专利名称：鉴别鸡毒支原体强弱毒株的多重荧光pcr检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种鉴别鸡毒支原体强弱毒株的多重荧光 PCR检测试剂盒。
背景技术：
鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)是鸡及其它禽类慢性呼吸道疾病的主要病原，感染鸡群常出现啰音、咳嗽、流鼻涕等症状，可引起鸡生长速度下降，肉鸡胴体品质下降和种鸡产蛋率、受精率和孵化率下降等，给养禽业造成较大的经济损失。MG在世界各国广泛存在，我国鸡群中MG的感染率很高，郭锐等通过对湖北、河南两地38个鸡场的162 只患呼吸道疾病的鸡进行支原体的分离，结果59个分离物被鉴定为鸡毒支原体。邓显文等对广西不同地区鸡场调查中发现，鸡群MG平均感染率为56. 9%。MG既可水平传播，也可经种蛋垂直传播，长期存在于鸡群中，给该病的防控带来困难。目前，防治MG的最有效方法， 就是应用弱毒疫苗或灭活油乳剂苗进行预防接种，但鸡群中使用弱毒疫苗，会导致鸡群长期受到疫苗株的污染，干扰MG的检测，影响到鸡群MG的控制和净化，因此，建立一种特异、 敏感、快速的鉴别MG强毒株和弱毒疫苗株的检测方法是非常必要的。传统的MG诊断方法有病原分离鉴定和血清学方法，但这些方法存在耗时长、灵敏度低、操作繁琐等缺点，无法快速鉴别MG强毒株和弱毒株，毒力的测定要通过鸡胚接种和 SPF鸡感染等致病性试验，费时、成本比较高，无法满足生产实际的需要。在鉴别鸡毒支原体强毒株和弱毒疫苗株的PCR检测方面，邓显文等根据MG强毒株和弱毒疫苗株基因组结构特点，分别设计合成2对引物XZ1、XZ2和XZ45、XZ46，建立了可检测MG强、弱毒株的PCR方法。谢芝勋等根据对邓显文等设计的引物XZ1、XZ2和XZ45、XZ46，进一步建立了一种多重聚合酶链反应快速鉴别MG强毒株和弱毒疫苗株的方法，即在数小时内，一次多重PCR反应， 就能同时检测鉴别MG强、弱毒株的技术。但这些鉴别检测方法存在耗时长、敏感性较低、并且常规PCR需要使用PCR仪和进行凝胶电泳，不能确定鸡毒支原体感染的含量。荧光PCR技术直接探测PCR过程中荧光信号的变化，使PCR的扩增及其分析过程均在同一封闭系统下完成，只需加样时打开一次PCR反应管，具有特异性强、假阳性低、灵敏度高(是常规PCR的100倍以上)、操作简单、交叉污染和污染环境的机会少(不需要EB 染色)等优点，而且整个反应可在30min左右完成。多重荧光PCR是在同一反应体系中加入多个引物对和探针，同时检测多个目的基因的方法，该方法可以方便的进行一管多检，从而达到省时省力的目的。在同时检测多个毒株(如鸡毒支原体强弱毒通用和弱毒专用)时， 前景广阔。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测鸡毒支原体的多重荧光PCR的引物组。本发明提供的引物组，由引物I、引物2、引物3和引物4组成；所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列I、序列2、序列4和序列5。本发明的另一个目的是提供一种检测鸡毒支原体的多重荧光PCR的试剂A。本发明提供的试剂A，由上述的引物组、探针A和探针B组成；所述探针A的核苷酸序列为序列表中的序列3，且所述探针A的5’端标记有报告荧光染料A，3’端标记有淬灭荧光染料；所述探针B的核苷酸序列为序列表中的序列6，且所述探针B的5’端标记有报告荧光染料B，3’端标记有淬灭荧光染料。在上述试剂A中，所述报告荧光染料A为R0X，所述报告荧光染料B为FAM ;所述淬灭突光染料为Eclipse ;所述试剂A中所述引物I、所述引物2、所述探针A、所述引物3、所述引物4和所述探针B的摩尔比为1-3 1-3 1-3 1-3 1-3 1_3，所述引物I、所述引物2、所述探针A、所述引物3、所述引物4和所述探针B的摩尔比具体为I : I : I : 2 : 2 : 2。