预防和治疗糖皮质激素药物引起的骨病的制作方法

预防和治疗糖皮质激素药物引起的骨病的制作方法
【专利摘要】本发明涉及预防和治疗糖皮质激素药物引起的骨病。具体地，本发明涉及Wnt信号通路在预防/治疗糖皮质激素药物引起的骨病中的应用。C/EBPalpha因子在BMP2诱导小鼠间充质干细胞系C3H10T1/2向成骨细胞分化的晚期表达下调，过表达该因子会抑制成骨细胞的分化；导致C/EBPalpha表达下调的原因是其远端启动子(-1286bp/-1056bp)在成骨细胞分化晚期发生了高甲基化而沉默，甲基化过程被阻断则促使C/EBPalpha高表达进而导致成骨/成脂肪分化失衡。本发明人通过Dex诱导的骨质疏松模型，证实了Wnt/beta-catenin信号通路对C/EBPalpha在成骨细胞分化中表达及甲基化都有重要的调控作用，而该通路的激动剂/激活剂能挽救Dex引起的成骨/成脂分化平衡。
【专利说明】预防和治疗糖皮质激素药物引起的骨病

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术，组织干细胞分化控制和免疫调节领域，具体地，本发明涉及 一种fct信号通路激动剂以及CEBPalpha抑制剂在预防/治疗糖皮质激素药物引起的骨病 中的应用。

【背景技术】
[0002] 地塞米松（Dexamethasone, Dex)是一种人工合成的糖皮质激素类药物，作为免疫 反应抑制剂在临床上得到广泛的应用。然而长期使用会导致诸如骨丢失，骨密度降低等骨 质疏松症状，目前尚无有效的治疗方法。
[0003] 临床上发现，长期使用地塞米松（Dex)不仅会导致严重的骨质疏松，而且还伴随 着骨髓脂肪化。由于成骨细胞与脂肪细胞都来源于同一种多能成体干细胞：骨髓间充质干 细胞（BMSCs)，而且二者的分化存在一种竞争性的平衡，因而骨质疏松病人骨髓中出现大量 的脂肪提示BMSCs转向脂肪细胞分化而成骨分化受到抑制。但其中具体调控机理仍不清 楚。
[0004] BMSCs的分化方向受到转录因子的严格调控。Runx2以及Osteorix(Osx)是启动 成骨细胞分化的关键转录因子，而脂肪细胞分化则受其他因子的调控和影响，但其中很多 具体机制尚不明了。
[0005] 因此本领域迫切需要开展地塞米松以及相关的信号通路在糖皮质激素类药物引 起的骨病中的机制和作用，以便提供新的有效的预防和治疗靶点。


【发明内容】

[0006] 本发明的一个目的就是提供Wnt信号通路在预防/治疗糖皮质激素药物引起的骨 病中的应用。
[0007] 本发明的另一目的就是提供C/EBPalpha在预防/治疗糖皮质激素药物引起的骨 病中的应用。
[0008] 在本发明的第一方面，提供了一种Wnt信号通路激活剂/激动剂的用途，它用 于制备预防或治疗糖皮质激素引起的骨病的组合物；或用于制备抑制骨髓间充质干细胞 (BMSC)分化为脂肪细胞的组合物。
[0009] 在另一优选例中，所述的组合物为药物组合物。
[0010] 在另一优选例中，所述的药物组合物还用于促进骨髓间充质干细胞（BMSC)分化 为骨细胞。
[0011] 在另一优选例中，所述的骨细胞为成骨细胞。
[0012] 在另一优选例中，所述的组合物还用于抑制或下调CEBPalpha的表达。
[0013] 在另一优选例中，所述的Wnt信号通路激活剂/激动剂选自下组：Wnt信号通路的 beta-catenin、Wnt3a、WntlOb、Wntl6、Wnt5a、Wnt7b、氯化锂。
[0014] 在另一优选例中，所述的糖皮质激素选自下组：地塞米松、倍他米松、泼尼松、泼尼 松龙、甲泼尼龙、曲安西龙、氢化可的松和可的松。
[0015] 在另一优选例中，所述的糖皮质激素为地塞米松。
[0016] 在另一优选例中，所述的糖皮质激素引起的骨病选自下组：骨质疏松、骨髓脂肪 化、和股骨头坏死。
[0017] 在另一优选例中，所述的骨病为骨质疏松。
[0018] 在本发明的第二方面，提供了一种fct信号通路抑制剂的用途，它被用于制备调 节骨髓间充质干细胞分化平衡的组合物；或用于制备抑制骨髓间充质干细胞（BMSC)分化 为脂肪细胞的组合物。
[0019] 在另一优选例中，所述的Wnt信号通路抑制剂选自下组：siRNA、抗体、shRNA、 RNAi, IWR-UDKKlo
[0020] 在另一优选例中，所述的组合物为药物组合物。
[0021] 在另一优选例中，所述的组合物还用于促进或上调CEBPalpha的表达。
[0022] 在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，其特征在于，包括药学上可接受的 载体和有效量的活性成分，其中所述的活性成分为fct信号通路激活剂/激动剂或Wnt信 号通路抑制剂。
[0023] 在另一优选例中，所述的药学上可接受的载体包括（但并不限于）：盐水、缓冲液、 葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。
