专利名称：用于骨髓干细胞(bmsc)成骨分化的方法及其用途的制作方法
技术领域：
一方面，本发明涉及用于骨髓干细胞(BMSC)的成骨分化(优选还 至少部分内皮分化)的体外或离体方法，并涉及这样的分化细胞的应用。 另一方面，本发明涉及特定的细胞类型和细胞群，它们表现出与先前公开 的骨原细胞和成骨细胞类似但却是新的特征。在相关的方面中，本发明提 供了上述方法、可使用该方法获得的细胞和细胞群以及本文具体描述的细 胞类型和细胞群的用途，特别是在治疗(优选骨治疗)领域的用途。
背景技术：
同种骨髄移植(allogeneic bone marrow transplantation)的可行性在 患有重度成骨不全的儿童中得到了证实(Horwitz等1999. Nat Med 5(3): 309-13)。在该研究中，移植来源于骨髄的功能性间充质细胞，并促进形成 新的骨密质，il^明移植细胞分化为生成骨的成骨细胞。还报道了在患有 肱头骨坏死的患者中进行的自体骨髓移植(Hernigou等1997. J Bone Joint Surg Am 79:1726-1730)。因此，移植能够进行成骨分化的干细胞或者定向 (commit)为成骨分化的细胞可成为用于治疗骨相关疾病(特别是当所述 治疗需要生成新骨时)的纟艮有前景的途径。
因此，非常需要提供适于作为骨相关疾病的疗法而移植的足量细胞(特 别是自体细胞)的有效技术。
尽管可以移植未分化的骨髓干细胞，然而这些细胞尚未定向至骨谱系， 因此所移植的干细胞中相当大的部分可能最终对骨组织的形成没有贡献。 另外，已经证实(Banfi等2000. Exp Hematol28:707-15),当4吏用生长因 子(如FGF-2)进行处理时，骨髓干细胞的体外培养降低其增殖潜力及其 分化能力。例如，在该研究中，与新分离的骨船目比，体外培养的骨髓干 细胞的骨形成率在第一次传代时已降低了 36倍。因此，骨髓干细胞的体外 扩增可能降低其在移植后作为生成骨的成骨细胞来源的效率。
Martin等(Endocrinology 138: 4456-4462,1997)证明，在2型成纤维
细胞生长因子(FGF-2)与胎牛血清(FCS)组分共同存在下体外培养骨 髓干细胞，使该细胞保持在未成熟状态(较少的碱性磷酸酶以及成纤维细 胞样的形态)，尽管该细胞在特定的成骨培养条件下能够在体外进行成骨 分化。然而，这样的未成熟细胞在体内向生成骨的成骨细胞的分化仍取决 于在移植时提供的适当信号。因此，虽然这样的细胞可能能够在体外进行 成骨分化，但是在体内其相当大的一部分可能仍然不变为成骨细胞。同样， Chaudhary等(Bone 34: 402-11, 2004)显示，经FGF-2处理的人骨髄干 细胞不表现任何成骨表型(不表达碱性磷酸酶)，并且事实上具有营养不 良的形态。类似地，Kalajzic等(J Cell Biochem 88: 1168-76， 2003 )证明， FGF-2抑制成骨分化。
另外，制备用于人类治疗的材料应避免在培养基中使用非人动物的组 分，如血清组分(例如，FCS)。然而，如Kuznetsov等(Transplantation 70: 1780-1787， 2000 )所示，同源或自体人血清的使用大大减弱了人骨髄干 细胞在体外形成集落和扩增以及在体内形成骨的能力。因此，Kuznetsov 等提出，使用FCS是骨髄干细胞的有效扩增及其形成骨的能力的前提。
Takagi等2003( Cytotechnology 43: 89-96 )在特定条件下在含有FGF-2 的^^血清中孵育人骨髄抽取物。由Takagi等2003如此获得的细胞^ 表现出分化形成软骨的潜力，从而作者将其用于软骨再生中。
Kobayashi等2005 (J Bone Joint Surg Br 87: 1426-3 )描述了用于在自 体,血清中分离和维持人BMSC的特定4Hf ，推断这些条件可提供充分 的人BMSC离体扩增，而同时保留其多分化潜能。Kobayashi等2005在 继代培养中使用FGF-2以，促进BMSC进:步扩增而不分化。这些作者并
Lin等2005 (Transplant Proc 37: 4504-5)报道了在自体W^血清中延 长多能人BMSC的扩增。在某些条件下向细胞添加FGF-2和EGF不影响 细胞的增殖，并且不使细胞向成骨方向;5La。
为了提供最大骨形成，移植已表现为成骨细胞表型的细胞将是理想的， 因为这些细胞基本上是惟一已证实具有骨形成活性的细胞。然而，骨髓干 细胞在体外分化为成骨细胞涉及在成骨培养基中进行培养(Jaiswal等 1997. J Cell Biochem 64: 295-312 )，这可导致这些细胞体外增殖的降低。
而且，使用成骨培养基包括向细胞添加另外的组分，这可增加细胞培养物 发生污染的风险。
因此，本领域需要用于以下目的的筒单可靠的方法在体外^A成体 干细胞(尤其是人骨髓干细胞)产生骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型 细胞，而同时维持该细胞的高扩增能力、确保自体条件并使细胞培养中涉 及的组分数最少。
本领域还需要具有特别有用的特征(例如，在骨治疗中)的骨原细胞 或成骨细胞以及含有这些细胞的细胞群。
发明内容
本发明关注现有技术的上述问题及其他问题。
特别地，本发明人意识到，使用本文公开的培养条件可以容易地离体 扩增成体干细胞特别是骨髄干细胞(BMSC)(优选来源于人的)，并将 其导向有用的骨原细胞或成骨细l&^型，以及包含这些及其他表型的有用 细麟。
因此，在一方面，本发明涉及用于体外或离体vM^v骨髓干细胞获得骨
原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞的方法，其包括4吏所述骨髓干细胞 接触人的血浆或血清以及生长因子或其生物活性变体或衍生物。
本发明人Jf见察到，本发明的方法可以将显著部分(如大多数)进行接 触的干细胞向骨原细胞或成骨细胞表型分化。因此，在一方面，本发明方 法可用于获得骨原细胞、成骨细胞或成骨细#型细胞本身。
尽管如此，可以理解的是，本发明的方法通常产生包含骨原细胞、成 骨细胞或成骨细胞表型细胞的细胞群，通常为包含显著部分(例如大多数) 上述细胞的细胞群。本发明人还发现，该方法得到的细胞群可包含另外的 细胞类型，其中至少某些细胞类型可以增加存在于这些细JJfc^中的骨原细 胞或成骨细M型细胞的有用特征(特别是在骨治疗中)。例如，在一个 实施方案中，本发明的方法得到的细,还可以包含内皮细胞或内皮祖细 胞。
因此，在一方面，本发明涉及用于体外或离体^A骨髓干细胞获得包
，骨原细胞、成骨细胞或成骨细,表型细胞的细胞群的方，，其包括使,
生物o
如实JiHi据所示，本发明的方法可以在3周(更具体为21天)中提供 40,000 ~ 710,000倍的骨髓干细胞扩增。就现有技术中使用人血清显著减弱 人骨髓干细胞扩增的教导(Kuznetsov等2000)而言，如此高程度的扩增 是出乎意料的。因此，本发明允许产生大量细胞用于移植目的。这有利地 降低了为提供干细胞而需要从受试者中抽取的骨髄样品的大小。另外，本 发明允许缩短可将分化细胞移植进患者中的时间，因此带来更快捷的治 疗。
在一个优选的实施方案中，该方法使用成纤维细胞生长因子，特别是 FGF-b (即FGF-2 )。就现有技术中关于FGF-2导致更不成熟的骨髄干细 胞表型(Martin等1997, Kalajzic等2003)的教导而言出人意料的是， FGF-2与人血浆或血清组分的共同使用刺激骨髓干细胞的分化而获得骨原 细胞、成骨细胞或成骨细Jifc^型细胞的表型特征。
因此，本方法通过组合现有技术中已知在分别使用时提供相反效果的 要素而提供了出乎意料的有利效果——高扩增和成骨细胞表型。更惊AJfc, 现有技术教导，体外分化为成骨细胞需要成骨培养基，其包含如地塞米松、 抗坏血酸磷酸酯和(3-甘油磷酸的组分。本发明出人意料地显示，这些组分 不是获得骨原细胞、成骨细胞或成骨细M型细胞所必需的。因此，可有 利地减少培养基中的组分数，这使得出错或污染或者这些组分在移植后遗 留的机会更低。
在另一些优选实施方案中，该方法在骨髓干细胞的培养中使用人血浆 或血清，所人血浆或血清就所述骨髓干细胞而言是自体的，和/或不包括 任何非人动物的材料(如血清组分)。这使得该方法对于人类治疗中的用险。
本方法的另一些优选实施方案定义了另一些特征，例如但不限于孵育 时间、传代、组分的量等，它们单独或组合地进一步从现有技术限定该方 法，并且成为提供具有有利特征(例如在骨移植中的优越性)的细胞和细
胞群的^ftl;。
本发明人意识到，可使用本发明方法获得的骨原细胞、成骨细胞或成 骨细胞表型细胞以及细胞群表现出优于现有技术的示例性优点。首先，至 少在离体培养期间，所述细胞表现出快速的增殖速率，估计倍增时间约为 2天。因此，可以在相对较短的时间内产生足量的细胞，这有利地缩短了 患者的治疗周期。其次，所述细胞显示相对较快的基质矿化速率，这使得 将细胞移植进患者后骨形成增强。第三，所述细胞很少或基本不显示向其 它间充质表型(特别是向脂肪细胞或软骨细胞)分化的倾向。这可以有利 地限制移植细胞时形成除骨以外的组织。
因此，在另一些方面，本发明提供了可使用本发明方法获得或者直接 通过本发明方法获得的骨原细胞、成骨细胞或成骨细g型细胞以及包含 它们的细胞群和培养物，本发明还提供了它们在骨相关疾病中的治疗用途 以及包含它们的相应药物制剂。
在本发明的进一步发展中，本发明人详细分析了实施本发明的方法所 获得的细胞和细胞群，从而定义可在治疗中(特别是在骨移植治疗中)提 供特定优越性的新的成骨细胞类型以及包含它们的新细胞群。因此，本发 明还关注这些新的细胞类型、包含它们的细胞群及其用途(特别是在骨治 疗中的用途)。
因此，在一方面，本发明提供了骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型
细胞(本文中称为"OOP-l细胞")，其特征在于它们共表达(1)选自碱 性磷酸酶(ALP)(更具体地为骨-肝-肾型ALP) 、 1型前胶^、氨基端前 肽(P1NP)和骨涎蛋白(bonesialoprotein，BSP)的至少一种成骨细胞标 志物与(2)选自CD63(例如，通过抗体HOP-26识别的；参见Zannettino 等2003. J Cell Biochem. 89: 56-66)和CD166的至少一种干细胞/未成熟 骨原细胞标志物。在(l)中在一个优选的实施方案中，所述OOP-l细 胞可以表达至少ALP;在另外的优选实施方案中，OOP-l细胞可以表ili^ 自ALP、 P1NP和BSP的至少两种标志物，例如，至少ALP和P1NP、至 少ALP和BSP或者至少P1NP和BSP;在又一优选的实施方案中，OOP-l 细胞可以至少表达ALP、 BSP和P1NP的所有3种。在(2)中在一个 优选的实施方案中，OOP-l细胞可以表达至少CD63;在另一优选的实施 方案中，OOP-l细胞可以表达至少CD166;在又一优选的实施方案中，
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OOP-l细胞可以表达至少CD63和CD166。
就本发明人所知，现有技术仅在ALP、 P1NP和BSP为阴性时在干细 胞/未成熟骨原细胞中观察到CD63和/或CD166。现有技术中这些CD63 和/或CD166阳性细胞显示多能性并且可以分化为软骨细胞、脂肪细胞以 及成骨细胞。因此，ALP、 P1NP或BSP中至少一种与CD63和/或CD166 的同时存在标志着本发明的骨原细胞或成骨细胞表型细胞(OOP-l细胞) 是新的、先前未公开的细胞类型。而且，这种新的细胞类型显示出至少某
些有利的性质，如高增殖速率、高矿化速率以; L^本上不会向软骨细胞和
脂肪细胞分化，这在例如骨治疗中特别有用。
在一个优选的实施方案中，所述骨原细胞或成骨细胞表型(OOP-l细 胞)的骨钙蛋白(OCN)是阴性的。本领域已知OCN在成熟的成骨细胞 中偏好表达。因此，缺乏OCN表达表明这些细胞较不成熟的特征。
在另一方面，本发明提供了骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞 (本文中称为"OOP-2细胞")，其特征在于它们共表达(即是阳性的)(1) 选自碱性磷酸酶(ALP)(更具体地为骨-肝-肾型ALP) 、 1型前胶原氨 基端前肽(P1NP)和骨涎蛋白(BSP)的至少一种成骨细胞标志物与(2) 造血/内皮祖细胞标志物CD34。在(l)中在一个优选的实施方案中， OOP-2细胞可以表达至少ALP;在另 一些优选实施方案中，OOP-2细胞 可以表iii^自ALP、 P1NP和BSP的至少两种标志物，例如，至少ALP 和P1NP、至少ALP和BSP或者至少P1NP和BSP;在又一优选的实施 方案中，OOP-2细胞可以表达至少ALP、 BSP和P1NP的所有3种。
就本发明人所知，表达CD34的骨原细胞或成骨细M型细胞以前从 未有过记栽，通常认为缺乏CD34是骨髄间充质干细胞的特征之一。因此， ALP、 P1NP或BSP中至少一种与CD34的同时存在标志着本发明的骨原 细胞或成骨细胞表型细胞(OOP-2细胞)是新的、先前未公开的细胞类型。 而且，这种新的细胞类型表现出至少某些有利的性质，如高增殖速率、高 矿化速率以及基本上不会向软骨细胞和脂肪细胞分化，这在例如骨治疗中 特别有用。
在一个优选的实施方案中，所述骨原细胞或成骨细胞表型(00P-2细 胞)的骨钙蛋白(OCN)是阴性的。本领域已知OCN在成熟的成骨细胞
中偏好表达。因此，缺乏OCN表达表明这些细胞较不成熟的特征。
本发明人还关注本发明上述骨原细胞或成骨细胞细胞类型的重叠。例 如，在某些实施方案中，OOP-l细胞也可以共表达CD34。在另一些实施 方案中，OOP-2细胞也可以表达CD63和CD166中至少一种(例如，一 种或两种)。
如上文所述，本发明还包括包含本发明上述骨原细胞或成骨细胞表型 细胞(例如，包含上述OOP-l和/或OOP-2细胞类型)的细胞群。示例性 的细胞群可包含至少10%、优选至少30%、更优选至少50% (例如，至 少60%)、更优选至少70% (例如，至少80%)、甚至更优选至少卯％ (例如，至少95% )的OOP-l和/或OOP-2细胞类型。在一些优选的实 施方案中，所述细胞群可以包含少于50°/。、优选少于40%、更优选少于 30%、更优选少于20°/。以及更加优选少于10% (例如，少于7%、少于5 %或少于2% )的除上述OOP-l和/或OOP-2细胞类型以外的细胞类型。
