专利名称：诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化并稳定表达胰岛素的方法及其专用诱导液的制作方法
技术领域：
本发明涉及诱导干细胞分化的技术领域，具体涉及一种诱导人胎肝间充质 干细胞向胰岛3样细胞分化并稳定表达胰岛素的方法及其专用诱导液。
背景技术：
糖尿病已成为21世纪威胁人类生命健康的主要杀手。目前在针对糖尿病 病因病理的各种治疗措施中，服用药物和注射胰岛素是常用的方法，但是服用 药物和注射胰岛素不仅会带来沉重的经济负担，而且会引起严重的并发症； 近年来，移植胰岛治疗糖尿病初见疗效，但面临着组织来源不足和免疫排斥 反应两大难题。基因/细胞治疗越来越受到人们的关注。胰-十二指肠同源盒1 基因(PDX1)是决定胰腺分化发育和胰岛功能的主要调节基因。因此是这一 治疗最具希望的候选基因。
利用PDX1对非P细胞进行直接或间接修饰很可能是今后糖尿病基因治 疗中极具潜力的一个发展方向。PDX1基因可以在不同载体的介导下直接导入 体内，诱导非P细胞中内源性胰岛素的表达。但是以病毒为载体的介导方式在 临床应用中存在安全问题，因此迫切需要一种安全的、高效的介导方法。
其中TAT蛋白转导域是一种倍受瞩目的跨膜递送载体的方式。它不但自 身可以跨膜进入细胞，而且能把与它融合的其它超过50种的蛋白和其它外源 物质带入细胞。TAT是一种来源于人类免疫缺陷病毒HIV-1的转录激活因子，
能够有效引导肽段或者蛋白质穿透细胞膜，其分子中具有蛋白转导作用的结构 是一个富含碱性氨基酸的多肽片段，这一多肽片段称为蛋白转导结构域。其氨
基酸序列为YGRKKRRQRRR。它可以非常高效将与其融合的蛋白质转入各 种细胞及细胞核中并发挥该蛋白质的功能。通过TAT蛋白转导域技术将PDX1 蛋白导入到人胎肝间充质干细胞内，获得有功能的胰岛素产生细胞，将为糖尿 病的干细胞治疗提供一种新的种子细胞。 发明内容为了克服上述现有技术的缺点和不足，本发明的目的首先是提供一种用于
诱导人月台肝间充质干细胞(mesenchymal stem cells derived from human fetal liver, hFL-MSCs)向胰岛P样细胞分化的诱导液。本发明的另一目的是提供 一种诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛P样细胞分化并稳定表达胰岛素的方法。
本发明的目的通过以下的技术方案实现 一种诱导液，是在细胞培养液中 添加TAT-PDX1融合蛋白得到的。
所述TAT-PDX1融合蛋白可从市售渠道或通过重组蛋白纯化技术得到。
所述TAT-PDX1融合蛋白的摩尔浓度优选20 mol/L。所述细胞培养液优选 含3%~5%体积浓度胎牛血清(FCS)的DMEM/F12培养液。
一种诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛P样细胞分化并稳定表达胰岛素的 方法，包括以下步骤
(1) 分离、纯化并传代扩增人胎肝间充质干细胞；
(2) 将步骤(1)中第3代以后的人胎肝间充质干细胞，于上述的诱导液 中培养3-5天，然后加入高糖DMEM/F12培养基(市售即可，通常葡萄糖含 量一般为4500mg/L)中继续培养10天以上即得到胰岛P样细胞团。
步骤(2)中所有培养基的加入量参照常规细胞培养时培养基的加入量。 步骤(1)的优选方案是先采用分歩离心法，再用羟乙基淀粉沉降法分 离出人胎肝间充质干细胞；然后将间充质干细胞重新悬浮于完全培养基中，反 复吹打使细胞分散成单细胞悬液，然后接种培养；细胞达到70% 80%融合时， 用胰酶进行消化处理，然后按1 : 2~3比例传代培养；
(2)取步骤(1)中第3代以后的达到80% 卯％融合的人胎肝间充质干 细胞，消化、接种后，按加入所述诱导液，每8小时换诱导液一次，连续4天， 然后加入含体积分数为10。/。胎牛血清的高糖DMEM/F12培养基中继续IO天以 上即得到胰岛3样细胞团。
步骤(1)更优选的方案包括，所述的完全培养基优选含有10% FCS、 2mmol/L谷胺酰胺、20mmol/LHEPES (中文名4-羟乙基哌嗪乙磺酸英文名 4画(2勿droxyerhyl)piperazine-l-erhanesulfonic acid )的DMEM/F12培养基；所 述的接种培养的优选方案是将细胞按1.5X 106/(^2接种于25 cn^培养瓶中，在 37°C、 5% C02的培养箱中培养，培养3天后首次更换培养液，弃去未贴壁 细胞，以后每2 3天换液l次；所述用胰酶进行消化处理优选包括如下过程
5加入质量浓度为0.25%的胰酶，浸没所有细胞后倒掉胰酶，然后再加入上述胰