[0024] 在本发明的第四方面，提供了一种体外非治疗性的调节骨髓间充质干细胞分化平 衡的方法，包括步骤：在fct信号通路激活剂/激动剂或Wnt信号通路抑制剂存在的条件 下，培养所述的骨髓间充质干细胞，从而调节骨髓间充质干细胞分化平衡。
[0025] 在另一优选例中，所述的骨髓间充质干细胞分化为：成骨细胞、软骨细胞、脂肪细 胞、心肌细胞、成纤维细胞。
[0026] 在另一优选例中，所述的骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞、软骨细胞、或脂肪细 胞。
[0027] 在另一优选例中，在BMP2和Wnt信号通路激活剂/激动剂存在的条件下，培养所 述的骨髓间充质干细胞，从而使骨髓间充质干细胞分化为骨细胞。
[0028] 在另一优选例中，在BMP2和Wnt信号通路抑制剂存在的条件下，培养所述的骨髓 间充质干细胞，从而使骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞。
[0029] 在本发明的第五方面，提供了一种CEBPalpha抑制剂的用途，它被用于制备预防 或治疗糖皮质激素引起的骨病的药物组合物。
[0030] 在另一优选例中，所述的药物组合物还用于促进骨髓间充质干细胞（BMSC)分化 为骨细胞。
[0031] 在另一优选例中，所述的骨细胞为成骨细胞。
[0032] 在另一优选例中，所述的糖皮质激素选自下组：地塞米松、倍他米松、泼尼松、泼尼 松龙、甲泼尼龙、曲安西龙、氢化可的松和可的松。
[0033] 在另一优选例中，所述的糖皮质激素引起的骨病选自下组：骨质疏松、骨髓脂肪 化、股骨头坏死。
[0034] 在另一优选例中，所述的CEBPalpha抑制剂包括抑制CEBPalpha基因（CEBPA)转 录的RNAi，CEBPalpha基因的甲基化促进剂、或抑制CEBPalpha蛋白功能的抑制剂。
[0035] 在另一优选例中，所述的CEBPalpha抑制剂选自：抑制CEBPalpha基因转录的 shRNA、CEBPalpha基因的siRNA、CEBPalpha基因的甲基化促进剂、桦木酸、或抗CEBPalpha 的抗体。
[0036] 在本发明的第六方面，提供了一种CEBPalpha或其促进剂的用途，它被用于制备 调节骨髓间充质干细胞分化平衡的组合物；或用于制备抑制骨髓间充质干细胞（BMSC)分 化为脂肪细胞的组合物。
[0037] 在本发明的第七方面，提供了一种体外非治疗性的调节骨髓间充质干细胞分化平 衡的方法，包括步骤：在CEBPalpha或其促进剂存在的条件下，或在CEBPalpha抑制剂存在 的条件下培养所述的骨髓间充质干细胞，从而调节骨髓间充质干细胞分化平衡。
[0038] 在另一优选例中，在BMP2和CEBPalpha抑制剂存在的条件下，培养所述的骨髓间 充质干细胞，从而使骨髓间充质干细胞分化为骨细胞。
[0039] 在另一优选例中，在BMP2和CEBPalpha或其促进剂存在的条件下，培养所述的骨 髓间充质干细胞，从而使骨髓间充质干细胞分化为脂肪细胞。
[0040] 在本发明的第八方面，提供了一种预防或治疗糖皮质激素引起的骨病或抑制骨髓 间充质干细胞（BMSC)分化为脂肪细胞的方法，包括步骤：给需要
[0041] 在CEBPalpha或其促进剂存在的条件下，或在CEBPalpha抑制剂存在的条件下培 养所述的骨髓间充质干细胞，从而调节骨髓间充质干细胞分化平衡。
[0042] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【专利附图】

【附图说明】
[0043] 下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的 本发明范围。
[0044] 图1显示，Dex诱导的骨质疏松小鼠骨髓脂肪化；6周雄性C57BL6J小鼠经Dex皮 下注射5周后，microCT检测到小鼠股骨丢失（图1A);骨密度（BMD)、骨量比值（BV/TV)、小 梁厚度（Tb.Th)、小梁数（Tb.N)下降，小梁间隙（Tb.Sp)增加（图1B);组化检测发现Dex 小鼠股骨骨髓中出现大量脂肪颗粒（图1C)。
[0045] 图2显示，Dex抑制成骨细胞分化，抑制脂肪细胞分化；图2A显示，Dex鼠及对照鼠 的BMSCs体外经BMP2诱导分化不同时间点成骨相关基因（0sx、Collal及Ocn)与脂肪相关 基因（aP2及Glut4)的表达情况；图2B显示，Dex鼠及对照鼠的BMSCs经BMP2诱导21天后 转而成脂IFMD诱导8天，脂肪相关基因 aP2及Glut4在Dex鼠 BMSCs中仍高表达，油红0染 色显示Dex鼠 BMSCs大部分已转分化为脂肪细胞；图2C显示，Dex抑制BMP2对C3H10T1/2 的成骨诱导，促进脂肪基因的高表达；图2D显示，不同浓度Dex处理的细胞向脂肪细胞转分 化能力的比较，油红〇染色显示10-6M Dex下大部分细胞已分化为脂肪细胞。
