一种用于治疗、预防或降低纤维化的透析液的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于治疗、预防或降低腹膜纤维化的透析液，包含电解质、渗透剂、生理可接受的pH溶液、及药学有效剂量的CB1R拮抗剂或CB2R促效剂。本发明还提供了CB1R拮抗剂或CB2R促效剂于在制造用于治疗、预防或降低腹膜纤维化的药剂中的用途。
【专利说明】一种用于治疗、预防或降低纤维化的透析液
[0001]相关申请案
[0002]本申请案主张美国临时专利申请案第61/729，170号(申请日:2012年11月21日)的优先权，兹将上述申请案的全部内容作为参考数据并入本文。
【技术领域】
[0003]本发明涉及一种用于治疗、预防或降低纤维化的透析液，特别涉及一种用于治疗、预防或降低腹膜纤维化的透析液。属于疾病治疗药物领域。
【背景技术】
[0004]终生的腹膜透析(PD, peritoneal dialysis)为一肾脏替代性疗法,其使用却因腹膜纤维化而受限。数个研究显示高张的葡萄糖溶液不仅对于间皮细胞有毒性[1;2]，亦会促使免疫细胞的细胞凋亡[3]。此外，高温灭菌过程会产生葡萄糖降解产物(⑶Ps，glucosedegradation products)像是于F1D透析液中的甲基乙二醒(MGO,methyIglyoxal)、乙醒、甲醛、以及3-脱氧葡萄醛酮+'GDPs具有强氧化特性及毒性，以及可诱发糖化终产物(AGEs，advanced glycosylated end products)?。再者，研究已证明 MGO,—重要的 GDP,于 F1D 透析液中会抑制胰岛素的信号通路，导致内生性活性氧的产生增加以及后续的细胞损伤[9]。研究中已指出2至33μ M的MGO存在于市售以葡萄糖为基底的腹膜透析液中[1°;11]。经长期暴露于各种不同GDPs及AGEs后，间皮细胞会进行去分化过程，且随的产生腹膜纤维化[12_16]。再者，这些慢性发炎部位是与渐进式的腹膜血管新生有关联[16_19]，最终导致H)效率降低。然而，针对该致病过程的治疗策略尚未被完全的开发[17]。
[0005]引证的文件:
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【发明内容】
[0031]本发明基于一非可预期的发现，无论是腹膜内的CB1R拮抗剂或CB2R促效剂，于甲基乙二醛(MGO)模式中，可有效改善腹膜纤维化。[0032]因此，于一方面中，本发明提供一种用于治疗、预防或降低腹膜纤维化的透析液，包含电解质、渗透剂、生理可接受的PH溶液及药学有效剂量的I型大麻素受体(CB1R)拮抗剂或II型大麻素受体(CB2R)促效剂。
[0033]在本发明中，优选的，该I型大麻素受体(CB1R)拮抗剂是选自由:5-(4-氯苯基)-1-(2，4- 二氯-苯基)-4-甲基-N-(哌啶-1-基)-1H-吡唑-3-羧酰胺(SR141716A)、4-[6-甲氧基-2-(4-甲氧苯基)1-苯并呋喃-3-羰基]苯甲腈(LY320135)、N-(哌啶-1-基)-1-(2，4- 二氯苯基)-5- (4-碘苯基)-4-甲基-1H-吡唑-3-羧酰胺(AM251)、N-(吗啉-1-基)-1- (2，4- 二氯苯基)-5- (4-碘苯基)-4-甲基-1H-吡唑-3-羧酰胺(AM281)、Δ9-四氢大麻酚(THCV)及其相似物所组成的群组。