在一个优选的实施方案中，所述细胞群还可以包含内皮细胞或其祖细 胞。优选地，这些内皮细胞或祖细胞可以表达冯.维勒布兰德因子(vWF)、 VEGF和CD133中至少一种(例如，至少两种，或至少所有3种)。在另 一实施方案中，所述内皮细胞还可以共表达CD34。
有利地，本发明人意识到，细胞群中这些内皮细胞或其祖细胞与本发 明的骨原细胞或成骨细胞表型细胞的共同存在可以改善所述成骨谱系细 胞在患者中的移植，推测这是通过促进形成支持移植细胞和组织并向其供 氧的血管和/或通过释放生长因子如VEGF来实现的，但作用方式并不仅 限于此。
在相关的方面，本发明提供了包含上述定义的细胞和细胞群的药物制 剂及其治疗用途。
本发明的这些特征及另 一些特征将在下文中并在所附的权利要求中进 一步进行解释，并且通过非限制性的实施例进行说明。
图1显示将根据本发明制备的细^注射入患有股骨头坏死的患者的 结果(带有菱形的实线)。A: VAS评分；B: WOMAC评分。"B"-基线，
"3m"-3个月，"6m"-6个月，虚线-历史对照(活组织检查对照)。 图2显示本发明的细胞/细胞群的矿化。
发明详述
除非另有明确说明，本文使用的无数量修饰的名词包括一种(个)和 多种(个)该指代物。例如，"细胞"是指一个或多个细胞。
本文使用的术语"包含"和"由…构成"与"包括"或"含有"的含义一致， 为包括式的或开放式，并且不排除其他未提及的成员、要素或方法步骤。
通过端点表述的数值范围包括该范围内的所有数值和分数，以及所述
'吾、o
涉及可测量值如M、量、持续时间等等时，本文使用的术语"约"意
在包含指定数值的+/-20%或更小的变化、优选+/-10%或更小的变化、更优 选+/-5 %或更小的变化、甚至更优选+/-1 %或更小的变化以及更加优选 +/-0.1 %或更小的变化，只要这些变化适于实施本文公开的发明。
本说明书中所有引用文献通过参考整体并入本文。特别地，本文中具 体提及的所有文献中的教导均通过参考并入本文。
除非另有定义，本发明所公开使用的所有术语(包括技术和科学术语) 具有本发明所属领域普通技术人员所通常理解的含义。
1.发明方法
如发明内容部分所详述的， 一方面，本发明涉及用于体外或离体>^ 骨髓干细胞获得骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞以及获得包含骨 原细胞、成骨细胞或成骨细，表型细胞的细胞群的方、法，其包括，所述骨
骨髓是占据长骨的髓腔、某些哈弗管以及松质骨或骨术>质(spongy bone)的小梁之间空间的软组织。通常分为两种类型的骨髓红骨髄，可 见于年轻时期的所有骨中以及成体阶段的有限位置中(例如骨松质中)， 其主要参与血细胞的产生(血细胞生成)；黄骨髓，其主要包含脂肪细胞 和结締组织。
总的来说，骨髓是由以下细胞构成的复合组织itjk千细胞、红细胞 和白细胞及其前体、间充质干细胞(MSC)、基质细胞及其前体以及包括 成纤维细胞、网织红细胞、脂肪细胞和形成结締组织网络(称为"间质，，) 的细胞的一群细胞。
骨髓细胞在小鼠和人中进行全身移植后均可形成多种组织。这种能力 可反映骨髄中存在的多能干细胞(例如造血千细胞、间充质干细胞和/或骨 髓多能千细胞)的活性。例如，Krause等(Cell 105: 369-377, 2001)显示， 来源于骨髄的单个干细胞可以产生造血和非造血镨系的细胞。这被 Dominici等(PNAS 101(32): 11761- 6， 2004)所证实，他们显示，在骨髓 移植后造血细胞和成骨细胞可以来源于共同的骨髓祖细胞。在另一实例 中，美国专利5,486,359公开了从骨髄中分离间充质干细胞，其能够形成间 充质谱系(例如骨、软骨、肌肉、腱、结締组织、脂肪或骨髄间质)的细 胞。另外，Horwitz等(NatMed 5(3): 309-13， 1999)显示，同种基因骨髓 移植在患有重度成骨不全的儿童中是有效的。在该研究中，将来源于骨髄 的功能性间充质细胞移植，并促进形成新的骨密质。如Horwitz等(PNAS 99(13): 8932-7， 2002 )所示，在仅移植间充质千细胞(塑料贴壁骨髄细胞) 之后，所移植的成骨细胞的百分数没有显著增加，由此推论除贴壁细胞 群(认为间充质干细l&^在于其中)中的细胞以外的骨髄细胞可以是有力 的可移植的成骨细胞祖细胞。综上所述，骨髄可能包含具有产生骨细胞 (骨)谱系细胞潜力的若千种干细胞类型。
因此，本文使用的术语"骨髄干细胞，，或"BMSC，，是指存在于骨髓中、 特别是存在于或(部分地)分离自骨髓样品的任何成体干细胞。可以从例 如受试者的,、股骨、胫骨、脊柱、肋骨或其他骨髓空间获得骨髄(BMSC ) 样品。术语BMSC还包括BMSC的后代，例如对得自受试者样品的BMSC 进行体外或离体增殖而得到的后代。
本文使用的术语"干细胞，，表示若接触适当的条件则能够产生至少一 种、优选两种或更多种不同细胞类型的任何细胞。这样的干细胞能够在体 内(在特定条件下也在体外)广泛增殖或者可能无限增殖，其中这些干细 胞的后代可保持表型特征以及母细胞的增殖能力，或者如果接触适当的条 件则可以产生更特化的(即更分化的)细胞。例如，干细胞不预先分裂而 分化为另 一细胞时，或者在干细胞的一轮或多轮分裂和/或分^f匕之后产生该
另一细胞，则称千细胞"产生"另一更分化的细胞。
本文使用的术语"成体干细胞，，是指在胎儿阶段或出生后的生物体中 存在或获得的干细胞。
本发明优选的骨髓干细胞具有产生至少成骨(骨)谱系细胞的潜能， 所述成骨(骨)谱系细胞例如成骨生成细胞和/或骨原细胞和/或前成骨细 胞和/或成骨细胞和/或骨细胞等。
优选地，本发明的至少某些骨髄干细胞还可以具有产生本发明方法所 得细胞群中包含的其他细胞(例如内皮镨系的细胞，如内皮祖细胞和/或内 皮细胞)的潜能。
具有产生至少成骨镨系细胞的潜能的示例性但非限制性BMSC类型 是间充质干细胞。本文使用的术语"间充质干细胞，，或"MSC"(也叫"骨髄 间质细胞")是指源自中胚层的成体干细胞，其能够产生间充质镨系的细胞， 通常能够产生两种或更多种间充质谱系的细胞，例如，骨细胞的(骨)、 软骨细胞的(软骨)、肌细胞的(肌肉)、腱细胞的(腱)、成纤维细胞 的(结締组织)、脂肪细胞的(脂肪)和间质(stromogenic)(骨髄间质) 谱系的细胞。MSC可以分离自例如骨髄、血液、脐带、胎盘、胎儿卵黄囊、 皮肤(真皮)，特别是胎儿和青少年的皮肤、骨膜和脂肪组织。人MSC、 其分离、体外扩增和分化描述于例如美国专利No. 5,486,359、美国专利No. 5,811,094、美国专利No. 5,736,396、美国专利No. 5，837，539或美国专利 No. 5,827,740中。本领域所述的以及通过本领域所述任何方法分离的任何 MSC均可适用于本发明，只要这些MSC能够产生至少骨细胞(骨)镨系 的细胞即可，例如骨生成细胞和/或骨原细胞和/或前成骨细胞和/或成骨细 胞和/或骨细胞等。
可能地，但非限制性地，至少某些MSC还能够产生本发明方法所得 细胞群中包含的其他细胞，例如，内皮谱系的细胞，例如内皮祖细胞和/ 或内皮细胞。
术语MSC还包括MSC的后代，例如通过对得自动物或人受试者生 物样品的MSC进行体外或离体增殖而得到的后代。
如实例中所示，本发明的方法涉及选择在接触人血浆或血清以及生长
因子或其生物活性变体或衍生物后在基质表面(例如培养容器表面)贴壁
的那些BMSC细胞。本领域已知，可以通过选择那些可在基质表面(例如 塑料表面)贴壁的(单个核的)细胞而从骨髄(或其它来源)中分离MSC (实际上，MSC有时被称为"塑料贴壁细胞"或"集落形成单位成纤维细 胞，，)。因此，不受任何^fgi兌的限制，本发明人推测，在本方法中MSC可 以至少部分地有助于从BMSC获得成骨细胞或成骨细胞表型细胞。
因此，在一方面，本发明还关注用于体外或离体从人间充质干细胞获 得成骨细胞或成骨细M型细胞的方法，其包括将MSC与人血浆或血清 以及生长因子进行接触。
MSC可以包含在生物样品中，例如，在包含BMSC的样品中，或者 如本领域所知可以至少部分地从其中分离。而且，MSC可以至少部分地分 离自骨髄或者分离自除骨髄以外包含MSC的来源，例如，血液、脐带、 胎盘、胎儿卵黄嚢、皮肤(真皮)，特别是胎儿和青少年的皮肤、骨膜以 及脂肪组织。
在一个优选的实施方案中，可以使存在于或者至少部分分离自生物样 品的BMSC或MSC与人的血浆或血清以及生长因子或其生物活性变体或 衍生物接触，之前不在使BMSC或MSC细胞生长和倍增而不分化的* 下增殖。
还已知，来自骨髓的MSC制备物包含这样的细胞亚群，它们4艮小、 增殖迅速、当以低密度再次铺板时周期性更新，并且是同一培养物中更为 成熟的MSC的前体。该细胞亚群称为"快速自我更新的细胞"，并且可含 有至少两种称为RS-1和RS-2的组刺Colter等PNAS 97(7): 3213-8, 2000; 通过参考并入本文中)。因此，不受任何假说的限制，本发明人推测，在 本方法中，Colter等2000所述的RS细胞可以至少部分地有助于从BMSC 获得骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞，这可能是通过更为成熟的 MSC中间体。可能地但非限制性地，本发明人推测，RS细胞还可能产生 本发明方法所得细胞群中包含的其他细胞，例如，内皮镨系的细胞，例如 内皮祖细胞和/或内皮细胞。
因此，在一个实施方案中，本发明还涉及体外或离体>^快速自我更 新细胞(RS)获得骨原细胞、成骨细胞或成骨细M型细胞或者获得包含
上述细胞的细胞群的方法，其包括将RS与人血浆或血清以及生长因子接
触o
还已知，骨髓包含称为"侧群细胞(sidep叩ulation， SP)"的前体细 胞群。这些细胞鉴定为CD34頻性造血前体细胞，然而就造血以及非造血 组织的再生而言具有显著的可塑性(Goodell等1997. Nat Med 3(12): 1337-45;通过参考并入本文中)。因此，不受任何假说的限制，本发 明人推测，在本方法中，Goodell等1997所述的SP细胞可以至少部分地 有助于从BMSC获得骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞，这可能是 通过更为成熟的MSC中间体。可能地但非限制性地，本发明人推测，SP 细胞还可能产生本发明方法所得细胞群中包含的其他细胞，例如，内皮谱 系的细胞，例如内皮祖细胞和/或内皮细胞。
因此，在一个实施方案中，本发明还关注用于体外或离体从人的侧群 细胞(side population cell, SP)获得骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型 细胞或者获得包含上述细胞的细胞群的方法，其包括将所述SP与人的血 浆或血清以及生长因子进行接触。
还已知，骨髄包含成骨前体细胞群，其最初通过其低密度(例如，通 过密度梯度离心)、非贴壁的性质以及低水平表达成骨标志物而识别(Long 等1995. J Clin Invest. 1995 Feb;95(2):881-7; US 5,972,703;通过参考并入 本文中)。然而，这些细胞在被诱导向成骨细胞分化时，它们也开始在基 质表面贴壁。因此，不受任何假说的限制，本发明人推测，在本方法中Long 等1995所述的成骨前体细胞可以至少部分地有助于从BMSC获得骨原细 胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞。
因此，在一个实施方案中，本发明还涉及用于体外或离体从人的成骨 前体细胞(osteogenic precursor, OP)获得骨原细胞、成骨细胞或成骨细 胞表型细胞或者获得包含上述细胞的细胞群的方法，其包括将所述OP与 人的血浆或血清以及生长因子进行接触。
还已知，骨髓包含原始的前体细胞群，其可以产生造血以及非itjfc镨 系的细胞(Krause等2001. Cell 105:369-377; Dominici等2004. PNAS 101 (32): 11761-6)。因此，不受任何假说的限制，本发明人推测，在本方法中， 这些原始的前体细胞可以至少部分地有助于从BMSC获得骨原细胞、成骨
细胞或成骨细胞表型细胞，可能是通过更为成熟的MSC中间体。可能地 但非限制性地，本发明人推测，这些原始的前体细胞还可能产生本发明方 法所得的细胞群中包含的其他细胞，例如，内皮镨系的细胞，例如内皮祖 细胞和/或内皮细胞。
应理解的是，由于骨髓干细胞群的复杂性，不应认为本发明限制在一 种或多种具体的BMSC类型。相反，在本方法中，例如如上所述的一种或 多种BMSC细胞类型可以(可能不同程度地)有助于获得骨原细胞、成骨 细胞或成骨细胞表型细胞或者获得包含上述细胞的细胞群。另一方面，应 理解的是，本方法还可以使用其他从BMSC群至少部分分离的特定BMSC 群，例如MSC。
才艮据本方面，在体外或离体实现从人骨髄干细胞获得骨原细胞、成骨 细胞或成骨细胞表型细胞。本文使用的术语"体夕卜"表示在动物或人身体的 外部或外面。本文使用的术语"体夕卜"应理解为包括"离体"。术语"离体"通 常是指从动物或人体取出并且在机体外(例如，在培养容器中)维持或增 殖的组织或细胞。
在一个实施方案中，BMSC是v^受试者的生物样品获得的。
本文使用的术语"生物样品，，或"样品"是指从生物来源(例如生物体) 获得的样品，例如动物或人受试者、细胞培养物、组织样品等。动物或人 受试者的生物样品是指从动物或人受试者中取出并包含其细胞的样品。动 物或人受试者的生物样品可以包含一种或多种组织类型，并可包含一种或 多种组织类型的细胞。获得动物或人受试者的生物样品的方法是本领域公 知的，例如，组织活检或抽血。
人受试者的有用的生物样品包括其骨髓干细胞。这些样品通常可以从 骨髓获得，例如从受试者的膝脊、股骨、胫骨、脊柱、肋骨或另外的骨髓 空间获得。其他有用的生物样品包括间充质干细胞，并可以来源于例如受 试者的血液、胯带、胎盘、胎儿卵黄嚢、皮肤(真皮)，特别^IJ台儿和青 少年的皮肤、骨膜或脂肪组织。
本文使用的术语"受试者"是指真核生物，尤其是动物或人类生物。动 物受试者包括动物出生前的形式，例如胎儿。人受试者可包括胎儿，但不 包括胚胎。