[0046] 图3显示，Dex抑制C/EBPalpha启动子的甲基化而促进其表达；图3A显示，BMP2 诱导Dex鼠及对照鼠的BMSCs成骨分化过程中C/EBPalpha的mRNA及蛋白水平；图3B显示， C3H10T1/2细胞经BMP2或BMP2与Dex同时处理不同时间点C/EBPalpha的mRNA及蛋白水 平；图3C显示，C/EBPalpha在Dex鼠及对照鼠股骨中的表达情况；图3D显示，两组BMSCs经 BMP2诱导21天后C/EBPalpha启动子的甲基化水平，C3H10T1/2经BMP2或BMP2及Dex处理 21天后C/EBPalpha启动子的甲基化水平的比较；图3E显示，C3H10T1/2细胞处理21天后 Dnmt3a/3b的蛋白水平；图3F显示，C3H10T1/2细胞处理21天后Dnmt3a/3b对C/EBPalpha 启动子的结合情况。
[0047] 图4显示shRNA沉默C/EBPalpha挽救了 Dex对BMSCs分化的影响；图4A显示， shRNA沉默效果检测；图4B显示，Dex鼠 BMSCs中沉默C/EBPalpha后再进行BMP2诱导到不 同时间点成骨及脂肪相关基因表达水平；图4C，图4D显示Dex鼠 BMSCs中沉默C/EBPalpha 后的转分化能力检测。
[0048] 图5显示，Wnt通路被Dex抑制；图5A显示，Dex鼠与对照鼠骨组织中活性 beta-catenin水平；图5B显不，C3H10T1/2在不同处理下的活性beta-catenin水平；图5C 显示，C3H10T1/2在不同处理下Wnt靶基因 Axin2及CyclinDl，以及Wnt抑制剂DKK1的表 达水平；图5D显示，C3H10T1/2中以IWR-1抑制Wnt通路后BMP2再诱导21天后成骨及脂 肪相关基因的表达水平；图5E显示，C3H10T1/2中以IWR-1抑制Wnt通路后细胞的转分化 能力；图5F显示，C3H10T1/2中以IWR-1抑制Wnt通路后C/EBPalpha的甲基化水平。
[0049] 图6显示，LiCl激活Wnt通路挽救了 Dex的效应；图6A显示，Dex鼠 BMSCs经LiCl 处理不同的时间点成骨及脂肪相关基因的表达水平；图6B显示，Dex鼠 BMSCs经LiCl处理 后的转分化能力；图6C显示，C3H10T1/2处理后的成骨及脂肪相关基因的表达水平；图6D 显示，C3H10T1/2处理后的转分化能力；图6E显示，Dex鼠 BMSCs及C3H10T1/2经处理21天 后C/EBPalpha启动子甲基化水平；图6F显示，C3H10T1/2处理21天后Dnmt3a/3b的蛋白 水平；图6G显示，C3H10T1/2处理21天后Dnmt3a/3b对C/EBPalpha启动子的结合；图6H 显示，Dex诱导骨质疏松机制总结。

【具体实施方式】
[0050] 本发明人经过广泛而深入的研究，在成功建立Dex诱导的骨质疏松小鼠模型的基 础上，首次意外地发现该小鼠的骨髓间充质干细胞（BMSCs)在BMP2的诱导下也更容易分化 为脂肪细胞，并且脂肪细胞的转录因子C/EBPalpha启动子甲基化被抑制，导致该因子在体 内外高度表达。在骨质疏松的BMSCs中沉默C/EBPalpha因子，能挽救其成骨分化能力，表 明Dex促进脂肪分化而抑制成骨分化是通过抑制C/EBPalpha启动子的甲基化而促进其表 达水平来实现。发明人进而发现fct/beta-catenin通路也参与到C/EBPalpha甲基化的调 节中。在骨质疏松小鼠的BMSCs中激活Wnt/beta-catenin通路可以将C/EBPalpha启动子 重新甲基化而下调其表达水平，进而挽救了 Dex导致的BMSCs分化失衡。本发明探明了 Dex 诱导的骨质疏松的机制以及fct信号通路在其中的作用，为该类疾病提供了新的有效的预 防/治疗靶点。在此基础上完成了本发明。
[0051] 术语
[0052] 糖皮质激素
[0053] 如本发明所用，术语"糖皮质激素"，"Glucocorticoid"，"肾上腺皮质激素"、或"糖 皮质激素药物"相同，可以互换使用。
[0054] 糖皮质激素是由肾上腺皮质分泌的一类留体激素，目前也可由化学方法人工合 成。糖皮质激素可用于一般的抗生素或消炎药所不及的病症，如SARS、败血症等，具有调节 糖、脂肪、蛋白质的生物合成和代谢的作用，还具有抗炎作用。
[0055] 糖皮质激素的基本结构特征包括，肾上腺皮质激素所具有的C3的羰基、Λ 4和17 β 酮醇侧链，以及糖皮质激素独有的17 α -0Η和11 β -0Η。代表性的糖皮质激素例子包括（但 并不限于）：地塞米松、倍他米松、泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、曲安西龙、氢化可的松和可 的松。
[0056] 糖皮质激素的药理作用主要有：抗炎作用，免疫抑制作用，抗毒素作用，抗休克作 用，影响造血系统，中枢兴奋作用，促进胃酸分泌，抑制松果体褪黑素的分泌，减少甲状腺对 碘离子的摄取清除和转化等。
[0057] 然而，一类与使用糖皮质激素药物相关的常见副作用是会导致不利的骨病，其中 包括（但并不限于）：骨质疏松、骨髓脂肪化、股骨头坏死。
[0058] 地塞米松
[0059] 如本发明所用，术语"地塞米松"，"Dexamethasone"，"氟美松"，"氟甲强地松龙"， "德沙美松"，以及"DEX"含义相同，可以互换使用。
