方案中，该亚群可以是具有SEQ ID NO :6的1_37位的氨基酸 残基的序列。如在以下实例部分5中进一步说明的，诸位发明人已经发现本披露的亲和配体可 以抑制乳癌细胞的生长。因此，在该第一方面的实施方案中，该亲和配体可以抑制人类乳 癌细胞的生长，如在培养物中的人类乳癌细胞。例如，相对于不能够与HER2的细胞外结构 域选择性地相互作用的一种亲和配体，该亲和配体(如能够与HER2的细胞外结构域选择 性地相互作用的一种抗体)可以抑制在培养物中人类乳癌细胞生长的20%-100% (如 30% -100% )。进行产生这样一种相对生长抑制值的测量并且使这类测量适合于一种特定 的情况是在本领域的那些普通技术人员能力之内的。
作为一个实例，相对抑制的测量的可以通过以下方式来进行将某一浓度的亲和 配体加入到人类乳癌细胞的一个第一培养物(如BT474乳癌细胞)，并且将同样浓度的能够 与HER2的细胞外结构域选择性地相互作用的一种抗体(如HPA001383(Atlas Antibodies, Sweden))加入到同样类型的人类乳癌细胞的一个第二培养物。孵育一定的时间(如4天) 后，对各培养物的细胞数进行计数。将在该第二培养物中的细胞数考虑作为参考，并且相对 于该参考计算该亲和配体的生长抑制值。即，若该参考是100个细胞并且该第一培养物包 含70个细胞，则该生长抑制是(100-70)/100 = 30%。参见以下实例部分5。因此，这些人类乳癌细胞例如可以是BT474乳癌细胞。并且此外，该生长抑制例如 可以是在500ng/ml的浓度下的生长抑制。如在以下实例部分如和如中进一步说明的，诸位发明人已经显示本披露的亲和 配体可以在一种低浓度结合它们的靶标。因此，在该第一方面的实施方案中，该亲和配体可 以在低于IOOnM的EC50结合该亚群，如低于50nM，如低于20nM，如低于10nM。EC50的测量 例如可以是根据以下实例部分4c和如来进行。在该第一方面的实施方案中，该亲和配体可以是一种抗体或其片段或衍生物。这 类抗体例如可以是根据本披露的这些实例部分生成的。以下给出了根据该第一方面的亲和配体的进一步的实例(“亲和配体”)。作为该第一方面的一个第一构型，提供了根据该第一方面的一种亲和配体，该亲 和配体用于作为一种药物。存在许多其特征为HER2过量表达的失调，并且结合HER2的细胞外结构域的亲和 配体可以被用于作为一种药物，用于治疗或影响这类失调的进展。因此，作为该第一方面的一个第二构型，提供了一种根据该第一方面亲和配体，该 亲和配体用于一种哺乳动物受试者的治疗，该哺乳动物受试者患有或怀疑患有一种以HER2 过量表达为特征的失调。以下讨论了根据该第一方面的其特征为HER2过量表达的不同失 调的实例("HER2失调”)。在本披露的情况下，“患有一种乳癌的哺乳动物受试者”是指患有一种原发或继发 乳房肿瘤的哺乳动物受试者或已经从乳房去除肿瘤的哺乳动物受试者，其中该肿瘤的去除 是指通过任何类型的手术或治疗杀死或去除该肿瘤。“乳房肿瘤”包括导管原位癌(DCIS)。 在本披露的方法和用途方面中，或在“用于使用的产品”(本披露的构型)中，“患有一种乳 癌的哺乳动物受试者”还包括其中该哺乳动物受试者在进行该用途或方法的时候怀疑为患 有一种乳癌并且随后确立乳癌诊断的情形。此外，在本披露的情况下，“怀疑患有乳癌的一个哺乳动物受试者”例如可以是一 个受试者，该受试者呈现出典型的一种或多种乳癌症候群和/或指示为乳癌的高风险，如 一种早期乳癌或遗传特征，例如在家族中的乳癌的历史。该风险还可以根据一种模型评估， 例如feiil模型。已经报告在用一种抗HER2抗体治疗的癌患者中，该癌症经常发展出针对该抗 HER2抗体的抗性。所以，一种靶向该抗HER2细胞外结构域(而不是该抗HER2抗体)的另 外部分的“新的”亲和配体可以适合用于进一步治疗患有这类癌症的患者。因此，在该第一方面的第二构型的实施方案中，对该受试者可能已经用一种能够 与HER2 (如HER2的细胞外结构域)选择性地相互作用的治疗性抗体进行治疗，这种治疗性抗体与该亲和配体是不同的。此外，在这类实施方案中，这种以HER2过量表达为特征的失调例如可以是一种癌 症，如一种乳癌，例如一种转移性乳癌，该癌症已经发展了对治疗性抗体的抗性。例如，能够与HER2选择性地相互作用的治疗性抗体可以是曲妥珠单抗或帕妥珠 单抗(pertuzumab)。作为本发明的一个第二方面，提供了一种组合物，该组合物包括一种根据该第一 方面的亲和配体，以及一个第二亲和配体，该第二亲和配体能够与具有来自HER2(SEQ ID NO 7)的细胞外结构域2和3的具有73个或更少的连续的氨基酸残基的一个第二亚群选择 性地相互作用，所述第二亚群包括SEQ ID NO 12, SEQ ID N0:13和/或SEQ ID N0:14的
氨基酸序列。这个第二方面是基于但不限于诸位发明人洞察到靶向HER2的细胞外结构域2和 3的两个不同部分的抗体的组合可以导致比仅仅靶向这些部分之一的抗体更强的生长抑制 作用。这在以下实例部分5d-f中进一步讨论了。以下给出了根据该第二方面的第二亲和配体的不同类型的实例(“亲和配体”)。已经发现这些序列SEQ ID NO 21-34与msAb-N相互作用。因此，在该第二方面的实施方案中，该第二亚群可以是选自下组的氨基酸序列，该 组的组成为SEQ ID NO :21-340此外，SEQID NO :21_34 分别是 26、44、27、45、19、39、23、31、70、22、22、23、38、以
及23个氨基酸残基长度(参见图7)。此外，鉴定的表位SEQ ID NO :12-14分别是8、10、以 及16个氨基酸残基长度。因此，在该第二方面的实施方案中，该第二亚群可以是70个或更少的氨基酸残 基、如55个或更少的氨基酸残基、如45个或更少的氨基酸残基、如44个或更少的氨基酸残 基、如39个或更少的氨基酸残基、如38个或更少的氨基酸残基、如31个或更少的氨基酸残 基、如27个或更少的氨基酸残基、如沈个或更少的氨基酸残基、如23个或更少的氨基酸残 基、如22个或更少的氨基酸残基、如19个或更少的氨基酸残基、如16个或更少的氨基酸残 基、如10个或更少的氨基酸残基、如8个或更少的氨基酸残基。此外，该第二方面的这些实施方案的该第二亚群例如可以是8个或更多的氨基酸 残基、如10个或更多的氨基酸残基。这在以上进一步讨论了。在该第二方面的实施方案中，该第二亚群可以是由序列SEQ ID NO :4的39-111位 的氨基酸残基组成的。如在以下实例部分5d_f中进一步说明的，诸位发明人已经发现本披露的抗体的 组合可以抑制乳癌的生长。因此，在该第二方面的实施方案中，该组合物可以抑制人类乳 癌细胞(如在培养物中的人类乳癌细胞)的生长。例如，相对于不能够与HER2的细胞外 结构域选择性地相互作用的一种亲和配体，该组合物(如能够与HER2的细胞外结构域选 择性地相互作用的一种抗体)可以抑制在培养物中人类乳癌细胞生长的20%-100% (如 30% -100% )。进行产生这样一种相对生长抑制值的测量并且使这类测量适合于一种特定 的情况是在本领域的普通技术人员能力之内的。这些人类乳癌细胞例如可以是BT474乳癌 细胞。并且此外，该生长抑制例如可以是在500ng/ml的浓度下的生长抑制。以上描述了与 该第一方面相关的生长抑制测量的一个实例。
如在以下实例部分如和如中进一步说明的，诸位发明人已经显示出本披露的抗 体可以一个低浓度结合它们的靶标。因此，在该第二方面的实施方案中，该第二亲和配体可 以在低于IOOnM的EC50结合该第二亚群，如低于50nM，如低于20nM，如低于ΙΟηΜ。这样的 EC50测量例如可以是根据以下实例部分如和如进行的。在该第二方面的实施方案中，该第二亲和配体可以是一种抗体或其片段或衍生 物。这样一种抗体例如可以是根据本披露的这些实例部分生成的。以下讨论了适合于该第 二方面的该第二亲和配体的亲和配体的其他类型(“亲和配体”)。为了加强和/或延长一种根据该第一方面亲和配体或一种根据该第二方面的组 合物的作用，或为了抵消抗性的发展，该亲和配体或组合物可以与一种靶向地针对HER2的 酪氨酸激酶抑制剂相组合。因此，作为该第二方面的一个变体，提供了一种组合物，该组 合物包括一种根据该第一方面的亲和配体或一种根据该第二方面的组合物；以及一种 针对HER2的酪氨酸激酶抑制剂。该针对HER2的酪氨酸激酶抑制剂例如可以是拉帕替尼 (Iapatinib)、吉非替尼(gefitinib)、或厄洛替尼(erlotinib)。作为该第二方面的一个第一构型，提供了根据该第二方面的一种组合物，该组合 物用于作为一种药物。存在许多其特征为HER2过量表达的失调，并且包括结合HER2的细胞外结构域的 亲和配体的组合物可以用于作为一种药物，用于治疗或影响这类失调的进展。因此，作为该第二方面的一个第二构型，其中提供了一种根据该第二方面的组合 物，该组合物用于一种哺乳动物受试者的治疗，该哺乳动物受试者患有或怀疑患有一种以 HER2过量表达为特征的失调。以下讨论了根据该第二方面的其特征为HER2过量表达的不 同失调的实例("HER2失调”)。如以上所叙述，已经报告在用一种抗HER2抗体治疗的癌症患者中，该癌症可能发 展针对该抗HER2抗体的抗性。因此，一种包括靶向抗HER2的细胞外结构域的其他部分的 抗体(而不是抗HER2抗体)的组合物可以适合用于进一步治疗患有这类癌症的患者。因此，在该第二方面的第二构型的实施方案中，对该受试者可能已经用一种能够 与HER2(如HER2的细胞外结构域)选择性地相互作用的治疗性抗体治疗，该治疗性抗体与 该亲和配体或该第二亲和配体是不同的。此外，在这类实施方案中，这种以HER2过量表达为特征的失调例如可以是一种癌 症，如一种乳癌，例如一种转移性乳癌，这些癌症已经发展了对该治疗性抗体的抗性。例如，能够与HER2选择性地相互作用的治疗性抗体可以是曲妥珠单抗或帕妥珠 单抗。作为本披露的一个第三方面，提供了一种分离的多肽，该多肽由来自HER2的细胞 外结构域2和3的37个或更少的连续的氨基酸残基(SEQ ID NO 7)组成，并且包括该氨基 酸序歹丨J LQVF (SEQ ID NO 8)和 / 或 ESFDGD (SEQ ID NO 9)。本披露的这个第三方面是基于但不限于诸位发明人洞察到HER2的细胞外结构 域的某些部分是特别令人感兴趣的，例如作为一种治疗靶标，并且可以利用包括或其组成 为这类部分的那些片段进行治疗物的生产、选择、或纯化。已经发现具有沈个氨基酸残基的一个多肽片段(SEQ ID NO 16)，以及更短的片 段如一个具有21个氨基酸残基的片段(SEQ ID NO 19)、一个具有12个氨基酸残基的片段(SEQ ID NO 20)、两个具有9个氨基酸残基的片段(SEQ ID NO 15和18)、以及两个具有8 个氨基酸残基的片段(SEQ ID N0:11和17)与展示出一种生长抑制作用的抗体相互作用。