酶，倒去大部分，仅剩刚好覆盖细胞的胰酶，在37"C继续消化1 3分钟，
然后加入完全培养基终止消化。
步骤(2)更优选的方案包括所述消化是用质量浓度为0.25 %的胰酶消 化；所述接种是按l :2比例接种于25cn^之培养瓶，所述诱导液的加入量为 2ml每瓶(25cm2)。
本发明所述的人胎是指已死亡的离体胎儿，胎儿时期的MSCs因为增殖能 力更强，可塑性更好，且免疫原性低，无成瘤性，因而具有显著的优越性，在 体外将其初步诱导为能分泌胰岛素的胰岛P样细胞，再移植到糖尿病患者体内 进一步发育可望实现血糖水平的调节。
相对于现有技术，本发明的有益效果体现在以下几个方面
本发明提供的诱导液中添加了 TAT-PDX1融合蛋白，诱导人胎肝间充质干 细胞得到的胰岛P样细胞团能够稳定表达胰岛素，克服了现有技术加入的细胞 因子较多，胰岛素表达不稳定等不足；直接使用融合蛋白，也避免了病毒转染 方法中涉及的生物安全性问题。
图1是倒置显微镜下所见未诱导的hFL-MSCs形态图。
图2是倒置显微镜下所见诱导10天后的胰岛P样细胞团的形态图。
图3是诱导后所得的胰岛P样细胞团双硫腙染色阳性表达图。
图4是诱导后所得的胰岛e样细胞团的胰岛素/C-肽阳性表达图(细胞爬
片)；其中图a是C-肽阳性表达图；图b是胰岛素的阳性表达图；图C为细胞
核染色；图d为图a、图b与图c的合图。
图5是RT-PCR鉴定诱导的胰岛3样细胞团胰岛相关基因表达的电泳图。 图6是培养中的胰岛P样细胞团释放的胰岛素累积分泌量的变化图 图7是葡萄糖刺激后的胰岛P样细胞团释放的胰岛素的变化图。 图8是肾包膜下细胞移植对糖尿病小鼠血糖影响的曲线图。
具体实施例方式
实施例1诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛e样细胞分化 (1)人胎肝间充质干细胞的分离、纯化及扩增无菌生理盐水冲洗胎儿， 剪去脐带后置于大烧杯中，用体积分数为75%的酒精浸泡5分钟，超净台中无菌取出胎肝，PBS冲洗血液数次，剪除包膜，将剩余肝组织剪碎，用尖嘴吸
管吸取含2。/。(体积分数)FCS的Hank液冲洗肝组织，收集肝组织悬液入50ml 或15ml无菌离心管中，吸管反复吹打以离散细胞，50Xg离心5分钟，沉淀 即为肝实质细胞，取上清液转入另一离心管(去除肝实质细胞)，500Xg离 心5分钟，弃上清液，沉淀即为肝非实质细胞，重复上述步骤两次。将获得 的肝非实质细胞用含2%FCS的Hank液重悬，与6%的羟乙基淀粉按照4: 1 的体积比混匀，室温下静置30分钟，RBC通过叠连下沉，有核细胞浮于上清 中，取上清于另一离心管中，500g离心5分钟，弃上清，将沉于管底的细胞 用含2%FCS的Hank液重悬，1500r/min离心5分钟，同法再洗1次。收集 细胞重悬于完全培养基(DMEM/F12， 10% (体积分数)FCS， 2mmol/L谷胺 酰胺，20mmol/LHEPES)中，反复吹打使细胞分散成单细胞悬液，取20" L 用于细胞计数及细胞活力测定，最后按1.5Xl(^/cn^接种于25cmn咅养瓶中， 在37"C、 5%(302的培养箱中培养。3天后首次更换培养液，弃去未贴壁细 胞。以后每2 3天换液l次。细胞达到70% 80%融合时，用D-PBS清洗 后，加入lmL质量浓度为0.25%的胰酶(从胰酶配制过程来看，似乎应该是 质量浓度，请发明人校核)，浸没所有细胞后倒掉，再加入lmL质量浓度为 0.25 %的胰酶，倒去大部分，仅剩少量胰酶覆盖细胞，在37'C消化1 5分钟， 镜下观察作用程度，及时加入新鲜全培养液终止消化。传代按1:2 3比例传代 培养。定期观察，换液。传代标记为P1、 P2、 P3等。
(2)诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛0样细胞分化取第3代以后的达 到80。/。 90X融合之胎肝MSCs，用质量浓度为0.25%的胰酶消化细胞，按1 : 2比例接种于25cn^特殊处理之培养瓶中，每瓶加5mL诱导液(含20M的 TAT-PDX1蛋白及3。/。 5。/。FCS的DMEM/F12培养液)，每8小时一次，连续 4天，然后加入含体积分数为0.1胎牛血清的高糖DMEM/F12培养基中继续 培养，培养10天以上。
实施例2对实施例1所得胰岛样细胞团的鉴定
(1)诱导前后细胞的形态变化图1是倒置显微镜下所见未诱导的 hFL-MSCs形态图。图2是倒置显微镜下所见诱导10天后的胰岛P样细胞团 的形态图。从图1可以看出未经诱导的MSCs呈长梭形，平行排列；从图2 可以看出诱导10天的hFLMSCs聚集成胰岛样细胞团。