[0060] 地塞米松是一种人工合成的肾上腺皮质激素，其衍生物有氢化可地松、泼尼松等， 具有抗炎、抗内毒素、抑制免疫、抗休克及增强应激反应等药理作用，广泛应用于各科治疗 多种疾病，如自身免疫性疾病，过敏，炎症，哮喘，及皮肤科、眼科疾病。
[0061] 地塞米松的药理作用主要包括：抗炎作用和免疫抑制作用。抗炎作用表现在，减轻 和防止组织对炎症的反应，抑制巨噬细胞和白细胞在炎症部位的集聚，抑制吞噬作用、溶酶 体酶的释放以及炎症化学中介物的合成和释放，减轻和防止组织对炎症的反应，从而减轻 炎症的表现。其免疫抑制作用表现在：防止或抑制细胞介导的免疫反应，延迟性的过敏反 应，减少T淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性细胞的数目，降低免疫球蛋白与细胞表面受体的结 合能力，抑制白介素的合成与释放，降低T淋巴细胞向淋巴母细胞转化，并轻原发免疫反应 的扩展；可降低免疫复合物通过基底膜，并能减少补体成份及免疫球蛋白的浓度。
[0062] 骨髓间充质干细胞及其分化
[0063] 如本发明所用，术语"骨髓间充质干细胞"，"bone marrow stem cell"，以及 "BMSC"含义相同，因此可以互换使用。
[0064] 骨髓间充质干细胞是一种存在于骨髓中的间充质干细胞，具有定向或多向分化的 潜能。BMSC源于中胚层，存在于全身结缔组织和器官间质中，其中以骨髓中含量最为丰富， 是骨髓中的非造血干细胞，同时它也是骨髓中的造血结构性和功能性支持细胞，因此又被 称为骨髓基质细胞。BMSC在骨髓中含量极少，仅占骨髓细胞比例的1/100-1/10000。BMSC 外观呈梭形、漩涡状生长，具有很强的自我复制和横向分化潜能，在体外特定的诱导条件下 可分化为骨、软骨、神经、脂肪、肌肉及肝等多种功能细胞，对间质组织如骨、软骨、肌键、月旨 肪和骨髓基质的再生也有重要作用。
[0065] 骨髓间充质干细胞具有很强的可塑性，可以多向分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪 细胞、心肌细胞、成纤维细胞，及肝细胞等间叶细胞和其他胚层细胞。本领域的普通技术人 员可以使用常规的通用方法对骨髓间充质干细胞进行不同方向的分化处理。一种优选的 实施方式为：用抗氧化剂作诱导剂，如：2_琉基乙醇（2-ME)、2%二甲基亚矾（DMS0)、硫代甘 油。另一种优选的实施方式是用生长因子作诱导剂，如：血小板衍生生长因子（PDGF)，表皮 生长因子，肝细胞生长因子（PGF)和胰导素样生长因子。在地塞米松处理的条件下BMSC可 转化为骨、软骨和脂肪细胞。
[0066] Wnt信号通路
[0067] Wnt是一个富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白家族，包括多个家族成员，如Wnt3a、 Wntl0b、Wntl6、Wnt5a、Wnt7b等。Wnt分子在多种组织中都有表达，并对细胞分裂、分化、组 织发育及肿瘤发生都具有重要的调控作用。fct信号通路可分为经典途径与非经典途径。 其中经典Wnt通路为Wnt - Fzl/LRP5/5 - β -catenin - TCF/LEF ;非经典通路主要有两条， 分别为 fct/Ca2+通路，即 Wnt - Fzl-G 蛋白一Ca2+- PKC/CaMK II /CaN - NFAT ;以及影响细 胞形状与极性的Wnt/RhoA通路[22]。
[0068] Wnt信号通路激活剂/激动剂
[0069] 小分子化合物如氯化锂（LiCl)能抑制Wnt负调控蛋白GSK_3beta而激活Wnt通 路。该药物最早用于治疗狂躁和抑郁交替发作的双相情感性精神障碍。后来发现该药物对 Wnt经典通路（Wnt/beta-catenin通路）有较强的激活作用。此外Wnt激活剂/激动剂还 有经典通路的Wnt小分子蛋白如Wnt3a、Wntl0b，通过和Wnt受体结合而激活该通路。过表 达Wnt通路中的效应分子beta-catenin能不通过Wnt通路上游信号的传递而直接发挥Wnt 通路的效应。
[0070] Wnt信号通路抑制剂
[0071] 在本发明中，Wnt信号通路抑制剂包括各种能抑制Wnt经典通路（Wnt/ beta-catenin通路）的小分子化合物、重组蛋白、单抗及RNAi制品，其祀点可以是Wnt分泌 蛋白，信号通路中间分子，效应蛋白等。
[0072] 小分子化合物IWR-1作用于Wnt受体FZD，阻止Wnt信号的传递；细胞分泌的小分 子蛋白DKK1与Wnt竞争性结合受体而抑制Wnt通路；针对Wnt小分子蛋白（Wnt3a、Wntl0b 等）的单抗能拮抗Wnt分子与受体的结合；促进GSK_3beta的化合物导致beta-catenin降 解；针对 beta-catenin 的 siRNA、shRNA 及 microRNA 等降低 beta-catenin 的蛋白水平，都 能有效抑制Wnt通路。
[0073] 药物组合物
[0074] 本发明提供了一种药物组合物，，包括药学上可接受的载体和有效量的活性成分， 其中所述的活性成分为fct信号通路激活剂/激动剂或Wnt信号通路抑制剂。