上述各引物和各探针可独立包装。本发明的第三个目的是提供一种检测鸡毒支原体的多重荧光PCR试剂B。本发明提供的试剂B，由上述的试剂A、多重荧光PCR缓冲液、MgCl2、dNTP和DNA聚合酶组成；所述引物I、所述引物2、所述探针A、所述引物3、所述引物4和所述探针B在所述扩增试剂B中的终浓度均具体为O. 2uM-0. 8uM。所述引物I在所述PCR试剂B中的终浓度进一步具体为O. 2uM ；所述引物2在所述PCR试剂B中的终浓度进一步具体为O. 2uM ；所述探针A在所述PCR试剂B中的终浓度进一步具体为O. 2uM ；所述引物3在所述PCR试剂B中的终浓度进一步具体为O. 4uM ；所述引物4在所述PCR试剂B中的终浓度进一步具体为O. 4uM ；所述探针B在所述PCR试剂B中的终浓度进一步具体为O. 4uM。本发明的第四个目的是提供一种检测鸡毒支原体的多重荧光PCR试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括上述的引物组或上述的试剂A或上述PCR试剂B。上述的引物组或上述的试剂A或上述PCR试剂B或上述试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸡毒支原体产品中的应用也是本发明保护的范围。上述的引物组或上述的试剂A或上述PCR试剂B或上述试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸡毒支原体强毒株或鸡毒支原体弱毒株产品中的应用也是本发明保护的范围。上述检测和/或辅助检测为用上述的引物组或上述的试剂A或上述PCR试剂B或上述试剂盒对所述待测样品进行多重荧光PCR反应。本发明的目的通过以下技术方案实现针对鸡毒支原体强、弱毒株的基因保守序列和弱毒株的基因保守序列，分别设计了 PCR引物和荧光TaqMan探针。在常规PCR的基础上添加了一条标记了两个荧光染料基团的核苷酸探针，报告荧光染料在探针的5’端，淬灭荧光染料标记在探针的3’端，二者构成能量转移结构。当探针完整时，报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭荧光染料吸收，在荧光PCR反应的退火过程中，探针优先结合到DNA模板上，当引物延伸到探针结合位置时，在DNA聚合酶5’端到3’端的外切酶的作用下，探针被水解，从而导致报告荧光基团和淬灭荧光基团距离变远，报告荧光信号得以释放出来而被仪器检测到，从而实现对鸡毒支原体强弱毒通用、弱毒专用序列的检测，并根据试验结果判定鸡毒支原体感染，同时鉴别强毒株和弱毒株感染。本发明的实验证明，一方面，本发明的试剂及检测方法充分利用了 PCR技术的高扩增性、良好的特异性和荧光检测技术的快速敏感性，反应结束即时便可根据扩增曲线判定是否为鸡毒支原体感染，并进一步确定强毒或弱毒感染；另一方方面，将针对鸡毒支原体强弱毒通用和弱毒专用设计的引物对和探针组装到一个荧光PCR体系中进行多重荧光PCR 检测，且相互间没有干扰，进一步提高了检测的敏感性和特异性。
图I为MG强弱毒通用荧光PCR的特异性试验(R0X通道)图2为MG弱毒荧光PCR的特异性试验(FAM通道)图3为MG强弱毒通用荧光PCR的敏感性试验(R0X通道)图4为MG弱毒荧光PCR的敏感性试验(FAM通道)图5为MG强、弱毒通用常规PCR敏感性试验图6为MG弱毒常规PCR敏感性试验图7为MG强弱毒通用荧光PCR的重复性试验(R0X通道)图8为MG弱毒荧光PCR重复性试验(FAM通道)图9为MG强弱毒通用绝对定量标准曲线图10为MG弱毒专用绝对定量标准曲线