在另一实施方案中，BMSC ^A受试者获得，所U受试者有患骨 相关疾病的风险或者患有骨相关疾病。本发明人意识到，施用根据本发明 的方法从这些受试者的BMSC获得的成骨细胞或成骨细胞表型细胞可用 于治疗该受试者的骨相关疾病，例如通过重新形成骨或增加骨密度来实 现。
因此，本文使用的术语"骨相关疾病"是指任何类型的骨疾病，其 治疗可受益于向患有该疾病的受试者施用成骨谱系细胞(例如，骨原细 胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞)。特别地，这些疾病可以具有以下 特征例如骨形成降低或骨吸收过度；存在于骨中的成骨细胞或骨细胞 的数目、生存力或功能降低；受试者中的骨量降低；骨变薄；骨强度或 弹性受损等。
例如但非限制性地，可以受益于施用本发明成骨细胞或成骨细胞表型 细胞的骨相关疾病可包括局部或全身性疾病，如任何类型的骨质疏 f^或骨 质减少，例如原发的、绝经后的、老年的、肾上腺皮质激素诱导的骨质疏 松或骨质减少；任何继发的、单位点或多位点骨坏死；任何类型的骨折， 例如不愈"合的、畸形愈_合的、延迟lt"合的骨折或压缩骨折(compression ); 需要骨融合(例如脊柱融合和再造)的病症；颌面骨折；骨重建(例如在 外伤性损伤或癌症手术之后)、颅面骨重建、成骨不全、溶骨性骨癌、佩 吉特病、内分泌异常、低磷酸盐血症、低钾血症、肾病性骨营养不良、骨 软化、无力性骨病(adynamic bone disease)、类风湿性关节炎、曱状旁 腺功能亢进、原发性甲状旁腺功能亢进、继发性曱状旁腺功能亢进、牙周 病、Gorham-Stout病以及McCune國Albright综合征。
如上所述，本发明的方法用于从BMSC获得骨原细胞、成骨细胞或 成骨细胞表型细胞或者包含这些细胞的细胞群。
在本发明方法的内容中使用时，提及骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞 表型细胞时通常包括有助于形成骨材料或骨基质的细胞，或者能够发育成 有助于形成骨材料或骨基质的细胞的那些细胞。应理解的是，本发明的该 方面提供了得到细胞和细M的方法，所述细胞和细,已在本发明人的 实验中证实在治疗情况下可用于修复骨形成。因此，提及骨原细胞、成骨 细胞或成骨细胞表型细胞时应被视为希望包括本发明方法得到的任何有 用的这些成骨谱系细胞。
>$^>开内^供了足够的指导来实施本发明的方法，从而得到本文关
注以及上文一般提及的细胞和细胞群。就m^是否得到期望的细胞或细胞 群而言，技术人员可以应用例如实施例中公开的表型评估方法或者本领域 的其它测试。尽管如此，意在进一步的指导且非限制性地，骨原细胞、成 骨细胞或成骨细胞表型细胞可包括成骨细胞谱系的任意细胞，其具有以下 列出的至少一种特征，并且可表现出至少两种、至少三种、至少四种或至
少五种特征(a) CD卯、CD73和CD105为阳性；(b )碱性磷酸酶(ALP) (更具体地，骨-肝-肾型ALP)为阳性；(c)骨钙蛋白(对成熟的成骨细 胞具有特异性)为阳性；(d)密度为1.050 ~ l.O卯g/cm3; (e)骨连蛋白 (在成骨细胞和前体细胞中为阳性)为阳性；(f)细胞直径为6 ~ 70 fim, 并且基本上为立方体形状；(g) I型胶原(前胶原)为阳性和/或波形蛋白 和/或骨涎蛋白为阳性；(h)另一些成骨细胞特异性标志物为阳性，如BMP 受体、PTH受体；(i)当接触成骨培养基时，矿化外部围绕物或者合成 含钓的细胞外基质的能力(Jaiswal等1997. J Cell Biochem 64: 295-312 )。
可以使用本领域已知的任何适当的免疫学技术来检测上述细胞特异 性标志物的表达，如免疫细胞化学或亲和吸附、Western印迹分析、FACS、 ELISA等，或者通过任何适当的酶活性生物化学测定(例如，针对ALP )， 或者通过任何适当的技术来测量标志物mRNA的量，例如，Northern印 迹、半定量或定量的RT-PCR等。本文公开内容中所列出标志物的序列数 据是已知的，并且可以从公共数据库(如GenBank)获得。钙在细胞内部 的累积以及在M蛋白中的沉积可以通it^必Ca"中培养、洗涤以及继续
量(美国专利No. 5,972,703 )，或者通过使用Ca2+检测试剂盒(Sigma Kit #—587)测定培养物^^质的矿化，或者如实施例中所述。
称细胞对特定标志物为阳性时，这意味着当进行适当的测量时技术人 员将推断出标志物特有信号的存在。当该方法允许定量评估所述标志物 时，阳性细胞可以产生比对照细胞(例如，应用本发明方法前的BMSC细 胞，或者任何其它的非成骨细胞)产生的这些信号至少高2倍的信号，例 如，高出至少4倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍或至 少50倍。
如本文所解释地，将存在于或者至少部分地分离自生物样品的BMSC
与人的血浆或血清以及或者其生物活性变体或衍生物进行接触，从而获得 骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞。
技术人员会理解，人的血浆和血清是复杂的生物组合物，其可以包含 一种或多种生长因子、细胞因子或激素。因此，术语"与人的血浆或血清以 及生长因子或其生物活性变体或衍生物接触"表示所述生长因子或其生物 活性变体或衍生物在血浆或血清以外提供(即，外部添加或补充)。因此，
除了可包含在血浆或血清中的生长因子以外，BMSC与在血浆或血清以外 提供(即外部添加或补充)的生长因子或其生物活性变体或衍生物进行接 触。
所述生长因子或其生物活性变体或衍生物可以是所述血浆或血清中 不存在的。在这种情形下，BMSC与(即所述)生长因子或其生物活性变 体或衍生物接触，这些是它们仅接触血浆或血清时不会接触到的。所述生 长因子或其生物活性变体或衍生物也可以;l血浆或血清中存在的。在这种 情形下，BMSC所接触的(即所述)生长因子或其生物活性变体或衍生物 接触的量或浓度比仅接触血浆或血清时更高。
本文使用的术语"生长因子"是指生物活性物质，它们本身或者被其它 物质调节时影响多种细胞类型的增殖、生长、分化、存活和/或迁移并可以 影响生物中发育、形态和功能上的变化。生长因子通常可以作为配体通过 与细胞中存在的应答于该生长因子的受体(例如，表面或细胞内受体)结 合而起作用。特别地，本文的生长因子可以为包含一条或多条多肽链的蛋 白质实体。
用于举例非限制性地，术语"生长因子，，包括以下家族的成员成纤维 细胞生长因子(FGF)家族、骨形态生成蛋白(BMP)家族、血小板衍生 生长因子(PDGF)家族、转化生长因子p (TGFp)家族、神经生长因子
(NGF)家族、表皮生长因子(EGF)家族、胰岛素相关生长因子(IGF) 家族、肝细胞生长因子(HGF)家族、造血生长因子(HeGF)、血小板 衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、促血管生成素、血管内皮生长因子
(VEGF)家族、糖皮质激素等。
在一个优选的实施方案中，所述生长因子是成纤维细胞生长因子 (FGF)家族的成员。在另一实施方案中，所述FGF家族的成员选自酸性
和碱性的FGF (分别为FGF-1和FGF-2 ) 、 int2 (FGF-3 ) 、 hst (FGF-4 )、 FGF-5、 hst2 (FGF-6)、角质形成细胞生长因子(FGF-7)、雄激素诱导 生长因子(FGF-8)、神经胶质活化因子(FGF-9)以及FGF-10至23中 任意生长因子。
在一个优选的实施方案中，所述成纤维细胞生长因子是一碱性FGF， 也称为FGF-b、 FGF-2、 BFGF、 HBGH-2、 prostatr叩in或肝素结合生长 因子2前体(HBGF-2)。本发明AJL现FGF-b在本发明的方法中特别有 效。
在一个实施方案中，FGF-2或其生物活性变体或衍生物是本发明方法 中BMSC所接触的除可能存在于人血清或血浆中的那些以外惟一外源提 供的生长因子。
在另一实施方案中，BMSC与FGF-2或其生物活性变体或衍生物以 及一种或多种除FGF-2以外的其他生长因子接触。优选地，所述一种或多 种其他生长因子不包括EGF。
在另一实施方案中，所述生长因子是骨形态生成蛋白(BMP)家族 的成员。在又一实施方案中，所述BMP家族的成员选自BMP-2、 BMP-3、 BMP-4、 BMP-5、 BMP-3b/GDF-10、 BMP-6、 BMP-7、 BMP-8和BMP-15。
在一个实施方案中，所述生长因子是血小^L衍生生长因子(PDGF) 家族的成员。在另一实施方案中，所述PDGF家庭的成员选自神经毡蛋白 -2 (neuropilin-2) 、 PDGF、 PDGF-A、 PDGF曙B、 PDGF國C、 PDGF誦D、 PDGF國AB和PIGF。
在一个实施方案中，所述生长因子是转化生长因子j3 (TGFp)家族 的成员。在另一实施方案中，所述TGFP家族的成员选自TGF-B-1、 TGF-卩-2、 TGF-B-3、 TGF-卩-4、 GDFl(生长/分化因子1) 、 GDF-2、 GDF-3、 GDF-5、 GDF-6、 GDF-7、 GDF-8、 GDF-9、 GDF-ll、 GDF-15、 INHA(抑 制素a链)、INHBA (抑制素P A链)、INHBB (抑制素P B链)、INHBC
(抑制素p C链)、INHBE (抑制素P E链)、MIS (Muellerian-抑制因 子)以及GDNF亚家族的另外的成员，包括GDNF (神经自细胞系来源 的神经营养性因子)、NRTN (神经营养因子(neurturin) ) 、 PSPN
(persephin)。
在一个实施方案中，所述生长因子是神经生长因子(NGF)家族的成 员。在另一实施方案中，所述NGF家族的成员选自BDNF (脑来源神经 营养性因子)、NGF ((3-神经生长因子)、NT3 (神经营养素-3)和NT5。
在一个实施方案中，所述生长因子是表皮生长因子(EGF)家族的成 员。在另一实施方案中，所述EGF家族的成员选自双调蛋白、p细胞素、 EGF、表皮调节素、HB-EGF (肝素结合EGF样生长因子)、NRG1 (神 经调节素-l)同工型GGF2、 NRG1同工型SMDF、 NRGl-a、 NRG1-P、 TGFa、 Tomoregulin-l和TMEFF2。
在一个实施方案中，所述生长因子是胰烏素相关生长因子(IGF)家 族的成员。在另一实施方案中，所述IGF家族的成员选自胰岛素、IGF1A (胰島素样生长因子1A) 、 IGF1B、 IGF2、 INSL3 (胰岛素样3 ) 、 INSL5、 INSL6和爭>弛素。
在一个实施方案中，所述生长因子《_血管内皮生长因子(VEGF)家 族的成员。在另一实施方案中，所述VEGF家族的成员选自VEGF、 VEGF-B、 VEGF-C和VEGF-D。
在一个实施方案中，所述生长因子^1糖皮质素。在另一实施方案中， 所述糖皮质素选自地塞米松、氢化可的松、泼尼松龙、甲泼尼龙、泼尼松、 曲安西龙、皮质酮、氟轻松、可的松、倍他米松。
在一个优选的实施方案中，本方法中使用的生长因子是人生长因子。 本文使用的术语"人生长因子，，是指与天然存在的人生长因子基^目同的生 长因子。例如，当所述生长因子是蛋白质实体时，其组成肽或多肽可以具 有与天然存在的人生长因子一致的一级^酸序列。在本方法中优选使用 人生长因子，因为预期这样的生长因子对细胞功能产生理想的效果。
术语"天然存在的"用于描述可以在自然界中发现的与人为制造不同 的对象或实体。例如，可以从天然来源分离并且未经实验室中人为修饰的 存在于生物体中的多肽序列是天然存在的。当涉及特定的实体时，例如， 涉及多肽或蛋白质时，该术语包括其存在于自然界中的所有形式和变体， 例如，由于个体间的正常变异所致的变体。例如，当涉及蛋白质生长因子 时，术语"天然存在的，，包括由于个体间正常的等位变异而在其组成肽或多 肽一级序列中具有差异的生长因子。
本方法可以使用生长因子的生物活性变体或衍生物。在本发明的方法 中，当其它M基本相同时，生长因子的"生物活性"变体或衍生物至少与
相应生长因子以大致相同的程度从BMSC获得成骨细胞或成骨细胞表型 细胞。
当生长因子通过结合其相应受体而发挥作用时，所述生长因子的生物 活性变体或衍生物可以显示结合该对应受体的亲和力和/或特异性，其至少 与该生长因子与其结合的亲和力和/或特异性大致一样高。例如，所述生物 活性变体或衍生物可以具有结合同源受体的亲和力和/或特异性，其为各生 长因子结合该受体的亲和力和/或特异性的至少80% (例如，至少85% )、 优选至少90% (例如至少90%)、或者甚至100%或更高。技术人员可使 用本身已知的体外或细胞测定容易地确定上述结合参数。
当给定生长因子的活性可以在已建立的测定(例如体外或细胞的测 定，如测量细胞培养物中的致有丝分裂活性)中容易地测量时，所述生长 因子的生物活性变体或衍生物可以在这些测定中表现活性，其至少与该生 长因子的活性大致一样高。例如，所述生物活性变体或衍生物可以显示各 生长因子活性的至少80% (例如，至少85% )、优选至少卯％ (例如， 至少卯％)、或者甚至100%或更高的活性。
多肽的"变体，，具有与所述多肽的JL^酸序列基本一致(即，大部分而 非完全一致)的M酸序列。本文中，"基本一致的，，是指至少85 % —致(例 如，至少卯％—致)、优选至少95%—致(例如至少99%—致)。序列 差异可由一个或多个氨基酸的插入(添加)、缺失和/或替换所致。
两个多肽之间的序列 一致性可以通过以下来确定比对所述多肽的氨 基^列，并对比对中所述多肽包含相同^J^酸^l^的位置数以及比对中 两个多肽序列存在差异的位置数进行评分。当所述多肽在某位置包含不同 的M酸残基时(M酸替换)，或者当所述多肽之一在某位置包含M 酸残基而另一多肽不包含(或及^之亦然)时(^J^酸插V添加或缺失)， 两个多肽的序列在比对中的该位置存在差异。
序列一致性计算为比对中所述多肽包含相同氨基酸残基的位置与比 对中总位置数的比例(百分比)。
变体以及与所述变体基本一致的相应多肽的氨基酸序列之间的至少
某些差异可以包括^&酸替换。优选地，至少85% (例如至少卯％ )、更 优选至少95% (例如，100%)的所述差异可以是M酸替换。优选地， 所述絲酸替换可以是保守的。本文使用的术语"保守性替换"表示一个氨 基酸残基被另一在生物学上相似的氨基酸残基替换。保守性替换的非限制 性实例包括疏水氨基酸残基(如异亮氨酸、翔氨酸、亮M酸或甲碗I酸) 彼此替换，或者极性残基彼此替换，如精氨酸和赖氨酸之间、谷氨酸和天 冬氨酸之间或者谷氨酰胺和天冬酰胺之间等。