[0075] 如本文所用，术语"有效量"或"有效剂量"是指可对人和/或动物产生功能或活 性的且可被人和/或动物所接受的量。
[0076] 如本文所用，"药学上可接受的"的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良 副反应（如毒性、刺激和变态反应）的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语"药学上 可接受的载体"指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
[0077] 本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的 载体。这类载体包括（但并不限于）：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。载 体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
[0078] 通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服 制剂（片剂、胶囊、口服液）、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的 水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
[0079] 本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等 而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定（例如通 过临床试验）。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利 用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给 药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0. 00001mg-50mg/kg动物体重（较佳的 0. 0001mg-10mg/kg动物体重）的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫 切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
[0080] 应用
[0081] 本发明还提供了体外非治疗性的调节骨髓间充质干细胞分化平衡的方法，在fct 信号通路激活剂/激动剂或fct信号通路抑制剂存在的条件下，培养所述的骨髓间充质干 细胞，从而调节骨髓间充质干细胞分化平衡。
[0082] 优选地，所述的骨髓间充质干细胞特定分化为：成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心 肌细胞、成纤维细胞，肝细胞等。
[0083] 本发明的主要优点在于：
[0084] (1)本发明在小鼠中建立了 Dex诱导的骨质疏松模型，模型鼠中BMSCs在体外成骨 诱导中确实更容易分化为脂肪细胞；
[0085] (2)C/EBPalpha因子在模型中高表达，且在成骨分化诱导晚期其启动子也维持着 低甲基化的水平；
[0086] (3)Wnt/beta_catenin信号通路对C/EBPalpha在成骨细胞分化中表达及甲基化 都有重要的调控作用；
[0087] (4)Wnt/beta_catenin信号通路的激活剂LiCl能挽救Dex引起的成骨/成脂分化 平衡。
[0088] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和 份数按重量计。
[0089] 实施例1
[0090] Dex诱导的骨质疏松模型的建立
[0091] 为探索Dex导致的骨质疏松的机制，在本实施例中，发明人首先建立了 Dex诱导的 小鼠骨质疏松模型。6-8周小鼠经Dex皮下给药5周后，股骨用于microCT的分析。
[0092] 结果显示，经Dex处理的小鼠骨密度及骨量降低，骨小梁减少，呈明显的骨丢失表 型（图1A，图1B)。组织学检测发现和对照鼠相比，Dex给药的小鼠不仅骨小梁密度降低， 骨髓中出现大量脂肪（图1C)，与临床表型一致。
[0093] 实施例2
[0094] Dex抑制成骨细胞分化，并提高BMSCs向脂肪细胞分化的潜能
[0095] 为检测Dex处理小鼠的BMSCs分化能力是否发生改变，本发明人从Dex鼠及对照 鼠中分离了原代BMSCs，并在体外培养进行BMP2诱导的成骨分化能力检测。两组BMSCs经 BMP2诱导，在不同的时间点（3天、7天、14天、21天）检测成骨细胞相关基因的表达情况来 判断成骨分化的能力。