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、引物和探针的设计及试剂盒的制备I、引物和探针的设计根据基因库中鸡毒支原体的序列，进行比对，确定强弱毒通用的基因保守区域(genbank CP001872的第335524-335633位核苷酸)和弱毒专用的基因保守区域 (genbank CP001873 的第 603585-603714 位核苷酸)，采用 Primer Express3. O 软件设计引物对及探针，引物序列为MG 强弱毒通用正向引物(MGl) :5’ -TTGCTAACCGCAAGGAAGC-3’(序列 I)MG 强弱毒通用反向引物(MG2) :5’ -CTCCATAGAAAGGAGGTAATCCA-3’(序列 2)MG强弱毒通用TaqMan探针(MG3)5’-CCGGTGATTGGAGTTAAGTCGTAACAAG-3’(序列 3)MG强弱毒通用TaqMan探针MG3的5 ’端标记有报告荧光染料R0X，3 ’端标记有淬灭荧光染料Eclipse ；特异性地针对弱毒株基因保守序列的引物和TaqMan探针的核苷酸序列为MG 弱毒专用正向引物(MG4) :5’ -GTTGGTGATGAATTGGTTGATCT-3’(序列 4)
MG 弱毒专用反向引物(MG5) :5’ -GTAAACATCTCTGGGCGAATCT-3’(序列 5)MG 弱毒专用 TaqMan 探针(MG6)5’ -ACGGGAAGAAACGGTTATGATCCTAATTG-3’ (序列 6)MG弱毒通用TaqMan探针MG6的5 ’端标记有报告荧光染料FAM，3 ’端标记有淬灭荧光染料Eclipse。FAM在530nm激发光下发突光,用来检测含有的鸡毒支原体为弱毒或强毒；ROX在610nm激发光下发突光,用来检测是否含有鸡毒支原体；2、鸡毒支原体多重荧光PCR检测试剂盒的配制将引物对和探针采用灭菌双蒸水进行溶解，上下游引物和探针的浓度均为20uM。反应液(反应体系)组成为MG强弱毒通用正向引物(MGl)、MG强弱毒通用反向引物(MG2)、MG强弱毒通用TaqMan探针(MG3)、MG弱毒专用正向引物(MG4)、MG弱毒专用反向引物(MG5)、MG弱毒专用TaqMan探针(MG6)、PCR缓冲液(大连宝生物工程有限公司，产品目录号为DRR390S)、MgCl2、dNTP和Taq聚合酶；MG1、MG2、MG4和MG5在反应液中的终浓度分别为O. 2uM、0. 2uM、0. 4uM、0. 4uM ;探针MG3和MG6在反应液中的终浓度分别为O. 2uM、
O.4uM ；MgCl2在反应液中的终浓度为O. 25mM ;每一种dNTP在反应液中的终浓度为50uM ； Taq聚合酶在反应液中的终浓度为O. 025U/UL。试剂盒中包含上述独立包装的MG强弱毒通用正向引物(MGl)、MG强弱毒通用反向引物(MG2)、MG强弱毒通用TaqMan探针(MG3)、MG弱毒专用正向引物(MG4)、MG弱毒专用反向引物(MG5)、MG弱毒专用TaqMan探针(MG6)或者直接包含上述反应液。实施例2、引物及其试剂盒在多重荧光PCR检测鸡毒支原体强、弱毒株中的应用MG 的 4 个强毒株(S6、A5969、K-2221 (383T)、K-1501-S)和 MG 的 2 个弱毒株 (F2F10、K810)记载在如下参考文献I中；MG弱毒疫苗株(MG-F-vaccine)和鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)由中国兽药监察所提供；MG弱毒疫苗(MG-F-vaccine-Guangdeng)由广东永顺生物工程有限公司提供；鸡滑液支原体(MS-K1415)、火鸡支原体(MM-TACC)、衣阿华支原体(MI-I695)、新城疫病毒(NDV-Laseta)和鸡传染性支气管炎病毒(IBV Mass 41)记载在如下参考文献2 中；禽沙门氏菌(C7913)记载在如下参考文献3中；禽流感病毒(AIV H9)记载在如下参考文献4中。