生长因子变体可以由一种或多种肽或多肽组成，其中至少一种3一相应 生长因子的组成肽或多肽的上述定义变体。
多肽的"衍生物"可以通过一个或多个氨基酸残基处的一个或多个氨 基酸残基的化学变化和/或添加一个或多个部分来进行衍生，例如，通it^ 基化、磷酸化、g化、乙酖化、疏酸化、脂化、烷基化等来实现。通常， 衍生的多肽中少于50% (例如少于40%)、优选少于30% (例如，少于 20%)、更优选少于15% (例如，少于10%)或少于5% (例如，少于4 %、 3。/。、 2%或1%)的氨基酸可这样进行衍生。衍生的蛋白质生长因子 可以由 一种或多种肽或多肽组成，其中至少 一种至少在一个氨基酸戎基上 可以进行衍生。
在另一实施方案中，本方法中使用的生长因子可以是非人动物的生长 因子，尤其是非人哺乳动物的生长因子，或者其生物活性变体或衍生物。 本文使用的术语"非人动物的生长因子，，和"非人哺乳动物的生长因子"是指 分别与天然存在的非人动物或非人哺乳动物的生长因子基本相同的生长 因子。例如，当所述生长因子是蛋白质实体时，其组成肽或多肽可以具有 与天然存在的非人动物或非人哺乳动物的生长因子一致的一级氨基^ 列。技术人员将理解，非人动物或非人哺乳动物的生长因子在本方法中也 可以是适用的，尽管程度不;^A生长因子，因为后者与BMSC细胞具有相 同的来源。特别地，如果它们产生期望的效果，例如与人生长因子相似的 (类似的)效果，则可以使用非人动物或非人哺乳动物的生长因子。
在一个优选的实施方案中，所述生长因子或其生物活性变体或衍生物 是重组的，即由宿主生物通it^达重组核酸分子而产生，所述重组核酸分 子已引入该宿主生物或其祖先，并且包含编码所述多肽的序列。本文使用 的术语"重组核酸分子"是指由使用DNA重组技术连接在一起的区段组成
的核酸分子(例如，DNA或cDNA分子)。
使用重组表达的生长因子或其生物活性变体或衍生物可能是特别有 利的。例如，如果该生长因子是人生长因子，从重组来源制备比v^A的生 物材料分离可能更容易。而且，v^A或动物材料中分离生长因子可能带来 传播病原体的风险。这些风险可以在重组表达中更有效地得到控制或消 除，特别是如果它使用可以就病原体存在进行常恥险查的细胞表达系统的 话。有利地，如果所述细胞表达系统与人的亲缘关系远(例如细菌细胞、 酵母细胞、植物细胞或昆虫细胞)的话，这些风险还可以进一步减弱，因 为存在于这些培养物中的病原体可能不会伤害人的细胞或人。
适当的表达系统，例如表达栽体，如质粒和病毒栽体；宿主生物，如 细菌(例如，大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌(51. ^附/ 似附im'"附)、粘质沙雷
)、枯草芽孢杆菌(5""7/|^训&///5))、酵母
(例如，酿酒酵母(5". cwev/wV^)和巴斯德毕赤酵母(户/cA/"/;a对w/s))、 培养植物细胞(例如，来自拟南芥(Jm6iVfe/w/s ^fl&Vwifl )和烟^ (7V/"&Vma to^ccw挑))和动物细胞(例如，哺乳动物细胞和昆虫细胞)以及多细胞 生物(如植物或动物)；以及用于分离重组表达产生的蛋白质(如生长因 子或其生物活性变体或衍生物)的方法是本领域已知的。参考来自于^^p 的教科书，包括如，"Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第二版"
(Sambrook等，1989 )、 Animal Cell Culture (R. I. Freshney编辑，1987 )、 Methods in Enzymology丛书(Academic Press )、 Gene Transfer Vectors for Mannalian Cells (J. M. Miller & M. P. Calos编辑，1987 )、 "Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 第三版，，(F. M. Ausubel等编辑，1987 & 1995 )、 Recombinant DNA Methodology II (R. Wu编辑，Academic Press 1995 ),它们通过参考并入本 文中。重组生长因子常常是市售的(例如来自Sigma、 Biological Industries, R&D Systems 、 Peprotech等)。
术语"血浆，，如常规所定义。血浆通常从全血样品获得，在抽^jk样时 或之后短时间内向其提供或使其接触抗凝剂，如肝素、柠檬酸盐(例如柠 檬酸钠或酸式柠檬酸葡萄糖)、草酸盐或EDTA，以防止血液凝固。随后， 通过适当的技术从液体组分(血浆)分离血样的细胞组分，通常通过离心 来实现。因此术语"血浆，，是指不形成人或动物机体一部分的组合物。
术语"血清，，如常规所定义。通常可以通过以下步骤由全血样品获得血
清首先使所述样品凝固，随后通过适当的技术(通常通过离心)从液体 组分(血清)分离所述血样中这样形成的凝块和细胞组分。可以利用惰性 催化剂(例如玻璃珠或粉末)促进凝固。有利地，可以使用本领域已知的 血清分离管(serum separating tubes, SST )来制备血清，血清分离管包 含促进凝固的惰性催化剂并且还包含凝胶，所述皿的密度设计成4吏其在 离心之后位于液体组分与凝块及细胞组分之间，从而使分离简单化。或者， 可以通过除去抗凝剂和血纤蛋白而从血浆获得血清。因此，术语"血清，，是 指不形成人或动物机体一部分的组合物。
分离的血浆或血清可直接使用于本发明的方法中。它们也可以进行适 当的保存，以备以后用于本发明的方法中。通常，血浆或血清可以在高于 血浆或血清各自水点但是低于室温的温度下储存较短的时间，例如最多约 1-2周。通常，该温度约为15"C或更低，优选约IO'C或更低，更优选约5。C 或更低，例如，约5'C、 4'C、 3°C、 2。C或约rC,最优选约5-C或约4'C。 或者，血浆或血清可以在其各自冰点以下储存，即冷冻储存。如本领域常 规地，用于冷冻储存血浆或血清的优选温度可以约为-70。C或更低，例如， 约-75。C或更低或者约-80。C或更低。这样的温度可以有利地防止所储存血 浆或血清融化，从而保持其品质。无论血浆或血清需JH^存的时间如何均 可以使用冷冻储存，但特别适合需要较长时期的储存，例如，长于几天或 者长于1-2周。
在储存或使用前，所分离的血浆或血清可以进行热灭活。本领域中使 用的热灭活主要用于除去补体。当本方法中使用所培养细胞的自体血浆或 血清时，可以不需要热灭活该血浆或血清。当血浆或血清与所培养细胞是 至少部分同种异体时，热灭活所a浆或血清可能;l:有利的。热灭活通常 包括在均匀混合下在56。C孵育血浆或血清30 ~ 60分钟(如30分钟)，之 后使所述血浆或血清逐渐冷却至室温。技术人员会了解上述方法的任何常 见变化和要求。
任选地，还可以在储存或使用前将血浆或血清灭菌。通常的灭菌方法 可包括例如通过一种或多种滤器进行过滤，所述滤器的孔径尺寸小于1 pm，优选小于0.5pm,例如，小于0.45fim、 0.40 pm、 0.35 nm、 0.30 pm 或0.25 nm，更优选地0.2 pm或更小，例如，0.15 nm或更小，0.10
或更小。
在一个实施方案中，本方法使用对与其接触的人BMSC而言为自体 的人血浆或血清。涉及血浆或血清时，术语"自体，，表示血浆或血清从与所 述血浆或血清接触的BMSC的同一受试者获得。本发明人已发现使用自体 血浆或血清为从BMSC获得成骨细胞和成骨细胞表型细胞提供了有利的 条件。另外，当将所获得的成骨细胞或成骨细胞表型细胞施用至获得 BMSC的同一受试者时，使用自体血浆或血清可以确保受试者对所述细胞 的最佳接受和/或避免(例如从其它血清)意外地传播传染原。
在另一实施方案中，所述方法可以使用与其接触的人BMSC"同源" 的人血浆或血清，即M得所述BMSC的受试者之外的一个或多个(合并 的)人受试者。
在另一实施方案中，所述方法可以使用如上定义的自体和同源的血浆 或血清的混合物。
本文使用的术语"接触"意指直接地或间接地将一种或多种分子、组分 或材料与另外的分子、组分或材料靠近，从而促进它们之间的相互作用。 通常，生长因子或其生物活性变体或衍生物以;5LA血浆或血清可以通过包 含在培养BMSC的培养基中而与BMSC接触。
在一些实施方案中，培养基中包含的人血浆或血清比例(血清体积/ 培养基体积)可以为0.5 % ~ 30 % ，优选为1 % ~ 20 % ,更优选为2 % ~ 10 %，如5%~10%，例如，约为5%、 6%、 7%、 8%、 9%或10%。 >^发 明人出人意料地发现，相对较低的量(例如，约5%体积或更低，例如1 % ~5%、 2。/。 ~5%、 3% ~5%或4% ~5% )的人血浆或血清可足以从 BMSC获得骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞。这有利地减少了培 养BMSC所需从供体中(例如在自体血浆或血清的情况下从患者中)获得 的血浆或血清体积。
生长因子或其生物活性变体或f;f生物可以以足以诱导BMSC分化为 成骨细胞或成骨细胞表型细胞并从而获得后者的浓度与包含在同一培养 基中的人血浆或血清(以上述标明的比例之一) 一起包含在培养基中。通 常，培养基中包含的生长因子(例如FGF-2)或其生物活性变体或衍生物 的浓度可以为0.01 ~ 100ng/ml，优选为0.1 ~ 50ng/ml，例如0.5 ~ 30ng/ml，
更优选1 ~ 20ng/ml，如1 ~ 10ng/ml，例如，优选小于5ng/ml，例如1、 2、 3、 4或5ng/ml。当生长因子为糖皮质激素(例如，地塞米松)时，该浓度 可以优选为10力至l(r5 mMol。应理解，上述浓度是指在血浆或血清以外 提供(即外部添加至或补充，见文中其他处)的生长因子或其生物活性变 体或衍生物。
在一个优选的实施方案中，FGF-2或其生物活性变体或衍生物的浓度 低于20ng/ml，优选低于10ng/ml，更优选低于5ng/ml，例如l、 2、 3、 4 或5ng/ml。本发明人推测，这样较低的FGF-2浓度对于实现分化来说可 能是特别优选的。
在一个实施方案中，上述浓度可以指所述生长因子或其生物活性变体 或衍生物在培养基中的总浓度，即血浆或血清中以及额外提供的生长因子 或其生物活性变体或衍生物的总浓度。
在另一实施方案中，上述浓度可以指在血浆或血清以外提供的所述生 长因子或其生物活性变体或衍生物的浓度。可以理解，如果待添加的生长 因子通常在所述血浆或血清中不存在(不可检测)，则所述生长因子的总 浓度和添加浓度将(基本)相同。
在一个实施方案中，BMSC可以与人血浆或血清以及生长因子或其 生物活性变体或衍生物持续接触，其时间足以诱导BMSC分化为骨原细 胞、成骨细胞或成骨细M型细胞，从而获得后者。术语"持续接触，，可以 指该时间段内培养BMSC、其后代和/或其衍生细胞的所有培养基中均包含 该组分。通常，在用于在所述时间期间培养BMSC的所有(新鲜)培养基 中，Aik浆或血清以及生长因子或其生物活性变体或衍生物可以以各自基 ^目同的i^度来提供。
因此，通常，t-0天对应于首次将分离的BMSC在生长激素以;5LAjk 清或血浆(原代培养)存在下铺板的时间点。
在一些实施方案中，上述接触时间可以为至少5天，优选至少10天， 更优选至少15天以及更优选至少18天，例如至少20天。例如，所述时间 可以为5~30天，优选10 30天，更优选15 25天，以及更优选约20 天，例如，约20、 21、 22天左右。例如，在一个优选的实施方案中，所述 时间可以为12~16天，例如，12、 13、 14、 15或16天，特别优选约14
天。在另一优选的实施方案中，所述时间可以为18~24天，例如18、 19、 20、 21、 22、 23或24天，特别优选约21天。
在另外一些实施方案中，上述时间可以包括一次或多次细胞传代，如 1、 2、 3、 4或更多次传代，优选地其包括l、 2或3次传代，更优选地l 或2次传代，例如，l次传代。传代lbl指细胞群从培养容器取出并进行 继代培养(即传代)的次数。如技术人员所理解地，通常当培养物中生长 的细胞已到a定汇合度时进行传代。例如，如果细胞以单层存在，当它 们的汇合度为60%或更高时，例如，70%或更高，80%或更高，或者90 %或更高，或者甚至100%时，可以对其进行传代。所述细胞通常可以以 1/8至2/3的比率传代，如1/4至1/2。该比率表示传代后引入相同体积培 养基中的细胞比例。如果细胞以集落存在，可以对其进行传代，例如在培 养给定天lt^，例如在4 ~ 20天后，例如8 ~ 15天后，更优选10 ~ 15天后， 例如，在10、 11、 12、 13或14天后。例如， 一旦每个集落的平均细胞数 为20个或更多，或者50个或更多，或者100个或更多，500个或更多， 可以对其进行传代。
在细胞与生长因子(尤其是FGF-2 )以;S^ok清或血浆接触的总时间 优选为12 ~ 16天的一个特别优选的实施方案中，初次铺板的BMSC不需 要进行传代，而可以直接收集。在BMSC与生长因子(尤其是FGF-2)以 ;5LA血清或血浆接触的总时间优选地约为18~24天的另一优选的实施方 案中，原代培养物可以进行一次传代，优选地在8 ~ 17天，而更优选在12 ~ 16天，例如，最优选地在第14天。
本发明AJi见察到，使BMSC与生长因子(尤其是FGF-2 )以J5LAJr 清或血浆接触约12-16天可能是优选的，因为在该时期结束时所述细# 现出类似成骨细胞的表型。此后，细胞似乎至少部分去分化，这由改变的 形态、较低的ALP和较高水平的分化因子所证实。尽管如此，上述时间可 以有利地延长至约18至24天，以获得更多的所得成骨谱系细胞，而细胞 尚未显著去分化。尽管有可能进一步延长这个时间，可能包括另外的传代， 但是本发明人推测，这样延长的生长因子(尤其是FGF-2)存在可能导致 其他不希望的细胞去分化。因此，优选上文提到的较短时间。
在一个实施方案中，本方法中可以使用能够支持成纤维细胞在细胞培 养中生长的任何培养基。支持成纤维细胞生长的培养基配方包括但不限于
