分子设计结合藻尿胆素的藻红蓝蛋白α亚基类荧光蛋白质的制备方法

专利名称：分子设计结合藻尿胆素的藻红蓝蛋白α亚基类荧光蛋白质的制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术中色素蛋白质材料领域，具体涉及一种分子设计结合藻尿胆 素的藻红蓝蛋白α亚基类荧光蛋白质的制备方法。
背景技术：
藻胆蛋白(phycobiliprotein)是蓝藻和红藻光合作用捕光复合物的功能组 分。根据其吸收光谱和荧光光谱特征，藻胆蛋白可以分为藻红蛋白(phycoerythrin，简称 CPE)、藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin，简称 PEC)、藻蓝蛋白(phycocyanin，简称 CPC)和 变藻蓝蛋白(allophycocyanin，简称APC)。CPE、PEC、CPC和APC含α和β亚基，每个亚 基中藻胆色素(phycobilin)通过硫醚键与藻胆蛋白脱辅基蛋白(apo-phycobiliprotein) 半胱氨酸残基的巯基共价结合，其种类及其与脱辅基蛋白的相互作用决定藻胆蛋白的光谱 性质。藻胆色素与脱辅基蛋白共价结合形成特定的构象，使得CPE主要吸收约560nm的可 见光，发射约580nm的荧光；PEC吸收约570nm的可见光，发射约630nm的荧光；CPC吸收约 620nm的可见光，发射约640nm的荧光；APC吸收约650 660nm的可见光，发射约660 670nm的荧光。CPE结合的辅基色素为藻红胆素(phycoerythrobilin，简称PEB) ；PEC的α 亚基结合的辅基色素为藻紫胆素(phycoviolobilin，简称PVB) ；PEC的β亚基结合的辅基 色素为藻蓝胆素(phycocyanobilin，简称PCB) ；CPC和APC结合的辅基色素都为藻蓝胆素 PCB。藻红蓝蛋白PEC的α亚基可以通过大肠杆菌基因工程菌来生产(Tooley AJ, Glazer AN. Biosynthesis of the cyanobacterial light-harvesting polypeptide phycoerythrocyanin holo-α subunitin a heterologous host. J Bacteriol.2002 ； 184(17) :4666 4671)。我们发现，藻红蓝蛋白α亚基裂合/异构酶不仅可以催化PCB异 构为PVB后与藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白结合，还能催化藻红胆素PEB异构为PUB后与 藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白结合。通过基因工程技术，藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白 基因克隆于表达载体，可以在大肠杆菌内表达得到藻红蓝蛋白α亚基类脱辅基蛋白；把藻 红蓝蛋白α亚基裂合/异构酶基因、PEB生物酶合成基因克隆于表达载体。利用以上表达 载体，通过基因工程菌，可以直接生成结合PUB的藻红蓝蛋白α亚基类荧光蛋白质。藻胆蛋白类荧光蛋白质可以应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域。结合PUB 的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质具有与天然藻红蓝蛋白不同的光谱特性可为生物学检测以及 医疗检测提供更多选择。本发明为藻红蓝蛋白类色素蛋白质功能材料应用于医药和生物工 程领域，特别是检测领域奠定了基础。

发明内容
本发明的目的在于提供一种分子设计结合藻尿胆素的藻红蓝蛋白α亚基类荧光 蛋白质的制备方法。它是应用藻红蓝蛋白α亚基裂合酶催化藻红胆素(PEB)异构为藻尿胆素(PUB)与藻红蓝蛋白α亚基类脱辅基蛋白共价结合，制备结合PUB的藻红蓝蛋白α亚 基类荧光蛋白质。将含有藻红蓝蛋白α亚基裂合/异构酶基因、藻红蓝蛋白α亚基类脱 辅基蛋白基因、藻红胆素生物合成酶基因的表达质粒依次转入宿主菌，得到相应的工程菌， 通过这种方法得到的基因工程菌生产结合PUB的藻红蓝蛋白α亚基类荧光蛋白质。为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下
—种分子设计结合藻尿胆素的藻红蓝蛋白α亚基类荧光蛋白质的制备方法，包 括如下步骤(1)采用基因工程方法，将α亚基裂合/异构酶基因或其同源基因克隆于表达载 体中，得到α亚基裂合/异构酶表达质粒；应用基因工程方法将藻红蓝蛋白α亚基类脱辅 基蛋白基因或其同源基因克隆于第二个表达载体中，得到脱辅基蛋白表达质粒；应用基因 工程方法将藻红胆素PEB生物合成酶基因hol、pebA和pebB或其同源基因克隆于第三个和 /或第四个表达载体中，得到PEB合成质粒；(2)将α裂合/异构酶表达质粒、脱辅基蛋白表达质粒、PEB生物合成酶质粒依次 转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌，应用此工程菌通 过发酵工程能生产结合藻尿胆素PUB的藻红蓝蛋白α亚基类荧光蛋白质，发酵后，按常规 蛋白质提纯技术，提纯得到相应的结合藻尿胆素PUB的藻红蓝蛋白α亚基类荧光蛋白质；所述的分子设计结合藻尿胆素的藻红蓝蛋白α亚基类荧光蛋白质的制备方法， 其特征在于应用α亚基裂合/异构酶催化藻红胆素异构为藻尿胆素后与藻红蓝蛋白α亚 基类脱辅基蛋白进行共价结合而制备结合藻尿胆素PUB的藻红蓝蛋白α亚基类荧光蛋白 质。所述的α亚基裂合/异构酶基因是指与Anabaena sp. PCC7120中pecE和pecF 基因或M. Iaminosus sp. PCC7603中pecE和pecF基因同源的基因。藻红蓝蛋白α亚基类 脱辅基蛋白基因是指与Anabaena sp. PCC7120或M. Iaminosus sp. PCC7603中pecA同源的基因。本发明与现有技术相比，具有以下优点1、不使用藻类为原料而是利用大肠杆菌生产藻红蓝蛋白α亚基类荧光蛋白质， 大肠杆菌繁殖快，可以大大缩短周期；2、与藻类相比，大肠杆菌细胞壁容易破碎，纯化过程中可节省能源；3、通过大肠杆菌生产，目标蛋白含量高，有His-tag标记，且体系中几乎没有性质 类似的蛋白，提取方便；4、生成结合PUB的新型藻红蓝蛋白α亚基类色素蛋白，具有与天然藻红蓝蛋白α 亚基类色素蛋白不同的光谱特性，为发展荧光藻胆蛋白类色素蛋白质功能材料提供更多选 择。