7(2) 双硫腙(Dithizone， DTZ)染色
取实施例1所得的胰岛样细胞团，PBS洗2次后，加入5ml PBS和50^1 双硫腙工作液(V/V， 1%)， 37'C孵育10分钟，在倒置显微镜下观察并拍照。
胰岛3细胞的胞浆中富含锌离子，锌离子是形成2-锌-胰岛素六聚体的必 需成分，也是胰岛P细胞行使其功能的必要因素之一。DTZ能特异地与锌离 子鳌合，形成紫红色的络合物，是体外鉴定胰岛e细胞的方法之一。图3是倒 置显微镜下所见的诱导后所得的胰岛P样细胞团形态图，图3显示诱导后的胰 岛样细胞团被染成枣红色，说明细胞内富含锌离子，与胰岛e细胞具有相似之 处，也说明这些细胞具备合成、分泌胰岛素的前提条件。
(3) 激光共聚焦显微镜观察胰岛素/C-肽的表达
图4是诱导后所得的胰岛P样细胞团的胰岛素阳性表达图；其中图a是 C-肽的阳性表达图；其中图b是胰岛素的阳性表达图；图c为胞核被特异性核 染料DAPI染色图；图d为图a、图b与图c的合图。从图4可以看出，诱导 后的细胞胰岛素/C-肽呈阳性表达。
(4) 利用RT-PCR鉴定胰岛素相关基因的表达
应用Primer5.0软1牛设计了 (3-actin， pdx-l， insulin, NeuroD， nkx2.2， pax4， nkx6.1， pax6， isl-l，等引物，由上海生工公司合成，序列如下(各序列表可 见SEQNo.l國16):
基因上游引物r下游引物产物大 小(bp)Tm (°C)
pdxlcaa gga ccc atg cgc gtt cca gcggaa etc ctt etc cag etc tag cag ct45459
NeuroDeg cca cga cac gag gaa ttc gcggc atg tec tgg ttc tgc tea gg76658
nkx2.2tgg acg egg tgc aga gec tgcag gtc ctg ggc ttt gag eg51359
pax4cac etc tct gec tga gga cac ggt gactg cct cat tec aag cca tac agt ag44458
nkx6.1aga gag tea ggt caa ggt ctg gttact tgt get tct tea tea get gcg21555
pax6cag tea cag egg agt gaa tea gcgec ate ttg cgt agg ttg ccc tg56256
isl-lcgt ctg att tec eta tgt gtt ggttc ttg ctg aag ccg atg ctg23352
insulinget gca tea gaa gag gec ate agcg tct agt tgc agt agt tct cca g39554
P-actincgt aaa gac etc tat gec aaage cat gec aaa tgt etc at28655
8图5是RT-PCR鉴定诱导细胞胰岛相关基因表达的电泳图，RT-PCR鉴 定结果显示诱导细胞在不同时间点序贯表达pdx-l， insulin, NeuroD， nkx2.2， pax4， nkx6.1， pax6， isl-1等基因。其中pdxl是启动胰岛发育的关键基因， NeuroD， nkx2.2， pax4， nkx6.1和pax6在胰岛前体细胞中有所表达，是胰岛 e细胞发育、成熟过程中特征性的基因；isl-l， insulin是胰岛P细胞特征性表 达的基因；因此，这几种基因的联合表达说明诱导的细胞己初步具备了胰岛e 细胞的分子特征。
(5)用放射免疫分析法检测培养液上清中胰岛素的累积分泌量，及葡萄 糖刺激的胰岛素分泌的情况
取加入TAT-PDX1蛋白后每天收集的培养液上清，以放射免疫法测定胰岛 素累积分泌量。结果加入TAT-PDX1蛋白后，胰岛素累积分泌量逐渐增加，而 且随着时间延长分泌量维持在较高水平(见图6)。加入葡萄糖刺激后第1周， 细胞对葡萄糖的刺激可以产生反应;第2 4周细胞胰岛素基础分泌量和刺激后
胰岛素分泌量均显著增加，且可以维持在较高水平，提示细胞对葡萄糖的刺激 更加敏感(见图7)。
实施例3本方法所得的胰岛P样细胞的小鼠肾包膜下移植实验 取生理盐水，未诱导的hFLMSCs以及诱导10天的胰岛P样细胞，移植 到糖尿病小鼠肾包膜下。观察移植后不同细胞对糖尿病小鼠血糖值的影响。图 8提示胰岛e样细胞移植后糖尿病小鼠血糖明显下降，且能维持较长时间，而 生理盐水，未诱导的hFLMSCs移植后对糖尿病小鼠无降糖作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实 施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、 替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