市售(例如Invitrogen, Carlsbad, California )的基本必需培养基(Minimum Essential Medium, MEM) 、 Dulbecco改良的Eagle培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM) 、 a改进型基本必需培养基(a modified Minimum Essential Medium, a画MEM)、 ^ftfe必需培养基(Basal Medium Essential, BME ) 、 BGJb、 F-12养分混合物(Ham)等。本方法中特别 适合的培养基可以是从Invitrogen或Cambrex(新泽西州)获得的a-MEM、 IMDM、 X-Vivo-lO、 X-Vivo 20无血清培养基(临床级)。这样的液体培 养基包含哺乳动物细胞发育所必需的已知成分。例如，这些成分包括无机 盐(特别是Na、 K、 Mg、 Ca以及可能的Cu、 Fe和Zn)、氨基酸、维生 素和碳源(例如，葡萄糖)等。通常，可需要将5-20%的血清组分(例如， 胎牛血清(FCS))加至上述培养基中以支持成纤维细胞的生长。然而， 如果FCS中成纤维细胞生长所必需的因子已鉴定并在生长培养基中提供 的话，可以使用确定的无血清培养基。有利地，在本方法中，该血清组分 可以由与BMSC接触的人血浆或血清来代表，从而不在培养基中加入另外 的血清组分。培养基中还可以包含一种或多种目的化合物，其包括但不限 于碳酸氢钠、抗生素和/或抗真菌组分，如青霉素、链霉素和/或两性霉素 等。
在一个优选的实施方案中，BMSC不与从非人动物(特别是非人哺 乳动物)获得的任何组分接触。如果从BMSC获得的骨原细胞、成骨细胞 或成骨细胞表型细胞施用于人受试者，BMSC不与从非人动物获得的组分 接触确保了所述受试者最佳地接受所述细胞，并且避免向其意外传播传染 原。由于朊病毒病(例如BSE，其可以从动物传播至人类)的出现，因此 后一考虑变得日益重要。
在一个具体的实施方案中，BMSC不与来源于非人动物的任何血清 组分接触。例如，本方法中用于培养和分化BMSC的培养基可以不包含来 自非人动物的任何血清组分。如上文所述，向细胞培养基添加如FCS以维 持细胞培养物生长是本领域的常识。因此，本方法中用于培养和分化 BMSC的培养基可以不包含任何FCS或其他非人动物血清组分。本发明 人t现，当BMSC不与来自非人动物的任何血清组分接触时，这产生了对 从BMSC获得成骨细胞和成骨细#型细胞有利的务降。
在另一实施方案中，培养BMSC的培养基不包含任何抗生素或抗真
菌的组分。缺乏这些组分使得鉴别所述培养物的潜在污染更加容易。如果
将从BMSC获得的成骨细胞或成骨细胞表型细胞施用于人受试者，这避免 了向受试者引入病原性微生物。
在一个实施方案中，所述培养基不包含本领域中常用的用于诱导成骨 分化的组分，如糖皮质激素(例如，地塞米松)、抗坏血酸-2-磷酸酯和/ 或P-甘油磷酸酯。
因此，考虑到上述优选的特征，在示例性的实施方案中，用于在体外 或离体获得骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞或者包含上述细胞 (并且任选地还包含另一些细胞类型，例如，内皮细胞或祖细胞)的细胞 群的方法包括以下步骤
(a) 从包含BMSC的人受试者生物样品(优选骨髓样品)中回收细胞；
(b) 任选地，从(a)中回收的细胞中分离单个核的细胞，例如，使用适 当的密度梯度离心或其他方法；
(c) 将(a)的细胞或者优选(b )的细胞加入包含人血浆或血清以及生长 因子或其生物活性变体或衍生物的培养基中，并培养该细胞—培养基混合 物，从而使细胞贴壁于基质表面，例如培养容器的玻璃或塑料表面；
(d) 除去未贴壁的物质并在(c)中定义的培养基中继续培养贴壁细胞， 以允许获得骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞样细胞，或者包含上述细胞的 细胞群。
在一个优选的实施方案中，所述方法还可以包括收集(d)中获得的 所述细胞或细胞群，优选地在第12和16天之间(例如在第14天)进行收 集。
在另一优选的实施方案中，所述方法可包括将(d)的细胞或细自 在约第12天和第16天之间进行传代，并在约第18天和第24天之间收集 这样培养的细胞或细胞群。
在一个优选的实施方案中，所述培养容器可以提供塑料表面从而使细 胞能够贴壁。在另一实施方案中，所W面可以是玻璃表面。在另一实施 方案中，所述表面可以涂有有利于所述细胞生长的适当材料，例如Matrigel
(R)、层粘连蛋白或胶原。
涉及特定组分时，术语"分离"表示将所述组分与该组分所在组合物中 的至少一种其他组分分离。因此，分离BMSC包括将BMSC与包含BMSC 的组合物中的至少一种其他组分分离。分离BMSC还包括与分离BMSC 的组合物相比提高组合物中BMSC相对于其它组分(特别是相对于其它细 胞组分)的比例。例如，从生物样品分离BMSC表示将BMSC与样品中 另外的组分(特别是细胞组分)分离。
本文中涉及任何细胞群使用时，术语"分离"还意味着这样的细胞群不 形成动物或A^li体的一部分。
在一个实施方案中，(a)或(b )的细胞可以以下浓度铺板用于培养 1 ~ lx106个细胞/mm2,例如，1 一5xl05个细胞/mm2， 1 ~ 1.5x105个细胞 /mm2,例如，lxl03 5xl()5个细胞/mm2，可能地lx104 ~ 5xl05个细胞/mm2， 例如，lxl04 lxl()5个细胞/mm2，或5xl04 5x10s个细胞/mm2,或5xl04-lxl05个细胞/mm2,例如，约lxl04、 2xl04、 3xl04、 4xl04、 5xl04、 6xl04、 7xl04、 8xl04、 9xl()4或lxl0s个细胞/mm2。
在一些优选的实施方案中，(d)中所述除去非贴壁的物质在以下时 间进行1至8天之后，例如，2至6天，优选地在1和4天之间，更优选 地在约4天，例如在第4天，更优选地在第l、 2或3天，更优选地在第l 或2天。
另外，在一些优选的实施方案中，(d)中所述贴壁细胞的继续培养 可以进行以下时间5~30天，例如约10至25天，更优选地约18至22 天，更优选地在18和24天之间，例如18、 19、 20、 21、 22、 23或24天。
另外，在一些优选的实施方案中，(d)中所述继续培养贴壁细胞可 以包括一次或多于一次(例如2或3次)的细胞传代，优选1或2次，更 优选1次传代。优选地，它可以包括遵循步骤(c)在约10-18天传代，例 如在约12至16天传代，例如在14天传代。
在一个优选的实施方案中，这样的传代可以以恒定时间进行，以使培 养方法标准化，例如在大约14天，例如在培养的14天ii行。
优选地，所述细胞可以在传代后以以下浓度再次铺板用于(d)中进
一步培养l lxl06个细胞/mm2,例如lx102 ~ lxl()5个细胞/min2，lx103 ~ lxl()5个细胞/mm2，优选5乂103~5乂104个细胞/1111112,例如约5xl03、 6xl03、 7xl03、 8xl03、 9xl03、 lx104、 2xl04、 3xl04、 4xl04或5xl04个细胞/mm2， 更优选8xl03 2xl()4个细胞/mm2，例如，约lxl()4个细胞/inm2。
在一个实施方案中，可以在以下汇合度时将细胞再次铺板至少5%, 或者至少10% (例如至少30%)并且不大于卯％或不大于80%或不大于 50%,优选为30~80%。
在一个实施方案中，传代步猓包括用二价离子螯合剂(例如，EDTA 或EGTA)处理细胞和/或用胰蛋白酶处理。在一个优选的实施方案中，传 代步骤包括用二价离子螯合剂(例如，EDTA或EGTA)处理细胞并且不 用胰蛋白酶处理。这是有利的，因为胰蛋白酶可能来自动物来源并可能因 此带来引入病原体的风险。
处理步骤(a)至(d)的其他优选实施方案如上文所述。
如上文所解释地，本发明的方法及其优选的实施方案产生骨原细胞、 成骨细胞或者成骨细胞表型细胞以及包含上述细胞的细胞群，它们显示优 越的特征，例如，快速增殖、快速矿化以M本不会向脂肪细胞或软骨细 胞分化。本发明AJi发现，这些细胞和细胞群在^V患者骨组织中时性能 优越。由于通过本发明方法获得的细胞和细胞群的这些出人意料的特征， 这些细胞和细胞群本身对于本领域具有宝贵的贡献。而且，如以下章节进 一步解释地以及通过实验数据证实地，本发明的方法提供了成骨细胞的新 类型(如这些细胞上新的意想不到的标志物组合所证明)以及特别适于骨 治疗的新的细胞群。
因此，技术人员应当理解，当根据本发明处理BMSC以获得骨原细 胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞时，获得了主要由成骨细胞或成骨细胞 表型细胞组成的细胞群。然而，由于例如细胞应答中的波动，细胞群可包 含少部分不是骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞的细胞。
因此，在相关的方面，本发明提供了可使用上述本发明方法获得的或 者直接使用上述本发明方法获得的人骨原细胞、成骨细胞或成骨细#型 细胞。
在一个实施方案中，本发明提供了分离的细胞群，其包含骨原细胞、 成骨细胞或成骨细胞表型细胞，所述细胞群可使用本发明方法获得，或者
直接使用本发明方法获得。例如，这样的细胞群可以包含至少60%,例如， 至少65%，优选至少70 0/。，例如，至少75。/。，更优选至少80%，例如， 85%,更优选至少卯％,例如，95%或者甚至至少96%，至少97%，至 少98%或至少99%的骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞。
在一个优选的实施方案中，所述细,可以包含除骨原细胞、成骨细 胞或成骨细l&^型细胞以外的一种或多种细胞类型。例如，所述细胞群可 以包含小于50%，例如小于40%，优选小于30%，例如小于20%，更优 选小于15。/。或小于10°/。，例如，小于7%，小于5。/。或小于2%的除骨原 细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞以外的细胞类型。
所述细胞混合物中其余细胞的实际表型可能是重要的，因为成骨细胞 的快速增殖和分化可以至少部分依赖于所述混合物中其余细胞内源产生 的影响成骨细胞的物质，例如生长因子和/或分化因子。在这方面，可能很 有意义的是，已知骨发育和重建至少部分依赖于形成骨的成骨细胞与存在 于骨微环境内的其它细胞(特别是内皮细胞，它可能是骨中复杂的交互式 通讯网络的重要成员)之间复杂的相互作用。先前已证实人骨原细胞与内 皮细胞之间的细胞合作(Guillotin等2004. Cell Physiol Biochem 14(4-6): 325-32)。另外，内皮细胞的存在可以引起原位形成为新形成的骨组织提 供营养的血管或毛细血管。本发明人已发现，在本发明细胞混合物中这些 其余细胞可以是内皮样的，并且就特异性标志物而言可以是CD133和/或 CD34标志物阳性的，并且可能是CD45标志物阴性的；特别地以及优选 地，对vWF、 VEGF和CD133中至少任意一种、两种或所有为阳性的； 并且任选地对CD34也是阳性的。
因此，在另一优选的实施方案中，所述细胞群可以包含内皮细胞或祖 细胞。在另一实施方案中，所述细胞群可以包含骨原细胞、成骨细胞或成 骨细胞表型细胞以及内皮细胞或祖细胞。
在另 一方面，本发明涉及如上所述可使用本发明方法获得的或者直接 使用本发明方法获得的人骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞，其用 于治疗骨相关疾病和/或制造用于骨相关疾病治疗的药物。
在一个实施方案中，本发明涉及如上所述可使用本发明方法获得的或 者直接4吏用本发明方法获得的包含骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细 胞的分离细胞群，其用于治疗骨相关疾病和/或制造用于骨相关疾病治疗的 药物。
在一方面，如上所述可使用本发明方法获得的或者直接使用本发明方 法获得的骨原细胞、成骨细胞或成骨细M型细胞或者包含骨原细胞、成 骨细胞或成骨细胞表型细胞的分离细胞群(所述细胞群如上所述可4吏用本 发明方法获得或者直接使用本发明方法获得)可以施用于骨损伤(例如， 手术或骨折)部位。
在另一方面，本发明提供了用于预防和/或治疗骨疾病的方法，其包 括对需要这些治疗的受试者施用如上所述可使用本发明方法获得的或者 直接使用本发明方法获得的骨原细胞、成骨细胞或成骨细M型细胞或者 施用包含骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞的分离的细胞群(所述 细胞群如上所述可l吏用本发明方法获得或者直接使用本发明方法获得)。
在一方面，本发明涉及用于预防和/或治疗骨疾病的方法，其包括
(a) 从需要该治疗的受试者获得包含BMSC的生物样品；
(b) 根据本发明的方法在体外或离体从BMSC获得骨原细胞、成骨细胞 或成骨细胞表型细胞，或者获得包含成骨细胞或成骨细胞表型细胞的分离 的细胞群；以及
(c) 将这样获得的骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞或者所述包含 上述细胞的细胞群施用于所述受试者。
在一个优选的实施方案中，步骤(b)可包括^f吏用自体人血浆或血清 的本发明方法，更优选地无非人动物组分(例如血清组分)。这样的^Hf 在本文中可称为获得本发明的成骨细胞或成骨细胞表型细胞的"纯自体"条 件。
在另一方面，本发明涉及适于在骨损伤部位施用的药物组合物，其包 含可通过本发明方法获得或者直接通过本发明方法获得的骨原细胞、成骨 细胞或成骨细胞表型细胞或者包含含有骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表 型细胞的分离的细胞群，所述细胞群如上所述可使用本发明方法获得或者
直接使用本发明方法获得。
2.本发明的细胞和细胞群
如发明内容部分中所解释地，对本发明方法所得细胞和细胞群的进一 步研究使得本发明人定义了新的骨原细胞、成骨细胞或成骨细M型细胞 类型以及包含上述细胞的特定细胞群，这是在骨治疗中使用时观察到的有 利特性的基础。
特别地，在一方面，本发明提供了骨原细胞、成骨细胞或成骨细J!&^ 型细胞(本文称为"OOP-l细胞")(优选为人来源)，其特征在于它们共 表达(1)选自碱性磷酸酶(ALP) 1 (更具体地为骨-肝-肾型ALP) 、 1 型前胶原氨基端前肽(P1NP)和骨涎蛋白(BSP)的至少一种成骨细胞标 志物以及(2)选自CD63和CD166的至少一种干细胞/未成熟骨原细胞 标志物。