图1为本发明中PecE/PecF催化下生成的结合PUB的藻红蓝蛋白α亚基类荧光 蛋白质的光谱图；实线吸收光谱，虚线为荧光光谱。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。实施例1(1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp. PCC7120的全序列已经测定完成， M. Iaminosus sp. PCC7603 部分序列已经测定。Anabaena sp. PCC7120 在 GeneBank 中编号 为BA000019，M. Iaminosus sp. PCC7603 中所用到基因序列在 GeneBank 中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已经部分测序，所用到基因序列 在GeneBank中编号为AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通过 基因工程方法，将Anabaena SP.PCC7120中的藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白基因克隆于 Novagen公司购买的ρΕΤ30中，所得质粒叫pET30-peCA，在大肠杆菌中能表达藻红蓝蛋白α 亚基脱辅基蛋白，得到藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白的表达质粒。根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为 模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2)将Anabaena sp. PCC7120中的藻红蓝蛋白α亚基裂合/异构酶基因pecE和 pecF克隆于Novagen公司购买的pETDuet-Ι中，所得质粒叫pETDuet-pecE-pecF，在大肠杆 菌中能表达藻红蓝蛋白α亚基裂合/异构酶PecE/PecF，得到藻红蓝蛋白α亚基裂合/异 构酶表达质粒。(3)将藻红胆素生物合成酶基因(hoi和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1 中，所得质粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大肠杆菌中能同时表达Hol和PebB。(4)将藻红胆素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-Ι中， 所得质粒叫pACYCDuet-pebA，在大肠杆菌中能表达PebA。即脱辅基蛋白基因pecA在pET30中是在EcoR V和Xho I两个酶切位点之间；裂 合酶基因PecE在pETDuet中，处于第一个多克隆位点，酶切位点是Nco I和Pst I之间，裂 合酶基因PecF在pETDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是EcoR V和Xho I之间； PEB合成酶基因是3个(hol、pebA和pebB)，hol和pebB在同一个载体pCDFDuet-1中，hoi 在第一个多克隆位点Nco I和Pst I之间，pebB在第二个多克隆位点Nde I和Xho I之间， pebA在pACYCDuet-Ι中第二个多克隆位点Bgl II和Xho I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物 分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片 段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载 体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(5)将 pETDuet-pecE-pecF、pET30_pecA、pCDFDuet-hol-pebB 和 pACYCDuet-pebA 转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. O的LB培养基中，37°C振荡培养至OD6tltl为0. 5至0. 8，加入异丙基硫代-β -D-半乳糖苷 (isoprophylthio-β -D-galactoside，简称 IPTG)至终浓度为 lmmol/L，20°C至 37°C振荡表达约12小时，生产藻红蓝蛋白α亚基类荧光蛋白质藻尿胆素-藻红蓝蛋白Α;离心收集菌 体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过M2+亲和层析，可提纯得到相应的 藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻尿胆素_藻红蓝蛋白A。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式如下从新鲜涂布的平板上挑取大肠杆菌菌株BL21(DE3)单菌落，接种于5mL LB培养 基，37°C振荡培养过夜；取100 μ L饱和培养物，无菌转接至5mL LB培养基，37°C振荡培养 至OD6tltl = 0. 3 0. 4时，将菌液转移至5mL无菌离心管中，冰上放置10分钟；离心1分钟 (10000g，4°C)弃去上清，收集沉淀菌体；用ImL预冷的0. lmol/L CaCl2无菌溶液重悬菌体， 离心30s (lOOOOg, 4°C )去上清，菌体沉淀用100 μ L预冷的0. lmol/L CaCl2重悬，放置于冰 上，加入一定量的构建好的质粒，混勻后冰浴放置30分钟，42°C热休克90s，冰浴5分钟后加 入300 μ LLB培养基，37°C低速振荡培养45分钟，无菌涂布在含有相应抗生素的LB培养基 平板上，倒置于37°C培养箱至形成可见的单克隆菌斑。提取3个左右菌落，分别接种到5ml含相应抗生素的LB培养基中，振荡培养至饱 和；分别从中取100 μ L转接至5ml含相应抗生素的LB培养基中；37°C振荡培养至OD6tltl = 0. 5-0. 7时，冰浴约30分钟，加入IPTG诱导表达；避光、20°C、150转/分，表达约12小时。 离心收集细胞，细胞加入缓冲液重悬；通过光谱仪测其产物荧光量，选取荧光产量高的菌株 进行大量表达。实施例2(1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp. PCC7120的全序列已经测定完成， M. Iaminosus sp. PCC7603 部分序列已经测定。Anabaena sp. PCC7120 在 GeneBank 中编号 为BA000019，M. Iaminosus sp. PCC7603 中所用到基因序列在 GeneBank 中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已经部分测序，所用到基因序列 在GeneBank中编号为AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通过 基因工程方法，将Anabaena SP.PCC7120中的藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白基因克隆于 Novagen公司购买的ρΕΤ30中，所得质粒叫pET30-peCA，在大肠杆菌中能表达藻红蓝蛋白α 亚基脱辅基蛋白，得到藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白的表达质粒。根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为 模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2)将E laminosus sp. PCC7603中的藻红蓝蛋白α亚基裂合/异构酶基因pecE和pecF 克隆于Novagen公司购买的pETDuet-Ι中，所得质粒叫pETDuet-pecE-pecF，在大肠杆菌中能表达 藻红蓝蛋白α亚基裂合/异构酶PecE/PecF，得到藻红蓝蛋白α亚基裂合/异构酶表达质粒。