[0034]在本发明的一个特定实施例中，该CB1R拮抗剂为N-(吗啉-1-基)_1_ (2，4_ 二氯苯基)-5-(4-碘苯基)-4-甲基-1H-吡唑-3-羧酰胺(AM281)。[0035]在本发明中，优选的，该II型大麻素受体(CB2R)促效剂是选自由:(2-碘-5-硝基苯基)-[l-[(l-甲基哌啶-2-基)甲基]吲哚-3-基]甲酮(AM1241)、(6aR, IOaR)-3-(1, 1- 二甲基丁基)-6a, 7，10，IOa-四氢-6，6，9-三甲基-6H- 二苯并[b，d]吡喃(JWH-133)、l-(2，3-二氯苯甲酰)-5-甲氧基-2-甲基-3-[2-(4-吗啉基)乙基]-1H-吲哚(GW-405，833)、[(1R, 2R, 5R)-2-[2，6-二甲氧基-4-(2-甲基辛基-2-基)苯基]-7，7-二甲基-4-双环[3.1.1]庚-3-烯基]甲醇(HU-308)、A9-四氢大麻酚(THCV)、大麻二酚(CBD)及其相似物所组成的群组。
[0036]在本发明的一个特定实施例中，该CB2R促效剂为(2-碘-5-硝基苯基)-[1-[(1-甲基哌啶-2-基)甲基]吲哚-3-基]甲酮(ΑΜ1241)。
[0037]在本发明中，优选的，该纤维化为腹膜纤维化。
[0038]在本发明中，优选的，该电解质包含钠离子、钙离子、镁离子、及氯离子。
[0039]更优选的，该电解质包含130-150mM钠离子、l-2mM钙离子、O-1mM镁离子及90-110mM氯离子。
[0040]在本发明中，优选的，该渗透剂可为选自由:单糖、双糖、多糖及氨基酸所组成群组中的一或多个化合物。
[0041]更优选的，该渗透剂为葡萄糖或葡萄糖衍生的聚合物。
[0042]在本发明中，优选的，该生理可接受的pH溶液具有4.5至7.5的pH值。
[0043]于另一方面中，本发明还提供了一种抗剂或CB2R促效剂在制造用于治疗、预防或降低腹膜纤维化的药剂中的用途。
[0044]本发明的该等及其他方面，可通过以下的较佳具体实施例的描述以及搭配之后的图式，得以更为明晰；即便其中可能会有变化或修饰，但皆不背离本发明所揭露的新颖观念的精神及范畴。
【专利附图】
【附图说明】
[0045]本发明前述
【发明内容】
以及之后的实施方式，可配合所附的图式以更容易理解。图式中:
[0046]图1显示于大鼠以MGO诱发的腹膜纤维化。大鼠腹膜组织(a-d)[比例尺:100 μ m]的梅生(Masson’s)三色染色图；型态测量分析显示随着剂量增加，而使得腹膜厚度显著增加 (剂量依存方式)(e)，以及于较高浓度的MGO (6-12mM) (f)时，导致表面的间皮细胞显著的损失；数据以平均值土SEM (每组n=6)的方式呈现；缩写:PDF:腹膜透析液(peritonealdialysis fluid)；
[0047]图2显示于大鼠中CBR配体可改善MGO诱发的腹膜纤维化情形；大鼠腹膜组织的梅生三色染色及型态测量分析显示MGO诱发的腹膜增厚可显著的被CB1R拮抗剂(AM281)治疗(a-d)或被CB2R 促效剂(AM1241)治疗(e_h)[比例尺:100μπι]所减缓；数据以平均值土SEM (每组η=6)的方式呈现；缩写:PDF:腹膜透析液；
[0048]图3显示MGO所诱发的间皮细胞分离(a)及血管新生(b)，皆可被选择性的
抗剂(AM281)治疗所减缓；数据以平均值土SEM(每组n=6)的方式呈现；(c)大鼠腹膜组织的具代表性的PCR结果显示，经MGO处理而向上调控的TGF-β 1、VEGF、及Snail基因表现，可被ΑΜ281调降；缩写:PDF:腹膜透析液；VEGF:血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor)；