因此，在示例性的实施方案(a)至(u)中，所述骨原细胞、成骨细 胞或成骨细胞表型(OOP-l)细胞共表达(a)至少ALP和CD63， ( b ) 至少P1NP和CD63， ( c)至少BSP和CD63, (d )至少ALP、 PINT 和CD63， ( e)至少ALP、 BSP和CD63, (f)至少PINP、 BSP和CD63, (g)至少ALP、 PINP、 BSP和CD63， ( h)至少ALP和CD166, (i) 至少P1NP和CD166， (j)至少BSP和CD166， (k)至少ALP、 PINP 和CD166, (1)至少ALP、 BSP和CD166, (m)至少PINP、 BSP和 CD166, (n )至少ALP、 PINP、 BSP和CD166, (o)至少ALP、 CD63 和CD166, (p)至少PINP、 CD63和CD166, (q)至少BSP、 CD63 和CD166, (r)至少ALP、 PINP、 CD63和CD166, ( s )至少ALP、 BSP、 CD63和CD166, (t)至少P1NP、 BSP、 CD63和CD166,或者(u) 至少ALP、 P1NP、 BSP、 CD63和CD166。
在一个优选的实施方案(v)中，所述骨原细胞、成骨细胞或成骨细 胞表型(OOP-l)细胞(特别是上述实施方案(a)至(u)中任一定义的) 是骨钙蛋白(OCN)阴性的。
在另一优选的实施方案(w)中，所述骨原细胞、成骨细胞或成骨细 胞表型(OOP-l)细胞(特别是上述实施方案(a )至(v)中任一定义的) 是CD34阳性的。
在另一优选的实施方案(X)中，所述骨原细胞、成骨细胞或成骨细
胞表型(OOP-l)细胞(特别是上述实施方案U)至(v)中任一定义的) 是CD34阴性的。
在另一优选的实施方案(y)中，所述骨原细胞、成骨细胞或成骨细 胞表型(OOP-l)细胞(特别是上述实施方案(a)至(x)中任一定义的) 对CD90、 CD73和CD105之任意一种、两种或所有三种也是阳性的。
在另一优选的实施方案(z)中，所述骨原细胞、成骨细胞或成骨细 胞表型(OOP-l)细胞(特别是上述实施方案(a)至(y)中任一定义的) 对CD45、 CD19和CD14之任意一种、两种或所有三种是阴性的。
在另一优选的实施方案(ab)中，所述骨原细胞、成骨细胞或成骨细 胞表型(OOP-l)细胞(特别是上述实施方案(a)至(z)中任一定义的) 是CD133阴性的。
在另一优选的实施方案(ac)中，所述骨原细胞、成骨细胞或成骨细 胞表型(OOP-l)细胞(特别是上述实施方案(a)至(ab)中任一定义 的)在接触成骨培养基时表现出矿化外部围绕物或者合成含钩的细胞外基 质的能力(Jaiswal等1997. J Cell Biochem 64: 295-312 )。 1周后的矿化量
(如本领域已知的，通过矿化培养基中茜素红染色表面的总比例来测量) 可以是至少40%，优选至少45%，更优选至少50%，更优选至少55%, 最优选至少60 % ，如至少65 % 、至少70 % 、至少80 % 、至少85 % 、至少 卯％或至少95 %或者甚至100 % 。有利地，这些细胞的矿化比经典BMSC
(其中上述水平只有在成骨培养基中3至4周后才可以达到)快得多。
令人感兴趣的是，上述本发明的骨原细胞、成骨细胞或成骨细#型 细胞在矿化培养基中的倍增时间可以为1 ~3天，例如，约2天。这大大地 快于经典成骨细胞在这些^Hf下的倍增时间(约为6-7天)。
在又一优选的实施方案Ud)中，所述骨原细胞、成骨细胞或成骨细 胞表型(OOP-l)细胞(特别是上述实施方案(a)至(ac)中任一定义的) 基本上不向脂肪细胞i普系(例如，脂肪细胞)或软骨细胞镨系(例如，软 骨细胞)中任一种细胞分化，优选两种均不分化。可以使用本领域中建立 的标准分化诱导条件(例如，参见Pittenger等1999. Science 284:143-7 ) 和测定法(例如，当诱导时，脂肪细胞通常用显示脂质积聚的油红O染色；
软骨细胞通常用爱茜蓝或番红o染色)来检测向这些细胞镨系分化的缺乏。
基本缺少向脂肪形成分化或软骨形成分化的倾向通常可指测试细胞
(例如测试的OOP-l细胞)中的小于50%、优选小于40% (例如小于30 %)、更优选小于20%、更优选小于10%、更优选小于5% (例如小于4 o/。、小于3%、小于2%或小于1%或者甚至小于0.1% )在应用于各自测 试时显示脂肪形成分化或软骨形成分化。
在另一方面，本发明提供了骨原细胞、成骨细胞或成'fr细JJ^型细胞 (本文称为"OOP-2细胞")(优选人来源)，其特征在于它们共表达(1) 选自碱性磷酸酶(ALP) 1 (更具体地为骨-肝-肾型ALP) 、 l型前^f、氨 基端前肽(P1NP)和骨涎蛋白(BSP)的至少一种成骨细胞标志物与(2) itj&V内皮祖细胞标志物CD34。
因此，在示例性的实施方案(a，)至(g，)中，所述骨原细胞、成骨 细胞或成骨细胞表型(OOP-2 )细胞共表达(a，)至少ALP和CD34， (b，)至少P1NP和CD34， ( c，)至少BSP和CD34， ( d，)至少ALP、 P1NP和CD34， ( e，)至少ALP、 BSP和CD34, (f )至少P1NP、 BSP 和CD34或者(g，)至少ALP、 P1NP、 BSP和CD34。
在一个优选的实施方案(h，)中，所述骨原细胞、成骨细胞或成骨细 胞表型(OOP-2)细胞(特别是上述实施方案(a，)至(g，)中任一定义 的)是骨钙蛋白(OCN)阴性的。
在另一优选的实施方案(i，)中，所述骨原细胞、成骨细胞或成骨细 胞表型(OOP-2)细胞(特别是上述实施方案(a，)至(g，)中任一定义 的)是CD63阳性的。
在另一优选的实施方案(j，)中，所述骨原细胞、成骨细胞或成骨细 胞表型(OOP-2 )细胞(特别是上述实施方案(a，)至(i，)中任一定义的) 是CD166阳性的。
在另一优选的实施方案(k，)中，所述骨原细胞、成骨细胞或成骨细 胞表型(OOP-2 )细胞(特别是上述实施方案(a，)至(j，)中任一定义的) 对CD卯、CD73和CD105之4壬意一种、两种或所有三种也是阳性的。
在另一优选的实施方案(1，)中，所述骨原细胞、成骨细胞或成骨细
胞表型(OOP-2)细胞(特别是上述实施方案(a，)至(k，)中任一定义 的)对CD45、 CD19和CD14之任意一种、两种或所有三种是阴性的。
在另一优选的实施方案(m，)中，所述骨原细胞、成骨细胞或成骨 细胞表型(OOP-2 )细胞(特别是上述实施方案(a，)至(1，)中任一定义 的)是CD133阴性的。
在另一优选的实施方案(n，)中，所述骨原细胞、成骨细胞或成骨细 胞表型(OOP-2)细胞(特别是上述实施方案(a，)至(m，)中任一定义 的)在接触成骨培养基时显示矿化外部围绕物或合成含钓的细胞外基质的 能力(Jaiswal等，1997)。 1周后的矿化量(如本领域已知的，通过矿化 培养基中茜素红染色表面的总比例来衡量)可以是至少40% ,优选至少45 % ，更优选至少50 % ，更优选至少55 % ，最优选至少60 % ,如至少65 % 、 至少70%、至少80%、至少85%、至少卯％或至少95%或者甚至100%。 有利地，这些细胞的矿化比经典BMSC (其中上述水平只有在成骨培养基 中3至4周后才可以达到)快得多。
令人感兴趣的是，上述本发明的骨原细胞、成骨细胞或成骨细JJ&^型 细胞在矿化培养基中的倍增时间可以为1 ~3天，例如约2天。这大大地快 于经典成骨细胞在这些条件下的倍增时间(约为6-7天)。
在又一优选的实施方案(o，)中，所述骨原细胞、成骨细胞或成骨细 胞表型(OOP-2)细胞(特别是上述实施方案(a，)至(n，)中任一定义 的)基本上不向脂肪细胞镨系(例如，脂肪细胞)或软骨细胞镨系(例如， 软骨细胞)任一种细胞分化，优选两种均不分化。
提到细胞对于特定标志物为阳性时，这是指与适当的对照相比，技术 人员在进行适当的测量时将推断出该标志物的特有信号的存在或证据，例 如可检测抗体或者可通过逆转录聚合SI^式^^应检测。当所述方法允许定 量评估所述标志物时，阳性细胞可以平均产生显著不同于对照的信号，例 如但非P艮制性地，比对照细胞产生的信号高至少1.5倍，例如，高出至少2 倍，至少4倍，至少10倍，至少20倍，至少30倍，至少40倍，至少50 倍或者甚至更高。
可以使用本领域已知的任何适当的免疫学技术来检测细胞特异性标
志物的表达，如流式细胞术、免疫细胞化学或亲和吸附、Western印迹分 析、ELISA等，或者通过测量所述标志物的mRNA量的任何适当技术， 例如，Northern印迹、半定量或定量RT-PCR等。
在一些实施方案中，上述骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞在 称为ALP阳性时将指通过FACS测定为ALP阳性。在一些实施方案中， ALP阳性细胞将包含至少300mU ALP/1 mg总细胞蛋白质，优选至少 400mU ALP/1 mg总细胞蛋白质，更优选至少450mU ALP/lmg总细胞蛋 白质，例如，至少500mU、至少600mU、至少700mU、至少800mU、至 少卯OmU或至少1 U的ALP/lmg总细胞蛋白质。例如，ALP活性可以为 400~1500mU/lmg总细胞蛋白质，例如450 ~ 1500mU， 500~1500mU， 550~1500mU或者600 ~ 1500mU/l mg总细胞蛋白质，并且可以通常为 400 ~ 800mU/lmg总细胞蛋白质，例如，约500mU，约550mU,约600mU, 约650mU，约700mU，约750mU或者约800mU/lmg细胞蛋白质。上述 ALP活性可以与上文限定的一种或多种另外的特征(a)至(h)组合存在。
在一些实施方案中，本发明的骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细 胞在称为P1NP阳性时将在培养基中产生以下量的1型前J3^f、氨基端前肽 (P1NP) (P1NP用每毫升培养基每106个细胞的ng数来表示)至少 0.4ng，优选地至少0.5,更优选地至少1.0，更优选地至少1.2，最优选地 至少1.5，例如至少1.6,至少1.7，至少1.8或者至少2。例如，P1NP可 以为0.4 ~ 3.5，例如0.5~3.5， 0.8 ~ 3.5, 1.0 ~ 3.5， 1.2 ~ 3.5， 1.5 ~ 3.5， 1.8 ~ 3.5， 2.0 ~ 3.5， 2.2 ~ 3.5, 2.5 ~ 3.5， 2.8 ~ 3.5或者3.0 ~ 3.5;伞J如约1.5， 约1.6，约1.7,约1.8，约1.9或者约2.0。上述P1NP的产生可以与上面 限定的一种或多种另外的特征U)至(h)组合存在。
在另外一些实施方案中，本发明的骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表 型细胞在称为BSP阳性时可以包含中等至大量的骨涎蛋白。通过定量方法 进行测量(例如定量RT-PCR)时，本发明的骨原细胞、成骨细胞或成骨细 胞表型细胞中产生的信号可以比对照细胞(例如任何另外的非成骨细胞) 产生的信号高出2倍，并且可以优选高出至少4倍、至少10倍、更优选至 少20倍、至少30倍、至少40倍或者至少50倍。上述骨涎蛋白的产生可 以与上面限定的一种或多种另外的特征(a)至(h)组合存在。
通常，上述CD和另一些标志物是本领域已知的，在细胞中对其进行
检测的方法和试剂是技术人员可获得的。
在另一方面，本发明包括包含上述骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表
型细胞的细胞群，例如包含如上所述的OOP-l和/或OOP-2细胞类型的细 胞群。优选地，这样的细胞群可以包含至少10°/。、优选至少30%、更优选 至少50%、例如至少60%、更优选至少70%、例如至少80%、甚至更优 选至少90 % 、例如至少95 % 、或者甚至至少96 % 、至少97 % 、至少98 % 或者至少99 %的OOP-l和/或OOP-2细胞类型。
例如，在骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞的:悉分数中，OOP-l 细胞可占至少5 % ，或者至少10 % ，或者至少20 % ,或者至少30 % ，或者 至少40 o/。，或者至少50 % ,或者至少60 % ，或者至少70 % ，或者至少80 %或者至少卯％或者至少95 %或者甚至100 % ，而OOP-2可以基本上组 成所述分数中的其余细胞。
在一些优选的实施方案中，所述细胞群可以包含小于50°/。、优选地 小于40 % 、更优选地小于30 。/。、更优选地小于20 %并且更优选地小于10 %、例如小于7%、小于5%或小于2%的除上述骨原细胞、成骨细胞或成 骨细胞表型细胞(特别是OOP-l和/或OOP-2细胞类型)以外的细胞类型。
在一个优选的实施方案中，所述细胞群可以包含内皮细胞或其祖细胞。
优选地，这样的内皮细胞或祖细胞可以表达冯.维勒布兰德因子 (vWF) 、 VEGF和CD133中的至少一种(例如至少两种或至少所有3 种)。
西此，在实施方案(a")至(g")中，所述内皮细胞表达:(a") 至少vWF， ( b")至少VEGF， ( c")至少CD133, ( d")至少vWF和 VEGF， ( e")至少vWF和CD133， ( f")至少VEGF和CD133，或者 (g")至少vWF、 VEGF和CD133。
在另一实施方案(h")中，所述内皮细胞尤其是上述实施方案(a") 至(g ")的内皮细胞还表达CD34。
因此，在一个实施方案中，所述细胞群包含(A)骨原细胞、成骨细 胞或成骨细胞表型细胞，特别是如上定义的OOP-l和/或OOP-2细胞，还
包含(B)如上定义的内皮细胞或祖细胞。
在一个实施方案中，(A)中所述的成骨细胞和(B)中所述的内皮 细胞共同组成所述细胞群中至少50%的细胞，例如至少60%，优选至少 70%,例如至少80%,更优选地至少90%，更优选地至少95%，最优选 地至少96%，例如至少97%，至少98%,或者至少99%，或者甚至100 %。