因此，在该第三方面的实施方案中，该多肽可以由31个或更少的氨基酸残基，如 26个或更少的氨基酸残基，如21个或更少的氨基酸残基，如16个或更少的氨基酸残基，如 12个或更少的氨基酸残基，如9个或更少的氨基酸残基，如8个或更少的氨基酸残基组成。在一种亲和配体(如该第一方面的一种亲和配体)与该多肽之间的一种充分的相 互作用在一些情况下可能要求不同长度的氨基酸序列。因此，在该第三方面的实施方案中， 该多肽可以由6个或更多个氨基酸残基，如8个或更多个氨基酸残基，如10个或更多个氨 基酸残基组成。如以下实例部分1和2中所示，一种出产具有生长抑制作用的抗体的免疫法是通 过使用一种抗原(SEQ ID N0:1)来进行的，其中在C末端的最后四个氨基酸残基是LQVF。 因此，在该第三方面的实施方案中，如果该多肽包括该序列LQVF，则它在该LQVF的C端侧 具有2个或更少的氨基酸残基，如在该LQVF的C端侧没有氨基酸残基。即，在一些实施 方案中，该多肽的C端可能由以下组成...LQVFET(在LQVF的C端侧上有两个氨基酸残 基)、...LQVFE (在LQVF的C端侧上有一个氨基酸残基)、或...LQVF (在LQVF的C端侧上 没有氨基酸残基)。已经发现许多片段(SEQ ID NO 11以及15-20)与展示了生长抑制作用的抗体(即 msAb-C，见实例部分3)相互作用。因此，在该第三方面的实施方案中，该多肽可以选自下 组，其组成为=SEQ ID NO 11以及15-20。在该第三方面的进一步的实施方案中，该多肽可以包括该序列LQVF(SEQ ID NO
8)。在这类实施方案中，该多肽例如可以选自下组，其组成为SEQID NO :16和20。SEQ ID NO 16 禾口 20 包括 LQVF。此外，在该第三方面的实施方案中，该多肽可以包括该序列ESFD⑶(SEQ ID NO
9)。在这类实施方案中，该多肽例如可以选自下组，其组成为SEQID NO=Il以及15-19。更进一步地，在该第三方面的实施方案中，该多肽可以包括该序列PESFD⑶(SEQ ID NO: 10)或 LPESFDGD (SEQ ID NO :11)。在该第三方面的实施方案中，该多肽可以由SEQ ID NO :6的1_37位的氨基酸残基 的序列组成。(即以LQVF结尾的SEQ ID NO :6的一个37个氨基酸残基长度的子序列。)作为该第三方面的一种构型，其中提供了根据该第三方面的一种多肽，用于作为 一种抗原如一种用于例如非人类哺乳动物的免疫的抗原。作为它的一种相关构型，其中提供了根据该第三方面的一种多肽，用于在制备治 疗性抗体(例如为用于治疗其特征为HER2的过量表达的失调的治疗性抗体)中使用。以 下讨论了根据该第三方面的其特征为HER2过量表达的不同失调的实例(“HER2失调”)。作为本披露的一个第四方面，其中提供了根据该第三方面的一种多肽用于作为一 种抗原如一种用于例如非人类哺乳动物的免疫的抗原的用途。以下进一步讨论了其中根据该第三方面的一种多肽用作一种抗原的用途和方法。作为该第四方面的一个第一构型，其中提供了根据该第三方面的一种多肽在一种 治疗性抗体(如一种治疗性单克隆抗体，例如一种治疗性嵌合抗体或人源化单克隆抗体) 的制备中的用途。
作为一个实例，单克隆抗体可以通过融合来自已经用该多肽免疫的小鼠的脾细胞 和骨髓瘤细胞而制备。此外，兔B细胞也可用于这一目的。然后可以稀释细胞的这种混合物，并且可以从单个母细胞生长出克隆。然后可以 测试由这些不同的克隆分泌的抗体结合至该多肽的能力。随后，可以在培养基中生长一种 稳定的和/或生产的克隆到一个高的量。例如，可以将编码来自该稳定克隆的单克隆鼠抗体的结合部分的DNA与编码人类 抗体的DNA合并。然后可以用哺乳动物的细胞培养物表达基因工程DNA并且生产鼠-人抗 体。论及嵌合抗体或人源化抗体，取决于该鼠抗体部分的大小。作为另一个实例，可以涉及 基因工程鼠以产生更多的人源样抗体(human-like antibody) 0用于生产单克隆抗体和抗体的人源化的方法对技术人员是熟知的。将以上所描述的编码人类抗体的DNA或涉及基因工程鼠的合并的一个原因是避 免人类免疫系统将这些抗体识别为外来的。然后可以将这些嵌合抗体或人源化抗体用作治疗性抗体，例如用于治疗其特征为 HER2过量表达的失调。作为该第四方面的一个第二构型，其中提供了根据该第三方面的一种多肽的用 途，用于选择或纯化一种治疗性亲和配体，该治疗性亲和配体用于治疗一种以HER2过量表 达为特征的失调。以下讨论了根据该第四方面的其特征为HER2过量表达的不同失调的实 例("HER2失调”)。以下给出了根据该第四方面的治疗性亲和配体的实例(“亲和配体”)。例如，这样的使用可以包括在一种固相支持物(其上已经固定该多肽)上的亲和 纯化。例如可以将该固相支持物安排在一个柱中。此外，该使用可以包括使用一种固相支持 物(其上已经固定该多肽)的亲和配体的选择，该亲和配体具有根据该第三方面的一种多 肽的特异性。这样的固相支持物可以是96孔板、磁珠、琼脂糖珠粒或琼脂糖凝胶珠粒。此 外，该使用可以包括在一种可溶基质(例如使用一种葡聚糖基质)上的亲和配体的分析，或 在一种表面等离子共振仪(如一种Biacore 仪)中的使用，其中该分析例如可以包括监测 固定的多肽与许多潜在的亲和配体的亲合性。作为该第四方面的一个第三构型，其中提供了根据该第三方面的一种多肽作为一 种治疗靶标的用途。作为一个第五方面，其中提供了根据该第一方面亲和配体的用途。作为该第五方面的一个第一构型，其中提供了根据该第一方面的一种亲和配体作 为一种药物的用途。作为该第五方面的一个第二构型，其中提供了一种根据该第一方面的亲和配体的 用途，用于制造用于治疗一种哺乳动物受试者的药物，该哺乳动物受试者患有或怀疑患有 一种以HER2过量表达为特征的失调。以下讨论了根据该第五方面的其特征为HER2过量表 达的不同失调的实例(“HER2失调”)在该第五方面的该第二构型的实施方案中，对该受试者已经用一种能够与 HER2(如HER2的细胞外结构域)选择性地相互作用的治疗性抗体治疗，这种治疗性抗体与 该亲和配体是不同的。此外，在该第五方面的该第二构型的实施方案中，这种以HER2过量表达为特征的失调例如可以是一种癌症，如一种乳癌，例如一种转移性乳癌，该癌症已经发展了于该治疗 性抗体的抗性。如以上进一步讨论了与该第一方面的第一和第二构型相关的该第五方面的第一 和第二构型的细节。作为本披露的一个第六方面，其中提供了用于鉴定一种亲和配体的方法，该亲和 配体用于治疗一种以HER2过量表达为特征的失调，该方法包括以下步骤a)使一种多肽与一种公认的亲和配体接触，该多肽包括根据该第一方面的亚群； 以及b)确定是否该公认的亲和配体结合至该亚群。在该第六方面的实施方案中，步骤a)可以是使根据该第三方面的一种多肽与一种公认的亲和配体在使之能够结合的条件下 进行接触；并且步骤b)可以是确定是否该公认的亲和配体结合至该多肽。以下给出了根据该第六方面的其特征为HER2过量表达的不同失调的实例(“HER2 失调”)。此外，以下给出了根据该第六方面的亲和配体的实例(“亲和配体”)。这个第六方面是基于但不限于诸位发明人洞察到与鉴定的HER2的细胞外结构 域的靶序列对应的蛋白片段可能对于鉴定或选择治疗性亲和配体是有用的。在该第六方面的实施方案中，其中该失调是一种癌症，如一种乳癌，该方法可以进 一步包括以下步骤c)确定是否该公认的亲和配体抑制了癌细胞的生长或诱导了癌细胞的凋亡，如乳 癌细胞，例如BT474乳癌细胞。例如，与一种靶向HER2胞内部分的抗体相比，步骤c)的标准可以是该公认的亲和 配体抑制生长的20%或更高、如30%或更高。例如，该公认的亲和配体在一个250ng/ml或 500ng/ml的浓度下可以抑制生长。这样的测定例如可以如以下实例部分5进行。作为该第六方面的一个第一构型，其中提供了用于鉴定一种或多种亲和配体的方 法，这些亲和配体用于治疗一种以HER2过量表达为特征的失调，该方法包括以下这些步 骤a)使根据该第三方面的一种多肽与一种或多种公认的亲和配体接触；并且b)鉴定结合至该多肽的亲和配体。作为该第六方面的一个第二构型，其中提供了一种方法，该方法用于生产一种克 隆，例如表达一种治疗性抗体的克隆，该治疗性抗体用于治疗一种以HER2过量表达为特征 的失调，该方法包括a)提供从一种哺乳动物获得的细胞，该哺乳动物已经用一种抗原免疫，该抗原包 括一种根据该第一方面的亚群，这些细胞包括编码能够与该亚群选择性地相互作用的一种 抗体的DNA;并且b)将所述细胞与骨髓瘤细胞融合以获得至少一个克隆。在本披露的情况下，“一个克隆”是指一群相同的细胞，这些细胞共享一个共同祖先(common ancestry)，即衍生自同一个母细胞。例如，步骤b)可以包括培养。在该第六方面的第二构型的实施方案中，该方法进一步包括以下步骤a’ )用该抗原免疫该哺乳动物，其中步骤a’ )先于步骤a)。例如，步骤a)的哺乳动物可以是一个非人类哺乳动物。此外，在步骤a)中提供的这些细胞例如可以是脾细胞。并且，步骤a)的哺乳动物 例如可以是一种鼠。因此，在步骤a)中提供的这些细胞例如可以是来自一种鼠的脾细胞。可替代地，在步骤a)中提供的这些细胞例如可以是B细胞。此外，步骤a)的哺乳 动物例如可以是一种兔。因此，在步骤a)中提供的这些细胞例如可以是兔的B细胞。在该第六方面的第二构型的实施方案中，该方法可以进一步包括以下步骤c)选择来自步骤b)的一种克隆，该克隆分泌能够与该亚群选择性地相互作用的 抗体。此外，在该第六方面的该第二构型的实施方案中，该抗原可以由根据该第三方面 的一种多肽组成。在这类实施方案中，如果该方法包括步骤c)，则选择一种分泌能够与该抗 原选择性地相互作用的抗体的克隆。还有，在该第六方面的第二构型的实施方案中，该方法可以进一步包括以下步 骤d)提供在步骤b)中获得的或在步骤C)中选择的一种克隆，并且将来自该克隆的 DNA(其中来自该克隆的DNA编码由该克隆表达的一种抗体的至少与该亚群选择性地相互 作用的这个部分)与编码人类抗体的DNA合并；并且e)将来自步骤d)合并的DNA结合进细胞以获得用于表达一种治疗性抗体的一种 克隆，该治疗性抗体用于治疗一种以HER2过量表达为特征的失调。例如，步骤e)可以包括培养。步骤e)的克隆例如可以是一种哺乳动物细胞系。由步骤e)的这个克隆表达的治 疗性抗体例如可以是嵌合抗体或人源化抗体。作为该第六方面的一个第三构型，其中提供了一种生产亲和配体(如一种抗体， 例如一种治疗性抗体)的方法，该方法包括使用根据该第六方面的方法鉴定一种亲和配 体；并且生产所述的鉴定的亲和配体。特别地，如果通过本披露的传授内容的指导来生产这 样的鉴定的亲和配体是在技术人员的能力范围之内的。作为该第六方面的一个第四构型，其中提供了一种生产亲和配体(如一种抗体， 例如一种治疗性抗体)的方法，该方法包括使用根据该第六方面的该第二构型的方法生 产一种克隆；并且从所述克隆获得所述亲和配体。特别地，如果通过本披露传授的内容指导 来生产来自该克隆的亲和配体是在技术人员的能力范围之内的。例如，从该克隆获得所述 亲和配体可以包括启动该亲和配体(例如一种抗体)的表达，并且收获该随后分泌的亲和 配体(例如抗体)。作为本披露的一个第七方面，其中提供了一种治疗一个哺乳动物受试者的方法， 该哺乳动物受试者患有或怀疑患有一种以HER2过量表达为特征的失调，该方法包括对该 受试者给予一个有效量的根据该第一方面的一种亲和配体或根据该第二方面的一种组合 物。