9SEQUENCE LISTING
〈110〉 暨南大学
<120>诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛e样细胞分化并稳定表达胰岛素的方法及其专用诱导液 <160> 16
<170> Patent Inversion 3. 3
<210> 1
<211> 24
<212> ■
<213> PDXl上游引物
<400> 1
caa gga ccc atg cgc gtt cca gcg 24
<210> 2
<211> 26
<212〉 DNA
<213> PDX1下游引物
〈400〉 2
gaa etc ctt etc cag etc tag cag ct 26
<210> 3 <211〉 23<212> DNA
<213〉 NeuroD上游引物
〈400〉 3
cgg cca cga cac gag gaa ttc gc 23
<210> 4
〈211〉 23
<212> DNA
<213> NeuroD下游引物
〈400〉 4 ggc atg tcc
tgg ttc tgc tea gg 23
<210〉 5
<211> 20
〈212〉 DNA
<213> Nkx2.2上游引物
<400> 5 tgg 3Cg cgg
tgc aga gcc tg 20
<210> 6
<211> 20
〈212> DNA
<213> Nkx2.
2下游引物
11<400> 6
cag gtc ctg ggc tU gag eg 20
<210> 7
<211〉 26
<212> DNA
<213> Pax4上游引物
〈400〉 7
cac etc tct gcc tga gga cac ggt ga 26
<210> 8
〈211> 26
〈212〉 應
<213> Pax4下游引物
<400> 8
ctg cct cat tec aag cca tac agt ag 26
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Nkx6. l上游引物
<400> 9
aga gag tea ggt caa ggt ctg gtt 24
12<210> 10 〈211〉 24 〈212〉 DNA
〈213> Nkx6. l下游引物 <400> 10
act tgt get tct tea tea get gcg 24
〈210〉 11
<211> 23
<212〉 DNA
〈213〉 Pax6上游引物
<400> 11
cag tea cag egg agt gaa tea gc 23
<210> 12
〈211〉 23
〈212> 画A
〈213〉 Pax6下游引物
<400> 12
gcc ate ttg cgt agg ttg ccc tg 23
〈210> 13<211> 23
〈212> DNA
<213> Isl-l上游引物
<400〉 13
cgt ctg att tcc cta tgt gtt gg 23
<210> 14
<211〉 21
<212> DNA
<213> Isl-l下游引物
〈400> 14
ttc ttg ctg aag ccg atg ctg 21
〈210〉 15
<211> 22
<212〉 醒
<213> Insulin上游引物
<400> 15
get gca tea gaa gag gcc ate a 22
<210> 16
<211> 25
<212〉 腿
〈213〉 Insulin下游引物
14<400> 16
gcg tct agt tgc agt agt tct cca g 25
<210> 17
<211> 20
<212> 讓
<213〉 e-actin上游引物
<400> 17
cgt aaa gac etc tat gcc aa 加
〈210〉 18 <211〉 20 <212> DNA
〈213>P-actin下游引物
<400〉 18
age cat gcc aaa tgt etc at 20
1权利要求
1、一种用于诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的诱导液，其特征在于是在细胞培养液中添加TAT-PDX1融合蛋白得到的。
2、 根据权利要求1所述的用于诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛5样细胞分 化的诱导液，其特征在于所述TAT-PDX1融合蛋白的摩尔浓度为15~25mol/L。