在该(A+B)的分数中，(A)中所述的成骨细胞优选占至少50%, 例如至少60%，更优选地至少70%，例如至少80%，甚至更优选地至少 卯％，例如至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，或者甚至至少 99%,在优选的实例中为在卯％至99%，卯％至95%或者95%至99%。
因此，在该(A+B)的分数中，(B)中所述的内皮细胞优选地占小 于50%，例如小于40。/q，更优选地小于30%，例如小于20%，甚至更优 选地小于10%,例如小于5%，小于4%，小于3%，小于2%，或者甚至 小于1%，在优选的实例中为1%至10%， 5%至10%,或者1%至5%。
应该理解，使用本发明的分化方法可以有利地获得本文公开的细胞类 型和细胞群。这样的方法可以任选地增加另外的分开或分离特定细胞类型 (例如基于标志物讀4吏用FACS)，并且任选地这些细胞类型的组合形成 期望的细胞群。
尽管如此，应该理解，本发明通过它们的结构和功能特征定义了细胞 类型和细胞群(即其本身)，并且不受其任何制备方式的限制。用于举例 并且非限制性地，可以通过使用将细胞分化为成骨镨系的其他条件并选择 (例如通过FACS)具有如本文定义的特定标志物模式的细胞来获得如上 定义的骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞。类似地，所述内皮细胞 还可以通过应用例如血管发生因子或者vyjt血细胞、然后选择具有期望标 志物镨的细胞来产生。
在另外一些方面，本发明还涉及具有特定标志物镨的特定细胞群。
例如，本发明涉及细胞群("POPl，，)，其中的70%至100%、优选 80%至100%、更优选卯％至100%、更优选95%至100% (例如高达90 %至100%或者卯％至98%，或者95%至98% )是CD105阳性的，并且
优选地也是CD45阴性的、CD19阴性的、CD14阴性的、CD90阳性的和 CD73阳'性的。
本发明还涉及具有如POP 1的特征的细胞群2 ("POP 2")，并且其 中70% ~100%、优选80 0/。 ~100%、更优选90% ~100%、更优选95% ~ 100%的CD105阳性细胞也是ALP阳性的和/或P1NP阳性的和/或BSP阳 性的。
本发明还涉及具有如POP 1的特征的细胞群3 ("POP 3")，另外其 中50%~100%、例如60%~100%、优选70%~100%、例如80%~100 % 、更优选卯％ ~ 100 % 、更优选95 % ~ 100 %的CD105阳性细胞也是CD63 阳性的和/或CD166阳性的。
本发明还涉及具有如POP 2的特征的细胞群4 ("POP 4")，另外其 中50%~100%、例如60%~100%、优选70%~100%、例如80%~100 % 、更优选90 % ~ 100 % 、更优选95 % ~ 100 %的ALP阳性的和/或P1NP 阳性的和/或BSP阳性的细胞也是CD63阳性的和/或CD166阳性的。
本发明还涉及具有如POP 1或POP 3之任何的特征的细胞群5( "POP 5")，其中1%~20%、优选1%~10%、更优选1%-5。/。的细胞是vWF 阳性的和/或VEGF阳性的和/或CD133阳性的。
本发明还涉及细胞群6 ( "POP 6"):其中约50 %至约98 % 、优选约 70 %至约98 % 、甚至更优选约80 %至约98 % 、例如约卯％至约98 。/。的细 胞是ALP阳性的；其中约30%至约98%、优选约40%至约98% 、甚至更 优选约50%至约98%、例如约60%至约98%、约70%至98%、约80。/0 至98 %或者甚至约90 %至98 %的细胞是CD166阳性的；其中约30 %至约 98%、优选约40%至约98%、甚至更优选约50%至约98%、例如约60% 至约98%、约70%至98%、约80%至98%或者甚至约卯％至98%的细 胞是CD63阳性的；其中约0.5%至约10%、优选约1%至10°/。、更优选 约1。/。至4。/。之间的细胞是CD133阳性的；其中约0.5%至约10% 、优选 约1 %至10 % 、更优选约1 %至4 %之间的细胞是VEGF阳性的；以及其 中约0.5%至约10%、优选约2%至10%、甚至更优选约5%至10%、约8 %至10 %的细胞是vWF阳性的。
在相关的方面，本发明涉及上述定义的用于治疗骨相关疾病和/或用
于制造用于治疗骨相关疾病的药物的细胞或细胞群。
在一方面，可以将上述定义的细胞或细胞群施用于骨损伤(例如手术 或骨折)的部位。
在另一方面，本发明提供了用于预防和/或治疗骨病的方法，其包括 向有此治疗需要的受试者施用上述定义的细胞或细胞群。
在一方面，本发明涉及用于预防和/或治疗骨病的方法，其包括
(a) 获得上述定义的细胞或细胞群，以及
(b) 对受试者施用这样获得的细胞或细胞群。
在一个优选的实施方案中，所述步骤(a)可以包括使用自体人血浆 或血清的本发明方法(更优选地没有非人动物组分(例如，血清组分))。
的"纯自体"糸并。
在另 一方面，本发明涉及包含如上定义的细胞和细胞群并适于在骨损 伤部位施用的药物组合物。
3.涉及本发明的细胞和细胞群的其他方面
本方面涉及如通过上文第一部分中所述方法获得或可通过该方法获 得的骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞以及包含上述细胞的细胞 群；还涉及如上文笫二部分中所述的骨原细胞、成骨细胞或成骨细M型 细胞以及包含上述细胞的细胞群本身。
在另一方面，本发明涉及装置，其包括用于将组合物施用在骨损伤部 位的手术器械，并包括包含如上定义的本发明细胞或细胞群的药物组合 物，其中所述装置适于在骨损伤部位施用所述药物组合物。例如，适当的 手术器械可以能够将包含本发明细胞的液体组合物注射到骨损伤部位。
才艮据以上方面，可在手术或骨折部位将本发明的细胞或细胞群引y^A 受试者的骨中。将成骨细胞引入骨中对于治疗骨折和骨相关疾病是有用 的。
如上文所述，优选地，所述成骨细胞得自可引入分化成骨细胞的受试
者的BMSC。然而，BMSC也可以分离自与受试者相同或不同物种的生物。 受试者可以是具有骨组织的任何生物。优选地，受试者是哺乳动物，最优 选地，受试者是人。
可以在引入到受试者的骨损伤(例如手术或骨折部位)之前用目的核 酸稳定或瞬时地转化BMSC细胞或者本发明的细胞或细JW。目的核^ 列包括但不限于编码基因产物的核,列，所述基因产物增强成骨细胞的 生长、分化和/或矿化。例如，为了治疗非愈合骨折(non-healing fracture) 或骨质疏^s可以以稳定或瞬时方式将用于BMP-4的表达系统引入 BMSC。转化BMSC和成骨细胞的方法是本领域技术人员已知的，用于将 成骨细胞在骨损伤(例如手术或骨折)部位引入骨中的方法也是如此。
可以将本发明的细胞或细l^单独引入或者与其他組分混合引入，所 述其他组分对于骨创伤和缺陷的修复是有用的。这样的组合物包括但不限 于骨形态生成蛋白、羟磷灰石/磷酸三钙颗粒(HA/TCP)、明胶、聚乳酸、 聚乳酸鞋基乙酸、透明质酸、壳聚糖、聚L-赖氨酸和胶原。例如，从脂肪 基质细胞分化来的成骨细胞可以与脱矿质骨基质(Demineralized Bone Matrix, DBM)或其他基质组合，以使该复合材料成为成骨(本身即形成 骨)以及骨诱导的性质。使用自体骨髄细胞与同种异体DBM的类似方法 已产生良好的结果(Connolly等1995. Clin Orthop 313: 8-18 )。
当将本发明的细胞或细胞群单独引入或者与其他组分混合引入时，所 述组合物(例如药物组合物)可以包含确保这些细胞(例如其中的骨原细 胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞)的生存力的其他组分。特别地，所述 细胞或细胞群可以以药物组合物的形式来提供，所述药物组合物包含在无 菌程度足以用于人类施用的务泮下制备的等渗赋形剂。对于药物配制中的 一般原则，读者可参考G Morstyn & W. Sheridan编辑的Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, Cambridge University Press, 1996以及Hematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000 。所述组合物中细胞赋形剂和 任何附带要素的选择将根据施用设备进行调整。例如，所述组合物可以包 含适当的緩冲系统至适当的pH，例如接近中性的pH (例如磷酸盐或碳酸 盐緩冲体系)，并可以包含足够的盐以确保细胞或细胞群的等渗条件，即
防止渗透压。例如，用于这些目的的适当溶液可以是本领域已知的磷酸盐
緩冲液(PBS)。另外，所述组合物可包含可提高细胞生存力的载体蛋白， 例如白蛋白。优选地，为了确保排除非人动物材料，所述白蛋白可以是人 来源的(例如vMwA的材料分离或重组产生的)。白蛋白的适当浓度是7>^ 的。
所述细胞或细胞群可以以使它们移植或迁移至预期组织部位并重建 或再生功能缺陷区域的方式来施用。所述组合物的施用将取决于被修复的 肌骨骼部位。例如，可以与重建组织或插入裂片的手术操作一起或者与修 复装置(如^P替换物) 一起来促进骨生成。在另一些情形中，不需要介 入式手术，可以通过注射或者(对于修复脊柱)使用可引导的内窥镜来施 用组合物。
如果需要，所述细胞制备物还可以包括补充的生物活性因子或者与其 共同施用，如骨形态生成蛋白(如BMP-2或BMP-4)或者任何另外的生 长因子。其他可能的附带组分包括适于辅助骨再生的钓或磷酸盐的无机物 来源(WO 00/07639)。如果需要，可以将细胞制备物施用至载体基质或 材料上以提供改进的組织再生。例如，所述材料可以是粒状的陶瓷制品， 或者生物聚合物如明胶、胶原、骨连蛋白、纤维蛋白原或骨钙蛋白。可以 根据标准技术(例如，Mikos等，Biomaterials 14:323， 1993; Mikos等, Polymer 35:1068， 1994; Cook等，J. Biomed. Mater. Res. 35:513,1997 )合成 多孑L基质。
在一个实施方案中，可以以液体组合物的形式施用如上文定义的细胞 制备物。
在另一实施方案中，可以将本发明的细胞或细胞群转移至和/或培养 在适当的基质上以保证移植。可以在其上应用和培养细胞的基质可以是金 属，如钛、钴/#^金或不锈钢，生物活性表面如磷酸钾，聚合物表面如聚 乙烯等。尽管优选程度较低，^^t材料如玻璃陶瓷也可以用作基质。最 优选的是金属(如钛)和磷酸钓，尽管如此，但磷酸钾并不A^质的必要 组分。_&质可以是多孔的或非多孔的。
例如，如有必要的话，可以将已增殖或者在培养亚中分化的细胞转移 至三维固体支持物上，从而通过将该固体支持物在本发明的液体营养培养
基中孵育而使它们增殖和/或继续分化过程。可以将细胞转移至三维固体支 持物上，例如通过用包含细胞的液体悬浮液浸渍所迷支持物来实现。以这 种方式获得的浸渍支持物可以移植到人受试者中。在最终移植之前，这样 的浸渍支持物还可以通过将其浸入液体培养基中而再次培养。
所述三维固体支持物必须为生物相容性，以^吏其能够移植到人中。它 可以具有任何适当的形状，如柱状、球状、板状或任意形状的一部分。在 适用于生物相容性三维固体支持物的材料中，可以特别提及的是碳酸钧， 特别是文石，特别是以珊瑚骨餘、基于氧化铝、氧化锆、磷酸三钙和/或羟 磷灰石的多孔陶资的形式，通过使碳酸钓能够转变为羟磷灰石的水热交换 获得的模拟珊瑚骨骼，或者磷灰石-U石玻璃陶瓷、生物活性玻璃陶瓷如
Bioglass (TM)玻璃。 实施例
实施例1:使BMSC分化为成骨细胞的方法
^A受试者的l^fr取出30ml骨髄，从同一受试者取出100ml血液。
如本领域通常地从血液制备血浆。更具体地，在20'C，将含有抗凝 剂肝素的血液以2000rpm离心15分钟，以除去细胞组分，回JML浆，在 56。C热灭活50分钟，3000 rpm离心15分钟使其澄清，通过0.22nm无菌 滤器进行过滤，分为等份并储存在-80 'C 。
使用Ficoll梯度离心从所述骨髓样品中回收单个核的细胞，特别地使 用Ficoll Paque Plus( Amersham Pharmacia )并在20'C以1400 rpm( 450g) 离心30分钟。
回收细胞，在PBS中洗涤并以lOxlO6个细胞/175cm2培养瓶 (Corning)沉积在包含培养基的培养瓶中，所述培养基包含IMDM (临 床级)无血清培养基(Cambrex)、上文分离的20%自体血浆和1 ng/ml FGF-b (Peprotech)。在培养的第4天，更换全部培养基，从而除去未贴 壁的物质。在第7和11天，更换一半培养基。在第12、 13或14天，用 PBS洗涤细胞，使用EDTA 4吏其脱壁并传代，以lxl(^个细胞/175cn^培 养瓶在相同培养基中进一步培养。在培养的第21和24天之间，如上述收 获细胞。就移植目的而言，将细胞重悬在含有5。/。人白蛋白的无菌PBS中。
一部分细胞用于表型表征(实施例2 )。
实施例2:对通过实施例1的方法获得的成骨细胞和成骨细胞样细胞进行 表型表征。
在Cell Therapy Unit中培养21天后，收获细胞用于向患者注射并用 于表征。制备20xl(^个细胞用于注射。其余的细胞用于表型表征
1.通过RT-PCR对骨涎蛋白进行半定量测量
在RNA提取緩冲液(RLT緩冲液，RNeasy试剂盒，Qiagen)中裂 解1至2xl(^个细胞，并储藏在-80。C直到处理。使用来自Qiagen的RNeasy 试剂盒从裂解物中提取总RNA。使用随机六聚体和逆转录酶对1吗总 RNA进行逆转录。使用针对骨涎蛋白(BSP)和持家基因P-肌动蛋白的 寡核苷酸引物对cDNA产物第一条链进行逆转录聚合酶链式反应 (RT-PCR)。通过在2 %琼脂糖凝胶中进行电泳来分析RT-PCR产物并 显色，用于半定量测量骨涎蛋白(BSP) (0=无表达，+=弱表达；++ = 中等表达，+++=高表达)。
结果骨涎蛋白的表达(n=6) 。 BSP的表达平均为++ (范围从+到
++)
培养基中总的l型前^f、氨基端前肽(P1NP)的剂量
在第21天，将2 ml培养基储藏在-20'C用于测定PlNP剂量。通过 电化学发光免疫测定(Roche， Elecsys， 1010/2010 modular analytics )来测 量P1NP水平。
结果PlNP-21-卯(范围)ng/ml培养基(n=6)