以下讨论了根据该第七方面的其特征为HER2过量表达的不同失调的实例(“HER2 失调”)。在该第七方面的实施方案中，该方法可以进一步包括对该受试者给予一种针对 HER2的酪氨酸激酶抑制剂。此外，在该第七方面的实施方案中，该治疗可以是一种手术前的治疗。因此，例如 可以根据该第七方面治疗怀疑患有一种乳癌或具有乳癌复发的高风险的一个受试者或具 有预定的乳癌外科手术的受试者。可替代地，在该第七方面的实施方案中，该治疗可以是一种手术后的治疗。此外，该治疗可以是手术前和手术后的治疗，例如，可以在外科手术去除一个乳癌 肿瘤之前对该受试者给予该亲和配体或组合物的一个第一有效量，并且在外科手术去除该 乳癌肿瘤之后对该受试者给予该亲和配体或组合物的一个第二有效量。在该第七方面的实施方案中，对该受试者可能已经用一种能够与HER2 (如HER2的 细胞外结构域)选择性地相互作用的治疗性抗体治疗，该治疗性抗体与该亲和配体是不同 的。这样的治疗性抗体例如可以是曲妥珠单抗或帕妥珠单抗。在该第七方面的这类实施方案中，这种以HER2过量表达为特征的失调可以是一 种癌症(如一种乳癌)，该乳癌已经发展了对该治疗性抗体的抗性。作为本发明的一个第八方面，其中提供了一种制造品，包括一种容器；在该容器 内的一种组合物，该组合物包括一种根据该第一方面的亲和配体或根据该第二方面的一种 组合物；以及在该容器上或与该容器相关的一种标签，该标签表明所述组合物可以用于治 疗一种以HER2过量表达为特征的失调。例如，该容器可以是一个瓶子、小瓶、或注射器。该容器可以是从许多种材料(如 玻璃或塑料)形成的。该容器容纳一种用于治疗该失调有效的亲和配体或组合物，并且可 以具有一个无菌入口。例如，该容器可以是一种静脉输液袋或一种小瓶(具有一个可通过 皮下注射针刺穿的塞子)。例如，该制造品可以进一步包括一个第二容器，该第二容器包括 一种药学上可接受的缓冲剂，如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液、或葡萄糖溶液。并且，该制造 品可以进一步包含来自一种商业的以及使用者立场的其他的所期望的材料，包括其他的缓 冲剂、稀释剂、过滤器、针头、以及注射器。例如，该制造品可以另外包括一种具有使用说明 书的包装插件。例如这可以是用于外科手术前和/或外科手术后使用的说明书和/或用于 对一个受试者给药的说明书，该受试者患有一种癌，该癌症已经发展了针对治疗性抗HER2 抗体的抗性。以下讨论了根据该第八方面的其特征为HER2过量表达的不同失调的实例(“HER2 失调”)。作为本披露的一个第九方面，其中提供了一种亲和配体，该亲和配体是该第二方 面的第二亲和配体。作为该第九方面的一个第一构型，其中提供了根据该第九方面的一种亲和配体， 该亲和配体用于作为一种药物。存在多种其特征为HER2过量表达的失调，并且结合HER2的细胞外结构域的亲和 配体可以用于作为一种药物，用于治疗或影响这类失调的进展。因此，作为该第九方面的一个第二构型，其中提供了根据该第九方面的亲和配体，该亲和配体用于治疗其特征为HER2过量表达的失调。以下讨论了根据该第九方面的其特 征为HER2过量表达的不同失调的实例(“HER2失调”)如以上所叙述，已经报告在用一种抗HER2抗体治疗的癌患者中，该癌症经常发 展出针对该抗HER2抗体的抗性。因此，一种靶向HER2的细胞外结构域的其他部分的“新 的”亲和配体(而不是抗HER2抗体)可以适合用于进一步治疗患有这类癌症的患者。因此，在该第九方面的第二构型的实施方案中，对该受试者可能已经用一种能够 与HER2(如HER2的细胞外结构域)选择性地相互作用的治疗性抗体治疗，该治疗性抗体与 根据该第九方面的亲和配体是不同的。此外，在这类实施方案中，这种以HER2过量表达为特征的失调例如可以是一种癌 症(如一种乳癌，例如一种转移性乳癌)，这些癌已经发展了对于该治疗性抗体的抗性。例如，能够选择性地与HER2相互作用的治疗性抗体可以是曲妥珠单抗或帕妥珠 单抗。作为本披露的一个第十方面，其中提供了一种分离的多肽，该分离的多肽由来自 HER2的细胞外结构域2和3的73个或更少的连续的氨基酸残基(SEQ ID NO 7)组成，并 且包括 LQVF(SEQ ID NO :12)、SEQ ID NO :13 禾口 / 或 SEQ ID NO 14 的氨基酸序列。本披露的这个第十方面是基于但不限于诸位发明人洞察到HER2的细胞外结构 域的某些部分是特别令人感兴趣的，例如作为一种治疗靶标，并且可以利用包括或其组成 为这类部分的那些片段用于治疗物的生产、选择、或纯化。在该第十方面的实施方案中，该多肽可以由选自下组的一个氨基酸序列组成，该 组的组成为=SEQ ID NO :21-340这些多肽SEQ ID NO :21-34 (已经发现它们与msAb-N相互作用)分别具有沈、44、 27、45、19、39、23、31、70、22、22、23、38以及23个氨基酸残基的长度(参见图7)。并且，这 些鉴定的表位SEQ ID NO :12-14分别具有8、10以及16个氨基酸残基的长度。因此，在该第十方面的实施方案中，该多肽可以是由70个或更少的氨基酸残基组 成、如55个或更少的氨基酸残基、如45个或更少的氨基酸残基、如44个或更少的氨基酸残 基、如39个或更少的氨基酸残基、如38个或更少的氨基酸残基、如31个或更少的氨基酸残 基、如27个或更少的氨基酸残基、如沈个或更少的氨基酸残基、如23个或更少的氨基酸 残基、如22个或更少的氨基酸残基、如19个或更少的氨基酸残基、如16个或更少的氨基酸 残基、如10个或更少的氨基酸残基、如8个或更少的氨基酸残基。如以上叙述，在一种亲和配体(如该第九方面的一种亲和配体)与该多肽之间的 一种充分的相互作用在一些情况下可能要求不同长度的氨基酸序列。因此，在该第十方面 的实施方案中，该多肽可以由6个或更多个氨基酸残基，如8个或更多个氨基酸残基，如10 个或更多个氨基酸残基组成。在该第十方面的进一步的实施方案中，该多肽可以包括序列SEQ ID NO :12。在这 类实施方案中，该多肽例如可以由包括SEQ ID N0:12的序列SEQ ID NO :21-34的任一个组 成。在该第十方面的进一步的实施方案中，该多肽可以包括序列SEQ ID NO :13。在这 类实施方案中，该多肽例如可以由包括SEQ ID N0:13的序列SEQ ID NO :21-34的任一个组 成。
在该第十方面的此外的实施方案中，该多肽可以包括序列SEQ ID NO :14。在这类 实施方案中，该多肽例如可以由包括SEQ ID N0:14的序列SEQ ID NO :21-34的任一个组 成。在该第十方面的实施方案中，该多肽可以是由序列SEQ IDNO 4的39-111位的氨
基酸残基组成。作为该第十方面的一种构型，其中提供了根据该第十方面的一种多肽用于作为一 种抗原使用，如一种用于(例如非人类哺乳动物的)免疫法的抗原。作为其一种相关的构型，其中提供了根据该第十方面的一种多肽用于制备治疗性 抗体(例如用于治疗其特征为HER2的过量表达的失调的治疗性抗体)。以下讨论了根据该 第十方面的其特征为HER2过量表达的不同失调的实例(“HER2失调”)作为本披露的一个第十一方面，其中提供了根据该第十一方面的一种多肽作为一 种抗原如一种用于免疫(例如一种非人类哺乳动物的免疫)的抗原的用途。以下进一步讨论了其中根据该第十方面的一种多肽用作一种抗原的用途和方法。作为该第十一方面的一个第一构型，其中提供了根据该第十方面的一种多肽在一 种治疗性抗体(如一种治疗性单克隆抗体，例如一种治疗性嵌合单克隆抗体或人源化单克 隆抗体)的制备中的用途。结合该第四方面的第一构型在以上进一步论述了这种情况。作为该第十一方面的一个第二构型，其中提供了根据该第十方面的一种多肽用 于选择或纯化一种治疗性亲和配体，该治疗性亲和配体用于治疗一种以HER2过量表达为 特征的失调。以下讨论了根据该第十一方面的其特征为HER2过量表达的不同失调的实例 ("HER2 失调”)例如，这样的用途可以包括在一种固相支持物(其上已经固定该多肽)上的亲和 纯化。例如可以将该固相支持物安排在一个柱中。此外，该用途可以包括选择对根据该第 十方面的一种多肽具有特异性的亲和配体，通过使用一种固相支持物(其上已经固定该多 肽)。这样的固相支持物可以是96孔板、磁珠、琼脂糖珠粒或琼脂糖凝胶珠粒。此外，该使 用可以包括在一种可溶基质(例如使用一种葡聚糖基质)上的亲和配体的分析，或在一种 表面等离子共振仪(如一种Biacore 仪)中的使用，其中该分析例如可以包括监测固定的 多肽与许多潜在的亲和配体的亲合性。以下给出了根据该第十一方面的治疗性亲和配体的实例(“亲和配体”)。作为该第十一方面的一个第三构型，其中提供了根据该第十方面的一种多肽作为 一种治疗靶标的用途。作为一个第十二方面，其中提供了根据该第九方面的亲和配体的用途。作为该第十二方面的一个第一构型，其中提供了根据该第九方面的一种亲和配体 作为一种药物的用途。作为该第十二方面的一个第二构型，其中提供了一种根据该第九方面的亲和配体 的用途，用于制造用于治疗一种哺乳动物受试者的药物，该哺乳动物受试者患有或怀疑患 有一种以HER2过量表达为特征的失调。以下讨论了根据该第十二方面的其特征为HER2过 量表达的不同失调的实例(“HER2失调”)在该第十二方面的该第二构型的实施方案中，对该受试者可能已经用一种能够与 HER2(如HER2的细胞外结构域)选择性地相互作用的治疗性抗体治疗，这种治疗性抗体与该亲和配体是不同的。并且，在该第十二方面的该第二构型的实施方案中，这种以HER2过量表达为特征 的失调可以是一种癌症，如一种乳癌，例如一种转移性乳癌，该癌症已经发展了对该治疗性 抗体的抗性。以上进一步讨论了与该第九方面的第一和第二构型相关的该第十二方面的第一 和第二构型的主题。作为本披露的一个第十三方面，其中提供了用于鉴定一种亲和配体的方法，该亲 和配体用于治疗一种以HER2过量表达为特征的失调，该方法包括以下这些步骤a)使一种多肽与一种公认的亲和配体接触，该多肽包括根据该第二方面的一个第 二亚群；并且b)确定是否该公认的亲和配体结合至该第二亚群。