3、 根据权利要求2所述的用于诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛P样细胞分 化的诱导液，其特征在于所述细胞培养液为含3%~5%体积浓度胎牛血清的 DMEM/F12培养液。
4、 一种诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛0样细胞分化并稳定表达胰岛素的 方法，其特征在于包括以下歩骤(1) 分离、纯化并传代扩增人胎肝间充质干细胞；(2) 将步骤(1)中第3代以后的人胎肝间充质干细胞，于含权利要求l-3 中任一项所述的诱导液中培养3-5天，然后在高糖DMEM/F12培养基中继续培 养10天以上即得到胰岛0样细胞团。
5、 根据权利要求4所述诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛P样细胞分化并稳 定表达胰岛素的方法，其特征在于包括以下步骤(1) 先采用分步离心法，再用羟乙基淀粉沉降法分离出人胎肝间充质干细 胞；然后将间充质干细胞重新悬浮于完全培养基中，反复吹打使细胞分散成单 细胞悬液，然后接种培养；细胞达到70%~80%融合时，用胰酶进行消化处理， 然后按1 : 2 3比例传代培养；(2) 取步骤(1)中第3代以后的达到80% 90%融合的人胎肝间充质干细 胞，消化、接种后，加入权利要求1-3中任一项所述诱导液，每8小时换诱导 液一次，连续4天，然后在含体积分数为10。/。胎牛血清的高糖DMEM/F12培养 基中继续培养10天以上即得到胰岛3样细胞团。
6、 根据权利要求5所述的诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛P样细胞分化的 方法，其特征在于所述步骤(1 )中，所述的完全培养基为含有10% FCS、2mmol/L 谷胺酰胺、20mmol/L HEPES的DMEM/F12培养基。
7、 根据权利要求5所述的诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛P样细胞分化的 方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述的接种培养是将细胞按1.5X106/cm2接种于25 cm2培养瓶中，在37°C 、 5% C02的培养箱中培养，培养3天后首次 更换培养液，弃去未贴壁细胞，以后每2 3天换液1次。
8、 根据权利要求5所述的诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛P样细胞分化的方法，其特征在于所述歩骤(1)中，所述用胰酶进行消化处理包括如下过程加入质量浓度为0.25%的胰酶，浸没所有细胞后倒掉胰酶，然后再加入上述胰酶， 倒去大部分，仅剩刚好覆盖细胞的胰酶，在37"C继续消化1 3分钟，然后加 入完全培养基终止消化。
9、 根据权利要求5所述的诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛P样细胞分化的 方法，其特征在于所述步骤(2)中，所述消化是用质量浓度为0.25 %的胰酶 消化；所述接种是按1 : 2比例接种于25cn^之培养瓶。
10、 根据权利要求9所述的诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛3样细胞分化 的方法，其特征在于所述步骤(2)中，所述诱导液的加入量为2ml每瓶。
全文摘要
本发明涉及一种诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化并稳定表达胰岛素的方法及其专用诱导液。本发明所述的方法包括以下步骤分离、纯化及扩增人胎肝间充质干细胞；然后取第3代以后的细胞用专用诱导液诱导，诱导后获得的胰岛β样细胞团能稳定表达胰岛素。所用的诱导液是在细胞培养液中添加TAT-PDX1融合蛋白得到的。本发明的方法在体外将人胎肝间充质干细胞诱导为能稳定分泌胰岛素的胰岛β样细胞。若将所得的胰岛β样细胞移植到糖尿病患者体内可以进一步调节血糖水平，从而实现糖尿病的细胞治疗。因此，该领域的研究具有广阔的临床应用前景，能带来较大的经济效益和社会效益。
文档编号C12N5/08GK101580818SQ200910037689
公开日2009年11月18日 申请日期2009年3月9日 优先权日2009年3月9日
发明者铧 姜, 洹 张, 李东升 申请人:暨南大学;郧阳医学院