[0049]图4提供间皮细胞培养中CBR的表现情形；Ca)大鼠腹膜组织、MeT_5A细胞及人类腹膜间皮细胞(HPMC, human peritoneal mesothelial cells)的 CB1R(绿色 FITC)以及CB2R(绿色FITC)的代表性免疫荧光染色图；(b)经TGF-β I处理后，于MeT_5A细胞中以PCR分析CB1R及CB2R的表现情形；
[0050]图5提供选择性CB1R拮抗剂(AM281)于培养的间皮细胞上的功效；(a)于MeT_5A及大鼠腹膜间皮细胞(RPMC, rat peritoneal mesothelial cell)培养中，AM281降低TGF- β I所诱发的细胞延长现象；(b) MeT-5A细胞的定量免疫荧光染色分析显示，于处理AM281后，可保存上皮标记(E-钙黏素及细胞角质素8/18，绿色FITC)的表现，及抑制第一型胶原蛋白(红色rhodamine)的合成；(c) MeT_5A细胞的western blot分析显示，AM281可调降TGB-β I所活化的ΡΙ3Κ ；
[0051]图6提供选择性CB2R促效剂(ΑΜ1241)于培养的间皮细胞的功效；数据以平均值土 SEM的方式呈现。
【具体实施方式】
[0052]除非另有定义，所有本文所用的技术性及科学性术语，对于属于本发明领域的具有通常知识者而言，皆具有与其所习知者相同意义。
[0053]于本文中所使用的单数形式「一(a)」、「一(an)」、及「该(the)」包括复数形式，除非文中有清楚指明者。因此，例如，当提及「一样本」时，包括复数个该等样本及本领域技术人员所知的同等物。
[0054]本发明非可预期地发现CBR配体对于降低腹膜纤维化具有显著的效用。尤其于本发明中，于本发明的具体实施例中显示，MGO诱发的腹膜增厚以及表面间皮细胞的显著损失，可被CB1R拮抗剂或被CB2R促效剂治疗所减缓(图2)。此一发现对于患有肾衰竭的病患特别有帮助，该等病患需要终生的腹膜透析(PD)治疗。此种长期的H)疗法将可能造成病患暴露于得到腹膜纤维化的风险，其可导致腹膜的寿命变短。因此，本发明不仅提供一可能的治疗方法以降低因透析所诱发的腹膜纤维化，同时亦延长ro病患的存活率。
[0055]因此，本发明提供一种用于治疗、预防或降低纤维化的透析液，包含电解质、渗透剂、生理可接受的PH溶液、及药学有效剂量的CB1R拮抗剂或CB2R促效剂。
[0056]I型大麻素受体(CB1R)存在于脑部中，且其可透过精神药物大麻或内源性大麻素，像是大麻素(anandamide)，于神经元中调控抑制性神经传导物质。然而，近来发现CB1Rs亦存在于非中央神经系统之组织中，且其功能于不同器官中也不相同[4]。第二型之大麻受体(CB2R)则位于免疫细胞上，且可调节细胞激素的释放该CBR配体，像是大麻二酚(cannabidiol)，已被证实，当将其长期施予人类时，其具有良好的耐受性，且不具副作用。
[0057]本文所使用的「I型大麻素受体(CB1R)拮抗剂」一词是指可选择性地用以阻断I型大麻素受体的任何物质或分子。在本发明中，该抗剂是选自以下组成的群组:5-(4-氯苯基)-1-(2，4-二氯- 苯基)-4-甲基-N-(哌啶-1-基)-1H-吡唑_3_羧酰胺(SR141716A)、4-[6-甲氧基-2-(4-甲氧苯基)1-苯并呋喃_3_羰基]苯甲腈(LY320135)、N-(哌啶-1-基)-1- (2，4- 二氯苯基)-5- (4-碘苯基)-4-甲基-1H-吡唑-3-羧酰胺(AM251)、N-(吗啉-1-基)-1-(2，4- 二氯苯基)~5~ (4~碘苯基)_4_甲基-1H-吡唑-3-羧酰胺(ΑΜ281)、Λ9-四氢大麻酚(THCV)及其相似物。于本发明的特定实例中，该CBlR拮抗剂为ΑΜ281。