在该第十三方面的实施方案中，步骤a)可以是使根据该第十方面的一种多肽与一种公认的亲和配体在使之能够结合的条件下 接触；并且步骤b)可以是确定是否该公认的亲和配体结合至该多肽。以下给出了根据该第十三方面的其特征为HER2过量表达的不同失调的实例 ("HER2 失调”)。此外，以下给出了根据该第十三方面的亲和配体的实例(“亲和配体”)。这个第十三方面是基于但不限于诸位发明人洞察到与HER2的细胞外结构域的 鉴定的靶序列对应的蛋白片段可能对于鉴定或选择治疗性亲和配体是有用的。在该第十三方面的实施方案中，其中该失调是一种癌症如一种乳癌，该方法可以 进一步包括以下步骤c)确定是否该公认的亲和配体抑制了癌细胞的生长或诱导了癌细胞的凋亡，如乳 癌细胞，例如BT474乳癌细胞。例如，步骤c)的标准可以是该公认的亲和配体比一种靶向HER2胞内部分的抗 体更能抑制生长。例如，该公认的亲和配体在250ng/ml或500ng/ml的浓度下可以抑制生长。这样的测定例如可以如以下实例部分5而进行。作为该第十三方面的一个第一构型，其中提供了用于鉴定一种或多种亲和配体的 方法，这些亲和配体用于治疗一种以HER2过量表达为特征的失调，该方法包括以下步骤a)使根据该第十方面的一种多肽与一种或多种公认的亲和配体接触；并且b)鉴定结合至该多肽的亲和配体。作为该第十三方面的一个第二构型，其中提供了一种生产一种克隆的方法，例如 表达一种治疗性抗体的克隆，该治疗性抗体用于治疗一种以HER2过量表达为特征的失调， 该方法包括a)提供从一种哺乳动物获得的细胞，该哺乳动物已经用一种抗原免疫，该抗原包 括根据该第二方面的第二亚群，这些细胞包括编码能够与该亚群选择性地相互作用的一种 抗体的DNA;并且b)使所述细胞与骨髓瘤细胞融合以获得至少一个克隆。
例如，步骤b)可以包括培养。在该第十三方面的第二构型的实施方案中，该方法进一步包括以下步骤a’ )用该抗原免疫该哺乳动物，其中步骤a’ )先于步骤a)。例如，步骤a)的该哺乳动物可以是一种非人类哺乳动物。此外，在步骤a)中提供的这些细胞例如可以是脾细胞。并且，步骤a)的哺乳动物 例如可以是一种鼠。因此，在步骤a)中提供的这些细胞例如可以是来自一个小鼠的脾细 胞。可替代地，在步骤a)中提供的这些细胞例如可以是B细胞。此外，步骤a)的哺乳 动物例如可以是一种兔。因此，例如可以由兔B细胞提供步骤a)中的这些细胞。在该第十三方面的第二构型的实施方案中，该方法可以进一步包括以下步骤c)选择来自步骤b)的一种克隆，该克隆分泌能够与该亚群选择性地相互作用的 抗体。此外，在该第十三方面的该第二构型的实施方案中，该抗原可以由根据该第十方 面的一种多肽组成。在这类实施方案中，如果该方法包括步骤c)，则选择一种分泌能够与该 抗原选择性地相互作用的抗体的克隆。并且，在该第十三方面的第二构型的实施方案中，该方法可以进一步包括以下步 骤d)提供在步骤b)中获得的或在步骤C)中选择的一种克隆，并且将来自该克隆的 DNA(其中来自该克隆的DNA编码了由该克隆表达的一种抗体的至少与该亚群选择性地相 互作用的这个部分)与编码人类抗体的DNA合并；并且f)将来自步骤d)合并的DNA结合进细胞以获得用于表达一种治疗性抗体的克隆， 该治疗性抗体用于治疗一种以HER2过量表达为特征的失调。例如，步骤e)可以包括培养。步骤e)的该克隆例如可以是一种哺乳动物细胞系。由步骤e)的该克隆表达的这 些治疗性抗体例如可以是嵌合抗体或人源化抗体。作为该第十三方面的一个第三构型，其中提供了一种生产亲和配体(如一种抗 体，例如一种治疗性抗体)的方法，该方法包括使用根据该第十三方面的方法鉴定一种亲 和配体；并且生产所述鉴定的亲和配体。特别地，如果通过本披露的传授内容的指导来生产 这样的鉴定的亲和配体是在技术人员的能力范围之内的。作为该第六方面的一个第四构型，其中提供了一种生产亲和配体(如一种抗体， 例如一种治疗性抗体)的方法，该方法包括使用根据该第十三方面的该第二构型的方法 生产一种克隆；并且从所述克隆获得所述亲和配体。特别地，如果通过本披露的传授内容的 指导从该克隆获得该亲和配体是在技术人员的能力范围之内的。例如，从该克隆获得所述 亲和配体可以包括启动该亲和配体(例如一种抗体)的表达，并且收获该随后分泌的亲和 配体(例如抗体)。作为本披露的一个第十四方面，其中提供了一种治疗哺乳动物受试者的方法，该 哺乳动物受试者患有或怀疑患有一种以HER2过量表达为特征的失调，该方法包括对该受 试者给予一个有效量的一种根据该第九方面的亲和配体。
以下讨论了根据该第十四方面的其特征为HER2过量表达的不同失调的实例 ("HER2 失调”)。在该第十四方面的实施方案中，该方法可以进一步包括对该受试者给予一种针对 HER2的酪氨酸激酶抑制剂。此外，在该第十四方面的实施方案中，该治疗可以是一种手术前的治疗。因此，例 如可以根据该第十四方面治疗怀疑患有一种乳癌或具有乳癌复发的高风险的一个受试者 或具有预定的一种乳癌外科手术的受试者。可替代地，在该第十四方面的实施方案中，该治疗可以是一种手术后的治疗。此外，该治疗可以是手术前和手术后的治疗，例如，可以在外科手术去除一个乳癌 肿瘤之前对该受试者给予该亲和配体的一个第一有效量，并且在外科手术去除该乳癌肿瘤 之后对该受试者给予该亲和配体的一个第二有效量。在该第十四方面的实施方案中，对该受试者可能已经一种能够与HER2(如HER2的 细胞外结构域)选择性地相互作用的治疗性抗体治疗，该治疗性抗体与该亲和配体是不同 的。这样的治疗性抗体例如可以是曲妥珠单抗或帕妥珠单抗。在该第十四方面的这类实施方案中，这种以HER2过量表达为特征的失调可以是 一种癌症，如一种乳癌，该癌症已经发展了对该治疗性抗体的抗性。作为本发明的一个第十五方面，其中提供了一种制造品，包括一种容器；在该容 器内的一种组合物，该组合物包括一种根据该第九方面的亲和配体；以及在该容器上或与 该容器相关的一种标签，该标签表明所述组合物可以用于治疗一种以HER2过量表达为特 征的失调。以下讨论了根据该第十五方面的其特征为HER2过量表达的不同失调的实例 ("HER2 失调”)亲和配体根据本披露的以上方面的不同实施方案的亲和配体，如该第一方面的亲和配体以 及该第二方面的第二亲和配体，可以独立地是任何类型的亲和配体。尽管如此，以下给出在本披露的情况下可以证明有用的这类亲和配体的实例。因此，在以上方面的实施方案中，这些亲和配体可以是独立地选自下组，其组成 为抗体、其片段以及其衍生物，即基于一种免疫球蛋白支架的亲和配体。例如，这些抗体 可以是分离的和/或单特异性的。抗体包括任何起源的单克隆和多克隆抗体，包括鼠、兔、 人以及其他抗体，连同包括来自不同物种的序列的嵌合抗体，如部分人源化抗体或人源化 抗体，如部分人源化鼠抗体或人源化鼠抗体。最初，通过用选择的抗原免疫动物而制造抗 体；然后从血液/血清中纯化多克隆抗体，而可以使用由Kiihler和Milstein研制的杂交 瘤技术生产限定特异性的单克隆抗体(K5hler G和Milstein C(1976)Eur. J. Immunol. 6 511-519)。抗体片段以及衍生物包括Fab片段，这些Fab片段包括一个完整的免疫球 蛋白的重链的第一恒定域(CH1)、轻链的恒定域(CL)、重链的可变域(VH)、以及轻链的 可变域(VL) ；Fv片段，这些Fv片段包括这两个可变抗体结构域VH和VL(Skerra A and PluckthunA(1988) Science 240:1038-1041)；单链 Fv 片段(scFv)，这些单链 Fv 片段包 括由一种柔性连接肽连接在一起的两个VH和VL结构域(Bird RE and Walker Bff(1991) Trends Biotechnol. 9 :132-137) ；Bence Jones 二聚体(Stevens FJ et al. (1991)Biochemistry 30 :6803-6805)；骆驼科动物重链二聚体(Hamers-Casterman C et al. (1993) Nature 363 :446-448)以及单链可变域(Cai X and Garen A (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 93 :6280-6285 ；Masat L et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91 893-896)，以及单域支架，像例如来自护士鲨(nurse shark)的新抗原受体(New Antigen Receptor, NAR) (Dooley H et al. (2003)Mol. Immunol. 40 :25-33)以及基于一种可变重 链结构域的微型抗体(minibodies) (Skerra A and Pluckthun A(1988) Science 240 1038-1041)。抗体连同它们的片段和衍生物代表了在治疗应用中亲和配体的传统选择。然而， 在本领域中的那些普通技术人员认识到例如由于选择性结合配体的高流通量生产以及低 成本生产系统的要求的增加，已经在最近十年期间研发了新的生物分子多样性技术。这已 经能够使免疫球蛋白连同非免疫球蛋白(作为结合配体例如在治疗应用中有用，并且可以 代替或与免疫球蛋白一起使用)二者起源的新类型的亲和配体的产生。需要用于亲和配体选择的生物分子多样性可以通过多种可能的支架分子之一的 组合工程而产生，并且然后使用一种适当的选择平台来选择特异性和/或选择性亲和配 体。该支架分子可以是免疫球蛋白起源的(Bradbury AR和Marks JD (2004) J. Immunol. Meths. 290 :29-49)，非免疫球蛋白起源的(Nygren P人禾口 Skerra A(2004) J. Immunol. Meths.四0 :3-28)，或一种寡核苷酸起源的(Gold L et al. (1995) Annu. Rev. Biochem. 64 763-797)。在新颖的结合蛋白的研制中已经将许多非免疫球蛋白蛋白支架用作支持结 构。对于生成针对有关HER2亚群的亲和配体有用的这类结构的非限制性实例是葡萄球 菌蛋白A和其结构域以及这些结构域的衍生物，比如蛋白Z(Nord K et al. (1997)Nat. Biotechnol. 