碱性磷酸酶活性(APA)的测量
使用5xl()S-l(^个细胞测量碱性磷酸酶活性。
用2mlPBS洗涤细胞，并在蒸馏水中超声处理。离心后，使用上清 液测定碱性磷酸酶的活性和蛋白含量。
按如下制备试剂。制备二乙醇胺緩冲液1 M， pH 9.8。将原液(D8885-Sigma-Aldrich)在水中稀释10倍，并用HC1调节pH为9.8。制备 反应溶液1M 二乙醇胺pH 9.8和0.5 mM MgCl2( M 8266 Sigma-Aldrich ) 溶液。制备pNPP底物将10 mM六7jc合4-硝基苯基磷酸二钠盐(N 4645， Sigma-Aldrich)溶液在所述反应溶液中。
APA催化以下反应
对硝基苯基磷酸盐+ H20—对硝基苯酚+磷酸盐
在37。C下孵育底物溶液；20ki1上清液+1000h1底物。在37。C下转移至分 光光度管中；2分钟后于405 nm进行读取，再孵育2分钟并再次读取，再 过2分钟后最后一次读取。计算吸光度A (差值)的平均值，并表示吸光 力分钟的A。
计算:1 U -每分钟产生一微摩尔对硝基苯酚的酶量。对硝基苯酚的 摩尔吸收系数=18450， mmolaire=18.45， fimolaire=0.01845。对于20 jil的 样品来i兌APA(U/L，或mU/ml) =AAxl020/0.01845x20。
蛋白质的量
如下制备考马斯溶液100 mg考马斯蓝(Merck 1.15444) + 50 ml 乙醇95% + 100 ml H3P04 85 % +H2OilL，混匀并过滤。如下制^^ 有1 mg /ml牛白蛋白的溶液10至50 jul de BSA( lmg/ml )+H20至lml。
如下制^^样品200 fil上清液+800 fil H20或者500 [il上清液+500 jil H20。加入2ml的考马斯溶液并涡旋。5分钟后，测量595nm处的OD。 以mg / ml表示蛋白质。
对于每个样品来说，APA水平是相对于蛋白质的总浓度(mU/mg 蛋白质)。
结果碱性磷酸酶(n=10) 。 APA: 693±126 mU/mg蛋白质(平均 数士SEM);范围274-1472 mU/mg蛋白质。
矿化能力
在培养的第14天，接种一个6孔板用于研究矿化能力。
在第21天，该板的培养基更换为MEM+15% FCS+50將/ml抗坏血 酸+108 M地塞米松+10mM P-磷酸甘油(EMEM, BioWhittaker BE12 -136F; FCS InVitrogen;抗坏血酸Sigma A-4403;地塞米松Sigma D-4卯2; P-甘油磷酸盐Sigma G"9891)。
在第28天通过茜素染色使矿化显色在PBS中的4 %甲醛中固定细 胞，用PBS洗涤，用2%萏素红(pH4.1)孵育用于染色。
以培养mL总表面积的百分比来评估矿化(n=lO) 患者中上述测量的具体实施例
患者骨髓 (ml)Ficoll 梯度 离心后 的MNC (xl06)培养物 中的MNC 10s )收集原 代培养物 (第7天)x收集继 代培养物 (第21 天)x 106所注射 细胞 (X 106)APA (mU/mg 蛋白)BSPP1NP ng/ml矿化 (总表面积 的百分比)
N。l2744.344.317.170.820640++43>65%
N°232605012282077382>65%
N°33115.615.611.512220274+26>65%
在另外的实验中，甚至观察到在1周时矿化能力高达75 % (参见图2 ) 或更高。
确定标志物谙
遵循上文和/或通过抗体染色和所述细胞的流式细胞术测定标志物的 表达。这些实验得到以下所收获细胞中标志物的表达情况。
总细胞群是>95% (或者甚至>99% )CD45-、 CD19-、 CD14-、 CD卯+、 CD73+、 CD105+。所有细胞中的卯-95%可以表征为骨原细胞或成骨细胞 表型。其中100。/q是ALP+， 50-100。/q是CD166+， 65-100%是CD63+。这 些细胞还是P1NP和BSP阳性的。这些细胞中35 %至65 %是CD34+。(在 总细胞群中，这对应于80-98 %的ALP+细胞、40-98 %的CD166+细胞和 60-98 %的CD63+细胞。)
另外，总细胞群包含估计数量为总细胞5-10%的内皮细胞或其祖细 胞。在这些细胞中，50-750/。是vWF (冯.维勒布兰德因子)阳性的，25-50 %是VEGF+, 25-50 %是CD133+。约50 %细胞共表达CD133和VEGF。 所有这些细胞都是CD34+。(在总细胞群中，这代表1-4%的CD133阳性 细胞，1-4 %的VEGF P日性细胞以及约5-8 %的vWF阳性细胞。)
另外的标志物镨测定使本发明人能够将该细胞类型定义为也在本公 开内容的其它地方详细描述的细胞类型。
实施例3:将实施例2的细胞移植至患者
在一个实施例中，根据Gangji等2005先前描述方法(Expert Opin Biol Ther 5(4): 437-42; J Bone Joint Surg Am 87 Suppl 1 :106-12 )，通过将 成骨细胞移^V膂部坏死区域来治疗患有第2阶段股骨头坏死的患者。
在基线水平下，患者的疼痛评刺目测模拟评分(visual analogue score -VAS))为38 mm (总分为100 ) ， WOMAC臀部功能评分为43 (总分 为96) , Lesquesne膂部功能评分为11 (总分为24)。
通过成骨细胞移植治疗的患者在3个月和6个月后表现明显的关节症 状改善VAS评分在3个月和6个月时降至0 (图1A) ， WOMAC在3 个月和6个月时降至0 (图IB) , Lequesne指数在3个月和6个月时>^ 线的11降至0。
在另一实施例中，才艮据相同的方法，通过将成骨细胞移^膂部坏死 区域来治疗患有第2阶段股骨头坏死的患者。在基线水平下，患者的目测 模拟疼痛评分为6 mm, Lesquesne功能评分为3。
通过成骨细胞移植治疗的患者在3个月和6个月后表现明显关节症状 改善VAS评分在3个月和6个月时降至0， Lequesne指数在3个月和6 个月时降至0。另外，未移植成骨细胞的另一侧臀部演变至最终的骨坏死 阶段，将需要替换整个臀部。
权利要求
1. 用于在体外或离体地从人骨髓干细胞获得骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞或者获得包括所述细胞的细胞群的方法，其包括将所述骨髓干细胞与人血清或血浆以及碱性成纤维细胞生长因子(FGF-b，FGF-2)或其生物活性变体或衍生物接触。
2. 根据权利要求l的方法，其中所^A血浆或血清是该骨髓干细胞 自体的。
3. 根据权利要求1或2中任一项的方法，其中所述骨髓干细胞不接 触任何得自非人动物的材料，例如血清组分。
4. 根据权利要求1至3中任一项的方法，其中所述骨髄干细胞v^A 受试者的生物样品中获得，所述生物样品优选为该受试者的骨髄样品。
5. 根据权利要求4的方法，其中所i^A受试者具有患骨相关疾病的 风险或者患有骨相关疾病，
6. 根据权利要求1至5中任一项的方法，其包括以下步骤(a)从包含BMSC的人受试者生物样品中回收细胞，所述生物样品 优选为骨髄样品；(b) 任选地，从(a)中回收的细胞中分离单个核的细胞，例如使用 适当的密度梯度离心或其他方法进行分离；(c) 将(a)的细胞或者优选(b)的细胞加入包含人血浆或血清以及 FGF-2或其生物活性变体或衍生物的培养基中，并培养该细胞-培养基混 合物，以使细胞贴壁于基质表面，例如傳雄养容器的玻璃或塑料表面；(d) 除去未贴壁的物质并将贴壁细胞在(c)中定义的培养基中进一步 培养，从而获得骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞样细胞，或者获得包含上 述细胞的细胞群。
7. 根据权利要求6的方法，其包括(e)在培养12天到16天时收集 (d)中获得的细胞或细胞群，优选在约第14天时收集。
8. 根据权利要求6的方法，其包括(e)在培养12天到16天时将(d) 的细胞或细胞群进行传代，优选在约第14天时传代；继续培养所述传代细 胞或细l&^;并在培养18天到24天时收集该细胞或细胞群，优选在约第 21天收集。
9. 根据权利要求1至8中任一项的方法，其中FGF-2或其生物活性 变体或衍生物以低于10ng/ml、优选低于5ng/ml、甚至更优选为1、 2、 3、 4或5ng/ml的浓度存在。
10. 可通过权利要求1至9中任一项的方法获得的人骨原细胞、成骨 细胞或成骨细胞表型细胞或者包含上述细胞的分离的细胞群。
11. 权利要求IO中所限定的分离的细胞群，其包含至少80%、优选 至少卯％、更优选至少95%的人骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞。
12. 权利要求10或11中任一项所限定的分离的细胞群，其包含少于 20%、优选少于10%、更优选少于5%的内皮样细胞。
13. 人骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞，其特征在于它们共 表达(1)选自碱性磷酸酶(ALP)更具体地为骨-肝-肾型ALP、 1型前胶 原氨基端前肽(P1NP)和骨涎蛋白(BSP)的至少一种成骨细胞标志物以 及(2 )选自CD63和CD166的至少一种干细胞/未成熟骨原细胞标志物。
14. 根据权利要求13的骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞， 其中适用以下任一项、多项或所有项-所述细胞是骨钧蛋白(OCN)阴 性的；國所述细胞是CD34阳性的；-所述细胞对于CD卯、CD73和CD105 中伶阿一种、两种或所有三种是阳性的；-所述细胞对于€。45、 CD19和 CD14中任何一种、两种或所有三种是阴性的；-所述细胞是CD133阴性的。
15. 根据权利要求13或14中任一项的骨原细胞、成骨细胞或成骨细 胞表型细胞，其中适用以下任一项或两项-当接触成骨培养基时，所述细 胞可以矿化外部围绕物，或者合成含钓的细胞外基质；-所述细胞基本上不 向脂肪细胞镨系细胞或软骨细胞谦系细胞中的任一种分化，并优选地不向 脂肪细胞谱系细胞和软骨细胞语系细胞两者分化。
16. 人骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞，其特征在于它们共 表达(1)选自碱性磷酸酶(ALP)更具体地为骨-肝-肾型ALP、 l型前胶 原M端前肽(P1NP)和骨涎蛋白(BSP)的至少一种成骨细胞标志物以 及(2 )造血/内皮祖细胞标志物CD34。
17. 根据权利要求16的骨原细胞或成骨细胞表型细胞，其中适用以 下任一项、多项或所有项-所述细胞是骨钩蛋白(OCN)阴性的；-所述 细胞是CD63阳性的；-所述细胞是〔0166阳性的；-所述细胞对于CD卯、 CD73和CD105中任何一种、两种或所有三种是阳性的；-所述细胞对于 CD45、 CD19和CD14中任何一种、两种或所有三种是阴性的；-所述细胞 是CD133阴'性的。
18. 根据权利要求16或17中任一项的骨原细胞、成骨细胞或成骨细 胞表型细胞，其中适用以下任一项或两项-当接触成骨培养基时，所述细 胞可以矿化外部围绕物，或者合成含钓的细胞外1^质；-所述细胞基本上不 向脂肪细胞谱系细胞或软骨细胞镨系细胞之任一种分化，并优选地不向脂 肪细胞镨系细胞和软骨细胞谱系细胞两者分化。
19. 包含权利要求13至15中任一项的骨原细胞、成骨细胞或成骨细 胞表型细胞和/或权利要求16至18中任一项的骨原细胞、成骨细胞或成骨 细胞表型细胞的细胞群，其优选地包含至少70%、更优选至少80%、甚至 更优选至少90 % 、更加优选至少95%的权利要求13至15中任一项的骨原 细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞和/或权利要求16至18中任一项的骨 原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞。
20. 权利要求19中所限定的细胞群，其还包含内皮细胞或其祖细胞。
21. 权利要求20中所限定的细胞群，其中所述内皮细胞或祖细胞表 达冯.维勒布兰德因子(vWF) 、 VEGF和CD133中至少一种、至少两种 或所有三种，并且优选是CD34阳性的。
22. 权利要求20或21中任一项所限定的细胞群，其包含少于10%、 优选少于5 %或少于2 %的内皮细胞或其祖细胞。
23. 用于治疗的权利要求10或13至18中任一项所限定的细胞或者 权利要求IO、 11、 12或19至22中任一项所限定的细胞群。
24. 权利要求10或13至18中任一项所限定的细胞或者权利要求10、 11、 12或19至22中任一项所限定的细胞群用于制造治疗骨相关疾病的药 物的用途。
25. 根据权利要求24的用途，其中将权利要求10或13至18中任一 项所限定的细胞或者权利要求10、 11、 12或19至22中任一项所限定的细 胞群施用于骨损伤部位。
26. 药物组合物，其包含权利要求10或13至18中任一项所限定的 细胞或者权利要求10、 11、 12或19至22中任一项所限定的细lfe^，并且 适于将所述细胞或分离的细胞群施用于骨损伤部位。
27. 包含用于将组合物施用于骨损伤部位的手术器械并且还包含权利 要求26中所限定的药物组合物的装置，其中所述装置适于将所述药物组合 物施用于骨损伤部位。
全文摘要
本发明提供了用于体外或离体从人骨髓干细胞获得骨原细胞、成骨细胞或成骨细胞表型细胞以及包含它们的细胞群的方法，其包括将所述骨髓干细胞与人血清或血浆以及生长因子或其生物活性变体或衍生物进行接触。另外，本发明提供了新的骨原细胞或成骨细胞表型的细胞类型以及包含它们的细胞群，其中这些细胞群还可以包含另外的细胞类型，如优选地为内皮细胞或祖细胞。在相关的方面，本发明提供了上述方法、可使用该方法可获得的细胞和细胞群以及本文具体描述的细胞类型和细胞群的用途，特别是在治疗(优选骨治疗)领域的用途。
文档编号A61K35/28GK101384707SQ200780005756
公开日2009年3月11日 申请日期2007年2月16日 优先权日2006年2月16日
发明者多米尼克·埃格里斯, 瓦莱丽·冈吉, 米什莱恩·朗贝蒙特, 米歇尔·通古, 让-菲利普·豪泽尔 申请人:布鲁塞尔大学