[0096] 结果发现，Dex鼠的BMSCs在BMP2诱导的不同时间点，成骨分化的marker基因 Osteorix(Osx)，I 型胶原（Collagen type I，Collal)及骨|丐素（Osteocalcin, Ocn)都低 表达，而在正常的BMSCs中这些基因都随着BMP2的诱导表达上升（图2A)。相反的，脂肪细 胞分化的相关基因 aP2和Glut4在Dex鼠 BMSCs向成骨细胞分化的过程中都高度表达（图 2A)。结果说明，与正常BMSCs相比，Dex诱导的骨质疏松小鼠的BMSCs成骨分化受到抑制， 而转向脂肪细胞分化。
[0097] 为进一步验证Dex小鼠的BMSCs的分化潜能已被改变，本发明人进一步进行了转 分化实验。两组BMSCs经BMP2成骨诱导21天后，转向IFMD诱导的脂肪分化。正常的BMSCs 在BMP2下诱导21天后，成脂诱导液IFMD下脂肪相关基因 aP2与Glut4也低表达，细胞不 会转分化为脂肪细胞。而Dex小鼠的BMSCs在BMP2诱导21天后，IFMD仍能诱导脂肪相关 基因高水平的表达，且大部分细胞都转分化为脂肪细胞（图2B)，说明成骨/成脂肪分化平 衡已经被破坏。
[0098] 进一步地，本发明人用小鼠间充质干细胞系C3H10T1/2重复以上实验。 C3H10Tl/2(小鼠胚胎间充质干细胞系，购自美国ATCC)在BMP2诱导下能分化为成骨细胞， 成骨相关基因都高表达；而与De X(l(T6M)同时作用时，BMP2对成骨相关基因的诱导性下降， 导致这些基因一直地水平表达。同时，与Dex小鼠的BMSCs类似，Dex作用下脂肪细胞相关 基因 aP2与Glut4高表达（图2C)。另外，Dex与BMP2同时处理的C3H10T1/2细胞在成骨 分化晚期时也能被IFMD诱导成脂肪细胞，且这种脂肪细胞转分化的能力随Dex浓度的增加 而提高，相比之下BMP2单独处理的细胞则不能（图2D)。上述结果与原代BMSCs类似，说明 长期高浓度的Dex抑制了成骨细胞的分化，将BMSCs转分化为脂肪细胞，导致成骨细胞数量 下降，成骨能力减弱，而脂肪细胞数量增加。
[0099] 实施例3
[0100] 在Dex处理下，C/EBPalpha因子高表达
[0101] 前期发现，脂肪细胞分化的关键转录因子C/EBPalpha在成骨细胞分化中表达下 调，它的过表达能破坏成骨/成脂的分化平衡。在骨质疏松模型中发现，BMSCs成骨/成脂 分化平衡已经被Dex破坏，本实施例用于检测C/EBPalpha表达水平的改变情况。
[0102] 首先，发明人在原代BMSCs及C3H10T1/2细胞中都对C/EBPalpha的水平进行检 测，结果发现，C/EBPalpha因子的mRNA及蛋白水平在Dex鼠的BMSCs中（图3A)以及Dex 处理的C3H10T1/2中（图3B)都明显高于对照，且在21天的成骨分化中都维持着这种高水 平。免疫组化实验发现Dex小鼠体内骨髓腔中C/EBPalpha的蛋白水平也明显比正常小鼠 商（图3C)。
[0103] 由于DNA甲基化是调控C/EBPalpha表达的主要分子机制，前期实验也证实该因 子在成骨分化晚期由于启动子高甲基化而沉默，因而模型中检测到的高水平的C/EBPalpha 表面其启动子甲基化被抑制。
[0104] 进一步地，发明人在Dex鼠及对照鼠的BMSCs中检测了 C/EBPalpha的启动子甲基 化水平，发现与对照BMSCs中的高甲基化水平相比，Dex鼠 BMSCs在BMP2诱导21天后C/ EBPalpha启动子几乎不甲基化，与其高表达水平一直。在C3H10T1/2的实验中也发现，Dex 抑制了 BMP2诱导的C/EBPalpha启动子甲基化（图3D)。
[0105] 进一步研究发现，Dex并不影响DNA甲基转移酶3a及3b的蛋白水平（图3E)，但 能抑制其对C/EBPalpha启动子的结合（图3F)，因而抑制了后者的甲基化。
[0106] 实施例4
[0107] 沉默C/EBPalpha能够挽救Dex对BMSCs的分化改变
[0108] 为进一步探索高表达的C/EBPalpha在Dex诱导的骨质疏松中的作用，发明人用 shRNA(短发卡 RNA，5' -TTCTCCGAACGTGTCACGTTTC-3' SEQ ID NO. : 1)将其在 Dex 鼠的 BMSCs 中沉默。Western blot证实了 shRNA的沉默效果后（图4A)，稳定转染的BMSCs进行BMP2 诱导的成骨分化检测。结果发现，C/EBPalpha沉默后，成骨相关基因表达有所上升，而脂肪 相关基因表达受到抑制（图4B)，同时BMSCs经BMP2诱导后不再向脂肪细胞转分化，即Dex 鼠BMSCs分化潜能得到了恢复（图4C，图4D)。
[0109] 结果说明，Dex转变BMSCs向成骨/成脂的分化平衡是通过提高C/EBPalpha的表 达水平而实现。
[0110] 实施例5
[0111] Wnt/beta-catenin信号通路参与调节C/EBPalpha的甲基化沉默
[0112] Wnt/beta-catenin信号通路是成骨细胞分化中最重要的调节信号之一。在本实施 例中，发明人在Dex诱导的骨质疏松模型中检测了该通路的活性。