15 :772-777)；脂质运载蛋白(Beste G et al. (1999)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 96 :1898-1903)；锚蛋白重复结构域(Binz HK et al. (2003) J. Mol. Biol. 332 489-503)；纤维素结合结构域(CBD) (Smith GP et al. (1998) J. Mol. Biol. 277 :317-332 ； Lehtio J et al. (2000) Proteins 41:316-322) ； Y 晶型(Fiedler U and Rudolph R, W001/04144)；绿色荧光蛋白(GFP) (PeelIe B et al. (2001)Chem. Biol. 8 :521-534)；绿 色荧光蛋白、人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4) (Hufton SE et al. (2000)FEBS Lett. 475 :225-231 ；Irving RA et al. (2001) J. Immunol. Meth. 248 :31-45)；蛋白酶抑制 齐[J，如 Knottin 蛋白(Wentzel A et al. (2001) J. Bacteriol. 183 :7273-7284 ；Baggio R et al. (2002) J. Mol. Recognit. 15 :126-134)以及 Kunitz 结构域(Roberts BL et al. (1992) Gene 121 9-15 ；Dennis MS and Lazarus RA(1994)J. Biol. Chem. 269 :22137-22144); PDZ 结构域(Schneider S et al. (1999)Nat. Biotechnol. 17 :170-175)；肽适体，如硫氧 还蛋白(Lu Z et al. (1995)Biotechnology 13 :366-372 ；Klevenz B et al. (2002)Cell. Mol. Life Sci. 59 :1993-1998)；葡萄球菌核酸酶(Norman TC et al. (1999) Science 285 591-595)；淀粉酶抑肽(McConell SJ and Hoess RH(1995)J. Mol. Biol. 250 :460-479 ； Li R et al. (2003)Protein Eng. 16 :65-72)；基于纤连蛋白III型结构域的三连接素 (trinectin) (Koide A et al. (1998)J. Mol. Biol. 284 :1141-1151 ；Xu L et al. (2002) Chem. Biol. 9 :933-942)；以及锌指结构(Bianchi E et al. (1995) J. Mol. Biol. 247 154-160 ；Klug A(1999)J.Mol. Biol. 293 :215-218 ；Segal DJ et al. (2003)Biochemistry42 :2137-2148)。以上提到的非免疫球蛋白支架的实例包括呈现有用于新颖的结合特异性的产 生的一种单随机化环(single randomized loop)的支架蛋白；具有一种刚性次级结构 的蛋白支架，其中从该蛋白表面突出的侧链被随机化以用于新颖的结合特异性的产生; 以及展示有用于新颖的结合特异性的产生的一种非邻接高可变环区域(non-contiguous hyper-variable loop region)白勺支架。除非免疫球蛋白之外，寡核苷酸也可以用作亲和配体。单链核酸被称为适体或假 目标(decoys)，折叠成轮廓分明的三维结构并且以高亲合性和特异性结合至它们的靶标。 (Ellington AD 禾口 Szostak Jff (1990)Nature 346 :818-822 ；Brody EN 和 Gold L(2000) J. Biotechnol. 74 5-13 ；Mayer G 和 Jenne A (2004) BioDrugsl8 :351-359) 这些寡聚核苷 酸配体可以是RNA或DNA，并且可以结合至宽范围的靶分子类别。为了从任何上述支架结构的变体的集合体(pool)选择所希望的亲和配体，许 多选择平台可用于分离一种特异的新颖的配体(针对选择的一种靶蛋白)。选择平台 包括但不局限于噬菌体展示(Smith GP (1985) Science 2 :1315-1317)、核糖体展示 (Hanes J and Pluckthun A(1997)Proc. Natl. Acad. ki. U. S. A. 94 :4937-4942)、酵母双 杂交系统(Fields S and Song 0(1989)Nature 340 :245-246)、酵母展示(Gai SA and Wittrup KD (2007) Curr Opin Struct Biol 17 :467-473)、mRNA 展示(Roberts Rff and Szostak Jff (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94 :12297—12302)、细菌展示(Daugherty PS(2007)Curr Opin Struct Biol 17 :474-480, Kronqvist N et al. (2008)Protein Eng Des Sel 1-9、Harvey BR et al. (2004) PNAS101(25) :913-9198)、微珠粒展示(Nord 0 et al. (2003) J Biotechnol 106 :1-13、W001/05808)、SELEX (System Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) (Tuerk C and Gold L (1990) Science 249 :505_510)、以^ 白质片段互补测定(PCA) (Remy I and Michnick Sff (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 5394-5399)。因此，在以上方面的实施方案中，这些亲和配体各自可以独立地是源自任何以上 列出的这些蛋白支架或一种寡核苷酸分子的一种非免疫球蛋白亲和配体。HER2 失调在以上方面(一至十五方面)的实施方案中，这种以HER2过量表达为特征的失调
可以是一种癌症。更进一步地，在以上方面的实施方案中，该癌症可以是选自下组，其组成为乳癌、 鳞状细胞癌、肺癌如小细胞肺癌或非小细胞肺癌、胰腺癌、恶性胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、外 阴癌、肝癌、肝细胞瘤、结肠直肠癌如结肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌、甲状腺癌、肾母 细胞瘤、膀胱癌、子宫内膜癌、肾癌、头颈部癌、胃癌、食管癌、以及前列腺癌。例如，该癌症可以是选自下组，该组的组成为乳癌、肺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、 以及肾母细胞瘤。已经报告HER2蛋白在大约全部乳癌的20 %并且在高达70 %的低分化乳癌中过量 表达。并且，已经很好地研究了抗HER2治疗对乳癌受试者(例如患有转移性乳癌的受试 者)的有效性。因此，在以上方面的实施方案中，这种以HER2过量表达为特征的失调可以是一种乳癌。例如，该乳癌可以是一种转移性乳癌。附图简要说明
图1显示了亲和纯化和特异性分析。Ia显示了用于连续的选择性亲和纯化的方案的示意图。将针对该全长抗原增高的 多克隆抗体(在此表示866(SEQ ID NO :1))分成四个特异性群一种抗C端部分(Ab-C)； 一种抗M(中间)部分(Ab-M)；抗N端部分(Ab-N)；并且最后将一种全长抗原柱连接以收集 可能的结合结构表位的抗体(Ab-S)。Ib显示了用于增高的针对该全长抗原(在此是指Ab-866)的多克隆抗体的结合 特异性的分析，并且使用一种Luminex珠粒阵列系统将所获得的这些抗体分成四个特异性 群Ab-C，Ab-M，Ab-N以及Ab-S。对于所有纯化的部分揭示了一种高特异性。黑色=结合， 白色=未结合。Ic显示了一种Luminex珠粒阵列竞争测定用于估计这些纯化的单特异性抗体的 相对亲和性。使用一种渐增浓度的可溶全长抗原(即866(SEQ ID NO :1))作为竞争蛋白 片段检测单特异性抗体与固定在该珠粒表面的全长抗原(即866 (SEQ ID NO :1))之间的相
互作用。图2显示了 BT474细胞的荧光激活细胞分选(FACS)的结果。分别评估了未标记 的细胞Oa)以及用Ab-Intra(—种靶向HER2胞内部分的多克隆抗体(HPA001383))标记 的细胞、以及用作阴性对照的(2b)、Ab-866 (2c)、Ab-N (2d)、Ab-M (2e)、Ab-C (2f)、曲妥珠单 抗(2g)、以及Ab-S Oh)的FACS。对于曲妥珠单抗、msAb-866、msAb-N、以及msAb-C表明的 细胞结合，观察了具有比未标记的细胞更高的荧光的富集的群，然而，对于msAb-intra或 msAb-M没有发现有显著的荧光富集。图3显示了一种剂量响应研究，其中用一种渐增量的msAb-866处理BT474细胞。图 4 显示了一 种分另Ij 使用 500ng/ml 的 msAb-Intra、msAb-M、msAb-N、msAb-C、 msAb-CNM、msAb-866、以及msAb_NC对BT474细胞的生长抑制研究。所呈现的“效 应”(“effect”)值是相对于用 msAb-htra 处理的培养物。msAb_N、msAb_C、msAb-CNM、 msAb-866以及msAb_NC显示出在14%与39%之间的细胞生长抑制作用。图 5 显示 了 一种分别使用 500ng/ml 的 msAb_M、msAb-Intra, msAb-N、曲妥珠单 抗、msAb-C、以及msAb-866对BT474细胞的生长抑制研究。所呈现的“效应”值是相对于用 msAb-Intra处理的培养物。图6显示了一种选择的HER2片段(SEQ ID NO 11以及15-20)的氨基酸比对，各 自包括通过表位作图鉴定的一个或多个C表位(SEQ ID NO :8-11)。这些序列的一些在该 图的上半部开始并且延续到下半部。图7显示了一种选择的HER2片段(SEQ ID NO :21-34)的氨基酸比对，各自包括通 过表位作图鉴定的一个或多个N表位(SEQ ID NO :12-14)。这些序列的一些在该图的上半 部开始并且延续到下半部。针对HER2的单特异性抗体的产生以及它们与不同HER片段的相互作用以及对癌 性细胞影响的研究1.抗原的产生a)材料和方法
