专利名称：诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液及诱导方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用新型植物诱导剂Conophylline与尼克酰胺联合高效诱导人脂肪干细胞分化为功能性胰岛样细胞团的培养液及诱导方法和用途。
背景技术：
一型糖尿病又称为胰岛素依赖型糖尿病，是原发性T细胞介导的自身免疫疾病，最终导致β细胞大量破坏，胰岛素分泌不足，血糖浓度调节失衡，严重危害人类健康。胰岛移植是治疗糖尿病的最有效方式，但供体细胞严重不足，需寻找新的胰岛移植替代物。间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的细胞，它能够定向诱导为胰岛样细胞、软骨细胞等多种细胞。且间充质细胞存在于人体多种组织中，尤其是脐带、胎盘、脂肪组织来源的间充质干细胞，具有来源广泛、易于采集、无伦理问题等优势，可规模化诱导分化为胰岛样细胞，为临床治疗糖尿病提供新的技术方案。尼克酰胺是ADP核糖合成酶抑制剂，能促进人胎儿胰腺的分化，并在长期高糖环境中保持胰岛细胞对葡萄糖刺激的正常反应，因而被广泛用于胰岛素分泌细胞的诱导分化环境构成成分。Conophylline具有诱导胰腺前体细胞模型-AR42J细胞体外分化为胰岛素分泌细胞的能力，并且和Activin-A相比，Conophylline分子量小，易于渗透,不会诱导细胞的凋亡，被认为是一种神奇的植物诱导剂。已有文献报道Conophylline诱导骨髓间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的效率比Activin-A更高。目前将间充质干细胞诱导分化为胰岛样细胞团多采用贴壁诱导的方式。因间充质干细胞有较强的贴壁性，在诱导过程中阻碍了细胞聚集成团，因此诱导率普遍较低。二部法或者三步法，诱导因子使用较多，诱导周期一般为14-21天，诱导周期长、残留因子种类繁多，增加了临床应用的风险。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液及诱导方法和用途。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液，包括尼克酰胺、Conophylline、细胞生长因子、细胞调节素和基础
培养基。每升基础培养基中含有尼克酰胺5-1 Ommo I
Conophylline 80-100 μ g 细胞生长因子 80-100pmol
细胞调节素 6-10 μ g。所述细胞生长因子为HGF、bFGF或EGF。所述细胞调节素为Betacellulin。所述基础培养基含有97%的高糖DMEM、2%的B-27、I %的N-2，所述浓度为体积比浓度。一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的方法，包括以下步骤(I)配制诱导培养液以高糖DMEM为基础培养基，添加2%的B_27、l%的N-2和诱导剂尼克酰胺、Conophylline、HGF、Betacellulin,混勻,4度保存,所述浓度为体积比浓度；(2)制备人间充质干细胞；(3)取人间充质干细胞，以I. 5-2X105cellS/孔接种于6孔超低吸附培养板中，每孔添加3ml诱导培养基，悬浮诱导；(4)每3天换液，于9天时收集细胞上清液，-20度保存。含有诱导剂尼克酰胺和Conophylline的培养液在诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化中的应用。本发明的有益效果是利用尼克酰胺与Conophylline联合诱导人间充质干细胞向胰岛样细胞团分化，缩短诱导周期，使悬浮细胞利于成团，形成类似天然胰岛的细胞团，显著提高诱导分化效率；显著减少细胞因子使用种类，降低临床应用风险；显著提高诱导细胞胰岛素分泌功能。克服了现有诱导剂及诱导方法中细胞不易聚集成团、诱导周期长、效率低、所得细胞数量少、功能差、细胞易凋亡等缺点。
图IA是hADSCs原代培养过程中形态变化(40X)。图IB 是 hADSCs 传代培养(P6) (4 X)。图IC是hADSCs生长曲线。图2hADSCs表面特异性蛋白检测。图3诱导后的脂肪细胞、成骨细胞鉴定(A，B 40X ；C 4X ；D :10X)。图4hADSCs分化与胰岛样细胞团的形成(10 X)。图5Insulin、c-peptide 免疫细胞化学分析(40 X)。图6胰岛细胞分化过程中相关基因的表达。图7葡萄糖刺激下胰岛素的分泌水平(P < 0. 001)。图8诱导9天后不同诱导组胰岛素分泌量(P < 0 . 05vs (NIC+CNP))。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细说明