参考文献[l]HanWang, A. A. Fadl, Μ. I. Khan. Multiplex PCR fer avian pathogenic mycoplasmas[J]. Molecular and Cellular Probes, (1997) 11,211-216. [2] 谢芝勋，邓显文，谢志勤，等.多重聚合酶链反应快速检测鉴别鸡毒支原体强毒株和弱毒疫苗株的研究[J]·中国预防兽医学报，2003，25(6) =476-479. [3]谢芝勋，谢志勤，庞耀珊， 等.采用二温式聚合酶链反应扩增鸡喉气管炎病毒TK基因的研究[J].中国兽医科技， 2000，30 (9) 5-7. [4]彭宜，谢芝勋，刘加波，等.H9亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立[J].中国人兽共患病学报，19-28. I、引物在多重荧光PCR检测中的特异性分别提取 MG 的 4 个强毒株(S6、A5969、K-2221 (383T)和 K-1501-S)、MG 的 4 个弱毒株(K810、F2F10、F-vaccine、F-vaccine-Guangdong)的 DNA、滑液囊支原体(MS-K1415)的DNA、火鸡支原体(MM-TACC)的DNA、衣阿华支原体(MI-I695)的DNA、新城疫病毒 (NDV-Lasota)的RNA、禽流感病毒(AIV H9)的RNA、鸡传染性支气管炎病毒(IBV Mass41) 的RNA、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的RNA和沙门氏菌(C7913)的DNA。将上述新城疫病毒(NDV-Lasota)的RNA、禽流感病毒(AIV H9)的RNA、鸡传染性支气管炎病毒(IBV Mass41)的RNA和鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的RNA分别反转录， 得到新城疫病毒(NDV-Lasota)的cDNA、禽流感病毒(AIV H9)的cDNA、鸡传染性支气管炎病毒(IBV Mass41)的cDNA和鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的cDNA。以上述的DNA/cDNA为模板，在装有24uL上述反应液样品管中分别加入IuL模板构成25uL反应体系，另设两管强弱毒混合感染的样品管，一管如下在装有24uL上述反应液样品管中加入 O. 5uLMG S6 的 DNA 和 O. 5uLMG F-vaccine 的 DNA，即 MGS6+F_vaccine ； 另一管如下在装有24uL上述反应液样品管中加入O. 5uLMG A5969的DNA和O. 5uLMG F-vaccine-Guangdong 的 DNA ,即 MGA5969+F-vaccine_Guangdong。将上述各样品管放入Roche公司LightCycler 2. OPCR仪后，设置如下条件进行反应94°C预变性30s ;然后采用三步法进行反应94°C变性5s，60°C退火20s，72°C延伸8s， 50个循环，每个循环结束后采集荧光信号。反应结束后根据扩增曲线判定结果。ROX通道(在610nm激发光下)的检测结果见图1，为强弱毒通用荧光PCR试验扩增曲线，图中 I 为 MG-S6、2 为 MG-A5969、3 为 MG-K-2221 (383T)、4 为 MG-K-1501-S, 5 为 MG S6+F_vaccine、6 为 MG A5969+F-vaccine_Guangdong、7 为 MG-F_vaccine、8 为 MG-F-vaccine-Guangdong、9 为 MG-K810、10 为 MG-F2F10、11-19 依次为 MS、MM、MI、NDV、AIV、 IBV、ILTV、C7913、阴性对照(水)，可以看出，对MG的4个强毒株(S6、A5969、Κ-2221 (383T) 和 K-1501-S)、MG 的 2 个混合毒株(MG S6+F_vaccine、MGA5969+F-vaccine_Guangdong)、 MG 的 4 个弱毒株(K810、F2F10、F-vaccine、F-vaccine-Guangdong)的检测均为阳性(明显S型曲线)，而对常见禽类病原体]\^-1(1415、丽-了40、]\0-1695、冊￥-1^80丨3、41￥ H9、IBV Mass、ILTV、C7913的检测结果均为阴性。