用人基因组序列作为模板使用生物信息学工具选择了由EnsEMBL基因ID ENSG 00000141736 编码的靴蛋白的一种适当的片段(Lindskog M et al. (2005)Biotechniques 38 =723-727, EnsEMBL, www. ensembl. org)。该片段被用作模板用于生产与HER2蛋白(SEQ ID NO :2 ;EnsEMBL 登陆号 ENSP00000269571)的 274-400 位的氨基酸残基(SEQ ID NO 1) 对应的具有127个氨基酸长度的片段。将该蛋白片段设计成由一种单一序列(该单一序列 具有与其他的人类蛋白低的序列相似性)组成，以使产生的亲合试剂的不想要的交叉反应 性最小化，并且仍具有一种适当的大小以允许构象性表位的形成并且允许在细菌系统中有 效表达。使用一种Superscript —步RT-PCR扩增试剂盒(具有Platinum 标签 (Invitrogen))以及一种人类总 RNA 池组(human total RNA Panel IV, BD Biosciences Clontecti)作为模板分离了包含EnsEMBL登录号ENST00000269571 (SEQ ID NO :3)的核苷酸 1058-1438的HER2基因转录物的一种片段。通过PCR扩增引物将侧翼限制酶切位点NotI 和AscI引入该片段以允许框内克隆进入表达载体(正向引物TACAACACAGACACGTTTGAG， 生物素酰化的反向引物AAACACTTGGAGCTGCTCTG)。将该生成的生物素酰化的PCR产 品固定在 Dynabeads ]\C80 链霉亲和素上(Dynal Biotech) (Larsson M et al. (2000) J. Biotechnol. 80 :143-157)，并且经过NotI-AscI消化在该固相支持物上经受Not-AscI消 化(New England Biolabs)，连接进入框内 pAff8c 载体(Larsson M et al, supra)，该载 体具有一种N端双亲和标签，其组成为用于固定化金属离子层析(IMAC)纯化的六组氨酸标 签以及来自链球菌G蛋白的一种免疫增强白蛋白结合蛋白(immunopotentiating albumin binding protein, ABP) ( Sjolander A et al. (1997) J. Immunol. Methods 201:115—123; Stahl S et al. (1999)Encyclopedia of Bioprocess Technology :Fermentation, Biocatalysis 禾口 Bioseparation(Fleckinger MC 禾口 Drew Sff, eds)John Wiley 禾口 Sons Inc.，New York，pp 49-63)，并且转化进入大肠杆菌BL21 (DE3)细胞(Novagen)。根据制造 商的建议，使用iTempliWiiDNA测序扩增试剂盒(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)，通过 质粒DNA扩增的染料终止循环测序验证这些克隆的序列。通过添加在相同培养基中的Iml的一种过夜培养物，将包含有该表达载体的 BL21(DE3)细胞接种在IOOml的30g/l大豆胰蛋白酶肉汤中，该大豆胰蛋白酶肉汤补充有 5g/l的酵母提取物(Merck KGaA)以及50mg/l的卡那霉素(Sigma-Aldrich)。在37°C以 及150rpm下将该细胞培养物在1公升摇瓶中孵育直到在600nm下的光密度达到0. 5-1. 5。 然后通过添加异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(Apollo Scientific)至一个ImM的终 浓度诱导蛋白表达，并且在25°C和150rpm继续孵育过夜。通过在MOOg离心收获细胞， 并且将片状沉淀物再悬浮在5ml溶解缓冲液中(7M盐酸胍、47mM Na2HPO4,2. 65mM NaH2PO4, IOmMTris-HClUOOmM NaCl、20mM β _ 巯基乙醇；ρΗ = 8. 0)，并且在 37°C禾Π 150rpm 下孵育 2小时。在35300g下离心以后，收集包含变性并且溶解的蛋白的上清液。使用一个自动化蛋白纯化步骤(SteenJ et al. (2006)Protein Expr. Purif. 46 173-178)在一种ASPEC XL4 (Gilson)上，通过在具有Iml Talon 金属(Co2+)亲合树脂的 柱子(BD Biosciences Clontech)上进行固定化金属离子亲和层析(IMAC)纯化见知标签 的融合蛋白。用20ml变性洗涤缓冲液(6M盐酸胍、46. 6mM Na2HPO4,3. 4mM NaH2PO4,300mM NaCl.pH 8. 0-8. 2)将该树脂平衡。然后，将澄清的细胞溶解产物加至该柱子。其后，将该树脂在 2. 5ml 洗脱缓冲液(6M脲、50mM NaH2PO4UOOmM NaCl、30mM 乙酸、70mM 乙酸 Na，pH 5.0) 洗涤之前用不少于31. 5ml的洗涤缓冲液洗涤。将洗脱的材料在500、700、以及1300 μ 1的 三个池中分离。将含有抗原的700 μ 1部分、以及汇集的500 μ 1以及1300 μ 1的部分储存
以用于进一步的使用。将该抗原部分用磷酸盐缓冲盐水(PBS ；1. 9mM NaH2PO4,8. ImM Na2HPO4,154mM NaCl)稀释到IM脲的终浓度，随后使用具有7500Da截留分子量的VivapOrel0/20ml浓缩器 的一个浓缩步骤以增加该蛋白质的浓度(Vivascience AG)。根据制造商的推荐使用一种具 有牛血清白蛋白标准品的一种双金鸡宁酸(BCA)微测定科学试验计划(Pierce)测定该蛋 白质的浓度。使用蛋白50或200测定法(Agilent Technologies)在Bioanalyzer仪器上 分析该蛋白质的质量。b)结果通过使用对于该蛋白片段特异的引物，通过RT-PCR从一个人RNA池成功分离了一 种对应于该HER2基因的长转录物(SEQ ID NO 3)的核苷酸1058至1438并且编码一种肽 (SEQ ID NO 1)的基因片段，该肽由该靶蛋白HER2 (SEQ ID NO 2)的274至400位氨基酸 组成。将编码该正确的氨基酸序列的一个克隆进行鉴定，并且在大肠杆菌中表达产生这 种正确大小的一种单一蛋白质，并且随后使用固定化金属离子层析进行纯化。将该洗脱的 样品稀释到IM脲的终浓度并且浓缩该样品到Iml以后，测定该蛋白片段的浓度为8. 6mg/ml 以及99. 5%纯度(根据纯度分析)。2.抗体的产生a)材料和方法根据国家指南(瑞典许可号A84-02)将如以上获得的纯化的HER2片段用作抗原 以免疫一种兔。用在弗氏完全佐剂中的200 μ g的抗原肌肉注射免疫该兔作为初次免疫，并 且用在弗氏不完全佐剂中的100 μ g的抗原以四星期的间隔加强三次。通过一个三步骤的基于免疫亲和性的科学试验计划将来自该免疫的动物的抗 血清进行纯化(Agaon C et al. (2004) J. Chromatogr. A 1043 33-40 ；Nilsson P et al. (2005)Proteomics 5 :4327-4337)。在第一步骤中，将 7ml 的总的抗血清用 IOx PBS 缓 冲到 Ix PBS 的终浓度(L9mM NaH2PO4,8. ImM Na2HPO4U54mM NaCl)，使用一种 0· 45 μ m 孔 径大小的过滤器过滤(Acrodisc ,Life Science)并且施加到一个亲和柱上，该亲和柱含 有5ml的N-羟基琥珀酰亚胺活化&kpharoseTM4FastFloW(GE Healthcare)，其结合至表达 自pAffSc载体的并且以如上描述的与用于该抗原蛋白片段同样的方式纯化的双亲和标签 蛋白Hi%-ABP(—种六组氨酰标签以及一种白蛋白结合蛋白标签)。在第二步骤中，以一个 0. 5ml/min的流率将流经消耗该双亲和标签Hk6-ABP的抗体荷载到Iml Hi-Trap NHS活化 的HP柱子(GE Healthcare)上，该柱子与用作抗原用于免疫的HER2蛋白(SEQ ID NO 1) 结合。如制造商的推荐将该Hk6-ABP蛋白以及该蛋白片段抗原结合至该NHS活化的基质。 用Ix PBST(lx PBS,0. 1% Tween 20、pH 7. 25)将未结合的材料洗去，并且使用一种低pH 甘氨酸缓冲液(0. 2M glycine、ImM EGTA，pH 2. 5)洗脱俘获的抗体。自动收集该洗脱的抗 体部分，洗脱后立即汇集相关的部分，并且使用IM Tris-HCl和IOxPBS将pH调节至7. 25。 该汇集的部分表示为msAb-866。
b)结果见以下部分3b。3.区域特异性抗体的产生a)材料和方法收集由EnsEMBL 基因 ID ENSG00000141736 (EnsEMBL, www. ensembl. org)编码的靴 蛋白的三个片段，以与用于免疫的蛋白片段(SEQ ID NO 1)的适当的重叠。以类似于如以 上所描述的用于免疫的蛋白片段(SEQ ID NO 1)的方式生产了与该HER2蛋白(SEQ ID NO 2 ;EnsEMBL 登录号 ENSP00000269571)的氨基酸残基 236-363 (SEQ ID NO :4)、347-492 (SEQ ID N0:5)、以及(364-530(SEQ ID NO :6)对应的这三个蛋白片段。使IOml来自如在2a)中所描述的同一免疫的粗制血清在PBS中缓冲，消毒过滤并 且使用如上描述的相同的科学试验计划使之从Tag特异的His6-ABP抗体排除(Larsson et al.，2006)。使用一种Akta Explorer (GE Health Care AB)系统(具有四个串联的亲和性 Iml HiTrap柱)按以下次序亲和纯化流经消耗的抗体C-端(SEQ ID N0:6)、中间(SEQ ID NO 5)、N-端(SEQ ID NO 4)、以及全长抗原柱(SEQ ID NO :1)(图 la)。使抗体以 0. 5ml/ 分钟的速度荷载到这些柱上，并且用20倍柱体积的洗涤缓冲液将未结合的材料洗去。在低 PH下分离洗脱后，将结合的抗体分成250ul的部分(Larsson et al.，2006)。洗脱后立即 汇集相关的部分，并且使用IM Tris-HCl和IOxPBS将pH调节至7. 25。为了不干扰随后的 研究，不加入甘油或NaN3。分别将来自各柱的这些汇集的部分表示为从C端柱(SEQ ID NO 6)洗脱的抗体表示为msAb-C，从中间柱(SEQ ID NO 5)洗脱的抗体表示为msAb-M，从 N端(SEQ ID NO 4)洗脱的抗体表示为msAb-N，并且从全长抗原柱(SEQ ID NO 1)洗脱的 抗体表示为msAb-Sob)结果简言之，分别将具有与用于免疫的该蛋白片段的C端、中间、以及N端部分连同该 全长抗原片段(SEQ ID NO :1)对应的特异性蛋白序列的四个亲和柱串联以使能够进行选 择性的亲和层析。