本发明诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液，包括尼克酰胺、Conophy 11 ine、细胞生长因子、细胞调节素和基础培养基。每升基础培养基中含有
尼克酰胺5-1 Ommo I
Conophylline 80-100 μ g 细胞生长因子 80-100pmol
细胞调节素 6-10 μ g。所述细胞生长因子为HGF、bFGF或EGF。所述细胞调节素为Betacellulin。所述基础培养基含有97%的高糖DMEM、2%的B_27、I %的N_2，所述浓度为体积比浓度。一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的方法，包括以下步骤(I)配制诱导培养液以高糖DMEM为基础培养基，添加2%的B_27、l%的N-2和诱导剂尼克酰胺、Conophylline、HGF、Betacellulin,混勻,4度保存,所述浓度为体积比浓度；(2)制备人间充质干细胞；(3)取人间充质干细胞，以I. 5-2X105cellS/孔接种于6孔超低吸附培养板中，每孔添加3ml诱导培养基，悬浮诱导；(4)每3天换液，于9天时收集细胞上清液，-20度保存。含有诱导剂尼克酰胺和Conophylline的培养液在诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化中的应用。本发明进行一步法悬浮诱导，采用新型植物诱导剂Conophylline与尼克酰胺联合诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化。实施例脂肪间充质干细胞的制备I. I脂肪间充质干细胞的制备无菌条件下取临床手术或美容整形的副产品一脂肪组织，生物安全柜中将脂肪组织在PBS中清洗2-3次，彻底去除红细胞与组织碎片。然后加入预热的0. 1% I型胶原酶溶液，置37°C水浴震荡消化lh。300g离心5min，去除上层脂肪细胞与胶原酶溶液。用PBS+1% BSA清洗底层团状沉淀，300g离心5min，加入适量含10% FBS的DMEM重悬细胞，经100 μ m细胞筛过滤，调整细胞密度接种至细胞培养瓶，于37°C、5% CO2培养箱中培养。48h后换液，去除未贴壁细胞及残留的红细胞。此后每3天换液。当细胞达到80%融合时，用
0.25%的Trypsin-EDTA消化贴壁细胞，按I : 2进行传代，倒置显微镜下观察细胞生长及形态变化特征。结果显示，原代hADSCs培 养24h后可见圆形贴壁细胞，48h细胞呈现长梭形，多角形，72h细胞数量明显增加，排列密集(图1A)。传代细胞(P6)增殖速度较快，于第3天开始数量明显增多，约6-7天细胞长满培养瓶底，呈斡旋状排列(图1B)。采用Alamar Blue法测定hADSCs生长曲线，取P3，P4，P5代对数生长期细胞，胰酶-EDTA消化计数，调整单细胞悬液浓度为104cells/ml，接种于24孔板，每孔1ml，分为8组，每组三个复孔，根据还原量公式还原量％= 117216 X (Τ570)-80586Χ (Τ600)/155677XC600)-14652X (C570)绘制生长曲线，计算群体倍增时间。结果显示，P3、P4、P5代细胞生长曲线均呈S型，1-3天细胞处于生长休眠期，接种4-5天后细胞进入对数增殖期，约7天细胞到达平台期，群体倍增时间为60h(图1C)。1. 2脂肪间充质干细胞的鉴定1. 2. 1流式细胞分析将Pl代脂肪干细胞经Trypsin-EDTA消化后，调整细胞浓度为106Cells/ml，与FITC和PE标记的抗体冰上避光孵育30min，用含2. 5% FBS的PBS重悬细胞，流式细胞术分析其表面特异性抗原 CD29-PE、CD44-FITC、CD31-PE、CD34-PE、CD45-FITC、CD49d_PE、⑶106-FITC、⑶105-PE及HLA-DR-FITC的表达情况。流式细胞仪检测结果显示，人脂肪干细胞表型呈 CD44+，CD105+，CD29+，CD49d+，CD106、CD3T, CD34、CD45、HLA-DR-(图 2)。