(3)将藻红胆素生物合成酶基因(hoi和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet_l 中，所得质粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大肠杆菌中能同时表达Hol和PebB。(4)将藻红胆素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-Ι中， 所得质粒叫pACYCDuet-pebA，在大肠杆菌中能表达PebA。即脱辅基蛋白基因pecA在pET30中是在EcoR V和Xho I两个酶切位点之间；裂 合酶基因PecE在pETDuet中，处于第一个多克隆位点，酶切位点是Nco I和Pst I之间，裂 合酶基因PecF在pETDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是EcoR V和Xho I之间；PEB合成酶基因是3个(hol、pebA和pebB)，hol和pebB在同一个载体pCDFDuet-1中，hoi 在第一个多克隆位点Nco I和Pst I之间，pebB在第二个多克隆位点Nde I和Xho I之间， pebA在pACYCDuet-Ι中第二个多克隆位点Bgl II和Xho I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物 分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片 段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载 体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(5)将 pETDuet-pecE-pecF、pET30_pecA、pCDFDuet-hol-pebB 和pACYCDuet-pebA 转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. O的LB培养基中，37°C振荡培养至OD6tltl为0. 5至0. 8，加入异丙基硫代-β -D-半乳糖苷 (isoprophylthio-β -D-galactoside，简称 IPTG)至终浓度为 lmmol/L，20°C至 37°C振荡表 达约12小时，生产藻红蓝蛋白α亚基类荧光蛋白质藻尿胆素-藻红蓝蛋白Α;离心收集菌 体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过M2+亲和层析，可提纯得到相应的 藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻尿胆素_藻红蓝蛋白A。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式如下从新鲜涂布的平板上挑取大肠杆菌菌株BL21(DE3)单菌落，接种于5mL LB培养 基，37°C振荡培养过夜；取100 μ L饱和培养物，无菌转接至5mL LB培养基，37°C振荡培养 至OD6tltl = 0. 3 0. 4时，将菌液转移至5mL无菌离心管中，冰上放置10分钟；离心1分钟 (10000g，4°C)弃去上清，收集沉淀菌体；用ImL预冷的0. lmol/L CaCl2无菌溶液重悬菌体， 离心30s (lOOOOg, 4°C )去上清，菌体沉淀用100 μ L预冷的0. lmol/L CaCl2重悬，放置于冰 上，加入一定量的构建好的质粒，混勻后冰浴放置30分钟，42°C热休克90s，冰浴5分钟后加 入300 μ LLB培养基，37°C低速振荡培养45分钟，无菌涂布在含有相应抗生素的LB培养基 平板上，倒置于37°C培养箱至形成可见的单克隆菌斑。提取3个左右菌落，分别接种到5ml含相应抗生素的LB培养基中，振荡培养至饱 和；分别从中取100 μ L转接至5ml含相应抗生素的LB培养基中；37°C振荡培养至OD6tltl = 0. 5-0. 7时，冰浴约30分钟，加入IPTG诱导表达；避光、20°C、150转/分，表达约12小时。 离心收集细胞，细胞加入缓冲液重悬；通过光谱仪测其产物荧光量，选取荧光产量高的菌株 进行大量表达。实施例3(1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp. PCC7120的全序列已经测定完成， M. Iaminosus sp. PCC7603 部分序列已经测定。Anabaena sp. PCC7120 在 GeneBank 中编号 为BA000019，M. Iaminosus sp. PCC7603 中所用到基因序列在 GeneBank 中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已经部分测序，所用到基因序列 在GeneBank中编号为AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通过基 因工程方法，将M. laminosus sp. PCC7603中的藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白基因克隆于 Novagen公司购买的ρΕΤ30中，所得质粒叫pET30-peCA，在大肠杆菌中能表达藻红蓝蛋白α 亚基脱辅基蛋白，得到藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白的表达质粒。
根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为 模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2)将Anabaena sp. PCC7120中的藻红蓝蛋白α亚基裂合/异构酶基因pecE和 pecF克隆于Novagen公司购买的pETDuet-Ι中，所得质粒叫pETDuet-pecE-pecF，在大肠杆 菌中能表达藻红蓝蛋白α亚基裂合/异构酶PecE/PecF，得到藻红蓝蛋白α亚基裂合/异 构酶表达质粒。(3)将藻红胆素生物合成酶基因(hoi和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1 中，所得质粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大肠杆菌中能同时表达Hol和PebB。