FAM通道(在530nm激发光下)的结果见图2，为弱毒专用荧光PCR试验扩增曲线，图中 I 为 MG-S6、2 为 MG-A5969、3 为 MG-K-2221 (383T)、4 为 MG-K-1501-S、 5 为 MG S6+F_vaccine、6 为 MG A5969+F-vaccine_Guangdong、7 为 MG-F_vaccine、8 为 MG-F-vaccine-Guangdong、9 为 MG_K810、10 为 MG-F2F10、11-19 依次为 MS_K1415、MM_TACC、 MI-1695、NDV Lasota, AIV H9、IBV Mass 41、ILTV、C7913、阴性对照(水)，可以看出，对 MG 的 4 个弱毒株(K810、F2F10、F-vaccine, F-vaccine-Guangdong)、2 个混合毒株(MG S6+F_vaccine、MG A5969+F-vaccine_Guangdong)的检测均为阳性(明显 S 型曲线),而对 MG 的 4 个强毒株(S6、A5969、Κ-2221 (383T)和 K-1501-S)和常见禽类病原体 MS-K1415、 MM-TACC、MI-I695、NDV-Lasota、AIV H9、IBV Mass、ILTV、C7913 的检测结果均为阴性。说明该引物及方法特异性高。因此，多重荧光PCR反应结果的判断如下反应结果为一条直线，则为阴性；反应结果为S型曲线，则为阳性；若ROX通道(在610nm激发光下)的反应结果为S型曲线，则待测样本中含有鸡毒支原体；反之，则样品中不含有鸡毒支原体；若ROX通道(在610nm激发光下)的反应结果为S型曲线，且FAM通道(在530nm
7激发光下)的反应结果为S型曲线，则样品中含有鸡毒支原体弱毒；若ROX通道(在610nm激发光下)的反应结果为S型曲线，而FAM通道(在530nm 激发光下)的反应结果为直线，则说明样品中含有鸡毒支原体强毒。上述标准可用于检测待测样本。2、引物在LAMP检测中的敏感性试验I)、以上述获得的MG S6的DNA为模板，使用上游引物 5，-ATGAGAGCTGGTAATATCTA-3 ’和下游引物 5' -AATAGAATCCGACCAACAAT 作为引物对，扩增得到263bp的目的片段I;以上述获得的MG F-vaccine的DNA为模板，使用上游引物 5’ -CTGITTGCTAAAGAACAAGTTGATC-3’ 和下游引物 5’ -CTCTAGATGAGGTGATGAAGGGTTA-3’ 作为引物对，扩增得到525bp的目的片段2 ；PCR产物切胶回收；2)、构建重组质粒，将目的片段I和目的片段2分别与PMD18-T Vector连接，连接后转化DH5 α感受态大肠杆菌细胞，扩大培养，提取质粒I和质粒2。经过测序，质粒I为将263bp的目的片段l(genbank CP001872的第 335496-335758位核苷酸)插入PMD18-T Vector,命名为强毒MG S6质粒，浓度为 I. 69 X 1010copies/ul ；质粒2 为将 525bp 的目的片段 2 (genbank CP001873 的第 603251-603775 位核苷酸)插入 PMD18-T Vector，命名为弱毒 MG F-vaccine 质粒，浓度为 2. 