该方法使得能够将这些抗原特异性抗体分离以便成分成四个不同的抗体 群msAb-N(该群的 18% )、msAb-M(该群的)、msAb_C(该群的 39% )、msAb_S(该群 的 8% )(图 la)。4.亲和纯化的证实a)蛋白阵列在一种蛋白阵列装置中，通过针对该抗原本身的结合分析，分析了该亲和纯化抗 体部分的特异性和选择性，包括用于免疫的该蛋白片段(SEQ ID NO 1)和与它重叠的一些 蛋白片段(SEQ ID NO :4-6)、以及针对92个其他的人蛋白片段的结合分析(Nilsson P et al. (2005)Proteomics 5 :4327-4337)。在 0. IM脲和 Ix PBS (pH 7.4)中将这些蛋白片段稀 释到40 μ g/ml，并且将50 μ 1的各片段转移到一种96孔点滴板的孔中。使用一种针和环状 阵列(pin-and-ring arrayer) (Affymetrix 427)将这些蛋白片段一式两份点样并且固定 在环氧树脂载玻片上(SuperEpoxy，TeleChem)。将该载玻片在Ix PBS中洗涤(5分钟)并且 然后将表面封闭(SuperBlock ，Pierce) 30分钟。在加入这些单特异性抗体(在Ix PBST 中按1 5000稀释到大致50ng/ml)之前将一种粘性16孔硅酮掩模(Schleicher紹chuell) 施加到该玻片上，并且在一种振荡器上孵育60分钟。将亲和标签特异性IgY抗体与这些单特异性抗体共孵育以量化在各点中的蛋白的量。将该载玻片用Ix PBST和Ix PBS洗涤两 次，每次10分钟。将第二抗体(与Alexa647结合的羊抗兔抗体和与Alexa555结合的羊抗 鸡抗体，分子探针)在Ix PBST中按1 60000稀释到30ng/ml并且孵育60分钟。关于该 第一次孵育，在相同的洗涤步骤之后，将该载玻片旋转干燥并且扫描(G2565BA阵列扫描 仪，Agilent)，其后使用图像分析软件将影像量化(GenePix 5.1，Axon Instruments)。b)悬浮珠粒阵列另外，使用一种Luminex悬浮珠粒阵列系统分析了特异性、选择性、以及相对亲和 性。如先前的描述进行结合特异性的多路分析Gchwenk et al.，2007)。简而言之，在PBST 中制备抗体稀释物以及与98个蛋白片段对应的100珠粒ID的一种珠粒混合物，该珠粒混 合物包括用于免疫的抗原(SEQ ID NO 1)以及用于亚纯化(sub-purification)抗原的三 个片段(SEQ ID NO :4-6)、一种HisABP片段以及一种抗兔IgG抗体。将45 μ 1的msAb稀释 物加至5 μ 1的珠粒，并且在一种96孔板(Corning)中在不断混合下孵育60分钟。随后， 加入25 μ 1的R-藻红蛋白标记的抗兔IgG抗体(0. 5μ g/ml，Jackson ImmunoResearch)或 加入以用于60分钟的最终孵育。c)多路竞争测定(Multiplexed competition assay)在PBST中制备竞争蛋白片段的连续稀释物并且按1 1的比率与msAb-866、 msAb-N、msAb-M以及msAb_C的溶液混合。在恒定混合下在50 μ 1的总体积中进行孵育60 分钟。随后，将该msAb-PrEST溶液转移到一个第二板上，该第二板每孔含有5 μ 1的珠粒 混合物。60分钟后，加入25 μ 1的R-藻红蛋白标记的抗兔IgG抗体(0. 5 μ g/ml, Jackson ImmunoResearch)并且另外孵育60分钟。进行三个独立的重复并且将其平均值用于资料分 析。选择一种四个参数的逻辑函数用于拟合竞争曲线以计算EC50值并且比较相对结合质 量。作为对于竞争的一种度量，对于所生成的曲线就它们的形状以及它们的估算的EC50值 (这些值必须是大于标准差的一个数值)进行了观察。d)悬浮阵列读出和资料分析使用具有Luminex IS 2. 3软件的Luminex LX200仪器装备进行测量。对于个实 验，计数每珠粒ID的100个事件并且选择该荧光强度中位值来展示相互作用。用R(—种 用于统计计算和制图的语言和环境)进行资料分析和图示ahaka and Gentleman, 1996)。e)结果为了在亲和纯化后确认抗体特异性以及选择性，使用平面阵列和Luminex悬浮珠 粒阵列技术二者进行了一种蛋白微阵列分析。该分析确认了一种定向针对His6标签和ABP 标签的成功的抗体耗尽(结果未显示)并且确保了高特异性抗体具有与固定的其他蛋白片 段低潜力的非特异性相互作用(图lb)。为了对在该蛋白阵列的各点中的蛋白的量进行定量，使用了一种与第一以及第二 抗体的一种组合的双色染料标记系统。用标记有Alexa 555荧光染料的一个第二羊抗母鸡 抗体检测了在母鸡中产生的标签特异性IgY抗体。用一种荧光Alexa647标记的羊抗兔抗体 检测了该兔msAb对它的在该阵列上的抗原的特异性结合。一式两份点样各蛋白片段。使用 平面阵列以及悬浮珠粒阵列的蛋白阵列分析显示出针对HER2的该亲合纯化的单特异性抗 体(msAb-866、msAb-N、msAb-M、msAb-C、ms-Ab-S)对正确的蛋白片段是高度选择性的，并且 对于在该阵列上分析的所有其他的蛋白片段具有一种非常低的背景。另外，使用一种竞争测定来确定相对亲和性，其中使用了一种浓度渐增的可溶全长抗原(SEQ ID NO 1)竞争蛋 白片段竞争了(challenged)在单特异性抗体与固定在珠粒上的全长抗原(SEQ ID NO=D 蛋白片段之间的相互作用(图lc，表1)。确定了在低纳摩尔范围的抗体mSAb-866(1.9nM)、 msAb-N(4. 5nM)、msAb_M(0· 7nM)、以及msAb_C(l. 2nM))的一种明显的亲和性，当用可溶蛋 白片段(SEQ ID NO :1)竞争了它们与偶联到在免疫中使用的蛋白片段上的珠粒的相互作用 时。
权利要求
1.能够选择性地与一种亚群相互作用的亲和配体，该亚群由来自HER2的细胞外结构 域2和3的37个或更少的连续的氨基酸残基(SEQ ID NO 7)组成，所述亚群包括氨基酸序 列 LQVF(SEQ ID NO 8)禾口 / 或 ESFDGD(SEQ ID NO 9)。
2.根据权利要求1所述的亲和配体，其中所述亚群由沈个或更少的氨基酸残基组成。
3.根据权利要求2所述的亲和配体，其中所述亚群由选自下组的一个氨基酸序列组 成，该组的组成为SEQ ID NO :11以及15-20。
4.根据权利要求2或3所述的亲和配体，其中所述亚群由21个或更少的氨基酸残基组成。
5.根据以上权利要求中任一项所述的亲和配体，其中所述亚群包括LQVF(SEQ ID NO 8)禾口 / 或 LPESFDGD(SEQ ID NO :11)。
6.根据以上权利要求中任一项所述的亲和配体，其中所述亚群是10个或更多个氨基酸残基。
7.根据权利要求1至5的任一项所述的亲和配体，其中所述亚群由8个或更少的氨基酸残基组成。
8.根据权利要求1所述的亲和配体，其中所述亚群由SEQID NO :6的1-37位的氨基 酸残基的序列组成。
9.根据以上权利要求的任一项所述的亲和配体，它抑制在培养物中人类乳癌细胞的生 长的 20% -100%。
10.根据权利要求9所述的亲和配体，其中这些人类乳癌细胞是BT474乳癌细胞。
11.根据权利要求9至10的任一项所述的亲和配体，它在500ng/ml的浓度下抑制生长。
12.根据以上权利要求的任一项所述的亲和配体，它以低于IOOnM的一个EC50结合该亚群。
13.根据以上权利要求的任一项所述的亲和配体作为一种药物的用途。
14.根据以上权利要求的任一项所述的亲和配体，用于一个哺乳动物受试者的治疗，该 哺乳动物受试者患有或怀疑患有一种以HER2过量表达为特征的失调。
15.根据权利要求14所述的亲和配体，其中所述受试者已经用一种能够与HER2如 HER2的细胞外结构域选择性地相互作用的治疗性抗体进行了治疗，该治疗性抗体不同于该 亲和配体。
16.根据权利要求15所述的亲和配体，其中所述以HER2过量表达为特征的失调是一种 癌症，并且所述癌症已经发展了对该治疗性抗体的抗性。
17.根据权利要求14所述的亲和配体，其中其特征为HER2过量表达的该失调是一种癌症。
18.根据权利要求16或17所述的亲和配体，其中该癌症是选自下组，其组成为乳癌、 鳞状细胞癌、肺癌例如小细胞肺癌或非小细胞肺癌、胰腺癌、恶性胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、 外阴癌、肝癌、肝细胞瘤、结肠直肠癌如结肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌、甲状腺癌、肾 母细胞瘤、膀胱癌、子宫内膜癌、肾癌、头颈部癌、胃癌、食管癌、以及前列腺癌。
19.根据权利要求18所述的亲和配体，其中该癌症是选自下组，其组成为乳癌、肺癌、 胰腺癌、结肠直肠癌以及肾母细胞瘤。
20.根据权利要求19所述的亲和配体，其中该癌症是乳癌。
21.根据权利要求20所述的亲和配体，其中该癌症是转移性乳癌。
22.根据以上权利要求的任一项所述的亲和配体，它是其一种抗体或它的一种片段或 衍生物，如一种单克隆抗体，如一种嵌合单克隆抗体或人源化单克隆抗体。
23.权利要求1至21的任一项所述的亲和配体，它是一种衍生于选自下组的一种支架 的蛋白配体，该组的组成为葡萄球菌蛋白A和其域、脂质运载蛋白、锚蛋白重复域、纤维素 结合域、Y晶型、绿色荧光蛋白、人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4、蛋白酶抑制剂、PDZ域、 肽适体、葡萄球菌核酸酶、淀粉酶抑肽、纤连蛋白III型域以及锌指结构。
24.根据权利要求1至21的任一项所述的亲和配体，它是一种寡核苷酸分子。
25.一种组合物，该组合物包括一种根据以上权利要求的任一项所述的亲和配体以及 一个第二亲和配体，该第二亲和配体能够选择性地与一个第二亚群相互作用，该第二亚群 具有来自HER2 (SEQ ID NO 7)的细胞外结构域2和3的73个或更少的连续的氨基酸残基， 所述第二亚群包括一个或多个选自下组的氨基酸序列，该组的组成为SEQ ID NO :12, SEQ ID NO 13 以及 SEQ ID NO :14。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中该第二亚群由选自下组的一个氨基酸序列组 成，该组的组成为=SEQ ID NO 21-34ο