(4)将藻红胆素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-Ι中， 所得质粒叫pACYCDuet-pebA，在大肠杆菌中能表达PebA。即脱辅基蛋白基因pecA在pET30中是在EcoR V和Xho I两个酶切位点之间；裂 合酶基因PecE在pETDuet中，处于第一个多克隆位点，酶切位点是Nco I和Pst I之间，裂 合酶基因PecF在pETDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是EcoR V和Xho I之间； PEB合成酶基因是3个(hol、pebA和pebB)，hol和pebB在同一个载体pCDFDuet-1中，hoi 在第一个多克隆位点Nco I和Pst I之间，pebB在第二个多克隆位点Nde I和Xho I之间， pebA在pACYCDuet-Ι中第二个多克隆位点Bgl II和Xho I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物 分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片 段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载 体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(5)将 pETDuet-pecE-pecF、pET30_pecA、pCDFDuet-hol-pebB 和 pACYCDuet-pebA 转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH 7. O的LB培养基中，37°C振荡培养至OD6tltl为0. 5至0. 8，加入异丙基硫代-β -D-半乳糖苷 (isoprophylthio-β -D-galactoside，简称 IPTG)至终浓度为 lmmol/L，20°C至 37°C振荡表 达约12小时，生产藻红蓝蛋白α亚基类荧光蛋白质藻尿胆素-藻红蓝蛋白Α;离心收集菌 体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过M2+亲和层析，可提纯得到相应的 藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻尿胆素_藻红蓝蛋白A。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式如下从新鲜涂布的平板上挑取大肠杆菌菌株BL21(DE3)单菌落，接种于5mL LB培养 基，37°C振荡培养过夜；取100 μ L饱和培养物，无菌转接至5mL LB培养基，37°C振荡培养 至OD6tltl = 0. 3 0. 4时，将菌液转移至5mL无菌离心管中，冰上放置10分钟；离心1分钟 (10000g，4°C)弃去上清，收集沉淀菌体；用ImL预冷的0. lmol/L CaCl2无菌溶液重悬菌体， 离心30s (lOOOOg, 4°C )去上清，菌体沉淀用100 μ L预冷的0. lmol/L CaCl2重悬，放置于冰 上，加入一定量的构建好的质粒，混勻后冰浴放置30分钟，42°C热休克90s，冰浴5分钟后加 入300 μ LLB培养基，37°C低速振荡培养45分钟，无菌涂布在含有相应抗生素的LB培养基 平板上，倒置于37°C培养箱至形成可见的单克隆菌斑。
提取3个左右菌落，分别接种到5ml含相应抗生素的LB培养基中，振荡培养至饱 和；分别从中取100 μ L转接至5ml含相应抗生素的LB培养基中；37°C振荡培养至OD6tltl = 0. 5-0. 7时，冰浴约30分钟，加入IPTG诱导表达；避光、20°C、150转/分，表达约12小时。 离心收集细胞，细胞加入缓冲液重悬；通过光谱仪测其产物荧光量，选取荧光产量高的菌株 进行大量表达。实施例4(1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp. PCC7120的全序列已经测定完成， M. Iaminosus sp. PCC7603 部分序列已经测定。Anabaena sp. PCC7120 在 GeneBank 中编号 为BA000019，M. Iaminosus sp. PCC7603 中所用到基因序列在 GeneBank 中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已经部分测序，所用到基因序列 在GeneBank中编号为AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通过基 因工程方法，将M. laminosus sp. PCC7603中的藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白基因克隆于 Novagen公司购买的ρΕΤ30中，所得质粒叫pET30-peCA，在大肠杆菌中能表达藻红蓝蛋白α 亚基脱辅基蛋白，得到藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白的表达质粒。根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为 模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2)将Μ. laminosus sp. PCC7603中的藻红蓝蛋白α亚基裂合/异构酶基因pecE 和pecF克隆于Novagen公司购买的pETDuet-Ι中，所得质粒叫pETDuet-pecE-pecF，在大肠 杆菌中能表达藻红蓝蛋白α亚基裂合/异构酶PecE/PecF，得到藻红蓝蛋白α亚基裂合/ 异构酶表达质粒。(3)将藻红胆素生物合成酶基因(hoi和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet_l 中，所得质粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大肠杆菌中能同时表达Hol和PebB。(4)将藻红胆素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-Ι中， 所得质粒叫pACYCDuet-pebA，在大肠杆菌中能表达PebA。即脱辅基蛋白基因pecA在pET30中是在EcoR V和Xho I两个酶切位点之间；裂 合酶基因PecE在pETDuet中，处于第一个多克隆位点，酶切位点是Nco I和Pst I之间，裂 合酶基因PecF在pETDuet中，处于第二个多克隆位点，酶切位点是EcoR V和Xho I之间； PEB合成酶基因是3个(hol、pebA和pebB)，hol和pebB在同一个载体pCDFDuet-1中，hoi 在第一个多克隆位点Nco I和Pst I之间，pebB在第二个多克隆位点Nde I和Xho I之间， pebA在pACYCDuet-Ι中第二个多克隆位点Bgl II和Xho I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物 分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片 段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载 体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(5)将 pETDuet-pecE-pecF、pET30_pecA、pCDFDuet-hol-pebB 和pACYCDuet-pebA 转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此工程菌接种于pH7. O的LB培养基中，37°C振荡培养至OD6tltl为0. 5至0. 