[0058]本文所使用的「II型大麻素受体(CB2R)促效剂」一词是指可选择性地用以活化II型大麻素受体的任何物质或分子。于本发明中，该CB2RM效剂是选自以下组成的群组:(2-碘-5-硝基苯基)-[1-[(1-甲基哌啶-2-基)甲基]吲哚-3-基]甲酮(ΑΜ1241)、(6aR, IOaR)-3-(1, 1- 二甲基丁基)_6a, 7，10，IOa-四氢-6，6，9-三甲基-6H- 二苯并[b，d]吡喃(JWH-133)、l-(2，3-二氯苯甲酰)-5-甲氧基-2-甲基-3-[2-(4-吗啉基)乙基]-1H-吲哚(GW-405，833)、[(1R, 2R, 5R)-2-[2，6-二甲氧基-4-(2-甲基辛基-2-基)苯基]-7，7-二甲基-4-双环[3.1.1]庚-3-烯基]甲醇(HU-308)、A9-四氢大麻酚(THCV)、大麻二酚(cannabidiol)及其相似物。于本发明的特定实例中，该CB2R拮抗剂为AM1241。
[0059]本发明的一具体实施例中，该电解质包含钠离子、钙离子、镁离子、及氯离子。本发明中所用的电解质的一实例包含约130-150mM钠离子、1-2mM钙离子、O-1mM镁离子、及90-110mM氯离子。
[0060]本文所使用的「渗透剂」一词是一种可于溶液中用于维持渗透压的药剂。于本发明中，该渗透剂可选自由:单糖、双糖、多糖、及氨基酸所组成群组。例如，该药剂为葡萄糖或葡萄糖衍生的聚合物，像是艾考糊精，其为淀粉衍生的、分支的及可溶于水的一种糊精。
[0061]在本发明中，该生理可接受的pH溶液可为具有pH值为4.5至7.5的任何溶液。本领域技术人员可理解的是，该溶液可通过以适用的缓冲剂，像是碳酸氢盐或乳酸盐而制得。在一特定实例中，该溶液具有的PH值约为5。
[0062]本文所使用的「药学有效剂量有效量」一词是指可有效治疗、预防或治疗腹膜纤维化的剂量，其可依照施予的方式及治疗的情况，包括年龄、体重、症状、治疗效果、施用方式及治疗时间调整。
[0063]于另一方面中，本发明亦提供一种抗剂或CB2RM效剂于制造用于治疗、预防或降低腹膜纤维化的药剂的用途。
[0064]本发明进一步通过以下实施例阐述，其仅用于示例的目的而非用以局限本发明。
[0065]实施例
[0066]1.材料及方法
[0067]1.动物模式及组织制备
[0068]所有动物实验皆按照台北荣民总医院的动物试验委员会的规范进行。五周龄的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠购自国立阳明大学实验动物中心。腹膜透析液(PDF)是依据Hirahara等人[1°;22]所述方式制备，其中含有2.5%葡萄糖、100mmol/L NaCl、35mmol/L乳酸钠、2mmol/L CaCl2、及 0.7mmol/L MgCl2, pH 值为 5.0。为了测试 MGO 功效，将含有 0、3、
6、12mM MGO(Sigma, St.Louis, MO, USA)的 PDF 以每 kg50mL 的剂量进行腹腔注射，连续 10天。以二甲基亚讽(DMS0, dimethyl sulfoxide) (Sigma, St.Louis, MO, USA)作为 MGO 的溶剂。为了探讨CBR配体的功效，将SD大鼠以含有选择性的CB1R拮抗剂，AM281 (AlexisBiochemicals, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA) (lmg/kg/天)或选择性的 CB2R促效剂，AM1241 (Sigma, St.Louis, MO, USA) (lmg/kg/天)的PDF进行预处理3天,接着以分别含有CBR配体(AM281或AM1241)，以及6mM MGO的PDF连续处理10天。动物被以含有DMSO的TOF (不含有MG0)处理者当作对照组(每组n=6)。所有动物于试验结束后于全身麻醉后，以放血方式安乐死。