1.2. 2hADSCs多向分化能力取P4代hADSCs培养于成脂诱导培养基和成骨诱导培养基中，观察其形态变化，并对诱导分化后的细胞分别进行油红O染色与茜素红染色。成脂诱导过程中细胞形态发生明显变化，细胞由长梭形逐渐变圆。2-3天倒置显微镜下可见胞内出现圆形脂滴，随诱导天数增加脂滴数量不断增多，诱导14天后，80%细胞内充满脂滴，细胞核被挤向边缘，油红O染色阳性(图3A)。免疫细胞化学实验表明诱导后的细胞表达脂肪细胞的特异性蛋白Leptin (图3C)，经RT-PCR分析，诱导后细胞表达LPL、AP2基因，而hADSCs中AP2有微弱表达，经成脂诱导后基因表达上调(图3E)。更换成骨诱导培养基后，细胞生长快速，呈现鳞片状，并且连接成片，形成集落，随后细胞呈多层生长，钙盐沉积增加，约21天后镜下可观察到钙结节，茜素红染色阳性(图3B)。免疫细胞化学结果显示诱导后的细胞表达Osteopontin蛋白(图3D)，PT-PCR检测成骨细胞特异性基因AKP、Osteopontin、Osteonectin,诱导后细胞均有表达,而未诱导的hADSCs不表达上述基因(图3F)。2、体外诱导脂肪间充质干细胞向胰岛样细胞分化2. I体外诱导hADSCs分化为胰岛样细胞团采用一步法悬浮诱导，将P5代hADSCs以I. 5-2X IO5ceIls/孔接种于6孔超低吸附培养板，培养液成分97 %高糖DMEM培养基，2 % B-27,1 % N-2,5-10mM 尼克酰胺，80-100 μ g/LConophylline，2nM Activin-A,6-10 μ g/L Betacellulin, 80-100pM HGF，按下列分组进行诱导(I) NIC+BTC+HGF (2)NIC+CNP+BTC+HGF(3)CNP+BTC+HGF(4)Activin-A+BTC+HGF(5)NIC+Activin-A+BTC+HGF,每 3天换液，诱导9天。所述浓度为体积比浓度。2. 2诱导分化后胰岛样细胞的鉴定2. 2. I双硫腙染色反应取诱导9天后的胰岛样细胞团进行双硫腙染色，观察细胞着色情况。结果显示诱导组细胞形态与对照组相比发生明显变化。铺板后细胞呈单个细胞悬浮生长，整个诱导过程中，细胞不断聚集形成细胞团，诱导9天后细胞团边缘渐光滑，直径50 150 μ m,类似于天然胰岛，双硫腙染色呈现砖红色(图4)。2. 2. 2免疫细胞化学检测将胰岛样细胞团转移至包被有多聚赖氨酸的盖玻片培养过夜，使细胞团贴壁。4%多聚甲醒室温下固定30min, PBS清洗后加入O. 5% Triton X-100穿透15min。用4% PBS-BSA封闭30min(RT)，防止非特异性结合。加入一抗，4°C过夜，PBS清洗后加入二抗，37°C孵育30min。然后与5 μ g/mlDAPI 37 °C孵育15min，其中一抗鼠抗人Leptin (I : 300),兔抗人 Osteopontin (I : 200),鼠抗人 Insulin(l : 300),兔抗人C-peptide (I 500)，二抗羊抗鼠 IgG，IgM, Alexaf luor488 (I 800)，羊抗兔 IgG，Cy3(l 500)。悬浮诱导后,免疫细胞化学检测胰岛样细胞团功能蛋白Insulin、C-peptide的表达，可见细胞团内存在Insulin、C-peptide阳性细胞，表明诱导分化后已产生具有胰岛素分泌功能的细胞团(图5)。 2. 2. 3RT-PCR基因表达分析应用TRIzol试剂提取hADSCs，诱导后细胞总RNA，取I μ gRNA用反转录试剂盒合成 eDNAo PCR 反应体系如下94°C预变性 5min，94°C 30s, 55-60°C 30s, 72°C 30s，72。。延伸10min,30个循环,取PCR扩增产物,2. 5%琼脂糖凝胶电泳分析,照相并记录。RT-PCR检测胰岛细胞发育相关基因的表达，结果未分化的hADSCs表达Isl_l，Isl-I是胰岛发育过程中重要的转录调节因子，对胰岛细胞成熟、增殖和分化具有重要作用，经诱导后该基因表达量上调，而胰岛素启动因子Ipf-I仅在诱导后细胞中表达，成熟胰岛细胞的标志基因Insulin、somatostatin、glueagon均可在诱导后细胞中检测到，未分化hADSCs 中 somatostatin 有微弱表达(图 6)。2. 2. 4葡萄糖刺激胰岛素分泌实验挑取约200个诱导9天的细胞团(50-150 μ m)至I. 5ml离心管中，用PBS清洗2遍。加入Iml无糖DMEM预培养3_6h,然后以300ul含5. 6mmol/L葡萄糖、16. 7mmol/L葡萄糖的DMEM依次培养2h，37度。收集上清液，用ELISA法检测上清中不同浓度葡萄糖刺激下胰岛素的分泌量，对照组细胞上清中几乎检测不到胰岛素，未在图中反映，而经诱导后的细胞团在5. 56mmol/L葡萄糖刺激下有少量分泌，经25mmol/L葡萄糖孵育2h后胰岛素分泌量明显升高(P<0. 001)，约为低糖条件下2. 5倍，由结果可知，诱导后胰岛样细胞团对葡萄糖刺激敏感，其胰岛素的分泌受外环境糖的调节(图7)。诱导9天后，收集5组细胞上清液，用ELISA法检测上清中胰岛素的分泌量，结果显示NIC、CNP、ACT单独使用及NIC与ACT联合诱导时胰岛素分泌量没有明显差异(P >