8，加入异丙基硫代-β -D-半乳糖苷 (isoprophylthio-β -D-galactoside，简称 IPTG)至终浓度为 lmmol/L，20°C至 37°C振荡表 达约12小时，生产藻红蓝蛋白α亚基类荧光蛋白质藻尿胆素-藻红蓝蛋白Α;离心收集菌 体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过M2+亲和层析，可提纯得到相应的 藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻尿胆素_藻红蓝蛋白A。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式如下从新鲜涂布的平板上挑取大肠杆菌菌株BL21(DE3)单菌落，接种于5mL LB培养 基，37°C振荡培养过夜；取100 μ L饱和培养物，无菌转接至5mL LB培养基，37°C振荡培养 至OD6tltl = 0. 3 0. 4时，将菌液转移至5mL无菌离心管中，冰上放置10分钟；离心1分钟 (10000g，4°C)弃去上清，收集沉淀菌体；用ImL预冷的0. lmol/L CaCl2无菌溶液重悬菌体， 离心30s (lOOOOg, 4°C )去上清，菌体沉淀用100 μ L预冷的0. lmol/L CaCl2重悬，放置于冰 上，加入一定量的构建好的质粒，混勻后冰浴放置30分钟，42°C热休克90s，冰浴5分钟后加 入300 μ LLB培养基，37°C低速振荡培养45分钟，无菌涂布在含有相应抗生素的LB培养基 平板上，倒置于37°C培养箱至形成可见的单克隆菌斑。提取3个左右菌落，分别接种到5ml含相应抗生素的LB培养基中，振荡培养至饱 和；分别从中取100 μ L转接至5ml含相应抗生素的LB培养基中；37°C振荡培养至OD6tltl = 0. 5-0. 7时，冰浴约30分钟，加入IPTG诱导表达；避光、20°C、150转/分，表达约12小时。 离心收集细胞，细胞加入缓冲液重悬；通过光谱仪测其产物荧光量，选取荧光产量高的菌株 进行大量表达。实施例5(1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp. PCC7120的全序列已经测定完成， M. Iaminosus sp. PCC7603 部分序列已经测定。Anabaena sp. PCC7120 在 GeneBank 中编号 为BA000019，M. Iaminosus sp. PCC7603 中所用到基因序列在 GeneBank 中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已经部分测序，所用到基因序列 在GeneBank中编号为AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通过 基因工程方法，将Anabaena SP.PCC7120中的藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白基因克隆于 Novagen公司购买的pCOLADuet-Ι中，所得质粒叫pCOLADuet-pecA，在大肠杆菌中能表达藻 红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白，得到藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白的表达质粒。根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为 模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2)将Anabaena sp. PCC7120中的藻红蓝蛋白α亚基裂合/异构酶基因pecE和 pecF克隆于Novagen公司购买的pETDuet-Ι中，所得质粒叫pETDuet-pecE-pecF，在大肠杆 菌中能表达藻红蓝蛋白α亚基裂合/异构酶PecE/PecF，得到藻红蓝蛋白α亚基裂合/异 构酶表达质粒。(3)将藻红胆素生物合成酶基因(hoi和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1 中，所得质粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大肠杆菌中能同时表达Hol和PebB。(4)将藻红胆素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet_l中，所得质粒叫pACYCDuet-pebA，在大肠杆菌中能表达PebA。
即脱辅基蛋白基因pecA的片段在pCOLADuet-Ι中是在第一个多克隆位点的EcoR I和Pst I两个酶切位点之间；裂合酶基因pecE在pETDuet中，处于第一个多克隆位点，酶 切位点是Nco I和Pst I之间，裂合酶基因pecF在pETDuet中，处于第二个多克隆位点，酶 切位点是EcoR V和Xho I之间；PEB合成酶基因是3个(hoi、pebA和pebB)，hoi禾口 pebB 在同一个载体P⑶FDuet-I中，hoi在第一个多克隆位点Nco I和Pst I之间，pebB在第二 个多克隆位点Nde I和Xho I之间，pebA在pACYCDuet-Ι中第二个多克隆位点Bgl II和 Xho I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物 分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片 段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载 体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。
(5)将 pETDuet-pecE-pecF、pCOLADuet-pecA、pCDFDuet-ho 1-pebB 禾口 pACY⑶uet-pebA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此 工程菌接种于PH 7. O的LB培养基中，37°C振荡培养至OD6tltl为0. 5至0. 8，加入异丙基硫 代-β-D-半乳糖苷(isoprophylthio-β-D-galactoside，简称 IPTG)至终浓度为 lmmol/ L，20°C至37°C振荡表达约12小时，生产藻红蓝蛋白α亚基类荧光蛋白质藻尿胆素-藻红 蓝蛋白A ；离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层 析，可提纯得到相应的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻尿胆素-藻红蓝蛋白Α。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式如下从新鲜涂布的平板上挑取大肠杆菌菌株BL21(DE3)单菌落，接种于5mL LB培养 基，37°C振荡培养过夜；取100 μ L饱和培养物，无菌转接至5mL LB培养基，37°C振荡培养 至OD6tltl = 0. 3 0. 