19 X 101Qcopies/ul ；3)、将上述得到的强毒MG S6质粒按10倍递减稀释成ΙΟ6、ΙΟ5、ΙΟ4、ΙΟ3、102、IO1和 10° ;将上述得到的弱毒MG F-vaccine质粒按10倍递减稀释成Io6UO5UO4UO3UO2UO1和 IO0o然后按照上述I反应体系和反应条件进行荧光PCR反应。ROX通道(在610nm激发光下)的检测结果如图3所示，为MG强弱毒通用荧光PCR 的敏感性试验，图中1-7分别为强毒MG S6质粒106、105、104、IO3UO2UO1和10°稀释，8为阴性对照，可以看出，1-6为阳性，说明鸡毒支原体强弱毒通用荧光PCR检测方法的检测限为101。图9为强弱毒通用绝对定量标准曲线。FAM通道(在530nm激发光下)的检测结果如图4所示，MG弱毒荧光PCR的敏感性试验，图中1-7分别为弱毒MG F-vaccine质粒ΙΟ6、ΙΟ5、ΙΟ4、ΙΟ3、102、IO1和10°稀释，8为阴性对照，可以看出，1-6为阳性，说明鸡毒支原体弱毒专用荧光PCR检测方法的检测限为 IO10图10为弱毒专用绝对定量标准曲线。将鸡毒支原体强、弱毒检测和弱毒检测用常规PCR方法，具体如下鸡毒支原体强弱毒通用常规PCR反应组成如下在25uL的反应体系中含有2XPCR预混液(天根生化科技有限公司，产品目录号KT201-01)12. 5uL，上游引物 5’ -ATGAGAGCTGGTAATATCTA-3’ 和下游引物 5' -AATAGAATCCGACCAACAAT-3’ 各 luL，分别取 IuL按照上述的方法稀释的强毒MG S6质粒作为模板，双蒸水9. 5uL。扩增程序为94°C 5min 预变性；94°C变性lmin，50°C退火lmin，72°C延伸lmin，共35个循环；最后经72°C延伸 8min，结果如图5所示，图中1-7分别为强毒MG S6质粒ΙΟ6、ΙΟ5、ΙΟ4、ΙΟ3、102、IO1和10°，得到263bp (genbank CP001872的第335496-335758位核苷酸))的为鸡毒支原体，可以看出常规PCR的检测鸡毒支原体强弱毒的检测限为105。鸡毒支原体弱毒专用常规PCR反应组成如下在25uL的反应体系中含有 2XPCR预混液12. 5uL(天根生化科技有限公司，产品目录号KT201_01)，上游引物 5' -CTGTTTGCTAAAGAACAAGTTGATC-3'和下游引物 5' -CTCTAGATGAGGTGATGAAGGGTTA-3' 各IuL,弱毒MG F-vaccine质粒模板IuL (按照上述的方法稀释)，双蒸水9. 5uL。扩增程序为940C 5min预变性；94°C变性lmin，50°C退火lmin，72°C延伸lmin，共35个循环；最后经72°C延伸8min，结果如图6所示，图中1-7分别为弱毒MG F-vaccine质粒IO6UO5UO4, 103、IO2UO1 和 10°，得到 525bp (genbank CP001873 的第 603251-603775 位核苷酸)的为鸡毒支原体弱毒，可以看出常规PCR的检测鸡毒支原体弱毒的检测限为104。从上述看出，鸡毒支原体强弱毒通用和弱毒专用荧光PCR检测方法的检测限为 IO1和101，而常规PCR的检测限分别为IO5和104，可见，荧光PCR方法敏感性比常规PCR高 10000 和 1000 倍。3、重复性试验按照上述I反应体系和反应条件取上述2得到的强毒MG S6质粒拷贝数为IO5作 5个重复性试验，荧光PCR检测结果见图7 (R0X通道，在610nm激发光下)，图中1_5为MG S6105的5个重复；6为阴性对照，可以看出，鉴别鸡毒支原体强、弱毒株的多重荧光PCR重复性良好。按照上述I反应体系和反应条件取上述2得到的弱毒MG F-vaccine质粒IO5稀释作5个重复性试验，荧光PCR检测结果见图8 (FAM通道，在530nm激发光下)，图中1_5为 MG F-vaccine IO5的5个重复；6为阴性对照，可以看出，鉴别鸡毒支原体弱毒株的多重荧光PCR重复性良好。