[0113] 免疫组化结果显示，Dex小鼠的股骨腔内活性beta-catenin水平明显低于对照鼠 (图5A);而在体外培养的C3H10T1/2中，Dex也显著下调活性beta-catenin的蛋白水平 (图5B)，以及Wnt靶基因Axin2及CyclinDl，而促进Wnt抑制因子DKK1的高表达（图5C)。 这些结果说明fct/beta-catenin信号通路在骨质疏松模型中被Dex严重抑制。
[0114] 接下来以Wnt通路的小分子抑制剂IWR-1处理C3H10T1/2细胞，发现将Wnt/ beta-catenin通路抑制后，BMP2下成骨相关基因也维持低表达水平，而脂肪相关基因包 括C/EBPalpha则高表达（图;同时细胞也能够转分化为脂肪细胞（图5E)，而且C/ EBPalpha启动子甲基化也被抑制（图5F)，与Dex处理的细胞类似。
[0115] 这些结果说明，该通路是BMP2诱导成骨细胞分化，建立成骨/成脂分化平衡及C/ EBPalpha启动子甲基化过程中不可缺少的，而Dex通过上调C/EBPalpha的表达而改变该平 衡，是通过抑制fct/beta-catenin信号通路实现的。
[0116] 实施例6
[0117] Wnt激活剂LiCl能挽救Dex的效应
[0118] 上述实施例的结果说明，Wnt/beta-catenin信号通路在Dex下游作用，而Dex通 过抑制该通路来破坏成骨/成脂分化的平衡。
[0119] 在本实施例中，用LiCl处理Dex鼠的BMSCs及Dex处理的C3H10T1/2,检测Dex的 效应是否能被挽救。20mM LiCl与BMP2同时处理Dex鼠的BMSCs，发现成骨相关基因表达 得到了部分上调，特别是〇sx及〇cn;而脂肪相关基因的高表达则被显著抑制（图6A);处 理21天后的细胞不会再被IFMD诱导转分化为脂肪细胞（图6B);更重要的是C/EBPalpha 启动子甲基化得到了恢复（图6E)。C3H10T1/2细胞中的结果类似，LiCl能逆转Dex下低 表达的成骨基因及高表达的脂肪基因（图6C)，抑制细胞易向脂肪细胞转分化的能力（图 6D)，并挽救了 C/EBPalpha启动子的甲基化水平（图6E)。同样，LiCl在不改变Dnmt3a/3b 的蛋白水平（图6F)，但能恢复二者对C/EBPalpha启动子的结合（图6G)，因而也恢复了 C/ EBPalpha启动子的甲基化水平。
[0120] 讨论
[0121] 目前的研究发现Dex诱导的骨质疏松的可能机制如下：（l)DeX能抑制成骨细胞的 增殖并促使其凋亡；（2) Dex促进破骨细胞的数量并促进骨吸收。但现在仍不知道骨髓中出 现的大量脂肪的具体机制。
[0122] 绝经后骨质疏松妇女的BMSCs在体外培养时更容易分化为脂肪细胞而非成骨细 胞，提示Dex同样可能抑制BMSCs向成骨细胞分化，促进其成脂分化，因而降低了成骨细胞 的数量而导致大量的骨髓脂肪出现。
[0123] 在本发明的小鼠模型中，也同样观察到了骨丢失及骨髓脂肪的增加。体外培养的 BMSCs也高表达脂肪相关基因，且更容易分化为脂肪细胞，这些结果说明，长期接受Dex而 造成骨质疏松的小鼠的BMSCs向成骨/成脂的分化平衡已经被改变，更倾向于脂肪细胞分 化。
[0124] 成骨细胞与脂肪细胞来源于同一种干细胞，而其分化命运选择及决定的机制一直 都是研究的热点。现在对表观遗传学的研究发现，干细胞分化命运的决定是基于全基因组 范围内的表观修饰状态，而在起关键调控作用的转录因子的基因上的表观修饰则更加重 要。前期研究发现，C/EBPalpha启动子甲基化沉默是BMSCs向成骨细胞不可逆分化的先决 条件之一。一旦甲基化模式建立，成骨细胞则不会再转分化为脂肪细胞。本发明中，发现 Dex诱导的骨质疏松小鼠的BMSCs中C/EBPalpha高度表达，且在BMP2诱导成骨分化晚期其 启动子也一直不甲基化，导致该因子的持续高表达。以shRNA沉默C/EBPalpha后能重新建 立Dex鼠 BMSCs向成骨/成脂的分化平衡，更进一步的说明该因子在BMSCs分化命运决定 及成骨细胞不可逆分化中的作用。
[0125] 低浓度糖皮质激素在体内外都对成骨细胞分化有益，1(Γ9Μ?10_8M的Dex更是对 体外诱导成骨细胞分化必须。而C3H10T1/2的转分化实验发现高浓度De X(10_6M?10_7M) 处理的细胞有更高的脂肪细胞转分化能力，而低浓度Dex处理的细胞则不容易向脂肪细胞 转分化。且Dex对成骨相关基因的抑制及C/EBPalpha的表达促进在早期（3天）不明显， 而是随着处理时间的延长才越来越明显，说明Dex的计量及时间效应。