4时，将菌液转移至5mL无菌离心管中，冰上放置10分钟；离心1分钟 (10000g，4°C)弃去上清，收集沉淀菌体；用ImL预冷的0. lmol/L CaCl2无菌溶液重悬菌体， 离心30s (lOOOOg, 4°C )去上清，菌体沉淀用100 μ L预冷的0. lmol/L CaCl2重悬，放置于冰 上，加入一定量的构建好的质粒，混勻后冰浴放置30分钟，42°C热休克90s，冰浴5分钟后加 入300 μ LLB培养基，37°C低速振荡培养45分钟，无菌涂布在含有相应抗生素的LB培养基 平板上，倒置于37°C培养箱至形成可见的单克隆菌斑。提取3个左右菌落，分别接种到5ml含相应抗生素的LB培养基中，振荡培养至饱 和；分别从中取100 μ L转接至5ml含相应抗生素的LB培养基中；37°C振荡培养至OD6tltl = 0. 5-0. 7时，冰浴约30分钟，加入IPTG诱导表达；避光、20°C、150转/分，表达约12小时。 离心收集细胞，细胞加入缓冲液重悬；通过光谱仪测其产物荧光量，选取荧光产量高的菌株 进行大量表达。实施例6(1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp. PCC7120的全序列已经测定完成， M. Iaminosus sp. PCC7603 部分序列已经测定。Anabaena sp. PCC7120 在 GeneBank 中编号 为BA000019，M. Iaminosus sp. PCC7603 中所用到基因序列在 GeneBank 中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已经部分测序，所用到基因序列在GeneBank中编号为AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通过 基因工程方法，将Anabaena SP.PCC7120中的藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白基因克隆于 Novagen公司购买的pCOLADuet-Ι中，所得质粒叫pCOLADuet-pecA，在大肠杆菌中能表达藻 红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白，得到藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白的表达质粒。根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为 模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2)将Μ. Iaminosus sp. PCC7603中的藻红蓝蛋白α亚基裂合/异构酶基因pecE 和pecF克隆于Novagen公司购买的pETDuet-Ι中，所得质粒叫pETDuet-pecE-pecF，在大肠 杆菌中能表达藻红蓝蛋白α亚基裂合/异构酶PecE/PecF，得到藻红蓝蛋白α亚基裂合/ 异构酶表达质粒。(3)将藻红胆素生物合成酶基因(hoi和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1 中，所得质粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大肠杆菌中能同时表达Hol和PebB。(4)将藻红胆素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-Ι中， 所得质粒叫pACYCDuet-pebA，在大肠杆菌中能表达PebA。即脱辅基蛋白基因pecA的片段在pCOLADuet-Ι中是在第一个多克隆位点的EcoR I和Pst I两个酶切位点之间；裂合酶基因pecE在pETDuet中，处于第一个多克隆位点，酶 切位点是Nco I和Pst I之间，裂合酶基因pecF在pETDuet中，处于第二个多克隆位点，酶 切位点是EcoR V和Xho I之间；PEB合成酶基因是3个(hoi、pebA和pebB)，hoi和pebB 在同一个载体P⑶FDuet-I中，hoi在第一个多克隆位点Nco I和Pst I之间，pebB在第二 个多克隆位点Nde I和Xho I之间，pebA在pACYCDuet-Ι中第二个多克隆位点Bgl II和 Xho I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物 分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片 段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载 体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(5)将 pETDuet-pecE-pecF、pCOLADuet-pecA、pCDFDuet-ho 1-pebB 禾口 pACY⑶uet-pebA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此 工程菌接种于PH 7. O的LB培养基中，37°C振荡培养至OD6tltl为0. 5至0. 8，加入异丙基硫 代-β-D-半乳糖苷(isoprophylthio-β-D-galactoside，简称 IPTG)至终浓度为 lmmol/ L，20°C至37°C振荡表达约12小时，生产藻红蓝蛋白α亚基类荧光蛋白质藻尿胆素-藻红 蓝蛋白A ；离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层 析，可提纯得到相应的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻尿胆素-藻红蓝蛋白Α。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式如下从新鲜涂布的平板上挑取大肠杆菌菌株BL21 (DE3)单菌落，接种于5mL LB培养 基，37°C振荡培养过夜；取100 μ L饱和培养物，无菌转接至5mL LB培养基，37°C振荡培养 至OD6tltl = 0. 3 0. 4时，将菌液转移至5mL无菌离心管中，冰上放置10分钟；离心1分钟(10000g，4°C)弃去上清，收集沉淀菌体；用ImL预冷的0. lmol/L CaCl2无菌溶液重悬菌体，离心30s (lOOOOg, 4°C )去上清，菌体沉淀用100 μ L预冷的0. lmol/L CaCl2重悬，放置于冰 上，加入一定量的构建好的质粒，混勻后冰浴放置30分钟，42°C热休克90s，冰浴5分钟后加 入300 μ LLB培养基，37°C低速振荡培养45分钟，无菌涂布在含有相应抗生素的LB培养基 平板上，倒置于37°C培养箱至形成可见的单克隆菌斑。提取3个左右菌落，分别接种到5ml含相应抗生素的LB培养基中，振荡培养至饱 和；分别从中取100 μ L转接至5ml含相应抗生素的LB培养基中；37°C振荡培养至OD6tltl = 0. 5-0. 7时，冰浴约30分钟，加入IPTG诱导表达；避光、20°C、150转/分，表达约12小时。 离心收集细胞，细胞加入缓冲液重悬；通过光谱仪测其产物荧光量，选取荧光产量高的菌株 进行大量表达。实施例7(1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp. PCC7120的全序列已经测定完成， M. Iaminosus sp. PCC7603 部分序列已经测定。