27.根据权利要求25或沈所述的组合物，其中该第二亚群由45个或更少的氨基酸残 基组成。
28.根据权利要求27所述的组合物，其中该第二亚群由16个或更少的氨基酸残基组成。
29.根据权利要求25所述的组合物，其中该第二亚群由序列SEQID NO :4的39-111位氨基酸残基组成。
30.根据权利要求25至四的任一项所述的组合物，它抑制在培养物中的人类乳癌细胞 的生长的20% -100%。
31.根据权利要求30所述的组合物，其中这些人类乳癌细胞是BT474乳癌细胞。
32.根据权利要求30至31的任一项所述的组合物，它在500ng/ml的浓度下抑制生长。
33.根据权利要求25至32的任一项所述的组合物，其中该第二亲和配体以低于IOOnM 的EC50结合该第二亚群。
34.根据权利要求25至33的任一项所述的组合物，其中该第二亲和配体是一种抗体或 一种它的片段或衍生物，如一种单克隆抗体，如一种嵌合单克隆抗体或人源化单克隆抗体。
35.根据权利要求25至33的任一项所述的组合物，其中该第二亲和配体是一种衍生于 选自下组的一种支架的蛋白配体，该组的组成为葡萄球菌蛋白A和其域、脂质运载蛋白、 锚蛋白重复域、纤维素结合域、Y晶型、绿色荧光蛋白、人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4、 蛋白酶抑制剂、PDZ域、肽适体、葡萄球菌核酸酶、淀粉酶抑肽、纤连蛋白III型域以及锌指结 构。
36.根据权利要求25至33的任一项所述的组合物，其中该第二亲和配体是一种寡核苷 酸分子。
37.组合物，包括根据权利要求1至M的任一项所述的一种亲和配体或根据权利要 求25至36的任一项所述的一种组合物；以及一种针对HER2的酪氨酸激酶抑制剂。
38.根据权利要求25至37的任一项所述的组合物作为一种药物的用途。
39.根据权利要求25至38的任一项所述的组合物，用于一个哺乳动物受试者的治疗， 该哺乳动物受试者患有或怀疑患有一种以HER2过量表达为特征的失调。
40.根据权利要求39所述的组合物，其中对所述受试者已经用一种能够与HER2如与 HER2的细胞外结构域选择性地相互作用的治疗性抗体进行了治疗，其中治疗性抗体与该亲 和配体和该第二亲和配体是不同的。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述以HER2过量表达为特征的失调是一种癌 症，并且所述癌症已经发展了对该治疗性抗体的抗性。
42.一种分离的多肽，该多肽由来自HER2的细胞外结构域2和3的37个或更少的连 续的氨基酸残基(SEQ ID NO :7)组成，并且包括氨基酸序列LQVF(SEQ ID NO⑶和/或 ESFDGD(SEQ ID NO :9)。
43.根据权利要求42所述的多肽，该多肽由沈个或更少的氨基酸残基组成。
44.根据权利要求42至43的任一项所述的多肽，该多肽由选自下组的一种氨基酸序列 组成，该组的组成为SEQ ID NO :11以及15-20。
45.根据权利要求42至44的任一项所述的多肽，该多肽由21个或更少的氨基酸残基 组成。
46.根据权利要求42至45的任一项所述的多肽，该多肽包括该氨基酸序列LQVF(SEQ ID NO 8)和 / 或 LPESFDGD(SEQ ID NO :11)。
47.根据权利要求42至46的任一项所述的多肽，该多肽由10个或更多个氨基酸残基 组成。
48.根据权利要求42至46的任一项所述的多肽，该多肽由8个或更少的氨基酸残基组成。
49.根据权利要求42至48的任一项所述的多肽，其中如果该多肽包括序列LQVF，则具 有两个或更少的氨基酸残基侧接在LQVF的C端侧。
50.根据权利要求42所述的多肽，该多肽由序列SEQID NO :6的1_37位氨基酸残基 组成。
51.根据权利要求42至50的任一项所述的多肽作为一种抗原的用途。
52.根据权利要求42至51的任一项所述的多肽作为一种抗原在免疫中的用途。
53.根据权利要求42至52的任一项所述的多肽在治疗性抗体的制备中的用途。
54.根据权利要求42至53的任一项所述的一种多肽作为一种抗原的用途。
55.根据权利要求42至53的任一项所述的一种多肽用于免疫的用途。
56.根据权利要求55所述的用途，其中该免疫是一种非人类哺乳动物的免疫。
57.根据权利要求42至53的任一项所述的一种多肽在一种治疗性抗体的制备中的用 途，该治疗性抗体如一种治疗性单克隆抗体，如一种治疗性嵌合单克隆抗体或人源化单克 隆抗体。
58.根据权利要求42至53的任一项所述的多肽在一种治疗性亲和配体的选择或纯化 中的用途，该治疗性亲和配体用于治疗一种以HER2过量表达为特征的失调。
59.根据权利要求42至53的任一项所述的一种多肽作为一种治疗靶标的用途。
60.根据权利要求1至M的任一项所述的一种亲和配体作为一种药物的用途
61.根据权利要求1至M的任一项所述的一种亲和配体在一种药物的制造中的用途， 该药物用于一个哺乳动物受试者的治疗，该哺乳动物受试者患有或怀疑患有一种以HER2 过量表达为特征的失调。
62.根据权利要求61所述的用途，其中对所述受试者已经用一种能够与HER2如与 HER2的细胞外结构域选择性地相互作用的治疗性抗体进行了治疗，其中治疗性抗体与该亲 和配体是不同的。
63.根据权利要求61或62所述的用途，其中所述以HER2过量表达为特征的失调是一 种癌症，并且所述癌症已经发展了对该治疗性抗体的抗性。
64.用于鉴定一种亲和配体的方法，该亲和配体用于治疗一种以HER2过量表达为特征 的失调，该方法包括以下步骤a)使一种多肽与一种公认的亲和配体在使之能够结合的条件下接触，该多肽包括根据 权利要求1至M的任一项所述的一种亚群；并且b)确定是否该公认的亲和配体结合至该亚群。
65.根据权利要求64所述的方法，其中步骤a)的该多肽是一种根据权利要求35至45 的任一项所述的多肽；并且步骤b)由确定是否该公认的亲和配体结合至该多肽组成。
66.根据权利要求64至65的任一项所述的方法，其中该失调是一种癌症，该方法进一 步包括以下步骤c)确定是否该公认的亲和配体抑制了癌细胞如BT474乳癌细胞的生长或诱导了其凋亡。
67.生产一种亲和配体的方法，该方法包括使用根据权利要求64至66的任一项所述 的方法鉴定一种亲和配体；并且生产所述鉴定的亲和配体。
68.用于生产一种克隆的方法，该方法包括以下步骤a)提供从一种哺乳动物获得的细胞，该哺乳动物已经用一种抗原免疫，该抗原包括根 据权利要求1至M的任一项所述的亚群，这些细胞包括编码能够与该亚群选择性地相互作 用的一种抗体的DNA;并且b)使所述细胞与骨髓瘤细胞融合以获得至少一个克隆。
69.根据权利要求68所述的方法，该方法进一步包括以下步骤a’ )用该抗原免疫该哺乳动物，其中步骤a’ )先于步骤a)。
70.根据权利要求68至69的任一项所述的方法，该方法进一步包括以下步骤c)选择来自步骤b)的克隆，该克隆表达能够与该亚群选择性地相互作用的抗体。
71.根据权利要求68至69的任一项所述的方法，其中步骤a)的抗原由根据权利要求 42至53的任一项所述的一种多肽组成。
72.根据权利要求71所述的方法，该方法进一步包括以下步骤c)选择来自步骤b)的克隆，该克隆表达能够选择性地与该抗原相互作用的抗体。
73.根据权利要求68至72的任一项所述的方法，该方法进一步包括以下步骤d)提供在步骤b)中获得的或在步骤c)中选择的一种克隆，并且将来自该克隆的DNA 与编码人类抗体的DNA合并，其中来自该克隆的DNA编码了由该克隆表达的一种抗体的至 少与该亚群选择性地相互作用的这个部分；并且e)在将来自步骤d)合并的DNA结合进入细胞以获得用于表达一种治疗性抗体的一种 克隆，该治疗性抗体用于治疗一种以HER2过量表达为特征的失调。
74.生产一种亲和配体的方法，该方法包括使用根据权利要求68至73的任一项所述 的方法产生一种克隆；并且从所述克隆获得所述亲和配体。
75.一个哺乳动物受试者的治疗方法，该哺乳动物受试者患有或怀疑患有一种以HER2 过量表达为特征的失调，该方法包括对该受试者给予一个有效量的根据权利要求1至M的 任一项所述的一种亲和配体或根据权利要求25至41的任一项所述的一种组合物。
76.根据权利要求75所述的方法，进一步包括对该受试者给予一种针对HER2的酪氨酸 激酶抑制剂。
77.根据权利要求75至76的任一项所述的方法，其中所述治疗是手术前的治疗。
78.根据权利要求75至76的任一项所述的方法，其中所述治疗是手术后的治疗。
79.根据权利要求75至78的任一项所述的方法，其中对所述受试者已经用一种能够 与HER2如与HER2的细胞外结构域选择性地相互作用的治疗性抗体进行了治疗，其中治疗 性抗体与该亲和配体是不同的。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述以HER2过量表达为特征的失调是一种癌 症，并且所述癌症已经发展了对该治疗性抗体的抗性。
81.根据权利要求75至80的任一项所述的方法，其中该以HER2过量表达为特征的失 调是一种癌症。
82.根据权利要求81所述的方法，其中该癌症是选自下组，其组成为乳癌、鳞状细胞 癌、肺癌例如小细胞肺癌或非小细胞肺癌、胰腺癌、恶性胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、外阴癌、肝 癌、肝细胞瘤、结肠直肠癌例如结肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌、甲状腺癌、肾母细胞 瘤、膀胱癌、子宫内膜癌、肾癌、头颈部癌、胃癌、食管癌、以及前列腺癌。
83.根据权利要求82所述的方法，其中该癌症是选自下组，该组的组成为乳癌、肺癌、 前列腺癌、结肠直肠癌以及肾母细胞瘤。
84.根据权利要求83所述的方法，其中该癌症是乳癌。
85.根据权利要求84所述的方法，其中该癌症是转移性乳癌。
86.—种制造品，该制造品包括一种容器、一种在该容器内的组合物，该组合物包括根 据权利要求1至M的任一项所述的一种亲和配体或根据权利要求25至41的任一项所述 的一种组合物、以及一种在该容器上或与该容器相关的标签，该标签表明所述组合物可以 用于治疗一种以HER2过量表达为特征的失调。
全文摘要
本发明涉及一种亲和配体，该亲和配体能够选择性地与一种亚群相互作用，该亚群由来自HER2的细胞外结构域2和3的37个或更少的连续的氨基酸残基组成，其中该亚群包括氨基酸序列LQVF和/或ESFDGD，并且本发明涉及由这类亚群组成的多肽。
文档编号C07K16/28GK102099376SQ200880129763
公开日2011年6月15日 申请日期2008年12月12日 优先权日2008年6月13日
发明者J·罗克伯格, M·乌莱恩 申请人:阿特拉斯医疗有限公司