[0126] 本发明的研究发现，Dex通过以下机制抑制Wnt/beta-catenin通路：（1)激活 GSK3-beta 而促进 beta-catenin 的降解；（2)上调 Wnt 抑制剂 DKK1 及 SFRP ; (3)抑制 Wnt 转录因子TCF/LEF的激活。本发明的骨质疏松模型证实，该通路在体内外都被Dex抑制。由 于该通路能抑制脂肪细胞分化，Dex下上调的脂肪细胞相关基因包括C/EBPalpha的表达也 可能是这条通路被抑制了。发明人在BMP2诱导的C3H10T1/2成骨分化中抑制了 Wnt通路， 发现细胞的表型与Dex处理类似，包括C/EBPalpha启动子甲基化的抑制，说明该通路在成 骨/成脂分化平衡中的重要调控作用，是BMP2下成骨细胞命运决定及不可逆分化中所必须 的。以LiCl激活Wnt信号后可以恢复C/EBPalpha启动子甲基化水平而抑制其高表达，从 而挽救Dex鼠 BMSCs以及Dex处理的C3H10T1/2的分化能力，促进成骨细胞分化，重新建立 成骨/成脂的分化平衡，提示该信号通路可以作为治疗此类骨质疏松的靶点，抑制长期使 用Dex而导致骨质疏松患者体内BMSCs的成脂分化潜能而促进其成骨能力，提高骨形成。
[0127] 因此，综上所述（图6H)，本发明人认为，Dex诱导骨质疏松的新机制为：Dex打破 了 BMSCs向成骨/成脂分化的平衡，促进成脂肪的分化而抑制成骨分化，导致骨髓脂肪化 而成骨能力减弱；由于C/EBPalpha启动子在BMP2诱导的成骨细胞分化晚期高度甲基化是 成骨细胞不可逆分化的先决条件之一，Dex通过抑制Wnt/beta-catenin通路而干扰了 C/ EBPalpha启动子的甲基化，导致该因子在成骨细胞分化中高水平表达，使原本应分化为成 骨细胞的BMSCs转而分化为脂肪细胞。本发明结果表明，重新激活Wnt通路，在高浓度Dex 下建立C/EBPalpha启动子高甲基化水平而下调其表达水平，或以C/EBPalpha的抑制剂如 shRNA、siRNA、桦木酸（参见：ChemBioChem，13 卷 302-307 页）等抑制 C/EBPalpha 的表达 或活性，可能成为治疗此类骨质疏松的新思路。
[0128] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
[0001] 序列表 <110、中R科学院上海牛命科学研究院 <120〉预防和治疗糖皮质激素药物引起的骨病 <130> P2013-0202 <160> 1 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213>人工序列 <220> <221> miscfeature <223>寡核ff酸 <400> 1 ttctccgaac gtgtcacgtt. tc 22
【权利要求】
1. 一种Wnt信号通路激活剂/激动剂的用途，其特征在于，用于制备预防或治疗糖皮质 激素引起的骨病的组合物；或用于制备抑制骨髓间充质干细胞（BMSC)分化为脂肪细胞的 组合物； 较佳地，所述的组合物为药物组合物。
2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的糖皮质激素选自下组：地塞米松、倍 他米松、泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、曲安西龙、氢化可的松和可的松。
3. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的糖皮质激素引起的骨病选自下组：骨 质疏松、骨髓脂肪化、股骨头坏死。
4. 一种Wnt信号通路抑制剂的用途，其特征在于，用于制备调节骨髓间充质干细胞分 化平衡的组合物；或用于制备抑制骨髓间充质干细胞（BMSC)分化为脂肪细胞的组合物。
5. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的Wnt信号通路抑制剂选自下组： siRNA、抗体、shRNA、RNAi、IWR-1、DKK1。
6. -种药物组合物，其特征在于，包括药学上可接受的载体和有效量的活性成分，其中 所述的活性成分为fct信号通路激活剂/激动剂或Wnt信号通路抑制剂。
7. -种体外非治疗性的调节骨髓间充质干细胞分化平衡的方法，其特征在于，包括步 骤：在Wnt信号通路激活剂/激动剂或Wnt信号通路抑制剂存在的条件下，培养所述的骨髓 间充质干细胞，从而调节骨髓间充质干细胞分化平衡。
8. -种CEBPalpha抑制剂的用途，其特征在于，用于制备预防或治疗糖皮质激素引起 的骨病的药物组合物； 较佳地，所述的糖皮质激素引起的骨病选自下组：骨质疏松、骨髓脂肪化、股骨头坏死。
9. 如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的CEBPalpha抑制剂包括抑制 CEBPalpha基因（CEBPA)转录的RNAi，CEBPalpha基因的甲基化促进剂、或抑制CEBPalpha 蛋白功能的抑制剂。
10. -种CEBPalpha或其促进剂的用途，其特征在于，用于制备调节骨髓间充质干细胞 分化平衡的组合物；或用于制备抑制骨髓间充质干细胞（BMSC)分化为脂肪细胞的组合物。
【文档编号】A61P19/08GK104096233SQ201310116616
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2013年4月3日 优先权日:2013年4月3日
【发明者】张晓玲, 李姣 申请人:中国科学院上海生命科学研究院