Anabaena sp. PCC7120 在 GeneBank 中编号 为BA000019，M. Iaminosus sp. PCC7603 中所用到基因序列在 GeneBank 中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已经部分测序，所用到基因序列 在GeneBank中编号为AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通过基 因工程方法，将M. laminosus sp. PCC7603中的藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白基因克隆于 Novagen公司购买的pCOLADuet-Ι中，所得质粒叫pCOLADuet-pecA，在大肠杆菌中能表达藻 红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白，得到藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白的表达质粒。根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为 模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2)将Anabaena sp. PCC7120中的藻红蓝蛋白α亚基裂合/异构酶基因pecE和 pecF克隆于Novagen公司购买的pETDuet-Ι中，所得质粒叫pETDuet-pecE-pecF，在大肠杆 菌中能表达藻红蓝蛋白α亚基裂合/异构酶PecE/PecF，得到藻红蓝蛋白α亚基裂合/异 构酶表达质粒。(3)将藻红胆素生物合成酶基因(hoi和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet_l 中，所得质粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大肠杆菌中能同时表达Hol和PebB。(4)将藻红胆素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-Ι中， 所得质粒叫pACYCDuet-pebA，在大肠杆菌中能表达PebA。即脱辅基蛋白基因pecA的片段在pCOLADuet-Ι中是在第一个多克隆位点的EcoR I和Pst I两个酶切位点之间；裂合酶基因pecE在pETDuet中，处于第一个多克隆位点，酶 切位点是Nco I和Pst I之间，裂合酶基因pecF在pETDuet中，处于第二个多克隆位点，酶 切位点是EcoR V和Xho I之间；PEB合成酶基因是3个(hoi、pebA和pebB)，hoi禾口 pebB 在同一个载体P⑶FDuet-I中，hoi在第一个多克隆位点Nco I和Pst I之间，pebB在第二 个多克隆位点Nde I和Xho I之间，pebA在pACYCDuet-Ι中第二个多克隆位点Bgl II和 Xho I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物 分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载 体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(5)将 pETDuet-pecE-pecF、pCOLADuet-pecA、pCDFDuet-ho 1-pebB 禾口 pACY⑶uet-pebA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此 工程菌接种于PH 7. 0的LB培养基中， 37°C振荡培养至OD6tltl为0. 5至0. 8，加入异丙基硫 代-β-D-半乳糖苷(isoprophylthio-β-D-galactoside，简称 IPTG)至终浓度为 lmmol/ L，20°C至37°C振荡表达约12小时，生产藻红蓝蛋白α亚基类荧光蛋白质藻尿胆素-藻红 蓝蛋白A ；离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层 析，可提纯得到相应的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻尿胆素-藻红蓝蛋白Α。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式如下从新鲜涂布的平板上挑取大肠杆菌菌株BL21(DE3)单菌落，接种于5mL LB培养 基，37°C振荡培养过夜；取100 μ L饱和培养物，无菌转接至5mL LB培养基，37°C振荡培养 至OD6tltl = 0. 3 0. 4时，将菌液转移至5mL无菌离心管中，冰上放置10分钟；离心1分钟 (10000g，4°C)弃去上清，收集沉淀菌体；用ImL预冷的0. lmol/L CaCl2无菌溶液重悬菌体， 离心30s (lOOOOg, 4°C )去上清，菌体沉淀用100 μ L预冷的0. lmol/L CaCl2重悬，放置于冰 上，加入一定量的构建好的质粒，混勻后冰浴放置30分钟，42°C热休克90s，冰浴5分钟后加 入300 μ LLB培养基，37°C低速振荡培养45分钟，无菌涂布在含有相应抗生素的LB培养基 平板上，倒置于37°C培养箱至形成可见的单克隆菌斑。提取3个左右菌落，分别接种到5ml含相应抗生素的LB培养基中，振荡培养至饱 和；分别从中取100 μ L转接至5ml含相应抗生素的LB培养基中；37°C振荡培养至OD6tltl = 0. 5-0. 7时，冰浴约30分钟，加入IPTG诱导表达；避光、20°C、150转/分，表达约12小时。 离心收集细胞，细胞加入缓冲液重悬；通过光谱仪测其产物荧光量，选取荧光产量高的菌株 进行大量表达。实施例8(1)从GeneBank中可以查到，藻种Anabaena sp. PCC7120的全序列已经测定完成， M. Iaminosus sp. PCC7603 部分序列已经测定。Anabaena sp. PCC7120 在 GeneBank 中编号 为BA000019，M. Iaminosus sp. PCC7603 中所用到基因序列在 GeneBank 中编号为M34254， 可从所查到序列中找到所需基因；Calothrix sp. PCC7601已经部分测序，所用到基因序列 在GeneBank中编号为AY363679，可从所查到序列中找到所需基因(pebA和pebB)。通过基 因工程方法，将M. laminosus sp. PCC7603中的藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白基因克隆于 Novagen公司购买的pCOLADuet-Ι中，所得质粒叫pCOLADuet-pecA，在大肠杆菌中能表达藻 红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白，得到藻红蓝蛋白α亚基脱辅基蛋白的表达质粒。根据GeneBank中查到的基因序列，设计了引物，利用相应的藻种提取总DNA作为 模板，通过PCR扩增得到所需片段，通过上下游引物中设计的酶切位点，把目标片段转入相 应质粒中同样的酶切位点上。