[0069]部分大鼠的腹膜组织被置于-80° C冷冻以进行免疫荧光分析，同时剩余的组织以中性福尔马林溶液进行固定，接着以石蜡包埋，以进行组织学分析。为了进行CBR的免疫荧光染色，将大鼠脑部及脾脏分别作为CB1R及CB2R的阳性对照组。为了进行腹膜增厚的量化，从每只大鼠的四个不同的腹膜位置取下大小为1.0X0.5cm的腹膜壁层，包括右腹、左腹、右体侧、左体侧的腹膜。每一个取样部位，该腹膜厚度为15个平均测量点的平均值。以梅生三色法将组织切片进行染色以量化腹膜纤维化。间皮细胞的数量是以型态测量学方式测定。将苏木素及伊红染色的切片以Aperio ScanScope影片扫猫机(Aperio, San Diego, CA, USA)以最高分辨率数字化。从每只动物的四个不同腹膜区域的每一个腹膜组织切片中取15个点以计算每mm的腹膜表面的间皮细胞平均数。腹膜血管新生是按照Patel et al.[23]所述方式进行量化。吾人以常规方式将6 μ m福尔马林固定且经石蜡包埋的大鼠腹膜组织切片进行免疫组织化学染色。经以抗α-平滑肌肌动蛋白的一级抗体(Abeam, Cambridge, MA，USA)作用后，将所有切片以聚合物-HRP染色套组(EnVision, Dako, Glostrup, Denmark)进行标记。染色后的切片是以 Aperio ScanScope 影片扫瞄机以最高分辨率数字化。从每只动物的四个不同腹膜区域的每一个腹膜组织切片中取15个点以计算每mm的腹膜的平均血管数量。
[0070]2.细胞培养
[0071]MeT-5A人类间皮细胞株取自美国菌种保藏中心(ATCC (AmericanType Culture Collection), Manassas, VA, USA),将含有 15% 胎牛血清(ThermoScientific, Waltham, MA, USA) > 及 1% 青霉素 / 链霉素 /L-麸胺酰胺(BiologicalIndustries, Israel)的 DMEM (Biological Industries, Israel)进行培养[24]。人类腹膜间皮细胞(HPMC)的初代培养是按先前技术所述方式制备[25]。所有病患材料皆按台北荣民总医院的人体试验委员会的道德行为规范方式执行。
[0072]大鼠腹膜间皮细胞(RPMC)的初代培养是从5周龄的雄性SD大鼠中所分离。以腹腔注射方式将胰蛋白酶-EDTA (Gibco, Grand Island, NY, USA) (1.25% ；100mL/kg)注入，接着经2小时作用后抽出。将抽出物以1500rpm离心10分钟，以磷酸盐缓冲液冲洗，接着以含有10%胎牛血清及1%青霉素/链霉素/L-麸胺酰胺的DMEM进行培养。
[0073]为了分析CB1R拮抗剂于间皮细胞的效用，本发明发明人以5μΜΑΜ281预处理MeT-5A细胞及RPMCl小时，接着同时以AM281及TGF-β I (R&Dsystems, Minneapolis, MN, USA)处理 5 天,并使用不同的 TGF- β I 浓度(0.1 至 1.0ng/mL)。于CB2R实验中，以AM1241替换，并于MeT_5A细胞及HPMC上测试。
[0074]为了进行免疫荧光研究，本发明发明人于玻片角瓶(Lab-Tek II;Nalge Nunc.Naperville, IL, USA)中培养间皮细胞。所用的一级抗体及作用条件皆列于表1中。
