专利名称：一种马铃薯腐烂茎线虫脂肪酸去饱和酶基因序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种马铃薯腐烂茎线虫脂肪酸去饱和酶基因序列，更具体涉及一种从腐烂经线虫中筛选出的一个新基因FAD (Fatty Acid Desaturase)的氨基酸序列,本发明还涉及该基因的用途。
背景技术：
脂肪酸去饱和酶是细胞膜的主要成分，对生物膜的生化活性及维系细胞的生物学功能起重要作用。最近的研究发现，脂肪酸去饱和酶在秀丽小杆线虫(C.elegans)抗寒过程中作用非常关键，尤其硬脂酰-CoA去饱和酶，该酶在与辅酶A相结合的饱和脂肪酸的A-9引入双键形成单不饱和脂肪酸，在生物体内的脂类代谢以及能量消耗过程中起着关键作用。目前秀丽小杆线虫共克隆得到7条脂肪酸去饱和酶基因FAT-I到FAT-7。其中FAT-5、FAT-6、FAT-7都编码A-9脂肪酸去饱和酶，FAT-5编码A-9脂肪酸去饱和酶可以催化软脂酸变成棕榈油酸，FAT-6(FAT-7)编码A-9脂肪酸去饱和酶可以催化硬脂酸形成油酸。腐烂莖线虫(Ditylenchusdestructor Thorne)垫刃目(Tylenchida),粒科(Anguinidae) , 线虫属(Ditylenchus Filip jev),是一类重要的植物病原线虫,主要为害寄主植物的地下部，种类多，分布广，危害重。目前已报道的腐烂茎线虫寄主植物达90多种，主要寄生为害甘薯。我国是世界上最大的甘薯生产国，马铃薯腐烂茎线虫引起的甘薯茎线虫病已经成为危害我国甘薯生产的重要病害，严重者发病率可高达80%，发病地块一般减产20-30 %，严重者达50 %以上，甚至绝产。该病不仅在田间为害直接造成减产，而且还引起储藏后期烂窖。目前甘薯茎线虫病在我国的北京、天津、山东、河北、河南、江苏、浙江、福建、辽宁、甘肃等省市均有发生。该病害的防治难点就是该线虫具有很强的抗逆性，土壤中越冬虫量的存活情况直接影响甘薯的产量。该线虫具有很强的抗低温能力，有研究结果表明，植物组织中的马铃薯腐烂茎线虫在_2°C情况下能存活，但在-4. 5°C条件下死亡。但是林茂松等从_6°C至_7°C的病土块分离得到大量的腐烂茎线虫。本研究小组也对该线虫的耐低温能力进行了研究，将保存在40%甘油的染病薯块，分别存放在-20°C和_70°C的低温下，180天后该线虫存活率仍然可以达到80%以上。目前，对该病害的研究主要集中在形态学、致病机制以及品种抗病性和防治措施等方面，而对该线虫的抗低温机制研究甚少。虽然对线虫耐寒性的生理、生化机制研究近些年来也虽然取得了一些的进展，但是目前线虫的耐寒机制还不是很清楚。Brock发现把秀丽小杆线虫FAT-6和FAT-7基因同时沉默，突变体在10°C低温处理，存活率不到1%。
发明内容
本发明的目的在于提供一种马铃薯腐烂茎线虫脂肪酸去饱和酶基因序列。为了实现上述目的，本发明采用了以下技术措施本发明所述的基因FAD是从腐烂茎线虫中克隆到的一个新基因，其cDNA序列和编码蛋白的氨基酸序列如下。该基因cDNA全长1183bp，自IlObp至1108bp区段为其开放阅读框，编码333个氨基酸，5’非编码区长109bp，3’非编码区长75bp,有多聚核苷酸尾巴。FAD基因编码蛋白的氨基酸序列如下MSTTVTQTVTVDPTIKEQFLSADLDDMEQLRESAKKVNFKPQIVWRNVILFIALHAGALVGLYQFAFTAKWLTCVWCVVCffVISGVGITAGAHRLffSHKSYKAKLPLKIILVAMNCVSFQNDIIEffSRDHRCHHKWTDTDADPHNVNRGFFFSHMGWLLTKKHPKIKEMGAKLDMSDLTSDPVLAFQRKFYLPLVVLGCFLFPTAVPVWGWGENAffIAFYTAALFRYAFTLHATffFINSAAHTFGYRPYDVNISPAES
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KQLGQLKLKGH通过RNAi技术沉默该基因，降低植物线虫耐低温能力，从而压低越冬虫源，为进一歩控制该病害的流行发生提供新的防治策略。鉴于该基因在植物寄生线虫中首次报道，目前人类对此基因的认识和了解仅限于本发明所作的科学工作研究。由于该基因为致病性基因，从而可以应用于抗线虫转基因作物的研究，为培育抗线虫植物提供了ー种新的途径和策略。本发明的优点通过该马铃薯腐烂茎线虫脂肪酸去饱和酶基因序列，来研究该基因在线虫抗低温中的作用，进而采取针对性的防治策略，減少病害带来的损失。