0.05),而尼克酰胺与Conophylline联合诱导显著提高了向胰岛样细胞团分化的能力(P< 0. 05)(图 8)综上所述，而本方法首次在人脂肪干细胞向胰岛样细胞诱导中使用了Conophylline,并且观察了 Conophylline与尼克酰胺联合诱导对分化效率的促进作用，结果表明，细胞在诱导9天后胰岛素的分泌量达到峰值，缩短了诱导周期，提高了诱导分化效率，是一种更有效的诱导人脂肪干细胞向胰岛样细胞分化的方法。本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。
权利要求
1.一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液，其特征在于，包括尼克酰胺、Conophylline、细胞生长因子、细胞调节素和基础培养基。
2.根据权利要求I所述的诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液，其特征在于，每升基础培养基中含有尼克酰胺5-1 Ommo IConophylline 80-100 μ g细胞生长因子 80-100pmol细胞调节素 6-10 μ g。
3.根据权利要求I或2所述的诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液，其特征在于，所述细胞生长因子为HGF、bFGF或EGF。
4.根据权利要求I或2所述的诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液，其特征在于，所述细胞调节素为Betacellulin。
5.根据权利要求2所述的诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液，其特征在于，所述基础培养基含有97%的高糖DMEM、2%的B-27、I %的N-2，所述浓度为体积比浓度。
6.一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)配制诱导培养液以高糖DMEM为基础培养基，添加2%的B-27、l%的N-2和诱导剂尼克酰胺、Conophylline、HGF、Betacellulin,混勻,4度保存,所述浓度为体积比浓度； (2)制备人间充质干细胞； (3)取人间充质干细胞，以I.5-2X105cellS/孔接种于6孔超低吸附培养板中，每孔添加3ml诱导培养基，悬浮诱导； (4)每3天换液，于9天时收集细胞上清液，-20度保存。
7.一种含有诱导剂尼克酰胺和Conophylline的培养液在诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种诱导间充质干细胞向胰岛样细胞分化的培养液及诱导方法和用途，包括尼克酰胺、Conophylline、细胞生长因子、细胞调节素和基础培养基。基础培养基含有97％的高糖DMEM、2％的B-27、1％的N-2。诱导方法包括配制诱导培养液；制备人间充质干细胞；取人间充质干细胞，以1.5-2×105cells/孔接种于6孔超低吸附培养板中，每孔添加3ml诱导培养基，悬浮诱导；每3天换液，于9天时收集细胞上清液，-20度保存。本发明利用尼克酰胺与Conophylline联合诱导人间充质干细胞向胰岛样细胞团分化，缩短诱导周期，使悬浮细胞利于成团，形成类似天然胰岛的细胞团，显著提高诱导分化效率，降低临床应用风险；显著提高诱导细胞胰岛素分泌功能。
文档编号C12N5/071GK102618491SQ20121007553
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月21日 优先权日2012年3月21日
发明者杨萍, 陈晓波, 韩红起, 黄家学 申请人:协和干细胞基因工程有限公司