[0075]表1.用于免疫组织化学分析的一级抗体及作用条件[0076]
【权利要求】
1.一种用于治疗、预防或降低纤维化的透析液，包含电解质、渗透剂、生理可接受的PH溶液、及药学有效剂量的I型大麻素受体(CB1R)拮抗剂。
2.如权利要求1所述的透析液，其中该I型大麻素受体(CB1R)拮抗剂是选自由:5-(4-氯苯基)-1-(2, 4-二氯-苯基)-4-甲基-N-(哌啶-1-基)-1Η-吡唑_3_羧酰胺(SR141716A)、4-[6-甲氧基-2-(4-甲氧苯基)1-苯并呋喃_3_羰基]苯甲腈(LY320135)、N-(哌啶-1-基)-1- (2，4- 二氯苯基)-5- (4-碘苯基)-4-甲基-1H-吡唑-3-羧酰胺(AM251)、N-(吗啉-1-基)-1-(2，4- 二氯苯基)~5~ (4~碘苯基)_4_甲基-1H-吡唑-3-羧酰胺(AM281)、Δ9-四氢大麻酚(THCV)及其相似物所组成的群组。
3.如权利要求2所述的透析液，其中该CB1R拮抗剂为N-(吗啉-1-基)-1-(2，4-二氯苯基)-5-(4-碘苯基)-4-甲基-1H-吡唑-3-羧酰胺(AM281)。
4.一种用于治疗、预防或降低腹膜纤维化的透析液，包含电解质、渗透剂、生理可接受的PH溶液、及药学有效剂量的II型大麻素受体(CB2R)促效剂。
5.如权利要求4所述的透析液，其中该II型大麻素受体(CB2R)促效剂是选自由:(2-碘-5-硝基苯基)-[1-[(1-甲基哌啶-2-基)甲基]吲哚-3-基]甲酮(AM1241)、(6aR, 10aR)-3-(1, 1- 二甲基丁基)-6a, 7，10，IOa-四氢-6，6，9-三甲基-6H- 二苯并[b，d]吡喃(JWH-133)、l-(2，3-二氯苯甲酰)-5-甲氧基-2-甲基-3-[2-(4-吗啉基)乙基]-1H-吲哚(GW-405，833)、[(1R, 2R, 5R)-2-[2，6-二甲氧基-4-(2-甲基辛基-2-基)苯基]-7，7-二甲基-4-双环[3.1.1]庚-3-烯基]甲醇(HU-308)、A9-四氢大麻酚(THCV)、大麻二酚(CBD)及其相似物所组成的群组。
6.如权利要求5所述的透析液，其中该CB2R促效剂为(2-碘-5-硝基苯基)-[1- [ (1-甲基哌啶-2-基)甲基]吲哚-3-基]甲酮(ΑΜ1241)。
7.如权利要求1至6中任一项所述的透析液，其中该纤维化为腹膜纤维化。
8.如权利要求1至6中任一项所述的透析液，其中该电解质包含钠离子、钙离子、镁离子、及氯离子。
9.如权利要求8所述的透析液，其中该电解质包含130-150mM钠离子、l-2mM钙离子、O-1mM镁离子及90-110mM氯离子。
10.如权利要求1至6中任一项所述的透析液，其中该渗透剂可为选自由:单糖、双糖、多糖、及氨基酸所组成群组中的一或多个化合物。
11.如权利要求10所述的透析液，其中该渗透剂为葡萄糖或葡萄糖衍生的聚合物。
12.如权利要求1至6中任一项所述的透析液，其中该生理可接受的pH溶液具有4.5至7.5的pH值。
13.—种抗剂在制造用于治疗、预防或降低腹膜纤维化的药剂中的用途。
14.一种CB2RM效剂在制造用于治疗、预防或降低腹膜纤维化的药剂中的用途。
【文档编号】A61K31/454GK103830732SQ201310116382
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2013年4月3日 优先权日:2012年11月21日
【发明者】杨智宇, 杨安航 申请人:台北荣民总医院