权利要求
1.检测鸡毒支原体的多重荧光PCR的引物组，由引物I、引物2、引物3和引物4组成； 所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列I、序列2、序列4和序列5。
2.检测鸡毒支原体的多重荧光PCR的试剂A，由权利要求I所述的引物组、探针A和探针B组成；所述探针A的核苷酸序列为序列表中的序列3，且所述探针A的5’端标记有报告荧光染料A，3’端标记有淬灭荧光染料；所述探针B的核苷酸序列为序列表中的序列6，且所述探针B的5’端标记有报告荧光染料B，3’端标记有淬灭荧光染料。
3.根据权利要求2所述的试剂A，其特征在于所述报告荧光染料A为R0X，所述报告荧光染料B为FAM ;所述淬灭荧光染料为Eclipse ；所述试剂A中所述引物I、所述引物2、所述探针A、所述引物3、所述引物4和所述探针 B的摩尔比为1-3 1-3 1-3 1-3 1-3 1_3，所述引物I、所述引物2、所述探针A、 所述引物3、所述引物4和所述探针B的摩尔比具体为I : I : I : 2 : 2 : 2。
4.检测鸡毒支原体的多重荧光PCR试剂B，由权利要求2或3所述的试剂A、多重荧光 PCR缓冲液、MgCl2, dNTP、DNA聚合酶和水组成；所述引物I、所述引物2、所述探针A、所述引物3、所述引物4和所述探针B在所述扩增试剂B中的终浓度均具体为O. 2uM-0. 8uM。所述引物I在所述PCR试剂B中的终浓度进一步具体为O. 2uM 所述引物2在所述PCR试剂B中的终浓度进一步具体为O. 2uM 所述探针A在所述PCR试剂B中的终浓度进一步具体为O. 2uM 所述引物3在所述PCR试剂B中的终浓度进一步具体为O. 4uM 所述引物4在所述PCR试剂B中的终浓度进一步具体为O. 4uM 所述探针B在所述PCR试剂B中的终浓度进一步具体为O. 4uM。
5.检测鸡毒支原体的多重荧光PCR试剂盒，包括权利要求I所述的引物组或权利要求 2或3所述的试剂A或权利要求4所述PCR试剂B。
6.权利要求I所述的引物组或权利要求2或3所述的试剂A或权利要求4所述PCR试剂B或权利要求5所述试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸡毒支原体产品中的应用。
7.权利要求I所述的引物组或权利要求2或3所述的试剂A或权利要求4所述PCR试剂B或权利要求5所述试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸡毒支原体强毒株或鸡毒支原体弱毒株产品中的应用。
8.根据权利要求6或7所述应用，其特征在于所述检测和/或辅助检测为用权利要求I所述的引物组或权利要求2或3所述的试剂A或权利要求4所述PCR试剂B或权利要求5所述试剂盒对所述待测样品进行多重荧光PCR反应。
全文摘要
本发明公开了一种鉴别鸡毒支原体强弱毒株的多重荧光PCR检测试剂盒。本发明提供的引物组，由引物1、引物2、引物3和引物4组成；所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、序列2、序列4和序列5。本发明的实验证明，一方面，本发明的试剂及检测方法充分利用了PCR技术的高扩增性、良好的特异性和荧光检测技术的快速敏感性；另一方方面，将针对鸡毒支原体强弱毒通用和弱毒专用设计的引物对和探针组装到一个荧光PCR体系中进行多重荧光PCR检测，且相互间没有干扰，进一步提高了检测的敏感性和特异性。
文档编号C12Q1/68GK102605072SQ20121007543
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月21日 优先权日2012年3月21日
发明者刘加波, 庞耀珊, 罗思思, 范晴, 谢丽基, 谢志勤, 谢芝勋, 邓显文 申请人:广西壮族自治区兽医研究所