图I脂肪酸去饱和酶基因扩增结果的电泳图(M为标准分子量)。具体实施方法I. Trizol法提取线虫总RNA參照TRIzol Reagents (康为世纪)使用说明，提取样品总RNA。取IOOmg线虫，液氮研磨，加入Iml Trizol勻衆,室温静置5min,加入200 μ I的氯仿,室温静置5min,12，OOOXg离心15min。将上清转移至新的离心管中，加入与上清等体积的异丙醇，室温静置IOmin, 12, OOOXg离心IOmin0向沉淀中加入Iml的75%こ醇清洗沉淀，12, OOOXg于4°C离心5min。弃上清保留沉淀，干燥，用DEPC处理水溶解附着于管底的总RNA。取两份I μ I分别用分光光度计电泳检测总RNA浓度和质量。2. RT-PCR 扩增取线虫RNA 3μ 1，合成第一链cDNA :加入Random 6引物I μ 1，DEPC处理水6μ 1，70°C保温5min后，冰上速冷2min ;然后在终体积为10 μ I的反应体系中，加入5Χ第一链反应缓冲液(250mmol/LTris-HCl, ρΗ8· 3 ；375mmol/L KCl ；30mmol/L MgCl2) 3 μ I、dNTP(10mmol/L)0. 5 μ I、RNase Inhibitor (40U/μ 1)0. 5μ I 和 RNase M-MLV (200U/ul)0. 5μ I, DEPC 处理水 0· 5 μ 1，42°C 保温 lh，70°C IOmin 合成第一链 cDNA。取 2μ I 第一链cDNA加入dNTP O. 5 μ 1、PCR引物O. 5 μ I、反应缓冲液2. 5 μ I和Taq DNA聚合酶O. 5 μ I于25 μ I反应体系中进行如下PCR循环95°C预变性4min后，以94 °C 40s,60 °C lmin、72 °C Imin反应30个循环后，72 °C延伸IOmin。反应结束后，取8μ I电泳检测。合成的cDNA连入pMD18-T载体中(TaKaRa)并转化入T0P-10感受态细胞中。铺平板(内含Amp)，37 °C培养过夜。3.测序及序列分析该基因cDNA全长1183bp，自IlObp至1108bp区段为其开放阅读框，编码333个氨基酸，5’非编码区长109bp，3’非编码区长75bp，有多聚核苷酸尾巴。测序结果通过tBLASTx比对分析表明秀丽隐杆线虫肪酸去饱和酶基因 FAT-5，FAT-6和FAT-7氨基酸序列序列的同源性分别达到62%、64%和64%。
权利要求
1.一种马铃薯腐烂茎线虫脂肪酸去饱和酶基因序列，其特征在于FAD基因CDNA序列及其编码蛋白的氨基酸序列，该基因cDNA全长1183bp，自IlObp至1108bp区段为其开放阅读框，编码333个氨基酸，5’非编码区长109bp，3’非编码区长75bp，有多聚核苷酸尾巴。
2.根据权利要求I所述的一种线虫耐寒机制相关因子的基因序列，其特征在于FAD基因编码蛋白的氨基酸序列MSTTVTQTVTVDPTIKEQFLSADLDDMEQLRESAKKVNFKPQIVWRNVILFIALHAGALVGLYQFAFTAKWLTCVWCVVCffVISGVGITAGAHRLffSHKSYKAKLPLKIILVAMNCVSFQNDIIEWSRDHRCHHKWTDTDADPHNVNRGFFFSHMGWLLTKKHPKIKEMGAKLDMSDLTSDPVLAFQRKFYLPLVVLGCFLFPTAVPVffGWGENAWIAFYTAALFRYAFTLHATffFINSAAHTFGYRPYDVNISPAESVWTTVTAFGEGGHNYHHTFPQDYRTSEMSAMFNFTKLFIDFFAKIGWAYDLRTMDDASIERQMGKQLGQLKLKGH。
3.根据权利要求I所述的一种马铃薯腐烂茎线虫脂肪酸去饱和酶基因序列在基因RNAi防治线虫病害中的应用。
4.根据权利要求I所述的一种马铃薯腐烂茎线虫脂肪酸去饱和酶基因序列在把饱和脂肪酸催化合成不饱和脂肪酸中的应用。
5.根据权利要求I所述的一种马铃薯腐烂茎线虫脂肪酸去饱和酶基因序列在抗线虫转基因作物方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一种马铃薯腐烂茎线虫脂肪酸去饱和酶基因序列，该基因cDNA全长1183bp，自110bp至1108bp区段为其开放阅读框，编码333个氨基酸，5’非编码区长109bp，3’非编码区长75bp，有多聚核苷酸尾巴，该基因在线虫耐寒作用机制中起作用，同时还在抗线虫转基因作物方面应用。
文档编号C12N15/53GK102634526SQ20121007565
公开日2012年8月15日 申请日期2012年3月21日 优先权日2012年3月21日
发明者万景旺, 张红艳, 赵雷, 邵颖, 魏利辉 申请人:江苏省农业科学院