(2)将Μ. laminosus sp. PCC7603中的藻红蓝蛋白α亚基裂合/异构酶基因pecE 和pecF克隆于Novagen公司购买的pETDuet-Ι中，所得质粒叫pETDuet-pecE-pecF，在大肠杆菌中能表达藻红蓝蛋白α亚基裂合/异构酶PecE/PecF，得到藻红蓝蛋白α亚基裂合/异构酶表达质粒。(3)将藻红胆素生物合成酶基因(hoi和pebB)克隆于Novagen公司的pCDFDuet-1 中，所得质粒叫pCDFDuet-hol-pebB，在大肠杆菌中能同时表达Hol和PebB。(4)将藻红胆素生物合成酶基因(pebA)克隆于Novagen公司的pACYCDuet-Ι中， 所得质粒叫pACYCDuet-pebA，在大肠杆菌中能表达PebA。即脱辅基蛋白基因pecA的片段在pCOLADuet-Ι中是在第一个多克隆位点的EcoR I和Pst I两个酶切位点之间；裂合酶基因pecE在pETDuet中，处于第一个多克隆位点，酶 切位点是Nco I和Pst I之间，裂合酶基因pecF在pETDuet中，处于第二个多克隆位点，酶 切位点是EcoR V和Xho I之间；PEB合成酶基因是3个(hoi、pebA和pebB)，hoi和pebB 在同一个载体P⑶FDuet-I中，hoi在第一个多克隆位点Nco I和Pst I之间，pebB在第二 个多克隆位点Nde I和Xho I之间，pebA在pACYCDuet-Ι中第二个多克隆位点Bgl II和 Xho I之间。基因插入载体的步骤为根据基因序列设计引物，分上下游，一对；上游下游引物 分别带有酶切位点；利用相应的藻种提取总DNA作为模板；经过PCR扩增得到所需基因片 段，把所得基因片段进行电泳，回收；所得片段用设计的限制性内切酶进行酶切，同时把载 体用同样的限制性内切酶进行酶切，分别回收基因片段和载体；基因片段和载体大致1 1 混合，在T4连接酶作用下连接一定时间(一般4 6小时)；连接产物转化进入大肠杆菌， 利用含抗生素的平板筛选，挑取克隆，验证正确即可。(5)将 pETDuet-pecE-pecF、pCOLADuet-pecA、pCDFDuet-ho 1-pebB 禾口 pACY⑶uet-pebA转入大肠杆菌，当这些质粒都转入大肠杆菌后得到大肠杆菌工程菌；将此 工程菌接种于PH 7. O的LB培养基中，37°C振荡培养至OD6tltl为0. 5至0. 8，加入异丙基硫 代-β-D-半乳糖苷(isoprophylthio-β-D-galactoside，简称 IPTG)至终浓度为 lmmol/ L，20°C至37°C振荡表达约12小时，生产藻红蓝蛋白α亚基类荧光蛋白质藻尿胆素-藻红 蓝蛋白A ；离心收集菌体细胞，加入缓冲液、破碎细胞后，离心收集上清液，通过Ni2+亲和层 析，可提纯得到相应的藻红蓝蛋白类荧光蛋白质藻尿胆素-藻红蓝蛋白Α。将所用到的质粒的组合转入大肠杆菌中的转化方式如下从新鲜涂布的平板上挑取大肠杆菌菌株BL21(DE3)单菌落，接种于5mL LB培养 基，37°C振荡培养过夜；取100 μ L饱和培养物，无菌转接至5mL LB培养基，37°C振荡培养 至OD6tltl = 0. 3 0. 4时，将菌液转移至5mL无菌离心管中，冰上放置10分钟；离心1分钟 (10000g，4°C)弃去上清，收集沉淀菌体；用ImL预冷的0. lmol/L CaCl2无菌溶液重悬菌体， 离心30s (lOOOOg, 4°C )去上清，菌体沉淀用100 μ L预冷的0. lmol/L CaCl2重悬，放置于冰 上，加入一定量的构建好的质粒，混勻后冰浴放置30分钟，42°C热休克90s，冰浴5分钟后加 入300 μ LLB培养基，37°C低速振荡培养45分钟，无菌涂布在含有相应抗生素的LB培养基 平板上，倒置于37°C培养箱至形成可见的单克隆菌斑。提取3个左右菌落，分别接种到5ml含相应抗生素的LB培养基中，振荡培养至饱 和；分别从中取100 μ L转接至5ml含相应抗生素的LB培养基中；37°C振荡培养至OD6tltl = 0. 5-0. 7时，冰浴约30分钟，加入IPTG诱导表达；避光、20°C、150转/分，表达约12小时。 离心收集细胞，细胞加入缓冲液重悬；通过光谱仪测其产物荧光量，选取荧光产量高的菌株进行大量表达。 上述制备方法适用于采用各种蓝藻中的α亚基裂合/异构酶、藻红蓝蛋白α亚基类脱辅基蛋白和PEB生物合成酶基因或其同源基因来制备结合PUB的藻红蓝蛋白α亚 基类荧光蛋白质，但涉及到微生物菌种公开的问题，本发明只选用了 GenBank中已公开全 序列的蓝藻Anabaena sp. PCC7120和已公开部分序列的蓝藻M. Iaminosus sp. PCC7603、 Calothrixsp. PCC7601为例对本发明方法加以说明，本领域的技术人员可以根据上述公开 的内容采用其它原料实施本发明。
权利要求
一种分子设计结合藻尿胆素的藻红蓝蛋白α亚基类荧光蛋白质的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)采用基因工程方法，将α亚基裂合/异构酶基因或其同源基因克隆于表达载体中，得到α亚基裂合/异构酶表达质粒；应用基因工程方法将藻红蓝蛋白α亚基类脱辅基蛋白基因或其同源基因克隆于第二个表达载体中，得到脱辅基蛋白表达质粒；应用基因工程方法将藻红胆素PEB生物合成酶基因或其同源基因克隆于第三个和/或第四个表达载体中，得到PEB合成质粒；(2)将α裂合/异构酶表达质粒、脱辅基蛋白表达质粒、PEB生物合成酶质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌，应用此工程菌通过发酵工程能生产结合藻尿胆素PUB的藻红蓝蛋白α亚基类荧光蛋白质，发酵后，按常规蛋白质提纯技术，提纯得到相应的结合藻尿胆素PUB的藻红蓝蛋白α亚基类荧光蛋白质；
2 根据权利要求1所述的分子设计结合藻尿胆素的藻红蓝蛋白α亚基类荧光蛋白质 的制备方法，其特征在于应用α亚基裂合/异构酶催化藻红胆素异构为藻尿胆素后与藻 红蓝蛋白α亚基类脱辅基蛋白进行共价结合而制备结合藻尿胆素PUB的藻红蓝蛋白α亚 基类荧光蛋白质。
3.根据权利要求1和2所述的方法，其特征在于α亚基裂合/异构酶基因是指与鱼 腥藻 Anabaena sp. PCC7120 中 pecE 和 pecF 基因或层理鞭枝藻 M. Iaminosus sp. PCC7603 中pecE和pecF基因同源的基因，藻红蓝蛋白α亚基类脱辅基蛋白基因是指与Anabaena sp. PCC7120 或 M. Iaminosus sp. PCC7603 中 pecA 同源的基因。
4.根据权利要求1所述的分子设计结合藻尿胆素的藻红蓝蛋白α亚基类荧光蛋白质 的制备方法，其特征在于所述的宿主菌采用大肠杆菌。
全文摘要
本发明涉及一种分子设计结合藻尿胆素的藻红蓝蛋白α亚基类荧光蛋白质的制备方法，通过应用藻胆蛋白α亚基裂合/异构酶催化藻红胆素异构为藻尿胆素PUB后与藻红蓝蛋白α亚基类脱辅基蛋白共价结合，制备结合PUB的藻红蓝蛋白α亚基类荧光蛋白质，本发明的方法应用生物过程生产结合PUB的藻红蓝蛋白类α亚基荧光蛋白质，是一种环境友好的生产方法；藻红蓝蛋白α亚基类荧光蛋白质能应用于生物学和医药功能材料领域，特别是应用为生物学和医学检测领域的荧光探针。
文档编号C12N15/70GK101824427SQ200910037628
公开日2010年9月8日 申请日期2009年3月6日 优先权日2009年3月6日
发明者佟顺刚, 夏坤 申请人:广州天宝颂原生物科技开发有限公司